CN107580630A - 产生重组蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加聚乙烯亚胺(PEI)。将PEI作为发酵增强剂添加至细胞培养物中可导致降低所述细胞培养物的粘度，和/或提高所述重组蛋白的细胞外浓度，和/或减少细胞培养至收获点或蛋白回收的持续时间。

Description

产生重组蛋白的方法
本发明涉及在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加聚乙烯亚胺(PEI)。将PEI作为发酵增强剂添加至细胞培养物可导致降低细胞培养物的粘度，和/或增加重组蛋白的细胞外浓度，和/或减少细胞培养至收获点或蛋白回收点的持续时间。
发明背景
重组蛋白的大规模且节约成本的制备、回收和纯化对于生物技术产业是重要的挑战。
大肠杆菌和中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞是用于产生重组蛋白的最广泛使用的生物中的两种。在生产期间的考量包括宿主细胞生长和重组蛋白的表达、蛋白滴度、蛋白位置(例如，细胞内、细胞外、周质等)，以及从最终位置的选择性回收和纯化重组蛋白。平衡和优化这些不同因素并不简单。
因此，存在对于生产、回收和纯化重组蛋白的改进方法的需要。
发明概述
本发明提供在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
还提供释放由宿主细胞培养物表达的重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
还提供降低表达重组蛋白的细胞培养物的粘度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
还提供增加由细胞培养物表达的重组蛋白的细胞外浓度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
还提供减少收获表达重组蛋白的细胞培养物的时间长度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
还提供药物组合物，其包含使用本文所述的方法获得的重组蛋白。
还提供PEI作为表达重组蛋白的宿主细胞培养物的细胞培养增强剂的用途。
还提供PEI作为细胞培养期间的释放剂以提高由所述细胞表达的细胞外重组蛋白滴度的用途。
附图说明
图1：作为细胞外DNA浓度的函数的大肠杆菌发酵液的流变性质。(○)诱导前0至20h，细胞浓度0至30g dwt/l；(●)诱导后20至65h，细胞浓度30至40g dwt/l。流变数据用于幂律拟合，针对增加和减少剪切两者的30s扫描(sweeps)，τ = kγn，(R2=0.99)，γ=37至1200 s-1 (在所述扫描之间的剪切应力值中未观察到显著差异)。对于[DNA]>1000mg/ml，一些样品似乎展现高表观屈服应力且不剪切。温度23℃。
图2：通过发酵产生DOM0101 (dAb)和构建关于dAb和DNA释放的同位图(parityplot)。A-细胞干重(DCW)、电容和二氧化碳释放速率(CER)的概况；B-细胞外、细胞内和总dAb的概况；C-释放至细胞外空间的DNA的概况；D-比较dAb和DNA释放至细胞外环境中的同位图。100% DNA释放=0.031*最大细胞DCW。构建：同位线(parity line)(_____)为来自诱导(0% dAb、17% DNA)的等同dAb和DNA释放的线；DNA释放边界(_ _ _)是指上限，培养液的流变蛋白超过该上限，使得离心被视为过度有挑战性的。
图3：细胞培养补充剂EDTA、EDTA-尿素和TweenTM20对dAb (DOM01010)产生以及dAb和DNA的相对细胞外浓度的影响。A-细胞干重(DCW)的时间概况，B-在1000KHz下的电容的时间概况，C-二氧化碳释放速率(CER)的时间概况，D-DNA释放至细胞外空间的时间概况，E-细胞外dAb浓度的时间概况，F-细胞内dAb浓度的时间概况和G-总dAb浓度的时间概况，和H-比较以下培养物的dAb产物和DNA两者释放至细胞外环境中的同位图：对照培养物、用125mMEDTA以5ml/l/h至最终18mM的[EDTA]处理的培养物、用125mM EDTA 7.5M尿素以5ml/l/h至最终18mM的[EDTA]和1M的[尿素]处理的培养物、和经23h递增(以受控方式进行以避免过度发泡)且最终浓度为20ml/l的TweenTM20处理的培养物。在35h处理时间处的线表示开始EDTA和EDTA-尿素进料。对于图3H，闭合点为对于在EDTA或EDTA-尿素发酵中实现的最大水平的%细胞外dAb释放；开放点为对于如在对照中获得的最大值的% dAb释放。
图4：细胞培养补充剂PEI对dAb (DOM0101)产生以及dAb和DNA的相对细胞外浓度的影响。A-细胞干重(DCW)的时间概况，B-在1000KHz下的电容的时间概况，C-二氧化碳释放速率(CER)的时间概况，D-DNA释放至细胞外空间的时间概况，E-细胞外dAb浓度的时间概况，F-细胞内dAb浓度的时间概况，和G-总dAb浓度的时间概况，和H-比较以下培养物的dAb产物和DNA两者释放至细胞外环境中的同位图：对照培养物、用PEI作为大量、以低进料速率和高进料速率(分别为0.09g/l/h和0.16g/l/h)进行添加至约5g/l的最终浓度处理的培养物。在35h和42h处理时间处的垂直线分别表示开始PEI大量添加和PEI连续添加。
