CN103709268A - 一种以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对甲壳素进行磷酸化修饰的方法，包括以下步骤：1）Eaton试剂的配制：在干燥状态下称取五氧化二磷加入烧瓶中，不断搅拌下与甲基磺酸混合溶解1-2小时；2）反应：将干燥后的甲壳素粉碎，取通过筛孔的组份，在氮气的保护下，将甲壳素干粉溶解到Eaton试剂中，搅拌反应；3）分离：向反应体系添加乙醚沉淀、离心后，洗涤沉淀；然后用去离子水溶解沉淀；浊液透析后真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得产物。本发明具有以下的优点：1、方法简单易操作、产率高、环境友好，适用于工业化生产。2、所得产物取代度高。3、本发明对甲壳素进行磷酸化修饰，溶解性增强后有利于生物体吸收，表现出新的生理生化活性。

Description

一种以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种对甲壳素进行磷酸化修饰使其在水中可溶的制备方法。

背景技术

甲壳素（Chitin）又名几丁质、聚乙酰氨基葡萄糖，化学名为(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是以β-1,4糖苷键相连的线性生物高分子，可从甲壳动物外壳和真菌细胞壁中提取，是仅次于纤维素的第二大可再生天然生物高分子。但甲壳素由于分子内及分子间的氢键作用难溶于普通溶剂，这很大程度上限制了甲壳素的进一步推广应用。为了增加其水溶性，通常对甲壳素脱乙酰制备得到壳聚糖。壳聚糖在酸性条件下才能溶解，限制了其应用范围。且在脱乙酰的过程中，残余的浓碱会对环境产生较大的污染。

磷是人体的重要元素成分，在众多的生命活动中具有极其重要的作用。目前，生命过程中还没有发现不含磷的生命体。磷之所以是生命过程中的重要元素，是因为绝大多数酶的催化反应都是以它们的磷酸化和去磷酸化来调控的。生物体所需的基本储存单元ATP参与了生命化学过程中的几乎每一个反应，新陈代谢过程常以含磷衍生物为中间体而进行。生物体内的遗传物质DNA和RNA的核苷之间是通过磷酸二酯键连接的。甲壳素是一种新兴的生物功能材料，其已经应用于骨质替代、组织工程以及基因和药物载体等与生命科学及医学息息相关的领域。近年来，研究人员逐步意识到将磷结合到甲壳素结构上所形成的衍生物在生命科学以及医学方面的某些特殊的应用价值。这也可能是磷酸化改性方法区别于其它改性修饰方法的独到之处。尤其是磷酸化后的水溶性甲壳素在骨整合以及组织工程等方面的应用已取得了突破性的进展，这是其它水溶性甲壳素衍生物所望尘莫及的。

我国每年新增大量的虾蟹壳等废弃物，不仅严重污染了环境，同时也造成了极大的资源浪费。甲壳素与人体的组织器官及细胞有良好的生物相容性。但是由于甲壳素在多数溶剂中不溶以及其他一些结构方面的因素仍然限制着其广泛应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种操作简单、产率高、环境污染小、应用广泛的甲壳素磷酸化衍生物的制备方法。在反应中，甲基磺酸不仅是甲壳素的良好溶剂，也是该磷酸化反应的有效催化剂。该方法不仅效率高，而且还能得到取代度较高的产物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）Eaton试剂的配制：甲基磺酸置于烧瓶中；在干燥状态下称取五氧化二磷加入烧瓶中，不断搅拌下与甲基磺酸混合溶解1-2小时；甲基磺酸与五氧化二磷的质量比为8:1-14:1；

2）反应：将干燥后的甲壳素粉碎，过60-100目筛，取通过筛孔的组份，在氮气的保护下，将甲壳素干粉溶解到Eaton试剂中，0-5℃持续搅拌反应；甲壳素干粉与Eaton试剂的质量比为1:6-1:18;

3）分离：向反应体系添加乙醚沉淀、离心后，再依次用丙酮和甲醇洗涤沉淀；然后用去离子水溶解沉淀；浊液透析后真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得产物。

按上述方案，步骤1）所述烧瓶为带氯化钙干燥管的烧瓶。

按上述方案，步骤2）在氮气的保护下，持续搅拌反应时间为2-3小时。

按上述方案，步骤2）反应过程中可以通过在反应体系中添加五氧化二磷来提高最终产物的取代度，五氧化二磷添加质量为甲壳素干粉的0.2-0.6倍。

按上述方案，步骤3）透析过程采用透析袋的截留分子量为3500-8000。

磷酸化甲壳素取代度的测定：使用硫酸-硝酸混合物消化破坏有机物质，并将磷酸盐转化为正磷酸盐。在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成的磷钼酸铵通过还原剂作用，形成“钼蓝”，用分光光度计测定蓝色在825nm波长的吸光值。从标准曲线上读取相应磷含量。磷酸根的取代度（Degree of substitution,DS）定义为每个乙酰氨基葡萄糖单元中所含的磷酸根的数目，计算公式如下：

