CN107604087A - 检测小麦Wx‑B1变异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测小麦Waxy‑B1缺失蛋白的方法，本发明还提供了检测该缺失蛋白编码基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，利用该引物进行PCR反应能够快速准确地检测小麦Wx‑B1基因中是否含有转座子插入型沉默变异。本方法能够准确检测出小麦杂种中Wx‑B1转座子插入型沉默变异的存在，实现快速跟踪检测，大大提高育种工作效率，加快小麦品质育种的进程，在小麦族的杂交育种领域具有良好的应用前景。

Description

检测小麦Wx-B1变异的方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及检测小麦B型Waxy(Wx-B1)蛋白编码序列因转座子插入引起表达沉默(Wx-B1转座子插入型沉默)的引物，本发明还涉及利用该引物进行小麦Wx-B1转座子插入型沉默突变检测的方法及检测试剂盒。

背景技术

淀粉是小麦籽粒的主要组分，占到干重的65％-75％。同时，它也是人类所需的能量重要来源。淀粉对小麦淀粉加工品质有着关键性的影响。淀粉由两类多聚葡萄糖组成即线性的直链淀粉(约占25％)和高度分支的支链淀粉(约占75％)。直链淀粉为线性的分子，是D-吡喃葡萄糖之间经由α-(1,4)键连接形成，其聚合度在500至6000个葡萄糖残基之间。支链淀粉是非常巨大的，高度分支的分子，其聚合度为3×10⁵至3×10⁶个葡萄糖残基，其葡萄糖残基之间除了α-(1,4)键的连接形成直链，还有α-(1,6)键的连接形成侧链。

在已报道的一些小麦、大麦和水稻的突变体中，有的材料其直链淀粉含量达到80％，还有的其支链淀粉含量甚至升至99％-100％。直链淀粉与支链淀粉比例的差异导致籽粒淀粉结构和理化性质的变异，因此影响其最终利用价值。比如，直链淀粉含量与抗性淀粉含量之间是正相关的，高直链淀粉含量的淀粉其抗性淀粉含量也高，而后者通过增加膳食纤维可以降低患肠道问题的风险。Waxy小麦淀粉(高支链淀粉含量淀粉)的高糊粘度和膨胀能力非常适合于优质白盐面条的制造。

前期的报道显示，作物籽粒淀粉的生物合成和积累受到不同的酶的调节。淀粉合成酶(starch synthetases，包括SSI，SSII和SSIII三个亚型)、淀粉分支酶(starchbranching,包括SBEI和SBEII两个亚型)和去分支酶(debranching enzymes，SDBEs)参与支链淀粉的合成；而颗粒结合性淀粉合成酶(granule-bound starch synthase I，GBSSI)或称之为Waxy蛋白是直链淀粉合成途径中唯一的酶。

在普通六倍体小麦(Triticum aestivum L.；AABBDD,2n＝6×7＝42)中，A、B、D三个基因组都含编码Waxy蛋白的基因序列，例如Wx-A1，Wx-B1，Wx-D1，它们分别位于7AS、4AL(7BS片段易位而来)和7DS。在不同地区的小麦品种的Wx-A1，Wx-B1和Wx-D1这三个位点中，沉默的Wx等位基因变异都有了相关的报道。这些变异材料被用于创制Wx蛋白变异的小麦品系例如Waxy小麦。然而，近来的小麦品种中的Wx-1位点的变异频率都相对较低。

众所周知，小麦地方品种含有丰富的遗传多样性和变异。已有研究用分子标记鉴定了一些沉默的Wx-A1，Wx-B1，Wx-D1等位位点。通过对中国的53个小麦地方品种的多样性和变异研究，申请人发现了一种新的沉默的Wx-B1等位位点变异类型(Wx-B1转座子插入型沉默)，参见文献(Zhang L L,Chen H,Luo M,et al.Transposon insertion resulted inthe silencing of Wx-B1n in Chinese wheat landraces.Theoretical and AppliedGenetics,2017,130:1321-1330.)。目前针对该变异类型，还没有有效的鉴定方法报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的引物。

