CN107582545A - 绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由细菌引起的相关疾病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供绵马酚及其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的葡萄球菌、链球菌或肠球菌的细菌引起的疾病的药物或饲料添加剂或食品中的用途，它们分别为式(I)和(II)所示。本发明还提供用于预防和/或治疗由敏感或耐药的葡萄球菌、链球菌或肠球菌的细菌引起的疾病的药物或饲料添加剂或食品，其包含有效量的式(I)所示的绵马酚或和式(II)所示的衍生物。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体涉及绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由细菌引起的相关疾病的药物中的用途。
背景技术
千百年来，细菌感染致人死亡在人类疾病致死中一直排名首位，人们对细菌感染束手无策。1928年青霉素的发现被认为是上个世纪医疗行业最伟大的发现，它使人类的平均寿命至少延长了10岁。随着青霉素的发现，四环素、大环内酯以及喹诺酮类抗生素相继被开发出来。近几十年，抗生素在防治细菌性感染方面发挥了不可替代的作用。然而，由于长期大量应用抗生素，造成了细菌耐药性问题越来越严重，细菌耐药性的产生和传播速度之快、耐药率之高、耐药谱之广，已经引起了全世界的广泛关注[1-3]。然而，更令人棘手的是由耐药病原菌引起的宿主感染，这给临床抗感染治疗带来了新的挑战。因此寻找高效、安全的新型抗菌药物成为当前药物研发的热点之一。
近年来，随着耐药菌株的增加、抗生素的滥用，天然抗菌药物已经成为研究的热点。从天然产物中寻找具有显著抗菌效果的化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物具有重要价值。
发明内容
本发明的一个目的是经过筛选候补化合物而提供一种新型的的预防和/或治疗由敏感的或耐药的细菌引起的相关疾病的化合物或药物，安全无耐药性；本发明的另一个目的是提供该种化合物或药物用于预防和/或治疗由耐药菌引起的相关疾病的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的一种由敏感的或耐药的细菌引起的相关疾病的化合物或药物是绵马酚或绵马酚衍生物，其分别由下式(I)或(II)定义：
在本发明中，术语“绵马酚”或“绵马酚化合物”通常包括其单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物或其药学上可接受的盐和水合物。
在式(I)和式(II)中，R1选自-COCH2CH2CH3、-OCOCH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3；R2～R4选在氢、烃基；R5选自氢、烃基、卤素、-SO3H、-CH2OH、-COR，其中R为烃基；R6选自烃基、-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2CN、-CH2COOH、-CH2CONH2、-CH2COR，其中R为烃基。
本发明涉及所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
具体地，可用于本发明的绵马酚衍生物如下式(III)-式(IX)所示：
在第二方面，本发明提供所述绵马酚的制备方法，包括下述步骤：取干燥植物香鳞毛蕨，粉碎，用70％乙醇浸泡提取3L×3次，提取液合并减压蒸干得浸膏；浸膏用纯乙酸乙酯溶液进行萃取，1L×3次，用200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯100∶0至0∶100(V/V)梯度洗脱，硅胶薄层色谱检测；合并石油醚-乙酸乙酯30∶1(V/V)洗脱部分，蒸干得橙黄色蜡状固体，重新用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚，得黄色固体；石油醚重结晶得到黄色晶体；经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为纯化合物，通过波谱数据鉴定得化合物绵马酚。
绵马酚及其衍生物能够抑制的细菌包括，但不限于，敏感以及耐药的葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
一般地，本发明所述的绵马酚及其衍生物的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
在第三方面，本发明提供绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的药物中的用途，其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供一种用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的药物，其包含有效量的绵马酚或其衍生物。其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明提供绵马酚或其衍生物在制备饲料添加剂中的应用。所述饲料添加剂中包含有效量的绵马酚或其衍生物，能够有效地预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病。其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供一种预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的饲料添加剂，其包含效量的绵马酚或其衍生物或它们的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物或其药学上可接受的盐和水合物。其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供绵马酚或绵马酚衍生物在制备人或动物食品中的应用。所述食品包含有效量的绵马酚或其衍生物，能够有效地预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病。其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供一种预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的食品，所述食品包含有效量的绵马酚或其衍生物，或它们的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物或其药学上可接受的盐和水合物。其中所述绵马酚或其衍生物分别为式(I)和(II)所示。优选地，所述绵马酚衍生物如式(III)-式(IX)所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
除非另外说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。
在实施本发明的过程中，使用了动物学、药物有机化学、细胞生物学、免疫学、微生物学等很多传统技术。这些技术是熟知的。
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1.从香鳞毛蕨中提取绵马酚
绵马酚为式(I)所示的化合物。本发明人从干燥植物香鳞毛蕨提取得到。提取方法包括下述步骤：取干燥植物香鳞毛蕨，粉碎，用70％乙醇浸泡提取3L×3次，提取液合并减压蒸干得浸膏；浸膏用纯乙酸乙酯溶液进行萃取，1L×3次，用200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯100∶0至0∶100(V/V)梯度洗脱，硅胶薄层色谱检测；合并石油醚-乙酸乙酯30∶1(V/V)洗脱部分，蒸干得橙黄色蜡状固体，重新用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚，得黄色固体；石油醚重结晶得到黄色晶体；经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为纯化合物，通过波谱数据鉴定得化合物绵马酚。