图5：细胞培养补充剂对细胞外dAb和相关污染物的影响。所有发酵都在诱导后进行45h且达到~25-30g dwt/L的最终细胞密度。如图4中所述施加补充剂。5A-产生的总dAb和细胞外dAb。在图B-D中，将污染物水平与这些细胞外dAb水平作为比率进行比较。5B-内毒素；5C-宿主细胞蛋白(HCP)；5D-DNA。
图6：PEI处理(0.09g/l/h)对细胞外抗原结合蛋白产物的影响。图6A、B和C分别为PEI添加后5h、25h和50h；且图6D、E和F中的可溶性DNA浓度分别为PEI添加后5h、25h和50h；对于四种不同重组抗原结合蛋白(包括DOM0101/TNFR1-dAb)，所述抗原结合蛋白的MW范围为13至25kDa。相对细胞外产物在释放的抗原结合蛋白中的比例增加(=使用PEI释放的抗原结合蛋白与在无PEI的情况下在收获时所释放的抗原结合蛋白的比例)。PEI的应用在诱导重组抗原结合蛋白产物后~4h开始。
详述
本公开涉及这一实现，即生产、回收和纯化重组蛋白的更节约成本和有效的方法通过在发酵中使用聚乙烯亚胺(PEI)(即，在细胞培养期间将PEI添加至培养基)而变得可能。
如本公开中所使用的细胞培养物被给出其最广泛的含义，即在生长培养基中的细胞的大量生长。如本文中所使用的“发酵”和“培养”意味着在生长培养基中大量生长细胞。术语“发酵”和“培养”在本文中可互换地使用。细胞并不处于休眠期。指数生长期是特征在于细胞倍增、因此大量生长的时段。每单位时间出现的新细胞的数目显著地增加且与现存群体成比例。稳定期是细胞的生长速率与死亡速率相等的情况，其通常是由于生长限制因素，诸如基本营养物的耗尽和/或抑制产物(诸如有机酸)的形成。为了在稳定期中维持恒定生物量且因此大量生长，细胞需要继续生长。在一个实施方案中，在细胞培养期间添加PEI，同时细胞活跃地生长且表达重组蛋白，即，细胞并不休眠。在一个实施方案中，在收获之前添加PEI。
术语细胞外培养基、培养液、上清液、细胞外环境、细胞外空间、培养基和发酵培养基在本文中都用于描述在细胞培养期间和在收获点处的细胞的外部环境。
术语收获在本文中用于意指发酵结束。可在发酵期间的任何时间点处进行收获，所述时间点被视为足以结束发酵过程和回收所表达的重组蛋白，即，在收获点处开始蛋白回收。收获时间可取决于上清液中的重组蛋白的最佳浓度。在收获时，可直接从细胞培养物的细胞外培养基回收重组蛋白并对其进行纯化。或者，可在从细胞外培养基回收和纯化产物之前将细胞从细胞外培养基中分离。
聚乙烯亚胺(PEI)是由伯胺、仲胺和叔胺构成的阳离子聚合物(C 2 H 5 N) n 。PEI在本文中不用作转染剂，PEI在本文中也不用作用于细胞培养的粘附因子。
因此，本文中的方法描述PEI作为细胞培养增强剂(或细胞培养补充剂)的用途，其导致多个优点，包括以下中的一个或多个优点：降低细胞培养物的粘度；和/或提高细胞外重组蛋白滴度；和/或在较早时间点将产物定位于上清液中；和/或减少收获细胞培养物的时间长度；和/或上清液中的较低水平的杂质(例如，DNA、HCP)含量；和/或较简单的回收和下游处理。因此，PEI在本文中的方法中用作发酵(或细胞培养)增强剂。PEI作为细胞培养补充剂(或试剂)添加至细胞培养物。在一个方面，我们描述了在收获表达重组蛋白的宿主细胞培养物之前，PEI作为细胞培养补充剂降低细胞培养物的粘度的用途。在另一个方面，我们描述了在收获表达重组蛋白的细胞培养物之前，PEI作为细胞培养补充剂提高重组蛋白的细胞外浓度的用途。在又一个方面，我们描述了在收获表达重组蛋白的细胞培养物之前，PEI作为细胞培养补充剂减少收获的时间长度的用途。
PEI在本文中可用作膜透化剂(也称作释放剂；所述术语可互换使用)以提高细胞外重组蛋白滴度。在将重组蛋白靶向至革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质时，可使用PEI作为释放剂，以将周质表达/定位的蛋白释放至细胞外培养基中。
本文中的方法描述了PEI作为细胞培养增强剂的用途，其可在上清液中产生较大量的重组蛋白产物，和/或可在较早时间点将产物定位于上清液中。因此，可将收获点改变至较早时间点，因为在PEI存在的情况下，足够的重组蛋白定位于细胞外培养基中。
在PEI存在的情况下，细胞外培养基中的重组蛋白浓度可大至少2倍。例如，在PEI存在的情况下，重组蛋白浓度大至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍。这可以在发酵期间的任何时间点处或在收获点处。
