CN107629134B

CN107629134B - 以离子液体为溶剂和催化剂合成硒化沙蒿多糖的方法

Info

Publication number: CN107629134B
Application number: CN201710837721.1A
Authority: CN
Inventors: 王俊龙; 包爱娟; 杨文�; 赵亚丽; 赵倩; 梁俊义; 孔维东; 姚健; 张继
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Northwest Normal University
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107629134A

Abstract

本发明公开了一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，属天然产物技术领域。本发明在制备能溶解多糖的酸性室温离子液体的同时，作为溶剂和催化剂，在温和条件下高效合成了高硒含量的硒化沙蒿多糖，硒含量达7688.9~10372.4μg/g，反应过程不会对多糖产生降解。本发明所用试剂环保、反应过程简单，有效缩短了反应所需时间，无需使用有毒的含硒中间体。

Description

以离子液体为溶剂和催化剂合成硒化沙蒿多糖的方法

技术领域

本发明属天然产物技术领域，涉及一种以离子液体同时作为溶剂和催化剂，合成高硒含量多糖衍生物的方法。

背景技术

硒（Selenium）是人体必需的微量营养元素，由于其在谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）中的重要作用以及对重金属的拮抗能力，近年来硒在有效提高机体免疫机能、抗氧化、防癌和抗癌等方面受到了持续关注。硒多糖的来源有三种：天然富硒生物提取、富硒生物转化和人工合成，所得硒多糖的硒含量通常依次升高。化学法制备硒多糖是目前报道较多的，其优势在于硒含量可控和相对便捷，主要有两种合成方法：一是单质硒、亚硒酸或亚硒酸钠在酸性条件下（或Ba²⁺催化）通过亚硒酸（或硒酸）和多糖羟基的酯化反应制备；二是合成化学性质活泼的硒化试剂进行多糖的硒化修饰。

专利CN 102532339.A公开了一种党参多糖硒化的方法及其应用，将亚硒酸加入到党参多糖的水溶液中，采用氯化钡催化，能将衍生物硒含量提高至500~5000 μg/g；专利CN107011458 A公开了一种使用亚硒酸钠制备硒化莲藕多糖的方法，在36~48h的反应时间下，所得产物硒含量范围为1170~1570 μg/g；专利CN 102850465 A公开了羊栖菜硒多糖的制备方法，以硝酸/亚硒酸为反应体系，反应6~10小时，得到硒含量为3.436 mg/g的多糖衍生物；专利CN 102936291 A公开了硒化甘露糖醛酸的制备方法，以磺化甘露糖醛酸为中间体，在硝酸/亚硒酸/氯化钡为反应中得到了硒含量为437.25 μg/g的硒多糖。对于有机法制备硒多糖，专利CN 103739729 A公开了制备板蓝根硒多糖的方法，所用硒化试剂包括三苯基硒化膦或二氯氧硒，产物能增强动物机体的免疫能力。专利CN 102653566 A公开了有机法制备硒化黄芪多糖的方法，以氯化亚硒酰和丁二酸为反应试剂，硒化反应时间为15~18小时，衍生物硒含量范围是18340~24864 μg/g。此外，也有专利CN 106036394 A公开利用脉冲电场生产淀粉硒多糖、富硒预糊化营养米糊的方法。

对于亚硒酸（钠）反应体系，以上专利和现有文献报道的硒多糖，其硒含量基于底物多糖结构而有很大差异，但普遍较低，且反应时间长、能耗高，酸性的反应介质还会造成多糖的降解，造成硒多糖产物结构的不可控，这对于硒多糖构效关系及相关补硒产品的开发是不利的。而有机法制备硒多糖则普遍存在含硒中间体制备复杂且毒性大、反应时间长、副反应多等缺点，不利于大规模推广和开发。因此，需要开发高效、温和的多糖硒化体系，以克服现有多糖硒化修饰中的难点和不足。

发明内容

近年来，室温离子液体在多糖溶解及衍生化中展现了较好的前景，本发明的目的在于提供一种以酸性离子液体为溶剂和催化剂合成硒化沙蒿多糖的方法。

硒化沙蒿多糖的合成，包括：

1. [Cl]基酸性离子液体的制备

将浓盐酸在-10℃~0℃下以30~50滴/min的速度滴加到咪唑或甲基咪唑中，滴加结束后，在室温25±5℃下800~1000 rpm搅拌反应8~12 h，反应完毕后，在室温下用乙酸乙酯洗涤5~8遍，收集下层粘稠液体，在60~80℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥10~14 h，得[Cl]基室温酸性离子液体。