实施例2.制备2-甲基-6-正丁基-3-甲氧基间苯二酚(JMF-1)
在配备回流装置和机械搅拌的干燥、干净的100ml四口反应瓶中，加入二乙二醇二甲醚(50mL)，降温至0℃左右，依次加入氢氧化钾(1.12g，0.02mol))，绵马酚(2.24g，0.01mol)，80％水合肼(1.35g，约0.02mol)，加热至回流，回流反应1小时后，改回流为蒸馏，加热至内温升至166～170℃左右，当馏温达到152～160℃时，撤掉蒸馏装置，继续加热回流2小时后，冷至室温，将反应液倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得浅黄褐色固体1.81g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得脱氧绵马酚1.10g，收率为52.38％。脱氧绵马酚如式(III)所示，化学名称为2-甲基-6-正丁基-3-甲氧基间苯二酚(JMF-1)。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.96(3H，t，-CH2CH3 )，1.44-1.63(4H，m，-CH 2CH 2CH3)2.33(3H，s，Ar-CH 3)，2.51(2H，m，-Ar-CH 2-C3H7)，3.73(3H，s，-OCH 3)，5.72(1H，s，Ar-H)。
实施例3.制备1-O-丁酰-3-甲基-4-甲氧基-1，2，6-苯三酚(JMF-2)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，乙醇(50mL)，过氧乙酸(2.2g，0.03mol)，加热回流12小时，TLC检测显示反应完全，在室温下，将反应液中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄色固体2.0g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得1-O-丁酰-3-甲基-4-甲氧基-1，2，6-苯三酚(式(IV))1.23g，收率为51.25％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(3H，t，-CH2CH 3)，1.57(2H，m，-CH 2CH3)，2.26-2.37(6H，m，Ar-CH 3；-OCO-CH 2-)，3.73(3H，s，-OCH 3)，5.72(1H，s，Ar-H)。
实施例4.制备5-叔丁基绵马酚(JMF-3)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，氯仿(50mL)，浓硫酸(1mL)，叔丁醇(0.75g，0.01mol)室温下搅拌1小时，减压浓缩除去氯仿，将浓缩液溶于20mL乙醇中，将所得液体中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体2.6g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得5-叔丁基绵马酚(式(V))0.25g，收率为12.5％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(3H，t，-CH2CH 3)，1.33(9H，s，Ar-C(CH 3)3)1.47(2H，d，-CH 2CH3)，2.34(3H，s，Ar-CH 3)，2.61(2H，m，-CO-CH 2-C2H5)，3.73(3H，s，-OCH 3)。
实施例5.制备5-甲基-1，3-二丁酰基间苯三酚(JMF-4)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，氯仿(50mL)，正丁腈酸(1.0g，0.014mol)，ZnCl2-HCl溶液(5mL)，加热回流2小时，加入100水，在室温下，搅拌24h，将反应液中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体2.4g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得2-甲基-3，6-二丁酰基间苯三酚(式(VI))1.85g，收率为66.07％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(6H，t，-CH2CH 3)，1.47(4H，m，-CH 2CH3)，2.34(3H，s，Ar-CH 3)，2.61(4H，m，-CO-CH 2-C2H5)。
实施例6.制备5-丁酰绵马酚(JMF-5)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，氯仿(50mL)，正丁腈(1.0g，0.014mol)，ZnCl2-HCl溶液(5mL)，加热回流2小时，加入100水，在室温下，搅拌24h，将反应液中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体2.4g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得3-丁酰绵马酚(式(VII))0.15g，收率为5.08％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(6H，m，-CH2CH 3)，1.47-1.53(4H，m，-CH 2CH3)，2.34(3H，s，Ar-CH 3)，2.52-2.63(4H，m，-CO-CH 2-C2H5)，3.75(3H，s，-OCH 3)。
实施例7.制备3-溴甲基绵马酚(JMF-6)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，氯仿(50mL)，N-溴代丁二酰亚胺(1.78g，0.01mol)加热回流4小时，减压浓缩除去氯仿，将浓缩液溶于20mL乙醇中，将所得液体中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体3.1g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得3-溴甲基绵马酚(式(VIII))1.95g，收率为64.36％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(3H，t，-CH2CH 3)，1.47(2H，m，-CH 2CH3)，2.61(2H，m，-CO-CH 2-C2H5)，3.73(3H，s，-OCH 3)，4.74(2H，s，Ar-CH 2Br)，5.72(1H，s，Ar-H)。
实施例8.制备2，5-二乙氧基绵马酚(JMF-7)
在250mL三颈瓶中依次加入绵马酚(2.24g，0.01mol)，乙醇(50mL)，溴乙烷(2.2g，0.02mol)，氢氧化钾(1g)，加热回流12小时，TLC检测显示反应完全，在室温下，将反应液中倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄色固体2.0g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得2，5-二乙氧基绵马酚(式(IX))1.44g，收率为51.43％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.98(3H，t，-CH2CH 3)，1.34(6H，t，-O-CH2CH 3)，1.57(2H，m，-CH 2CH3)，2.61(2H，m，-CO-CH 2-C2H5)，3.73(3H，s，-OCH 3)，3.92(4H，m，-O-CH 2CH3)5.79(1H，s，Ar-H)。