在不显著影响产物产量的情况下，在PEI存在的情况下的收获时间点可以比PEI不存在的情况下的收获时间点早至少5小时。例如，在不显著影响产物产量的情况下，在PEI存在的情况下的收获的发生可比PEI不存在的情况下的收获早至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少25小时、至少30小时、至少35小时、至少40小时、至少45小时或至少50小时。产物产量通过测量在PEI存在的情况下和PEI不存在的情况下的重组蛋白浓度来测定。相比于在PEI不存在的情况下在较后时间点的显著类似产物产量，当在PEI存在的情况下在较早时间点处观察到增加的产物产量时，对产物产量结果无显著影响。
在全部或部分发酵期间，PEI可以作为单次或多次大量添加或作为连续添加来添加。例如，可在收获之前添加PEI。可在诱导重组蛋白的表达时或在诱导重组蛋白的表达之后添加PEI。可在从诱导重组蛋白的表达至收获前约30分钟的任何时间处添加PEI。
可在收获前至少30分钟将PEI添加至细胞培养物。可在收获前至少1小时、或至少2小时、或至少5小时、或至少10小时、或至少15小时、或至少20小时、或至少25小时、或至少30小时、或至少40小时、或至少50小时将PEI添加至细胞培养物。
可在诱导性细胞表达系统中的诱导和收获之间的任何时间处将PEI添加至细胞培养物。可在诱导重组蛋白的表达时添加PEI。或者，可在诱导重组蛋白的表达之后至少1小时、或至少2小时、或至少5小时、或至少10小时、或至少15小时、或至少20小时、或至少25小时、或至少30小时、或至少40小时、或至少50小时、或至少60小时添加PEI。
PEI可在细胞培养物中存在至少30分钟。PEI可在细胞培养物中存在1至60小时、或1至50小时、或1至40小时。
可在细胞培养期间连续地添加PEI。这类似于可连续地添加至细胞培养物的培养基、营养物和生长因子的“进料”或“进料速率”。在一个实施方案中，以约0.01至1g/L/hr、或0.03至0.3g/L/hr、或0.05至0.2g/L/hr的速率将PEI添加至细胞培养物。在另一个实施方案中，以0.09g/L/hr或0.16g/L/hr的速率添加PEI。在一个实施方案中，以约0.1至10ml/L/hr、或0.5至5ml/L/hr、或1至3ml/L/hr的速率将PEI添加至细胞培养物。在另一个实施方案中，以1.5ml/L/hr或2.5ml/L/hr的速率添加PEI。
可以作为大量添加将PEI添加至细胞培养物。这可以是单次大量添加或多次大量添加。
经由连续或大量添加而添加至细胞培养物的PEI的总量可以是约10g/L或更少。因此，在收获点(发酵结束)，PEI在细胞培养物中的浓度可以是约10g/L或更少。在另一个实施方案中，添加至细胞培养物的PEI的总量为约5g/L、或4g/L、或3g/L、或2.5g/L、或2g/L或更少。在哺乳动物细胞中，细胞培养物中的总PEI浓度可以是0.025至250μg/ml之间。
本公开的方法中使用的PEI可以是支链或直链的。在一个实施方案中，PEI是支链的。
用于本公开的方法中的PEI的分子量(MW)在约600Da至约1000kDa之间。在一个实施方案中，PEI MW在50至1000kDa之间。在一个实施方案中，PEI MW是约750kDa。在一个实施方案中，PEI是支链的且具有50至1000kDa的MW。或者，PEI是支链的且其具有约750kDa的MW。
在一个实施方案中，相比于在PEI不存在的情况下，在PEI存在的情况下存在于细胞外环境中的可溶性DNA的量减少。在一个实施方案中，在PEI存在的情况下存在于细胞外环境中的DNA量比PEI不存在的情况下的低至少2倍。例如，在PEI存在的情况下的DNA浓度低至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍。这可以在发酵期间的任何时间点或在收获点。
在一个实施方案中，在添加PEI之后，上清液中剩余的可溶性DNA浓度低于600mg/L、低于500mg/L、低于400mg/L、低于300mg/L或低于250mg/L。在一个实施方案中，收获物中的DNA浓度为约250mg/L。
本公开还提供了通过在PEI存在的情况下培养细胞而降低细胞培养物的粘度的方法。在一个实施方案中，在PEI存在的情况下的粘度比在PEI不存在的情况下降低至少2倍。例如，在PEI存在的情况下的粘度降低至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍。这可以在发酵期间的任何时间点或在收获点。
因此，PEI充当发酵增强剂以(i)在发酵期间和/或(ii)在收获点降低细胞培养物中的粘度和/或降低细胞培养物中的DNA浓度。这可产生许多优点，包括以下中的一个或多个：在细胞外培养基中的较低杂质含量、更有效的操作、在收获点的细胞/产物的较简单回收和改善的下游加工。
如本文中所使用，当指可测量值(诸如量、分子量、持续时间等)时，“约”意味着涵盖从指定值±1%、±0.75%、±0.5%、±0.25%、±0.2%和±0.1%的变化，因为此类变化适合于进行所述的方法。
重组蛋白
重组蛋白可包括抗原结合蛋白，例如单克隆抗体、抗体片段或结构域抗体(dAb)。
重组蛋白可包括病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌抗原。