本发明的第二个目的在于提供通过检测小麦Wx-B1编码序列内外源片段的引物，鉴定小麦中是否有Wx-B1转座子插入型沉默变异。

本发明的第三个目的在于提供检测小麦中Wx-B1转座子插入型沉默变异的试剂盒。

基于以上目的，本发明根据Ling-Ling Zhang et al.(Theor Appl Genet 2017，130:1321-1330)对53个中国地方品种Waxy蛋白多样性的研究结果，依据其发现的新型的B型Waxy蛋白沉默的现象，通过基因克隆，基因步移及生物信息学分析等手段，确定了其沉默的机制，为Wx-B1基因2462bp处插入了一个2178bp的转座子导致Wx-B1基因表达沉默，据此，设计了多对引物并筛选出一对检测小麦中该类沉默的Wx-B1等位位点的高效特异性引物(WB1N)。通过该引物已从多个小麦地方品种中检测到了这种变异。利用SDS-PAGE和双向电泳技术对不同小麦的Waxy蛋白进行了检测，发现用WB1N引物检测出阳性的所有品种中都无Wx-B1蛋白的表达。结果证明，本发明设计的特异性引物可以快速地检测出Wx-B1转座子插入型沉默变异，而且结果可靠。

本发明首先提供了用于检测小麦Wx-B1基因表达沉默的分子标记，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的特异性引物对PCR扩增得到。

本发明提供了检测小麦Waxy-B1缺失蛋白编码基因的特异性引物对，其为WB1N，所述小麦Waxy-B1缺失蛋白是小麦B型Waxy蛋白编码基因因转座子插入引起B型Waxy蛋白功能缺失。

本发明提供了检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的引物，是WB1N

上游引物序列，5’-TAGGCTCGTCGATCCCTTGTGT-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物序列，5’-TAGCGATGCTTGAAAAACGGC-3’(SEQ ID NO.2)。

进一步地，本发明提供了上述引物在检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的应用。

本发明提供了一种检测小麦B型Waxy蛋白缺失变异的方法，用引物WB1N进行PCR方法扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物WB1N能够扩增出561bp的扩增片段，则标志着该待检小麦存在B型Waxy蛋白缺失变异，所述WB1N引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

其中，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～96℃，5～8min；94～96℃变性30～60s，60～63℃退火30～45s，72～74℃延伸30～50s，共30～35个循环；终延伸72～74℃8～10min。

优选地，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；终延伸72℃10min。

本发明还提供了一种检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的试剂盒，含有引物WB1N，

上游引物序列，5’-TAGGCTCGTCGATCCCTTGTGT-3’

下游引物序列，5’-TAGCGATGCTTGAAAAACGGC-3’。

本发明提供了上述方法或试剂盒在小麦资源材料的挖掘和育种中的应用。

本发明开发的用于检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的特异性引物，直接对小麦Wx-B1基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对不同小麦品种中的Wx-B1沉默等位位点进行验证，而且在育种过程中能够追踪检测该位点的存在。该鉴定方法简单，结果可靠，这对Waxy蛋白变异小麦材料的发掘和基于它们的改良育种工作来说将是一种很好的辅助育种手段，将极大地加快相关的品质改良育种进程。

附图说明

图1为不同引物对在中国春和毛红麦基因组中的特异性扩增插入Wx-B1的转座子的检测图，其中M为MarkerII，1-4号泳道对应的小麦材料为中国春，因为它不含Wx-B1转座子插入型沉默变异所以所有引物对都没有扩增出条带，5-8泳道对应的小麦材料为毛红麦；1和5泳道对应的引物对为WBF1/WBR1，2和6泳道引物为WBF1/WBR2，3和7泳道引物为WBF2/WBR1(WB1N)，4和8泳道引物为WBF2/WBR2。由图可知，7号泳道条带最亮且特异性好，说明WBF2/WBR1这个引物对(命名为WB1N)扩增检测Wx-B1转座子插入型沉默变异的效果最好。

