CN102464578A

CN102464578A - 绵马酚类化合物及其在制备抗耐药菌药物中的用途

Info

Publication number: CN102464578A
Application number: CN2010105441638A
Authority: CN
Inventors: 穆青; 王玮; 曾祎含; 西蒙.吉本斯; 卡迪者奥斯曼
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-05-23

Abstract

本发明属于药学领域，涉及绵马酚类化合物及其抑制多药耐药金黄葡萄球菌活性的用途。本发明从金丝桃科植物金丝桃中提取分离到绵马酚类具有抗耐药菌活性的化合物,它们的结构鉴定为式I所示化合物aspidinolC和D，本发明所述的化合物aspidinolC和D，经抑菌实验表明，对于六种不同机制的耐药菌株都有一定的抑制作用。其中对具有耐氟喹诺酮类外泵蛋白NorA的金葡菌株SA-1199B的活性均强于对照药物诺氟沙星，本发明所述的化合物可用于制备抗菌药物制剂。

Description

绵马酚类化合物及其在制备抗耐药菌药物中的用途

技术领域

本发明属于药学领域，涉及绵马酚类化合物及其在制备抗耐药菌药物中的用途，尤其是抑制多药耐药金葡菌活性的用途。

背景技术

细菌耐药性一直是困扰临床抗感染治疗的一大棘手难题。其中，多药耐药金葡菌 (Multidrug-resistant Staphylococcus aureus) 已经成为近年来医院内一种常见严重的传染病菌，除对所有内酰胺类抗生素具有耐药性外，它对大环内酯、氟喏喹酮、四环素等类型的抗生素也都已产生了耐药性。目前所应用的最强力的抗生素万古霉素 (vancomycin)，其耐药菌株 2002 年也已经在美国出现。抗耐药金葡菌的唑啉酮类药物Linezoid (Zyvox^TM) 以及链阳菌素类药物quinupristin/dalfostin合剂2001 年投放市场，一年内就出现了 Linezoid 耐药型菌株。我国近年来由于抗生素广泛的使用，甚至滥用，病菌耐药形势也越来越紧迫。在通过限制滥用抗生素以减缓耐药菌株增长速度的同时，必须研究新类型、新机制的抗多药耐药金葡菌的药物。

现有技术公开了细菌获得耐药性有多种机制。其中，减少细胞摄取药物是几种重要的耐药机制之一。它通过以下几种方式实现：细胞膜结构的改变；细胞膜蛋白的变异；药物从细胞中被主动外泵 (efflux pump)。主动外泵作用是目前普遍接受的一种细胞对药物降低通透性的机制。

研究表明，金葡菌产生耐药性有多种机制，除了具有染色体为40 kb的耐药基因 (mec A) 通过编码甲氧西林接合蛋白 (Penicillin Binding Protein, PBP) 产生对 β-内酰胺的耐药性之外，还对大环内酯 (macrolide)、氟喏喹酮 (fluoroqiunolones)、四环素和季铵盐分别通过 MsrA, NorA, TekA和 QacA外泵蛋白形成外泵耐药机制。在这些外泵机制中细菌细胞将普遍使用的大多数类型抗生素药物分子“泵出”，使得药物在细胞内的浓度降低而失效。

耐氟喹诺酮类基因 NorA (42 kDa) 存在于金葡菌 S. aureus 染色体的 SmaI D 片断上，它起先仅被当作是氟喹诺酮类耐药基因，后来表现出对多种抗生素类型的耐药性。NorA 基因在 S. aureus 中过度表达产物 NorA 蛋白位于细胞质膜上作为主要转运子 (transporter)，将包括氟喹诺酮类的多种药物作为基质，或与其他转运子协同作用，将药物分子泵出细胞外，产生细菌的耐药性。因此，选取具有NorA耐药基因的多药耐药金葡菌作为靶标，是寻找新型耐药菌抑制剂的一条重要途径。

已经使用的抗生素药物正在研究和抗菌药物多数来自于微生物发酵产物，或者是不同类型药物分子的衍生化合物。同一类化合物之间结构相近，这些药物分子曾经有效地抑制了细菌的泛滥。但是随着现有类型抗生素药物的普遍使用，细菌对已有类型的化合物分子具有识别功能，在外泵型耐药细菌中，这些类型的抗生素分子做为耐药外排泵底物(Substrate)，被细菌排出体外，实现了耐药作用。因此，从植物中发现结构完全不同于以往抗生素的新类型的化合物，对耐药细菌进行抑制，是寻找新型耐药菌抑制剂的一条不同途径。