其中：盐酸与咪唑或甲基咪唑的摩尔比为1:1，乙酸乙酯和离子液体的体积比为0.8:1~1.5:1。

2. 沙蒿多糖的溶解

将沙蒿多糖加入步骤1中制备好的酸性离子液体中，在40~60℃下、800~1000 rpm搅拌6~8 h，使多糖完全溶解，为沙蒿多糖的离子液体溶液。

上述沙蒿多糖为酸性杂多糖，白色无定形粉末，单糖组成为L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1:3.16:5.86:7.18:3.44，重均分子量为6.963×10⁴g/mol，总糖含量为89.7%。沙蒿多糖与离子液体的质量体积比为5~10 mg/mL。

3. 硒化沙蒿多糖的合成

将亚硒酸加入到步骤2中沙蒿多糖的离子液体溶液中，在N₂保护的条件下，以温度50~60℃、转速为800~1200 rpm，搅拌反应2.5~3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入液体溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析30~40 h，去离子水透析24~36h，透析完毕后袋内物在55~65℃、真空度0.06~0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/40~1/50，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中，无水乙醇含量占浓缩液总体积的70~80%；沉淀物在4000~5000 rpm/min下离心10~15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60~-50℃，真空度2~10 Pa下冷冻干燥40~80 h，得硒化沙蒿多糖。

其中：沙蒿多糖与亚硒酸的摩尔比为1:3。

所得硒化沙蒿多糖为粉红色或深红色无定形粉末，总糖含量范围84.3~89.7%，硒含量7688.9~10372.4 μg/g，重均分子量8.7×10⁴~2.57×10⁵ g/mol，分子量分布1.87~2.69。

二、硒多糖的测试及表征

本发明采用荧光分光光度法，傅里叶变换红外光谱分析及分子量测定对制备的硒化沙蒿多糖的结构进行分析和说明：

1. 硒含量的测定：采用荧光光度法对样品进行硒含量测定

称取干燥的硒化沙蒿多糖待测样品，加入混酸（HNO₃:H₂SO₄:HClO₄=1:1:4），静止过夜后，在135℃中消解10~12小时，将消解液用蒸馏水稀释定容，取8 mL加入0.2 mol/L的EDTA-2Na溶液和0.5 mol/L的盐酸羟胺各4~6 mL，振荡均匀后静置10~15 min，并于暗处加入浓度为0.1%的2,3-二氨基萘溶液4~6 mL，沸水浴5~8 min，取出冷却至室温后，加入环己烷6 mL，充分振荡萃取，取环己烷层在荧光分光度计中测定荧光值：激发波长376 nm，发射波长 520 nm，用工作曲线法计算硒含量。

2. 红外光谱图分析

充分干燥的样品与KBr压片，用Thermo Nicolet is10红外光谱仪在400~4000 cm^-1范围内扫描，扫描次数16次，分辨率4 cm^-1。

图1为沙蒿多糖和本发明实施例1的硒化沙蒿多糖的红外光谱图。图中沙蒿多糖的红外光谱显示其具有多糖的特征峰：3400 cm^-1左右极宽强的吸收峰为多糖羟基的O-H伸缩振动，2930 cm^-1处为C-H键的伸缩振动；与沙蒿多糖的红外光谱对比，硒化沙蒿多糖除了具有多糖的特征吸收峰外，在1153cm^-1处和778 cm^-1处出现新的吸收峰，分别为Se=O的伸缩振动和C-O-Se的弯曲振动，说明沙蒿多糖结构中的部分-OH被亚硒酸基取代，发生了硒化反应。

3. 分子量测定

采用体积排阻色谱-光散射联用仪，对样品分子量进行测定。多角度激光散射仪（multi-angle laser photometer，MALLS；DAWN EOS, Wyatt Technology Co., USA）波长为690 nm。色谱柱（Ultrahydrogel^TM column， Waters，USA）规格7.8 mm ×300 mm。样品用超纯水配制成所需浓度，溶解好的样品用0.45 μm的微孔滤膜过滤，样品进样量为50 μL，流速为0.5 mL/min，色谱柱温度为30℃，超纯水作为流动相，测定硒化沙蒿多糖分子量。

图2为沙蒿多糖和本发明实施例2的硒化沙蒿多糖的体积排阻色谱-光散射联用图。由图中可以看出，沙蒿多糖和硒化沙蒿多糖均为单一组成，沙蒿多糖的重均分子量为6.963×10⁴g/mol。反应后，硒化沙蒿多糖的出峰时间略有提前，分子量增高为8.70×10⁴g/mol，说明本发明以离子液体为溶剂和催化剂不会对多糖链产生降解作用。

