CN107586347B

CN107586347B - 一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法

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Publication number: CN107586347B
Application number: CN201710885438.6A
Authority: CN
Inventors: 王俊龙; 包爱娟; 杨文�; 赵雅楠; 武强强; 孔维宝; 梁俊玉; 姚健; 张继
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Northwest Normal University
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107586347A

Abstract

本发明公开了一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物及其应用，属生物高分子技术领域。本发明采用酸性离子液体催化亚硒酸，合成圆头蒿硒多糖，产物具有低分子量、高硒含量（10370~20438μg/g）的特点。所用试剂环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，反应条件温和、产率高，有效提高了硒含量并缩短了反应所需时间，并显著提高了圆头蒿多糖体外抑制肺癌H1650细胞的能力，拓展了圆头蒿多糖作为天然活性物质的应用范围。

Description

一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法

技术领域

本发明属生物高分子技术领域，涉及一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法；本发明同时还涉及硒化圆头蒿多糖体外对抑制H1650肺癌细胞的应用。

背景技术

硒（Selenium）是对人体重要微量营养元素，对硒的化学和生物学研究集中在各类无机硒和有机硒化合物（特别是硒蛋白和硒多糖）结构和功能的发掘。目前，人们很重视多糖经过硒化后活性的增强（或变化），主要集中在体内外免疫调节、抗肿瘤及抗氧化等方面。硒多糖目前报道较多的是化学法制备，亚硒酸钠-硝酸体系（Na₂SeO₃-HNO₃）反应条件温和、易于制备，是目前最受欢迎的多糖硒化试剂。专利CN 106336465 A公开了硒化香菇菌多糖的制备方法和用途，以硝酸/亚硒酸/氯化钡为反应体系，反应8~12小时，得到具有抑制肿瘤细胞的多糖含硒衍生物，硒含量为12 mg/g；专利CN 102718882 B公开了提高当归多糖免疫增强活性的制备方法，以硝酸/亚硒酸为反应体系，反应6~8小时，得到硒含量范围为6.41~12.98 mg/g的当归硒多糖；专利CN 106589154 A公开了野西瓜硒多糖的制备方法，以硝酸水溶液为反应介质，亚硒酸钠为硒化试剂，反应6.5~7.5小时后得到硒含量为5416 .24μg/g的野西瓜硒多糖。

此外，用化学性质活泼的硒化试剂进行多糖的硒化修饰报道较少，主要以含硒酰氯为主。专利CN 105884918 A公开了以二氧六环或甲苯为介质，采用氯氧化硒进行硒多糖的制备，产物硒含量为769~11036 μg/g；专利CN 104072629 A公开了南板蓝根硒化多糖的制备方法及应用，将南板蓝根多糖与乙酸硒醚和氯化亚砜在蒸馏水和DMF中进行反应，产物硒含量为8.9和10.35 mg/g，并具有体外抑制肿瘤细胞的作用。

以上专利和文献中涉及到的多糖硒化修饰技术，均存在各自的缺点：亚硒酸（钠）作为硒化试剂，需要在酸性水溶液中进行反应，这对酯化反应及产物硒多糖的分子量、分子量分布的控制都是不利的；有机法制备硒多糖，含硒中间体制备复杂且毒性大、副反应多，环境不友好。因此，需要开发以酸性离子液体为催化剂合成高效、温和的多糖硒化体系。而酸性离子液体以其热稳定性好、效率高、环境友好且可回收重复利用等优点而广泛应用在各类有机合成反应中。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的是提供一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法。

本发明的另一目的在于提供硒化圆头蒿多糖体外对抑制H1650肺癌细胞的应用。

一、硒化圆头蒿多糖的合成

1. 圆头蒿多糖甲酰胺溶液的制备：

将圆头蒿多糖在50℃~70℃、500~800 rpm的转速下搅拌3~6 h溶解于无水甲酰胺中，得圆头蒿多糖的甲酰胺溶液。

上述圆头蒿多糖为酸性杂多糖，单糖组成为L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1:3.16:5.86:7.18:3.44，重均分子量为6.963×10⁴g/mol，总糖含量为89.7%。其中，圆头蒿多糖与无水甲酰胺的质量体积比为2~4 mg/mL。