图2为利用WB1N引物对在不同小麦基因组中的特异性扩增检测图，其中M为MarkerII，1号泳道为中国春，2号泳道为小白皮，3号泳道为毛红麦，4号泳道为蜀麦126，5号泳道为川农16,6号泳道为良麦4号，7号泳道为蜀麦482。2号泳道的小白皮和3号泳道的毛红麦中的Wx-B1含有转座子插入型沉默变异，因此可以用WB1N引物扩增出特异片段，其他材料无此类型变异，因此无法扩增出相应的片段。

图3为不同小麦种子SDS-PAGE和双向电泳检测图，图a为SDS-PAGE电泳检测结果，其中M为低分子量蛋白Marker，1号泳道为中国春，2号泳道为小白皮，3号泳道为毛红麦，4号泳道为蜀麦126，5号泳道为川农16,6号泳道为良麦4号，7号泳道为蜀麦482，Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1对应的蛋白条带用黑色箭头指示；图b为双向电泳检测图，其中8号泳道为中国春，9号泳道为小白皮，10号泳道为毛红麦，11号泳道为蜀麦126，Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1对应的蛋白印记用黑色半框指示。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明使用的普通小麦均可从四川农业大学小麦研究所得到。本发明所用生化试剂均为市售。

本发明各试剂配方如下：

染色试剂盒：碧云天快速银染试剂盒

蛋白提取液A：55mM Tris-HCL，pH 6.8，2.3％SDS，5％2-巯基乙醇，10％甘油)。

蛋白提取液B：55mmolTris-HCL，pH 6.8，2.3％SDS，5％2-巯基乙醇，10％甘油，0.005％溴酚蓝)。

30％(30:0.135)分离胶贮液：30g丙烯酰胺和0.135g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100ml，过滤后4℃保存；

分离胶缓冲液：1.5M Tris—HCL(PH 8.8)18.171gTris溶于水中，用浓盐酸调至PH8.8，过滤后4℃保存。

10％APS：称10g电泳级过硫酸铵溶于100ml蒸馏水中，用2.0的离心管分装后，于20℃保存。

10％SDS：称取10gSDS溶于100ml蒸馏水，灭菌后保存于室温。

30％(29：1)浓缩胶贮液：29.0g丙烯酰胺和1.0g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100ml，过滤后4℃保存。

浓缩胶缓冲液：1M Tris-HCL(pH 6.8)12.14g Tris溶于水中，用浓盐酸调至pH6.8，加蒸馏水定容至100ml，过滤后4℃保存。

Tris-硼酸电极缓冲液：称取Tris151.2g，硼酸38g，SDS10g蒸馏水溶解至1000ml，磁力搅拌器混匀，临用前稀释十倍。

凝胶制备方法为：采用不连续缓冲系统，分离胶用12％SDS-PAGE(pH 8.9)，浓缩胶用5％SDS-PAGE(pH 6.8)；

裂解液：8M尿素,2M硫脲,4％Triton X-100,2％Bio-Lyte两性电解质(pH 3–10,现用现加)、5％β-巯基乙醇，-20℃存放。

水化液：7M尿素,2M硫脲,4％CHAPS,65mM DTT，0.2％Bio-Lyte两性电解质(pH 3～10)、0.001％(w/v)溴酚蓝(两性电解质和DTT现用现加，母液配好后-20℃存放)。

平衡液母液：0.375M Tris pH 8.8,6M尿素,20％甘油,2％SDS,-20℃存放。

平衡液|：母液中加入2％DTT；

平衡液||：母液中加入2.5％碘乙酰胺；

封胶液：0.5％低熔点琼脂糖；25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，0.001％溴酚蓝,4℃存放。