本发明的有益效果：

1、本发明以沙蒿多糖为原料，采用[Cl]基酸性离子液体的同时作为溶剂和催化剂，合成高硒含量沙蒿硒多糖，解决了多糖在有机溶剂中溶解困难，及常规硒化反应溶剂不利于酯化反应及硒含量较低等诸多难题。

2、离子液体无毒、环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，无废液排放，有效缩短了反应所需时间，在温和的条件下得到高硒含量的硒化沙蒿多糖；

3、本发明步骤简单、不需要特殊设备，成本低，适合推广应用。

附图说明

图1为沙蒿多糖及实施例1硒化沙蒿多糖的红外光谱图。

图2为沙蒿多糖及实施例2硒化沙蒿多糖的体积排阻色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种硒化沙蒿多糖的合成方法，包括：

（1） [Cl]基酸性离子液体的制备：将30 mL浓盐酸在-10℃下以40滴/min的速度滴加到29.6 g甲基咪唑中，滴加结束后，在室温下1000 rpm搅拌反应8 h，反应完毕后室温下用24 mL乙酸乙酯洗涤7遍，收集下层粘稠液体，在70℃、0.08 MPa下真空干燥14 h得[Cl]基室温酸性离子液体。

（2）沙蒿多糖的溶解：将300 mg沙蒿多糖加入步骤（1）中制备好的30 mL酸性离子液体中，在50℃下、800 rpm搅拌7 h，使多糖完全溶解，为沙蒿多糖的离子液体溶液。

（3）硒化沙蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中30 mL沙蒿多糖的离子液体溶液中，在N₂保护的条件下以温度60℃、转速为1200 rpm，搅拌反应3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入液体溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析40h，去离子水透析24 h，析完毕后袋内物在65℃、真空度0.07 MPa下减压浓缩至原体积的1/40，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中，无水乙醇含量占浓缩液总体积的80%。沉淀物在4500 rpm/min下离心15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60℃，真空度5 Pa下冷冻干燥70 h，得粉红色粉末状硒化沙蒿多糖。

该硒化沙蒿多糖的硒含量为7688.9 μg/g，总糖含量为88.2%，重均分子量为2.57×10⁵ g/mol，分子量分布为1.87。

实施例2

一种硒化沙蒿多糖的合成方法，包括：

（1） [Cl]基酸性离子液体的制备：将50 mL浓盐酸在-5℃下以50滴/min的速度滴加到40.8 g咪唑中，滴加结束后，在室温下800 rpm搅拌反应12 h，反应完毕后室温下用75mL乙酸乙酯洗涤8遍，收集下层粘稠液体，在80℃、0.06 MPa下真空干燥12 h得[Cl]基室温酸性离子液体。

（2）沙蒿多糖的溶解：将300 mg沙蒿多糖加入步骤（1）中制备好的50 mL酸性离子液体中，在40℃下、1000 rpm搅拌6 h，使多糖完全溶解，为沙蒿多糖的离子液体溶液。

（3）硒化沙蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中50 mL沙蒿多糖的离子液体溶液中，在N₂保护的条件下以温度60℃、转速800 rpm搅拌反应3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入液体溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析30 h，去离子水透析36 h，透析完毕后袋内物在55℃、真空度0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/50，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中，无水乙醇含量占浓缩液总体积的70%，沉淀物在4000rpm/min下离心10 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-55℃，真空度10 Pa下冷冻干燥40h，得深红色粉末状硒化沙蒿多糖。

该硒化沙蒿多糖的硒含量为10372.4 μg/g，总糖含量为84.3%，重均分子量为8.70×10⁴ g/mol，分子量分布为2.43。

实施例3

一种硒化沙蒿多糖的合成方法，包括：

（1） [Cl]基酸性离子液体的制备：将60 mL浓盐酸在0℃下以30滴/min的速度滴加到48.9 g咪唑中，滴加结束后，在室温下1000 rpm搅拌反应10 h，反应完毕后室温下用60mL乙酸乙酯洗涤5遍，收集下层粘稠液体，在60℃、0.07 MPa下真空干燥10 h得[Cl]基室温酸性离子液体。

（2）沙蒿多糖的溶解：将300 mg沙蒿多糖加入步骤（1）中制备好的60 mL酸性离子液体中，在50℃下、1000 rpm搅拌8 h，使多糖完全溶解。

（3）硒化沙蒿多糖的合成：将0.75 g亚硒酸加入到步骤（2）中60 mL沙蒿多糖的离子液体溶液中，在N₂保护的条件下以温度50℃、转速1000 rpm搅拌反应2.5 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入液体溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析35h，去离子水透析30 h，透析完毕后袋内物在60℃、真空度0.06 MPa下减压浓缩至原体积的1/50，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中：沉淀物在5000 rpm/min下离心15 min，收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-50℃，真空度2 Pa下冷冻干燥80 h，得深红色粉末状硒化沙蒿多糖。