如本文中所使用，“重组蛋白”是指可施用至哺乳动物以引发组织、系统、动物或人类的生物或医学反应的任何蛋白和/或多肽。重组蛋白可引发多于一种生物或医学反应。此外，术语“治疗有效量”意味着，与尚未接受此量的对应主体相比，导致（但不限于）疾病、病症或副作用的治愈、预防或改善，或疾病或病症的进展速率降低的任何量。该术语还包括在其范围内有效地增强正常生理功能的量，以及有效地引起患者体内的增强或有助于第二药剂的治疗效果的生理功能的量。
如本文中所使用的术语“抗原结合蛋白”是指能够与抗原结合的抗体、抗体片段和其他蛋白构建体，诸如结构域。
术语“抗体”在本文中用于在最广泛的意义上指具有免疫球蛋白样结构域的分子。如本文中所使用，“免疫球蛋白样结构域”是指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，其含有两个b折叠和通常保守的二硫键。该家族包括单克隆抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异缀合抗体；单一可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、双体、TANDABS™等(对于替代性“抗体”形式的概述，参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136)。
短语“单一可变结构域”是指独立于不同可变区或结构域特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如，VH、VHH、VL)。“结构域抗体”或“dAb”可视为与“单一可变结构域”相同。
如本文中所使用，“结构域”是指独立于蛋白的其余部分保留其三级结构的折叠的蛋白结构。一般而言，结构域负责蛋白的离散的功能性质，并且在许多情况下，在蛋白和/或结构域的剩余部分无功能损失的情况下，可将结构域添加、移除或转移至其他蛋白。单一抗体可变结构域或免疫球蛋白单一可变结构域意味着包含抗体可变结构域的特征序列的折叠的多肽结构域。因此，其包括：完整抗体可变结构域和修饰的可变结构域(例如，其中一个或多个环已被不是抗体可变结构域的特征的序列替换)，或已经截短或包含N端或C端延伸的抗体可变结构域，以及至少部分地保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠的片段。
结构域抗体可以以具有其他可变区或可变结构域的形式(例如，同源或异源多聚体)存在，其中其他区域或结构域对于通过单一免疫球蛋白可变结构域的抗原结合不是必需的(即，其中免疫球蛋白单一可变结构域独立于额外可变结构域结合抗原)。
结构域抗体可以是人类抗体可变结构域。dAbTM可以是人类来源的。换言之，dAbTM可基于人类Ig构架序列。
如本文中所使用，术语“抗原结合位点”是指在抗原结合蛋白上能够特异性结合抗原的位点，这可以是单一结构域，或其可以是如可在标准抗体上发现的成对VH/VL结构域。单链Fv (ScFv) 结构域也可提供抗原结合位点。
抗原结合蛋白可包含用于不同抗原的额外抗原结合位点。例如，抗原结合蛋白可具有针对多于一种抗原(例如两种抗原)，或针对三种抗原或针对四种抗原的特异性。
抗原结合蛋白可由或基本上由抗体的Fc区或其在各端处直接或间接地(例如，经由接头序列)连接至结合结构域的部分组成。此类抗原结合蛋白可包含由Fc区域或其部分分离的两个结合结构域。分离意味着结合结构域并不直接地彼此连接，且可位于Fc区的相对端(C端和N端)或任何其他支架区域处。
抗原结合蛋白可包含两个支架区域，其各自可例如在各支架区域的N端和C端处直接或间接地(经由接头)与两个结合结构域结合。各结合结构域可结合不同抗原。
抗原结合蛋白可采取mAbdAb的蛋白支架形式。“mAbdAb”和“dAbmAb”可互换使用，且意欲在本文中使用时具有相同含义。此类抗原结合蛋白包含蛋白支架，例如，Ig支架(诸如IgG)，例如连接至另一结合结构域的单克隆抗体，例如结构域抗体。mAbdAb具有至少两个抗原结合位点，其中的至少一个来自结构域抗体，而至少一个来自成对VH/VL结构域。
结构域抗体可以单体或多聚(例如，二聚)形式存在并结合靶标，且可与其他分子组合使用以用于格式化和靶向途径。例如，可制备具有多个结构域的抗原结合蛋白，其中结构域之一结合血清蛋白诸如白蛋白。结合血清白蛋白的结构域抗体(AlbudAb) 描述于例如WO05/118642中且可独立地为结构域融合配偶体提供延长的血清半衰期。
dAbs也可例如以与其他分子(例如，药物、另一蛋白、抗体分子或抗体片段)的dAb缀合物或dAb-融合体的形式与其他分子缀合。例如，dAbTM可以作为格式化的dAbTM存在，例如，dAbTM可以作为dAb-Fc融合体或缀合物存在，如例如WO 2008/149148中所述。或者，格式化的dAbTM可以作为mAbdAb存在，如WO 2009/068649中所述。dAbTM可以作为与半衰期延长的蛋白或多肽的融合体或缀合物存在，例如，结合血清白蛋白(AlbudAb)或半衰期延长的化学部分诸如聚乙二醇(PEG)的另一dAbTM。dAbTM可作为与其他治疗或活性分子的融合体或缀合物存在。