实施例1检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异引物的设计

根据文献(Zhang L L,Chen H,Luo M,et al.Transposon insertion resultedin the silencing of Wx-B1n in Chinese wheat landraces.Theoretical and AppliedGenetics,2017,130:1321-1330.)对一种全新的B型Waxy蛋白沉默机制(Wx-B1转座子插入型沉默)的研究分析，本发明对此类造成普通小麦中广泛存在的Wx-B1表达沉默现象的插入片段进行序列比对分析，经过反复分析和验证，确定了该片段的特异性。该片段为转座子，插入位置位于Wx-B1开放阅读框的第十号外显子内，据此设计了上游引物和下游引物各两条，不同上下游引物组成四个不同引物对，其核苷酸序列如下：

WBF1，5’-TCCTGCCGATTCCTTATCTCCC-3’

WBF2，5’-TAGGCTCGTCGATCCCTTGTGT-3’

WBR1，5’-TAGCGATGCTTGAAAAACGGC-3’

WBR2，5’-TGTGTGGGCATTTACGTAGATGG-3’。

实施例2检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异引物的确定

1、基因组DNA提取

将中国春和毛红麦种植于田间，待生长茂盛时取叶片进行基因组DNA提取。提取方法采用CTAB法。

2、PCR特异性扩增

采用实施例1中设计的不同引物对中国春和毛红麦的基因组进行PCR扩增。

WBF1，5’-TCCTGCCGATTCCTTATCTCCC-3’

WBF2，5’-TAGGCTCGTCGATCCCTTGTGT-3’

WBR1，5’-TAGCGATGCTTGAAAAACGGC-3’

WBR2，5’-TGTGTGGGCATTTACGTAGATGG-3’。

PCR反应体系：

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，共35个循环；72℃10min。

预期WBF1/WBR1引物对扩增片段长度为713bp，WBF1/WBR2引物对扩增片段长度为455bp,WBF2/WBR1引物对扩增片段长度为561bp，WBF2/WBR2引物对扩增片段长度为303bp。扩增结果见图1，由图1可看出，1-4号泳道扩增材料为中国春，因为它不含Wx-B1转座子插入型沉默变异因此所有的引物对都没有扩增出条带，5-8泳道扩增材料为毛红麦，其中7号泳道条带最亮并且特异性好，说明WBF2/WBR1引物对(命名为WB1N)扩增检验Wx-B1转座子插入型沉默变异的效果最好。

3、特异片段的验证：

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)进行PCR产物的回收与纯化。扩增产物回收并纯化后连接到T载体，按照pMD19-T试剂盒(TaKaRa)使用说明书进行，反应液于16℃水浴连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞，挑取培养过夜的平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37℃培养12h)。挑取重组菌进行PCR扩增，扩增使用载体上的引物M13:

M13F(RV-M):5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

M13R(M13-47):5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR反应总体积为25μL，其中含10×PCR buffer 2.5μL，1.5mmol/L MgCl₂ 1.5μL，4种dNTP各200μmol/L共1μL，引物各75ng，0.75U Taq酶，少许白斑菌体。PCR反应程序同上。获得阳性克隆后，送北京擎科成都分公司进行测序。测序结果表明利用WB1N引物在毛红麦中扩增的片段与在Wx-B1转座子插入型沉默型小麦小白皮中的目标区域序列一致。说明本发明提供的特异性引物可以特异地、准确地检测Wx-B1转座子插入型沉默变异。

实施例3检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异方法的建立及验证1、基因组DNA提取

将不同的中国小麦地方品种种植于田间，待生长茂盛时取叶片进行基因组DNA提取。提取方法采用CTAB法。

2、PCR特异性扩增

采用实施例2筛选出的引物WB1N对上述各小麦的基因组进行PCR扩增。

WB1N上游引物序列，5’-TAGGCTCGTCGATCCCTTGTGT-3’

下游引物序列，5’-TAGCGATGCTTGAAAAACGGC-3’。

PCR反应体系如实施例2所示

PCR反应程序：

WB1N引物扩增片段长度为561bp。

扩增结果见图2，由图可看出，2号和3号泳道代表的小白皮和毛红麦由于含有Wx-B1转座子插入型沉默变异，因此由引物WB1N能扩增出高亮的特异性的片段，而其他无此类型变异的材料则无法扩增出片段，说明引物特异性好。