$\mathrm{DS}=\frac{203\·\left[P\right]}{31-80\·\left[P\right]}$

式中       DS—样品的取代度          [P]—样品的磷含量

           203—甲壳素单元的分子量   31—磷原子的分子量

           80—一个磷酸基团取代后分子量的增加量

本发明涉及的主要化学反应式如下：

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

1、为了使甲壳素溶于水，通常需用强碱脱乙酰，再采用酶或酸降解壳聚糖，得到低聚合度的壳寡糖。从甲壳素到壳寡糖，工艺路线长，副产物多，对环境的污染大，且得到的产物性质不稳定。磷酸化甲壳素可以一步制备，方法简单易操作、产率高、环境友好，适用于工业化生产。

2、所得产物取代度高。修饰基团磷酸根具有一定的缓冲能力，使产物在很宽的pH值范围内保持溶解状态。同时磷酸根也具有很强的螯合能力。

3、本发明对甲壳素进行磷酸化修饰，溶解性增强后有利于生物体吸收，表现出新的生理生化活性。应用范围有金属螯合、生物医药、药物载体、骨质修复组织工程材料、抑菌剂等。

附图说明

图1为甲壳素和实施例1所得磷酸化甲壳素的红外光谱对比图，其中（a）为甲壳素的红外光谱图，（b）为实施例1所得磷酸化甲壳素的红外光谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明。

实施例1：

Eaton试剂的配制：甲基磺酸置于烧瓶中；在干燥状态下称取五氧化二磷加入烧瓶中，不断搅拌下与甲基磺酸混合溶解1.5小时；甲基磺酸与五氧化二磷的质量比为10:1；

反应：将干燥后的甲壳素粉碎，过100目筛，取通过筛孔的2g甲壳素与14ml Eaton试剂(14g)混合均匀，在氮气的保护下，2℃持续搅拌反应2小时。添加70ml乙醚沉淀、离心。再依次用42ml丙酮、42ml甲醇洗涤。然后用50ml去离子水溶解沉淀。浊液经截留分子量为3500透析袋透析后真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得产物。测得磷酸化甲壳素取代度为0.71。

图1（a）为甲壳素的红外光谱图，图1（b）为实施例1所得磷酸化甲壳素的红外光谱图。对甲壳素而言，3500-3400cm-1是V_OH（羟基—OH的伸缩振动）吸收带，3265cm-1是V_NH（氨基—NH的伸缩振动）吸收带；2890cm-1是V_CH2（糖环上次甲基—CH₂—的对称伸缩振动）吸收带；1661cm-1是V_C=O（酰胺键中羰基）吸收带，1558cm-1是δ_NH（酰胺键中氨基）吸收带。甲壳素磷酸化后在1310cm-1处的吸收峰消失了。在524cm-1出现强峰，这是P-O键的特征弯曲振动吸收带。甲壳素和磷酸化甲壳素的红外光谱分析表明磷酸基团已与甲壳素的乙酰氨基葡萄糖环结合。

本发明所得的磷酸化甲壳素能溶解在pH值大于7的水中，在pH值小于4时会沉淀析出。在胃部的酸性环境中，磷酸化甲壳素制备的胶囊外壳能保护内部的药物成分不会受到酸液的侵蚀。在小肠偏碱的环境中，胶囊外壳溶解，药物成分释放出来。

实施例2：

Eaton试剂的配制：甲基磺酸置于烧瓶中；在干燥状态下称取五氧化二磷加入烧瓶中，不断搅拌下与甲基磺酸混合溶解1.5小时；甲基磺酸与五氧化二磷的质量比为10:1；

反应：将干燥后的甲壳素粉碎，过100目筛，取通过筛孔的3g甲壳素与20ml Eaton试剂(20g)混合均匀，在氮气的保护下，4℃持续搅拌，缓慢添加五氧化二磷1.5g，反应3小时。添加100ml乙醚沉淀、离心。再依次用60ml丙酮、60ml甲醇洗涤。再用80ml去离子水溶解沉淀。浊液经截留分子量为6000透析袋透析后真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得产物。测得磷酸化甲壳素取代度为1.15。

Claims (6)

1.一种以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）Eaton试剂的配制：甲基磺酸置于烧瓶中；在干燥状态下称取五氧化二磷加入烧瓶中，不断搅拌下与甲基磺酸混合溶解1-2小时；甲基磺酸与五氧化二磷的质量比为8:1-14:1；

2）反应：将干燥后的甲壳素粉碎，过60-100目筛，取通过筛孔的组份，在氮气的保护下，将甲壳素干粉溶解到Eaton试剂中，0-5℃持续搅拌反应；甲壳素干粉与Eaton试剂的质量比为1:6-1:18;

3）分离：向反应体系添加乙醚沉淀、离心后，再依次用丙酮和甲醇洗涤沉淀；然后用去离子水溶解沉淀；浊液透析后真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得产物。

2.按照权利要求1所述的以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于：步骤1）所述烧瓶为带氯化钙干燥管的烧瓶。

3.按照权利要求1所述的以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于：步骤2）在氮气的保护下，持续搅拌反应时间为2-3小时。

4.按照权利要求1所述的以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于：步骤2）反应过程中可以通过在反应体系中添加五氧化二磷来提高最终产物的取代度，五氧化二磷添加质量为甲壳素干粉的0.2-0.6倍。

5.按照权利要求1所述的以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于：步骤3）透析过程采用透析袋的截留分子量为3500-8000。

6.按照权利要求1所述的以甲基磺酸为溶剂合成磷酸化甲壳素的方法，其特征在于：采用磷钼蓝分光光度法测定产物的磷含量，换算成磷酸化甲壳素的取代度。

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