如本文中所使用，“药物”是指可施用至个体以通过在个体中结合生物靶分子和/或改变其功能而产生有益治疗或诊断效果的任何化合物(例如，小有机分子、核酸、多肽)。靶分子可以是由个体的基因组编码的内源性靶分子(例如，由个体的基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或由病原体的基因组编码的外源性靶分子。药物可以是dAbTM或mAb。
“dAb缀合物”是指包含dAbTM的组合物，药物借助于共价键或非共价键而与dAbTM化学缀合。优选地，dAbTM与药物是共价键合的。此类共价键可通过肽键或其他方式诸如经由修饰的侧链。非共价键合可以是直接的(例如，静电相互作用、疏水相互作用)或间接的(例如，通过互补结合配偶体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一个配偶体与药物共价键合且互补结合配偶体与dAbTM共价键合)。当采用互补结合配偶体时，结合配偶体之一可直接地或通过合适接头部分与药物共价键合，且互补结合配偶体可直接地或经由合适接头部分与dAbTM共价键合。
如本文中所使用，“dAb融合体”是指包含dAbTM和多肽药物(其可以是多肽、dAbTM或mAb)的融合蛋白。dAbTM和多肽药物作为单一连续多肽链的离散组分(部分)存在。
因此，本公开的方法可应用于以下中的一种或多种：治疗蛋白、单克隆抗体(mAb)、结构域抗体(dAbTM)、dAbTM缀合物、dAbTM融合体、mAbdAb或本文中所述的任何其他抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是干扰TNFα信号传导的dAbTM。在一个实施方案中，所述dAbTM中和TNFα。在一个实施方案中，所述dAbTM特异性结合TNFα或TNFα受体。在一个实施方案中，所述dAbTM特异性结合TNFR1。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白为SEQID NO: 1 (DOM0101)或SEQ ID NO: 3 (C端丙氨酸延伸的DOM0101)的VH dAbTM (抗TNFR1)/DOM0101)。
蛋白的表达：宿主细胞
合适的宿主细胞包括：哺乳动物细胞诸如CHO(例如，CHOK1和CHO-DG44)和PerC6，和微生物细胞诸如革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌(例如，W3110和BL21)、假单胞菌和沙门氏菌)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在一个实施方案中，所述大肠杆菌菌株是W3110。
本文还描述了包含编码重组蛋白的重组核酸分子的载体。此类载体用于对细胞进行基因工程改造以表达所需蛋白产物。载体可以是包含一个或多个表达控制元件或序列的表达载体，所述表达控制元件或序列与重组核酸可操作连接。载体的实例包括质粒和噬菌体。
合适的表达载体可含有多种组分，例如，复制起点、可选择标记基因、一种或多种表达控制元件，诸如转录控制元件(例如，启动子、增强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号、信号序列或前导序列。表达控制元件和信号序列(如果存在)可由载体或其他来源提供。例如，编码抗体链的克隆的核酸的转录和/或翻译控制序列可用于直接表达。
可提供启动子用于在所需细胞中表达。启动子可以是组成型或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸可操作连接，使得其引导核酸的转录。可使用用于革兰氏阴性细菌的各种合适启动子(例如，用于大肠杆菌的lac、tac、trp、phoA、lambdapL、T3、T7(T7A1、T7A2、T7A3)启动子)。可采用的操纵子序列包括lac、gal、deo和gin。可采用一种或多种完美回文操纵子序列。在一个实施方案中，本公开的重组蛋白的表达在诱导型启动子的控制下进行。例如，大肠杆菌lac、tac和trc启动子可用乳糖或不可水解的乳糖类似物、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，和phoA、trp和araBAD启动子可分别由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导。
如本文中所使用的术语“诱导表达”是指通过例如添加诱导剂或温度变化（其中诱导是温度依赖性的）而开始诱导的点。术语“诱导后”在本文中用于描述开始诱导的点之后经过的时间。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的细胞的可选择标记，并在可复制表达载体的情况下包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见的可选择标记且可使用(例如，内酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在各种细胞中用甲氨喋呤选择。