3、小麦Waxy蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

3.1淀粉颗粒蛋白的提取

淀粉颗粒结合蛋白的提取采用适当改进后的Yamamori的方法。

(1)取成熟饱满的种子，将远胚端磨碎成粉,装入2ml的离心管中。

(2)向磨碎的粉末中加入700uL的蛋白提取液A，放在旋涡混匀器上充分涡旋混匀，离心(10000r/min，5min，4℃)，去除上清液，重复三次。

(3)然后向沉淀物中加入1000uL的ddH₂0漂洗，充分涡旋后离心(10000r/min，5min，4℃)，去除上清液，重复三次，之后用干净的纸尽量吸去离心管中残留的液体。

(4)最后加入700uL的丙酮，充分涡旋后离心,(10000r/min，5min，4℃)，去上清液，重复两次。

(5)用洁净的卫生纸吸去离心管口残留的液体，然后在空气中自然晾干。

(6)最后按每10mg沉淀物，加入100uL蛋白提取液B，涡旋混匀，沸水浴中放置5min，离心(10000r/min，5min，4℃)，取10uL上清液点样。

3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

聚丙烯酰胺凝胶电泳采用80×100×0.8(mm×mm×mm)垂直双板，用ACl000电泳仪和BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra system电泳槽。3.2.1制胶

按制胶的配方表配制好12％分离胶和5％的浓缩胶待用，将配好的分离胶按每板5ml的量加入准备好的双垂直板中，加入ddH₂O进行水封，水封时间为30分钟，后弃水，用吸水纸将双垂直板中的水尽量吸干净。每板加入1.5ml的浓缩胶，并插上梳子，大约于25min后拔掉梳子，加入电极缓冲液进行点样。

3.2.2点样

以蛋白Marker作为参考，以“中国春”小麦品种作为对照，取3.1步骤制得的上清液10uL点样，稳定电压采用初始电压100V，20min后在增加电压到120V，电泳时间大约为2个小时。之后取下胶，准备染色。如果单次试验的实验材料较多，取下胶时应做好标记，防止实验结果混杂。

3.2.3染色(银染)及照相

染色采用碧云天生物试剂公司生产的快速银染试剂盒，照其说明依次进行。染色后的胶通过成像仪拍照并保存。

采用上述方法检测不同小麦材料的Wx-B1蛋白亚基缺失情况，结合本发明WB1N引物扩增的结果，验证了本发明WB1N引物检验Wx-B1转座子插入型沉默变异的准确性。结果如图3a所示，泳道2-5的材料均缺失Wx-B1蛋白亚基，其他泳道的材料不缺失Wx-B1蛋白亚基。2-3号泳道材料含有转座子插入变异，4-5号含有Wx-B1位点缺失型变异(另一种变异，本发明引物无法扩增出条带)，结合图2可知，设计的WB1N引物可特异性检测Wx-B1转座子插入型沉默变异。

4小麦Waxy蛋白的双向电泳检测

为了进一步验证SDS-PAGE的结果，接下来采用双向电泳检测小麦Waxy蛋白。

4.1第一向电泳

(1)淀粉颗粒蛋白的提取，方法同上面3.1步骤(1)-(5)。

(2)从冰箱中取-20℃冷冻保存的裂解液1ml/管，置室温溶解，按每1mg干粉加入100uL裂解液，混匀，在常温下放置1h。10000g/min，离心5min，取上清，30uL/管分装，可现用也可放-80℃备用。

(3)从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化液(1ml/管)，置室温溶解。在小管中加入0.01g DTT，2uL Bio-Lyte(pH3-10)，充分混匀。从小管中取出170uL水化液加入30uL样品裂解液，混匀，冰上放置30min。

(4)从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(7cm pH 3-10)，于室温放置30分钟。