中草药自古以来的一大用途就是抗菌消炎作用。有报道，利用现代药理方法筛选发现了植物中一些天然化合物具有抗耐药细菌和抗细菌耐药性的作用(Gibbons 2004)，其中包括一些结构较为复杂的绵马酚类化合物。

与本发明相关的参考文献有：

Gibbons S. 2004. Anti-staphylococcal plant natural products Nat Prod Rep 21: 263 – 277。

发明内容

本发明的目的是提供具有抑制耐药菌活性的绵马酚类化合物及其在制备抗耐药菌药物中的用途，尤其是抑制多药耐药金葡菌活性的用途。

本发明的另一步目的是提供具有抑制耐药菌活性的绵马酚类化合物的制备方法。

本发明所述的绵马酚类化合物具有如下结构通式：

其中，R代表低级烷基 (1到5个碳的直链或支链烷基)，如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基 (即aspidinol C)、仲丁基 (即aspidinol D)、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基。其代表化合物为aspidinol C and D。它们化学结构名称分别为:1-[2,6-dihydroxy-4-methoxy-3-methyl-phenyl]-3’-methyl-1’-butanone和1-[2,6-dihydroxy-4-methoxy-3-dimethylphenyl]-2’-methyl-1’-butanone。

本发明中，所述化合物其结构特征在于：苯环的1位为酰基取代，2位为羟基取代并与1位羰基形成分子内氢键，3位甲基取代，4位甲氧基取代，5位无取代，6位为游离羟基取代，此取代方式的苯环结构为典型的绵马酚骨架。

本发明中，所述化合物aspidinol C和aspidinol D的物理性质和波谱数据如下述：

Aspidinol C: 黄色晶体。易溶于丙酮，氯仿。分子式C₁₃H₁₈O₄(238); UV (CHCl₃) λ_max (log ε) 330 (3.30), 288 (3.40), 267 (3.42), 243 (2.65) nm; IR (film) ν_max 3321, 2956, 1644, 1591, 1520, 1471, 1434, 1242, 1133, 794, 473 cm^-1; EIMS m/z (%) 181 (100), 238 (24.88), 223 (14.22), 182 (10.13), 154 (6.10), 196 (4.48), 221 (4.24), 205 (4.21)；核磁共振谱数据如表1所示。

Aspidinol D: 黄色晶体。易溶于丙酮，氯仿。分子式C₁₃H₁₈O₄(238); [α]²⁰ _D: –11.5 (c 0.400, CHCl₃); UV (CHCl₃) λ_max (log ε) 293 (3.26), 288 (3.33), 275 (3.26), 241 (2.10) nm; IR (film) ν_max 3387, 2963, 1635, 1585, 1412, 1229, 1145, 1097, 801 cm^-1; EIMS m/z (%) 181 (100), 238 (16.44), 182 (11.61), 69 (2.96), 239 (2.55), 138 (2.09), 41 (1.68), 55 (1.68)；核磁共振谱数据如表1所示。

表1、化合物aspidinol C和D的NMR谱数据 (δ in ppm, J in Hz)

本发明所述化合物aspidinol C和D可通过植物提取按下述方法制备：

取金丝桃 (Hypericum chinense L.) 干燥植物的果叶部分，粉碎，用95%的乙醇浸泡提取，将提取液合并后减压蒸干得浸膏，经过多次正相硅胶柱层析可得到化合物aspidinol C和D。

本发明所述化合物aspidinol C和D还可以通过化学合成方法制备得到。

本发明所述化合物aspidinol C或D经抗耐药菌活性实验，结果证实，所述化合物aspidinol C或D4具有抑制耐药菌的用途，尤其是抑制多药耐药金葡菌活性的用途。

本发明中，选取对氟喹诺酮类抗生素具有耐受性的耐药金黄葡萄球菌株SA-1199B进行抗耐药菌活性实验，该种菌株具有耐氟喹诺酮类外泵蛋白的金黄葡萄球菌。阳性对照药物诺氟沙星(norfloxacin)。

最低抑菌浓度 (MIC) 测试前，所有测试菌株接种于琼脂培养基 (Oxoid) 上于37^oC 培养 24 h。对照抗菌药物 norfloxacin购买于西格玛化学公司 (Sigma Chemical Co.)。基质为阳离子调节型肉汤 (Cation adjusted Mueller-Hinton broth, CAMHB)。对照 0.5 McFarland 硫酸钡标准浊度，金黄葡萄球菌 (S. aureus) 菌株菌落浓度为 5×105 cfu/mL 接种于普通溶解液 (9 g/L) 中，在 37oC 下培养 18 h。 MIC 测定，每一孔槽中加入 5 mg/mL 的二甲基噻唑二苯基四唑溴蓝 (MTT；Sigma) 染色液 20 μL，培养 20 min。通过颜色从黄色到深蓝色变化判断细菌生长。观察导致细菌无生长繁殖的最低浓度即为 MIC 值。结果显示，本发明所述化合物aspidinol C或D抑菌活性均强于阳性对照药物。