如WO2007/088371中所述的表达载体(例如pAVE037、pAVE007或pAVE011)可用于表达蛋白。在一个实施方案中，所述载体是pAVE011。或者，载体诸如pJExpress401可用于表达蛋白。
实例替代性表达载体和方法(例如与CHO、PerC6等一起使用)也是已知的。
宿主细胞包含上述重组核酸分子或载体。
本公开的宿主细胞培养物可在支持宿主细胞生长和重组蛋白表达的任何培养基中培养。此类培养基是本领域技术人员众所周知的。
蛋白靶向
尽管重组蛋白的表达发生在细胞质中，但重组蛋白的最终位置可以是细胞质、周质或细胞外，这取决于重组蛋白的性质、所使用的宿主细胞和所使用的发酵条件。
本发明中PEI的使用可与通过前导序列靶向至(i)细胞的周质或(ii)细胞外培养基的重组蛋白相关。重组蛋白可经由前导序列引导至细胞外培养基(例如在哺乳动物细胞中)或至周质(例如在革兰氏阴性细菌中)。
在哺乳动物细胞中，分泌性前导序列用于将重组蛋白引导至细胞外培养基。在革兰氏阴性细菌中，一些分泌的蛋白以单一步骤经由I型、III型、IV型或VI型分泌途径跨越内膜和外膜输出，而其他蛋白首先经由通用Sec或Tat途径输出至周质中，且然后主要经由II型或V型机制跨越外膜易位。II型系统涉及两步骤过程，其中使用Sec途径将含有Sec前导序列的前体蛋白(premature protein)输出至周质。通过蛋白水解移除前导序列，产生成熟的加工的蛋白存在于周质中，且该蛋白是否分泌至培养基中高度取决于前导序列、蛋白、细胞的特性和培养条件。此外，在细胞裂解(自溶)的情况下，可假定培养基中的大部分蛋白来源于周质且因此是加工的。重组蛋白可经由前导序列主动地分泌至培养基中；或经由本领域中已知的其他细胞途径被动地从周质分泌至培养基中。
前导序列的加工包括前导序列从蛋白切割和移除。然而，已知前导序列的一些氨基酸保留在该蛋白的N端，使得前导序列未被适当加工。90%或更多的前导序列可被加工，使得10%或更少的序列保留在蛋白的N端。至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的前导序列可被加工。约100%的前导序列可被加工，使得在通过细胞的分泌性途径排出之后无一残留在蛋白的N端。
前导序列可以是哺乳动物或人类前导序列，或周质靶向信号序列，例如，N端周质靶向序列。将蛋白引导至周质或细胞外环境的信号序列是本领域中已知的。例如，使用MalE信号序列。或者，使用PelB或OmpA信号序列。在一个实施方案中，所述信号序列是OmpA。
收获
收获是发酵的结束。收获可在发酵期间的任何时间点处，所述时间点被视为足以终止发酵过程且回收所表达的重组蛋白。收获可发生在诱导细胞培养液以表达重组蛋白后的10和60小时之间。例如，收获可发生在诱导后15和50小时之间。在收获时，微生物细胞群体的固体含量可在细胞湿重(WCW)的5%-30%之间。对于哺乳动物细胞培养物(例如，CHO、PerC6等)，由于相比于大肠杆菌的更慢分裂速率，重组蛋白的收获可通常发生在8和500小时之间。
发酵罐体积可以是：
(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或
(ii) 5和10,000升之间；10和5,000升之间；20和2,000升之间；50和1,000升之间。
收获物可包含已天然裂解(也称为自溶)的细胞。例如，收获物中的细胞的1-50%可已经历自溶。或者，收获物中的细胞的20-50%、或30-50%、或40-50%已自溶。或者，收获物中的细胞的10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、或50%或更多已自溶。自溶可间接地通过澄清的收获物中的DNA浓度测定，或通过电容测定，如实施例中所述。
收获可包括排空发酵罐的细胞和细胞外培养基(即，细胞培养物或培养液)的任选步骤。
收获物的任选预处理
根据宿主细胞和重组蛋白，收获物的预处理是调节收获物的方法。该步骤可在发酵罐中进行，或在已将收获物从发酵罐移除之后进行。预处理包括：热、机械或化学裂解收获物(例如，通过均质化、冻-融、裂解)；以及周质提取。可使用本领域中已知的方法提取至少一种周质提取物。或者，如果在细胞外环境中已存在足够的产物，则可不需要此预处理。
澄清
澄清是移除固体微粒的过程。澄清可降低对纯化期间的后续色谱步骤的负担。典型的澄清步骤包括沉降步骤 – 也称为沉积(例如，通过重力)，和/或离心步骤，和/或过滤步骤。
离心步骤可以是连续离心(例如，具有连续进料区域)。离心可就排出固体而言是自身 “分批地”或“间歇地”或“连续地”操作。例如，管式离心机可用作连续离心步骤。
重组蛋白的纯化
可直接从培养基回收重组蛋白。回收重组蛋白随后为纯化，以确保重组蛋白的足够纯度。在纯化中可使用一个或多个色谱步骤(例如，一种或多种色谱树脂)和/或一个或多个过滤步骤。例如，使用树脂(诸如蛋白A或L)的亲和色谱法可用于纯化重组蛋白。替代地或另外，离子交换树脂诸如阳离子交换可用于纯化重组蛋白。
实施例
实施例1：材料和方法
大肠杆菌表达系统