2. 酸性离子液体的制备

将无机酸在-10℃~0℃下以40~60滴/min的速度滴加到有机碱中，滴加结束后，在室温下500~800 rpm搅拌反应10~12 h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤3~5遍，收集下层物，在50~70℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥8~12 h得酸性离子液体。

所述无机酸为浓盐酸、浓硝酸或浓硫酸，有机碱为咪唑或甲基咪唑，无机酸与有机碱的摩尔比为1:1，乙酸乙酯和离子液体的体积比为1:1~1.5:1，所述室温为25±5℃。

3. 硒化圆头蒿多糖的合成

将亚硒酸加入到制备好的酸性离子液体中，在N₂保护的条件下将圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以60~80滴/min的速度进行滴加，完毕后，在此条件下，以温度50~60℃、转速500~800 rpm搅拌反应2.5~3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析36~48 h，去离子水透析18~36 h，透析完毕后袋内物在55~65℃、真空度0.06~0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/30~1/40，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的70~80%）沉淀，沉淀物在4000~5000 rpm/min下离心10~15min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60~-50℃，真空度5~10 Pa下冷冻干燥48~72 h，得硒化圆头蒿多糖。

其中：亚硒酸和酸性离子液体的质量体积比为0.06~0.1 g/mL，圆头蒿多糖与亚硒酸的摩尔比为1:3。

所得硒化圆头蒿多糖为暗红色或深红色无定形粉末，总糖含量范围83.7~88.1%，硒含量10370~19376 μg/g，重均分子量2.936×10⁴Da~3.904×10⁴g/mol，分子量分布1.645~2.134。体外对H1650肺癌细胞的IC₅₀为373.1~698.2 μg/mL。

二、硒化圆头蒿多糖的测试及表征

本发明采用荧光分光光度法，傅里叶变换红外光谱分析、分子量测定及体外抑制肿瘤细胞增殖实验，对制备的硒化圆头蒿多糖的结构和生物活性进行分析和说明：

1. 硒含量的测定：采用荧光光度法对样品进行硒含量测定

称取干燥的硒化圆头蒿多糖待测样品，加入混酸（HNO₃:H₂SO₄:HClO₄=1:1:4），静止过夜后，在135℃中消解6~8小时，将消解液用蒸馏水稀释定容，取8 mL加入0.2 mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5 mol/L的盐酸羟胺各4~6 mL，振荡均匀后静置10~15 min，并于暗处加入浓度为0.1%的2,3-二氨基萘溶液4~6 mL，沸水浴5~8 min，取出冷却至室温后，加入环己烷6 mL，充分振荡萃取，取环己烷层在荧光分光度计中测定荧光值：激发波长376 nm，发射波长 520 nm，用工作曲线法计算硒含量，硒多糖硒含量值为10370~19376 μg/g，与不用离子液体得到的硒多糖硒含量4836 μg/g相比，本发明方法使得硒含量得到显著提高。

2. 红外光谱图分析

充分干燥的硒化圆头蒿多糖待测样品与KBr压片，用Thermo Nicolet is10红外光谱仪在400~4000 cm^-1范围内扫描，扫描次数16次，分辨率4 cm^-1。

图1为圆头蒿多糖和本发明实施例2的硒化圆头蒿多糖的红外光谱图。图中圆头蒿多糖的红外光谱显示其具有多糖的特征峰：3340 cm^-1左右极宽强的吸收峰为多糖羟基的O-H伸缩振动，2924cm^-1处为C-H键的伸缩振动。与圆头蒿多糖的红外光谱对比，硒化圆头蒿多糖除了具有多糖的特征吸收峰外，在1150cm^-1处和711 cm^-1处出现新的吸收峰，分别为Se=O的伸缩振动和C-O-Se的弯曲振动，说明圆头蒿多糖结构中的部分-OH被亚硒酸基取代，发生了硒化反应。