本发明所述化合物aspidinol C或D可进一步制备抗耐药菌药物，尤其是制备抑制多药耐药金葡菌活性的药物。

具体实施方式

实施例1

取干燥植物金丝桃 (Hypericum chinense L.) 果叶部位2 kg，粉碎，用95%乙醇浸泡提取 (3 L × 3次)，提取液合并减压蒸干得浸膏437 g。浸膏用200-300目硅胶 (6×60 cm硅胶柱)，石油醚-乙酸乙酯 (100:0 ~ 0:100) 梯度洗脱，硅胶薄层色谱检测。合并石油醚-乙酸乙酯 70:30洗脱部分，蒸干得橙黄色蜡状固体，重新用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-丙酮 (80:20)，得黄色晶体。继续用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚-丙酮 (90:10)，得黄色晶体10 g。经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为一纯化合物，通过波谱数据鉴定为aspidinol C。

样品上柱所得石油醚-乙酸乙酯 100:10洗脱部分，合并蒸干得橙黄色蜡状固体，用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯 (80:20)，得橙色油状物。重新用硅胶柱层析纯化，洗脱剂仍为石油醚-乙酸乙酯 (80:20)，得黄色晶体化合物18 g。经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为一纯化合物，通过波谱数据鉴定为aspidinol D。

实施例2 抑菌实验

最低抑菌浓度 (MIC) 测试前，所有测试菌株接种于琼脂培养基 (Oxoid) 上于37oC 培养 24 h。对照抗菌药物诺氟沙星和受试化合物样品aspidinol C和aspidinol D溶液分别以一定溶度加入相应的孔槽中。基质为阳离子调节型肉汤 (Cation adjusted Mueller-Hinton broth, CAMHB)。在 37oC 下培养 18 h。 MIC 测定，每一孔槽中加入 5 mg/mL 的二甲基噻唑二苯基四唑溴蓝 (MTT；Sigma) 染色液 20 μL，培养 20 min。通过颜色从黄色到深蓝色变化判断细菌生长。根据观察结果，导致细菌无生长繁殖的最低浓度即为 MIC 值。

结果显示，氟喹诺酮类药物诺氟沙星对其最低抑制浓度MIC为32 μg/mL (100 μM)，本发明所述化合物aspidinol C和aspidinol D的MIC分别为 2 μg/mL (8.4 μM) 和4 μg/mL (16.8 μM)。实验证实所述化合物aspidinol C和aspidinol D二者抑菌活性均强于阳性对照药物。

Claims

1.具有如下结构通式的绵马酚类化合物，

其中，R代表低级烷基：1到5个碳的直链或支链烷基，如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基；

所述化合物其结构中：苯环的1位为酰基取代，2位为羟基取代并与1位羰基形成分子内氢键，3位甲基取代，4位甲氧基取代，5位无取代，6位为游离羟基取代。

2.按权利要求1所述的绵马酚类化合物，其特征在于，所述的绵马酚类化合物为aspidinol C 或 D，

。

3.权利要求1所述的绵马酚类化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：取干燥植物金丝桃果叶部位，粉碎，用95%乙醇浸泡提取 3 L × 3次，提取液合并减压蒸干得浸膏；浸膏用200-300目硅胶，石油醚-乙酸乙酯 100:0 ~ 0:100 梯度洗脱，硅胶薄层色谱检测；合并石油醚-乙酸乙酯 70:30洗脱部分，蒸干得橙黄色蜡状固体，重新用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-丙酮 80:20，得黄色晶体；继续用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为石油醚-丙酮 90:10，得黄色晶体；经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为纯化合物，通过波谱数据鉴定得化合物aspidinol C；

样品上柱所得石油醚-乙酸乙酯 100:10洗脱部分，合并蒸干得橙黄色蜡状固体，用硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(80:20，得橙色油状物；重新用硅胶柱层析纯化，洗脱剂仍为石油醚-乙酸乙酯 80:20，得黄色晶体化合物；经正反相硅胶薄层色谱及HPLC检测为纯化合物，通过波谱数据鉴定得化合物aspidinol D。

4.权利要求1的绵马酚类化合物在制备抗耐药菌药物中的用途。

5.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的耐药菌是多药耐药金葡菌。