使用具有质粒pAVE011的大肠杆菌W3110菌株，所述质粒pAVE011携带TNFR1 dAb(DOM0101，SEQ ID NO: 1)、约13.1kDa分子量的VH结构域抗体结构域以及用于分泌至周质的OmpA前导序列。[大肠杆菌W3110-pAVE011-ompA-DOM0101，基因型：大肠杆菌(Fˉ mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1 λ)]。
培养和生物反应器设置
在-80℃下将大肠杆菌细胞储存于甘油(20%，v/v)中。为了制备用于生物反应器实验的接种物，将1ml甘油储备物接种至含有400ml vLB接种培养基(vLB Lennox：选择大豆蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，pH为7.0)的各1000ml挡板烧瓶(UltraYield烧瓶，Thomson Instrument Company, Kent, UK)中。使烧瓶在旋转振荡孵育箱中以220rpm和在37℃下生长，直至OD600达到1。相同接种物用于各组生物反应器实验以避免种菌培养变化。
平行的8生物反应器系统具有1l工作体积反应器(SR1000DLL生物反应器，容器直径100mm，纵横比2.4：1)、顶置驱动式双重Rushton 6叶片叶轮(直径46mm，DASGIP AG,Julich, Germany)。
以1：50体积比接种生物反应器以便产生等于OD600=0.02的初始细胞密度。
在复合培养基中培养大肠杆菌细胞，所述复合培养基含有作为主碳源的甘油、酵母提取物和大豆蛋白胨。通过自动添加25%(v/v) NH4OH和2M H3PO4而将pH保持为7.0±0.05。在诱导之前将温度维持在30℃下并在诱导之后将温度降低至26℃。溶解氧(DO)设定点被设定为30±5%，并且这由串级系统自动控制，当DO下降低于寻求维持最小DO水平的设定点时，所述串级系统依次增加叶轮速度(400至1600rpm)，然后增加气流速率(1vvm-2vvm)(vvm=体积/体积/分钟)，且然后增加气体中的氧含量(21-100%)。
在甘油消耗后观察到DO尖峰，此时开始含有酵母提取物(50g/l)的甘油进料(714g/l)。除非另有说明，否则进料添加的速率为3.6ml/l/h。
对于实施例4：诱导后的进料速率为3、3.6、4.2和4.8ml/l/h。
对于实施例5：125mM EDTA(pH 7)和125mM EDTA 7M尿素(pH 7)的连续添加在诱导后约15h以5ml/h的流动速率开始。在诱导后15h开始TweenTM20添加，并在23h内增量地进行(以受控方式进行以避免发泡)至最终浓度20ml/l。
对于实施例6：所使用的PEI为750kDa支链(购自BASF-目录号11736)。
在诱导后23h进行大量PEI(40ml 6.25% w/v PEI)的添加，导致反应器中的PEI的最终浓度为0.25%(w/v)。在诱导后15h以1.5ml/l/h(其对应于0.09g/l/h(图4中为低))和2.5ml/l/h(其对应于0.16g/l/h(图4中为高))的速率开始PEI的连续添加，(这导致在发酵结束后，发酵中的PEI浓度分别为约3和5g/l)。
对于实施例7：针对细胞外滴度且还针对使用表达为每克的细胞外产物的培养物上清液中的污染物诸如内毒素、HCP和DNA分析如实施例3中所述的对照培养物的收获材料，如实施例5中所述的TweenTM20、EDTA处理、EDTA-尿素处理，和如实施例6中所述的PEI的低进料添加(0.09g/l/h)。如下所述(分析方法)测定内毒素、HCP和DNA。
对于实施例8：以与施加750kDa PEI相同的连续性低进料施用(0.09g/l/h)施加25kDa PEI (Aldrich 408727)。
当生物量浓度已达到对应于OD600=80±2的水平时，诱导dAb DOM0101产生，其中IPTG以反应器中的250μM的最终浓度添加。
通过生物反应器软件(DASGIP Control, Julich, Germany)自动记录在发酵期间的pH、溶解氧、搅拌速度、温度、空气流动速率、氧百分比、摄氧速率、二氧化碳释放速率的实时值。
所有发酵处理都一式两份地进行，其中各组实验在同一时间使用相同接种物进行。各图中的误差条表示在至少两个复制生物反应器之间的标准偏差。
分析方法
使用蛋白A亲和色谱法测量dAb产物浓度。使用蛋白A色谱法(HPLC Agilent 1200,Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, UK，其装配有1 mL HiTrap MabSelectRXtra, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)分析所研究样品中的产物浓度。使用pH 7.2的0.1M PBS缓冲液进行上样和平衡。在平衡缓冲液中恰当地稀释样品并使用0.22μm PVDF注射器过滤器进行过滤。使用20mM HCl进行洗脱。通过记录220nm处的吸光度测量洗脱的产物的量。将产物峰面积自动积分(Empower, Waters, Milford, USA)。