3. 分子量测定

采用体积排阻色谱-光散射联用仪，对硒化圆头蒿多糖待测样品绝对分子量进行测定。多角度激光散射仪（multi-angle laser photometer，MALLS；DAWN EOS, WyattTechnology Co., USA）波长为690 nm。色谱柱（Ultrahydrogel^TM column， Waters，USA）规格7.8 mm ×300 mm。

用超纯水配制成所需浓度，溶解好的硒化圆头蒿多糖液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，硒化圆头蒿多糖液进样量为50μL，流速为0.5 mL/min，色谱柱温度为30℃，超纯水作为流动相。本发明测得硒化圆头蒿多糖的重均分子量范围为2.936×10⁴Da~3.904×10⁴g/mol，与反应前的圆头蒿多糖相比分子量降低，说明酸性离子液体在催化合成硒多糖的同时，起到了降低分子量的作用。

图2为圆头蒿多糖和本发明实施例2的硒化圆头蒿多糖的体积排阻色谱-光散射联用图。由图中可以看出，圆头蒿多糖和其硒化衍生物均为单一组成，圆头蒿多糖的重均分子量为6.963×10⁴g/mol。反应后，硒化圆头蒿多糖的出峰时间略有延迟，分子量为3.057×10⁴ g/mol，说明本发明以酸性离子液体为催化剂能在反应过程中促进酸催化的糖苷键水解，使产物分子量降低。

4. 硒化圆头蒿多糖体外对H1650肺癌细胞的抑制作用

取对数生长期的肺癌H1650细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含15%新生牛血清的DMEM培养基制成浓度3×10⁵个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以0.2ml/孔接种于96孔培养板（板边缘封无菌水，空白组加3孔不含细胞的培养基），置CO₂培养箱内在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

培养24 h后细胞贴壁，换含药培养基，所用药物为圆头蒿多糖及本发明实施例和比较例中制备的4种硒化圆头蒿多糖的水溶液，每孔加190 μL培养基和10 μL药物（空白组和对照组加10 μl PBS液），药物终浓度为25，50，100，200，300，400 μg/mL，每浓度重复6孔，并设不加样品的对照组和空白调零组。置CO₂培养箱内，在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件下培养。

样品处理48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃下继续培养1 h。小心弃去孔内上清液，并加入150 μL DMSO，振荡10 min。用酶标仪在450 nm处测吸光值，对照组以空白组调零，并按下列公式计算抑制率，并根据不同浓度样品的抑制率计算半数抑制浓度（IC₅₀）：

抑制率（%）=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%

通过细胞实验测定的吸光值，本发明中圆头蒿硒多糖的IC₅₀为373.1~698.2 μg/mL，说明圆头蒿多糖对H1650肺癌细胞具有抑制能力，显著提高了圆头蒿多糖的体外抑制肿瘤细胞增殖能力，可作为H1650肺癌细胞的抑制剂，用于开发抗癌药物。

本发明的有益效果：

1、本发明以圆头蒿多糖为原料，采用酸性离子液体催化亚硒酸，合成高硒含量圆头蒿硒多糖。离子液体环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，无废液排放，有效提高了硒含量并缩短了反应所需时间，反应条件温和、产率高；

2、同时制备的硒化圆头蒿多糖还具有低分子量的特点，减少了酸解反应步骤，避免各类环境不友好的酸性试剂的使用及苛刻的酸解条件，不会对反应设备产生强烈的腐蚀；

3、通过硒化和降低分子量，显著提高了圆头蒿多糖体外抑制H1650肿瘤细胞的活性，拓展了圆头蒿多糖作为天然活性物质的应用范围；

4、本发明不需要特殊设备，简单可控，成本低，适合推广应用。

附图说明

图1圆头蒿多糖及实施例2中硒化圆头蒿多糖多糖的红外光谱图。

图2圆头蒿多糖及实施例2中硒化圆头蒿多糖多糖的体积排阻色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明酸性离子液体制备硒化圆头蒿多糖的合成方法作进一步的说明。