实施例9.绵马酚的抗葡萄球菌活性
药品与试剂：
Mueller-Hinton培养基(缩写为MH培养基，牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中)、绵马酚、苯唑西林、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
溶血性葡萄球菌：SH2017；ZC240-1；SH322-1；ZC117(均为临床分离敏感株)
小牛葡萄球菌：SH134；MH121；MH313-1(均为临床分离敏感株)
表皮葡萄球菌：MH118-1；SH2032-2；ZC219-1；SH2025-3(均为临床分离敏感株)
金黄色葡萄球菌：ATCC29213(标准株)；SH118-2(临床分离株，耐甲氧西林)；SH121(临床分离株，耐甲氧西林)；SH324-1(临床分离敏感株)
产色葡萄球菌：SH315-1；SH329-2；SH2014-2(均为临床分离敏感株)
琥珀葡萄球菌：MH313-1；MH324-1；MH309-4(均为临床分离敏感株)
上述菌株除ATCC29213购自美国ATCC菌株库外，其余均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得，目前保存在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，如果公众需要，申请人承诺从申请日起二十年内向公众发放该分离株。
实验方法：
培养基的配制
取牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
葡萄球菌的培养
在无菌室内，将葡萄球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到己融化又冷却至50℃左右的MH培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1∶1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抗菌实验
将待测药品(即，绵马酚)和对照药品(即，苯唑西林，作为阳性对照)分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品以一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下赋育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得绵马酚针对葡萄球菌的平均MIC见表1所示。
表1.绵马酚对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
结果表明：绵马酚对葡萄球菌有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照苯唑西林大致相当。
实施例10.绵马酚的抗肠球菌活性
药品与试剂：
Mueller-Hinton培养基(缩写为MH培养基，牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中)、绵马酚、氟苯尼考、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
肠球菌：MH223-1；SH112；SH257-1(均为临床分离敏感株)
粪肠球菌：ATCC29212(标准株)；MH145-1；MH133-1；MH216-1(均为临床分离敏感株)
屎肠球菌：MH249-1；MH272-1；SH161-1；ZC231-1(均为临床分离敏感株)
溶血性肠球菌：MH244-1；MH144-1；MH134-1；MH157(均为临床分离敏感株)
假鸟肠球菌：ZC235-1；ZC183-1；ZC318-1(均为临床分离敏感株)
解糖肠球菌：MH286-1；SH199-1；SH259-1(均为临床分离敏感株)
上述菌株除ATCC29212购自美国ATCC菌株库外，其余均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得，目前保存在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，如果公众需要，申请人承诺从申请日起二十年内向公众发放该分离株。
培养基的配制
取牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
肠球菌的培养
在无菌室内，将肠球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到己融化又冷却至50℃左右的MH培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1∶1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抗菌实验
将待测药品(即，绵马酚)和对照药品(即，氟苯尼考，作为阳性对照)分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品以一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下赋育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得的绵马酚对肠球菌的平均MIC见表2所示。
表2.绵马酚对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
结果表明：绵马酚对肠球杆菌有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照氟苯尼考大致相当。
实施例11.绵马酚抑制链球菌活性实验
药品与试剂：
THB Medium培养基(缩写为THB培养基，牛肉粉10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖2g，碳酸氢钠2g，氯化钠2g，磷酸氢二钠0.4g，加入1000mL蒸馏水中)、绵马酚、氟苯尼考、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
无乳链球菌：MH203-1；MH319-1；MH328-1；MH311-1(均为临床分离敏感株)
停乳链球菌：ZC224-1；MH128-1；ZC326-1(均为临床分离敏感株)
化脓链球菌：MH156-1；SH209；SH113；MH221-2(均为临床分离敏感株)
肺炎链球菌：MH112-2；SH116；SH205(均为临床分离敏感株)
猪链球菌：MH214-1；SH214-1；ZC312-1(均为临床分离敏感株)
乙型溶血性链球菌：SH322-1；SH264-1；MH311-1(均为临床分离敏感株)
上述菌株均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得。
培养基的配制
牛肉粉10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖2g，碳酸氢钠2g，氯化钠2g，磷酸氢二钠0.4g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
链球菌的培养
在无菌室内，将肠球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到己融化又冷却至50℃左右的THB培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1∶1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抑菌实验