该硒化沙蒿多糖的硒含量为9178.6 μg/g，总糖含量为89.7%，重均分子量为8.85×10⁴ g/mol，分子量分布为2.69。

比较例

（1）沙多糖甲酰胺溶液的制备：将300 mg沙蒿多糖在40℃、1000 rpm的转速下搅拌6 h溶解于50 mL无水甲酰胺中，得沙蒿多糖的甲酰胺溶液。

（2）硒化沙蒿多糖的合成：在N₂保护的条件下将（1）中圆头蒿多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以60滴/min的速度滴加到0.75 g亚硒酸中，以温度60℃、转速800 rpm搅拌反应3h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析30h，去离子水透析36 h，透析完毕后袋内物在55℃、真空度0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/50，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中：无水乙醇含量占浓缩液总体积的70%，沉淀物在4000 rpm/min下离心10 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-55℃，真空度10 Pa下冷冻干燥40 h，得淡红色粉末状圆头蒿硒多糖。

该沙蒿硒多糖的硒含量为4836 μg/g，总糖含量为85.6%，重均分子量为6.771×10⁴ g/mol，分子量分布为3.615。

该比较例的各参数与实施例2对应，二者的区别是：实施例1采用离子液体作为溶解多糖的溶剂和反应催化剂，硒含量为7688.9 μg/g；而比较例以甲酰胺作为溶剂进行反应，硒含量为为4836 μg/g。通过实施例1和比较例硒含量对比结果可以看出，实施例1硒含量之所以比比较例高，是因为酸性离子液体能活化亚硒酸，增强亚硒酸的酯化能力，大幅度提高产物的硒含量。同时，以酸性离子液体作为反应溶剂，破坏了多糖分子内、分子间的氢键，促进硒化反应的顺利进行。由于该反应体系为无水环境，有效避免了质子催化下多糖链的水解。因此，本发明克服了现有多糖硒化合成方法中的缺点和不足，具有简便、高效的特点。

Claims

1.一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，包括以下工艺步骤：

（1）[Cl]基酸性离子液体的制备：将浓盐酸在-10℃~0℃下以30~50滴/min的速度滴加到咪唑或甲基咪唑中，滴加结束后，在室温下800~1000 rpm搅拌反应8~12 h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤5~8遍，收集下层粘稠液体，在60~80℃、0.06~0.08 MPa下真空干燥10~14 h得[Cl]基酸性室温离子液体；

（2）沙蒿多糖的溶解：将沙蒿多糖加入步骤（1）中制备好的离子液体中，在40~60℃下、800~1000 rpm搅拌6~8 h，使多糖完全溶解，为沙蒿多糖的离子液体溶液；

（3）硒化沙蒿多糖的合成：将亚硒酸加入到步骤（2）中沙蒿多糖的离子液体溶液中，在N₂保护的条件下，以温度50~60℃、转速为800~1200 rpm，搅拌反应2.5~3 h，待反应完毕后，立刻用注射器将丙酮在隔绝空气的条件下注入液体溶液并反复洗涤，直至丙酮层遇到抗坏血酸不显红色为止，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析30~40 h，去离子水透析24~36 h，透析完毕后袋内物在55~65℃、真空度0.06~0.08 MPa下减压浓缩至原体积的1/40~1/50，在浓缩液中加入无水乙醇沉淀，其中，无水乙醇含量占浓缩液总体积的70~80%；沉淀物在4000~5000 rpm下，离心10~15 min收集下层沉淀物，最后，沉淀物在-60~-50℃，真空度2~10 Pa下冷冻干燥40~80 h，得硒化沙蒿多糖。

2.如权利要求1所述一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述浓盐酸与咪唑或甲基咪唑的摩尔比为1:1。

3.如权利要求1所述一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，其特征在于：步骤（1）中，乙酸乙酯和离子液体的体积比为0.8:1~1.5:1。

4.如权利要求1所述一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述沙蒿多糖为酸性杂多糖，白色无定形粉末，单糖组成为L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1:3.16:5.86:7.18:3.44，重均分子量为6.963×10⁴g/mol，总糖含量为89.7%。

5.如权利要求1所述一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述沙蒿多糖与离子液体的质量体积比为5~10 mg/mL。

6.如权利要求1所述一种离子液体为溶剂和催化剂制备沙蒿硒多糖的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述沙蒿多糖与亚硒酸的摩尔比为1:3。