实施例1

一种硒化圆头蒿多糖的合成，包括：

（1）圆头蒿多糖甲酰胺溶液的制备：将300 mg圆头蒿多糖在60℃、800 rpm的转速下搅拌3 h溶解于75 mL无水甲酰胺中，得圆头蒿多糖的甲酰胺溶液。

（2）酸性离子液体的制备：将10 mL浓硝酸在-10℃下以40滴/min的速度滴加到9.86 g咪唑中，滴加结束后，在室温下800 rpm搅拌反应10 h，反应完毕后室温下用10 mL乙酸乙酯洗涤5遍，收集下层物，在70℃、0.06 MPa下真空干燥9 h得酸性离子液体，H ₀为3.78。

（3）硒化圆头蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中制备好的10 mL酸性离子液体中，在N₂保护的条件下将（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以80滴/min的速度进行滴加，完毕后，在此条件下，以温度55℃、转速500 rpm搅拌反应3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析48h，去离子水透析18 h，透析完毕后袋内物在65℃、真空度0.07 MPa下减压浓缩至原体积的1/35，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，乙醇含量占浓缩液总体积的70%。沉淀物在4500 rpm/min下离心15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60℃，真空度5 Pa下冷冻干燥72 h，得暗红色粉末状圆头蒿硒多糖。

该圆头蒿硒多糖的硒含量为19376 μg/g，总糖含量为85.9%，重均分子量为2.936×10⁴ g/mol，分子量分布为2.624，对H1650肺癌细胞的体外IC₅₀值为373.1 μg/mL。

实施例2

一种硒化圆头蒿多糖的合成，包括：

（1）圆头蒿多糖甲酰胺溶液的制备：将300 mg圆头蒿多糖在70℃、500 rpm的转速下搅拌6 h溶解于150 mL无水甲酰胺中，得圆头蒿多糖的甲酰胺溶液。

（2）酸性离子液体的制备：将10 mL浓硫酸在0℃下以50滴/min的速度滴加到15.1g甲基咪唑中，滴加结束后，在室温下700 rpm搅拌反应12 h，反应完毕后室温下用15 mL乙酸乙酯洗涤3遍，收集下层物，在50℃、0.07 MPa下真空干燥12 h得酸性离子液体，H ₀为3.76。

（3）硒化圆头蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中制备好的酸性离子液体（12.5 mL）中，在N₂保护的条件下将（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以60滴/min的速度进行滴加，完毕后，在此条件下，以温度50℃、转速800 rpm搅拌反应2.5 h，待反应完毕后立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析36 h，去离子水透析24 h，透析完毕后袋内物在55℃、真空度0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/40，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的80%）沉淀，沉淀物在5000 rpm/min下离心10 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-55℃，真空度10 Pa下冷冻干燥60 h，得深红色粉末状圆头蒿硒多糖。

该圆头蒿硒多糖的硒含量为10370 μg/g，总糖含量为83.7%，重均分子量为3.057×10⁴ g/mol，分子量分布为1.771，对H1650肺癌细胞的体外IC₅₀值为549.2 μg/mL。

实施例3

一种硒化圆头蒿多糖的合成，包括：

（1）圆头蒿多糖甲酰胺溶液的制备：将300 mg圆头蒿多糖在50℃、600 rpm的转速下搅拌5 h溶解于100 mL无水甲酰胺中，得圆头蒿多糖的甲酰胺溶液。

（2）酸性离子液体的制备：将10 mL浓盐酸在-5℃下以60滴/min的速度滴加到8.16g咪唑中，滴加结束后，在室温下500 rpm搅拌反应11 h，反应完毕后室温下用10 mL乙酸乙酯洗涤4遍，收集下层物，在60℃、0.08 MPa下真空干燥8 h得酸性离子液体，H ₀为3.79。

（3）硒化圆头蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中制备好的酸性离子液体（7.5 mL）中，在N₂保护的条件下将（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以70滴/min的速度进行滴加，完毕后，在此条件下，以温度60℃、转速600 rpm搅拌反应3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析48h，去离子水透析36 h，透析完毕后袋内物在60℃、真空度0.06 MPa下减压浓缩至原体积的1/30，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的75%）沉淀，沉淀物在4000 rpm/min下离心15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-50℃，真空度5 Pa下冷冻干燥78h，得暗红色粉末状圆头蒿硒多糖。