(5)沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯，注意不要有气泡。

(6)去除胶条的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极，在放置胶条的槽内覆盖2ml矿物油。

(7)在每根胶条隔壁聚焦槽内覆盖1ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

(8)盖上盖子，设置等电聚焦程序。等电聚焦程序设置如下：S1被动水化，12-16小时(20℃)；S2除盐，250V，线性升压，30分钟；S3除盐，500V，快速升压，30分钟；S4升压，1000v，快速升压，30分钟；S5升压，6000v，线性升压，2小时；S6聚焦，6000V，快速升压15,000v/h，S7保持，500V，快速升压，任意时间。每根胶条的极限电流为30-50μA/根，等电聚焦时的温度为20℃。依次添加程序，创建完毕后保存。打开程序，选择是否水化以及水化温度、水化时间和水化温度、水化后是否暂停。

(9)聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

4.2.第二向SDS-PAGE电泳

(1)配制12％的丙烯酰胺凝胶。配制对应浓度的凝胶溶液，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用ddH₂O水封面。

(2)待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的ddH₂O，用滤纸吸干剩余水分。

(3)配制胶条平衡缓冲液I。

(4)在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用ddH₂O浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。

(5)将聚焦完毕的胶条转移至水化盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入2.5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃10-15分钟(最好手摇)。

(6)配制胶条平衡缓冲液II。

(7)第一次平衡结束后，用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。至于一新的水化槽内，加入胶条平衡缓冲液II，在水平摇床上缓慢摇晃10-15分钟(最好手摇)。

(8)将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己，取少量琼脂糖封胶加入到玻璃板之间做润滑。

(9)第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液，将完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上，用镊子推支撑膜至分离胶处，注意不要有气泡，将凝胶转移至电泳槽中。

(10)在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通循环水浴，打开电源，起始时用低电压(80v/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(100v/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

(11)电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。

(12)进行银染染色和拍照。

不同小麦Waxy蛋白的SDS-PAGE和双向电泳鉴定结果如图3。

图3a显示Wx-B1蛋白在中国春、良麦4号和蜀麦482中都有表达，而在小白皮、毛红麦、蜀麦126和川农16中都没有相应的条带；由图3b可看出通过分辨率更高的二维电泳分离后，中国春的A、B和D型Waxy都被检测出明显的印记，而在小白皮、毛红买和蜀麦126中都没有Wx-B1蛋白的印记。结合利用WB1N引物在小白皮和毛红麦中检测出Wx-B1转座子插入型沉默变异以及通过蛋白电泳检测验证其Wx-B1蛋白条带的缺失，结果表明本发明设计的引物以及检测方法能够快速、准确地检测出小麦种子中的Wx-B1转座子插入型沉默变异，能够在小麦特异材料挖掘和育种中进行应用。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 检测小麦 Wx-B1 变异的方法

<130> KHP171114115.2

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taggctcgtc gatcccttgt gt 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagcgatgct tgaaaaacgg c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

Claims (10)

1.用于检测小麦Wx-B1基因表达沉默的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQID NO.1～2所示的特异性引物对PCR扩增得到。

2.检测小麦Waxy-B1缺失蛋白编码基因的特异性引物对，其特征在于，其为WB1N，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述小麦Waxy-B1缺失蛋白是小麦B型Waxy蛋白编码基因转座子插入引起B型Waxy蛋白功能缺失。

3.权利要求2所述特异性引物对在检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默变异的应用。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述特异性引物对在小麦杂交鉴定中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述特异性引物对在小麦育种中的应用。

6.一种检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默的方法，其特征在于，用引物WB1N进行PCR方法扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物WB1N能够扩增出561bp的扩增片段，则标志着该待检小麦存在Wx-B1转座子插入型沉默，所述WB1N引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～96℃，5～8min；94～96℃变性30～60s，60～63℃退火30～45s，72～74℃延伸30～45s，共30～35个循环；终延伸72～74℃8～10min。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；终延伸72℃10min。

9.一种检测小麦Wx-B1转座子插入型沉默突变的试剂盒，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对。

10.权利要求6～8任一所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在小麦育种中的应用。