将待测药品(即，绵马酚)和对照药品(即，氟苯尼考)分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品以一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下赋育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得平均MIC见表1所示
表3.绵马酚抑制链球菌的最小抑菌浓度(μg/mL)
结果表明：绵马酚对链球杆菌有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照大致相当。
实施例12.检测绵马酚衍生物的抑菌活性
以葡萄球菌、链球菌、肠球菌为受试菌株，按照实施例9-11的检测方法，检测并对比绵马酚及部分绵马酚衍生物(JMF-1、JMF-2、JMF-3、JMF-4、JMF-5、JMF-6、JMF-7)的最小抑制浓度(MIC)，结果见表4-表24。
表4.JMF-1对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表5.JMF-1对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表6.JMF-1对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表7.JMF-2对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表8.JMF-2对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表9.JMF-2对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表10.JMF-3对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表11.JMF-3对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表12.JMF-3对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表13.JMF-4对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表14.JMF-4对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表15.JMF-4对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表16.JMF-5对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表17.JMF-5对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表18.JMF-5对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表19.JMF-6对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表20.JMF-6对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表21.JMF-6对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表22.JMF-7对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表23.JMF-7对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表24.JMF-7对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表4-24所示的实验结果表明，绵马酚衍生物(即JMF-1、JMF-2、JMF-3、JMF-4、JMF-5、JMF-6和JMF-7)同样具有显著的抗葡萄球菌、肠球菌和链球菌活性，绵马酚衍生物JMF-2和JMF-7的抑菌活性与绵马酚相近，绵马酚衍生物JMF-1、JMF-3、JMF-4、JMF-5、JMF-6的抑菌活性优于绵马酚。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (9)
1.绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的药物中的用途，其中所述绵马酚或其衍生物分别为下式(I)和(II)所示，并且所述绵马酚或其衍生物包括式(I)和(II)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，
在式(II)中，R1选自-COCH2CH2CH3、-OCOCH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3；R2～R4选在氢、烃基；R5选自氢、烃基、卤素、-SO3H、-CH2OH、-COR，其中R为烃基；R6选自烃基、-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2CN、-CH2COOH、-CH2CONH2、-CH2COR，其中R为烃基。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
4.绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的饲料添加剂中的用途，其中所述绵马酚为式(I)所示，所述衍生物为式(II)所示，并且所述绵马酚或其衍生物包括式(I)和(II)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，其中，在式(II)中，R1选自-COCH2CH2CH3、-OCOCH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3；R2～R4选在氢、烃基；R5选自氢、烃基、卤素、-SO3H、-CH2OH、-COR，其中R为烃基；R6选自烃基、-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2CN、-CH2COOH、-CH2CONH2、-CH2COR，其中R为烃基。
5.绵马酚或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的食品中的用途，其中所述绵马酚为式(I)所示，所述衍生物为式(II)所示，并且所述绵马酚或其衍生物包括式(I)和(II)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，其中，在式(II)中，R1选自-COCH2CH2CH3、-OCOCH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3；R2～R4选在氢、烃基；R5选自氢、烃基、卤素、-SO3H、-CH2OH、-COR，其中R为烃基；R6选自烃基、-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2CN、-CH2COOH、-CH2CONH2、-CH2COR，其中R为烃基。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
7.根据权利要求1和4-5中任一项所述的用途，其中所述细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
8.根据权利要求1和4-5中任一项所述的用途，所述衍生物为式(III)-式(IX)所示的化合物中的任一种：
9.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
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