该圆头蒿硒多糖的硒含量为15691 μg/g，总糖含量为88.1%，重均分子量为3.904×10⁴ g/mol，分子量分布为1.645，对H1650肺癌细胞的体外IC₅₀值为698.2 μg/mL。

比较例

（2）硒化圆头蒿多糖的合成：在N₂保护的条件下将（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以80滴/min的速度滴加到0.75 g亚硒酸中，以温度55℃、转速500 rpm搅拌反应3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析48 h，去离子水透析18 h，透析完毕后袋内物在65℃、真空度0.07 MPa下减压浓缩至原体积的1/35，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的70%）沉淀，后在4500rpm/min下离心15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60℃，真空度5 Pa下冷冻干燥72h，得淡红色粉末状圆头蒿硒多糖。

该圆头蒿硒多糖的硒含量为4836 μg/g，总糖含量为86.6%，重均分子量为6.771×10⁴ g/mol，分子量分布为3.615。

该比较例的各参数与实施例1对应，二者的区别是：实施例1采用离子液体作为催化剂进行反应。通过体外实验发现，圆头蒿多糖和比较例中硒含量较低、分子量较高的圆头蒿硒多糖，另外通过细胞实验测定的吸光值，进而计算抑制率和IC₅₀值，均没有观察到对H1650肺癌细胞显著的体外抑制肿瘤细胞增殖能力，说明本发明方法通过离子液体同时降低多糖的分子量和提高硒含量，有效地提高了其作为肺癌H1650细胞抑制剂的能力，具有显著的生物活性增强效应。

Claims

1.一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，包括以下工艺步骤：

（1）圆头蒿多糖甲酰胺溶液的制备：将圆头蒿多糖在50℃~70℃、500~800 rpm的转速下搅拌3~6 h溶解于无水甲酰胺中，得圆头蒿多糖的甲酰胺溶液；

（2）酸性离子液体的制备：将无机酸在-10℃~0℃下，以40~60滴/min的速度滴加到有机碱中，滴加结束后，在室温下500~800 rpm搅拌反应10~12 h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤3~5遍，收集下层物，在50~70℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥8~12 h得酸性离子液体；上述无机酸为浓盐酸、有机碱为咪唑或甲基咪唑；

（3）硒化圆头蒿多糖的合成：将亚硒酸加入到步骤（2）中制备好的酸性离子液体内，在N₂保护的条件下，将步骤（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以60~80滴/min的速度进行滴加，完毕后，在温度50~60℃、转速500~800 rpm的条件下搅拌反应2.5~3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析36~48h，去离子水透析18~36 h，透析完毕后，袋内物在55~65℃、真空度0.06~0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/30~1/40，在浓缩液中加入无水乙醇，乙醇含量占总体积的70~80%沉淀，沉淀物在4000~5000 rpm下离心10~15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60~-50℃，真空度5~10 Pa下冷冻干燥48~72 h，得硒化圆头蒿多糖。

2.如权利要求1所述一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述圆头蒿多糖为酸性杂多糖，单糖组成为L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1:3.16:5.86:7.18:3.44，重均分子量为6.963×10⁴g/mol，总糖含量为89.7%。

3.如权利要求1所述一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，其特征在于：步骤（1）中，圆头蒿多糖与无水甲酰胺的质量体积比为2~4 mg/mL。

4.如权利要求1所述一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述无机酸与有机碱的摩尔比为1:1。

5.如权利要求1所述一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，其特征在于：步骤（3）中，亚硒酸和酸性离子液体的质量体积比为0.06~0.1 g/mL。

6.如权利要求1所述一种以酸性离子液体为催化剂合成圆头蒿多糖衍生物的方法，其特征在于：步骤（3）中，圆头蒿多糖与亚硒酸的摩尔比为1:3。

7.利用权利要求1的方法合成圆头蒿多糖衍生物作为H1650肺癌细胞抑制剂在制备抗癌药物中的应用。