关于细胞内dAb浓度，将1ml抽取的培养物以24200×g离心10min并回收细胞培养物上清液。然后将沉淀再悬浮于具有50mM Tris pH 8的1ml最终体积中，经受4次冻-融循环(在干冰中冷冻，随后在37℃下在金属浴(dry bath)中孵育5分钟)和使用超声波浴(Camsonix C275, Elma Electronic GmbH, Singen, Germany) 2次冷冻-超声处理循环(在干冰中冷冻，随后超声处理15分钟)。将超声处理的样品以24200×g离心10min并回收细胞裂解物且测试滴度，如上文所描述。
使用杯摆流变仪(cup-and-bob rheometer)(装配有主轴40的Brookfield DV-2+粘度计，Brookfield Engineering Laboratories，MA)进行粘度测量，以各增量处保持30s的七个增量将0.5ml细胞培养液暴露于37.5至1500s-1的剪切速率。进行增加和减少剪切扫描两者。使用冷却水环路将粘度计中的温度维持在23℃。
使用Qubit 2.0荧光计(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)测定细胞外环境中的双链DNA的浓度。将10μl适当稀释的培养物上清液添加于190μl Qubit工作溶液(含有Quant-iT™ dsDNA BR缓冲液中1：200的Quant-i dsDNA BR试剂)中。将管涡旋并在恰好2min后测量吸光度。将相同程序应用于浓度为0ng/μl和100ng/μl的两个预稀释DNA标准品中。
培养物的生长被测量为600nm处的光密度和重量分析方面测量为细胞干重(DCW)。将1ml样品放置于预称量的Eppendorfs中，且然后在微型离心机中以24200×g离心3min，弃去上清液并将回收的沉淀在蒸馏水中再悬浮并洗涤两次，且然后在105℃的烘箱中24h干燥至恒重。然后再次称重Eppendorfs并将最终重量和空Eppendorfs之间的差异视为DCW。
使用经由放大器连接至检测器的Aber探头(Aber Instruments, Aberystwyth,UK)在1000KHz下在线测量培养物的电容。
使用具有含有鲎变形细胞裂解物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)的一次性筒的商业携带型测试系统按照生产商说明书(Charles Rivers Laboratories, USA)来测量适当稀释的收获物样品的内毒素水平。
使用大肠杆菌抗HCP夹心ELISA方法来测量培养液上清液中的宿主细胞蛋白(HCP)的浓度。
实施例2 DNA浓度和粘度
图1表征一系列悬浮液(包括裂解的细胞培养液)作为可溶性DNA浓度的函数的流变性质。所有溶液都显示特征性假塑性流动行为，其与时间无关且完全可逆。幂律表达充分描述获得的数据且稠度指数(等于在剪切率1 s-1下的表观粘度)给出其将在试图通过离心澄清时面临的挑战的指示。将在600mg/l的DNA浓度处获得的约~ 0.03 N sn m-2的稠度指数视为限定有挑战性离心的限值。
实施例3 细胞活力：电容和细胞干重
图2提供本研究中使用的标准发酵的实例。诱导后时间用于跟踪发酵进程。如通过电容记录的完整细胞浓度在15h达到峰值；这不久后为在~30 h处细胞干重的峰值和细胞呼吸作用的降低(较低CER)(图2A)。该概况匹配15h处的细胞外结构域抗体(dAb)的显著上升和细胞内dAb的平行减少的开始和总dAb在30h处达到最高水平(图2B)。在DCW开始减少时，DNA的释放(图2C)急剧增长，且似乎平行于dAb的释放，除了在诱导开始时存在的初始高水平的DNA外。
同位图(图2D)遵循伴随DNA释放的dAb释放。同位线遵循从诱导处的初始值至在整个细胞和细胞影(cell ghost)的完全破坏上可获得的最大值的dAb和DNA的释放。最大值根据通过对dAb的测量和从最大细胞干重的估计对DNA的估计；这归因于用于测量的完整形式的所有DNA的释放的困难。绘入60%的可接受的DNA释放边界；这基于裂解的悬浮液的流变数据的分析(图1)，其显示在培养液中大于~600mg/l的DNA水平将在典型处理规模离心条件下导致差的澄清，且还通过观察显示混合差的证据(例如，通过大气泡的出现)。在该DNA释放限值处，已释放仅~40%的dAb，且挑战为寻找在同位线上方移动以实现具有可接受的有限DNA释放的高dAb回收的方式。
实施例4 进料速率
探索改变诱导后的碳源进料速率的影响和所得的dAb对核酸释放的平衡。本实施例的数据在附图中并未显示，但描述于本文中。选择的进料速率的范围基于高端值（以避免过量甘油累积）和低端值（低于所述低端值发酵将超过诱导后50h）。较高进料速率似乎最初导致少量的(基于DCW)生物量水平提高或无(基于电容)生物量水平提高且然后导致较早裂解并最终导致较低的生物量水平。CER值反映随进料速率增加时所增加的生物量活性(至多20h)和较早开始裂解。依然是，DNA释放反映细胞裂解的水平。最终的总dAb、细胞内dAb和细胞外dAb水平很大程度上不受进料速率的选择的影响，但以较大进料速率的较高dAb产生速率反映较高生物量活性，而以较大进料速率的较早释放至细胞外空间中反映较早开始细胞裂解。所得的同位图显示，进料速率越大，dAb相比于DNA的释放程度越高。所实现的改进将对于60% DNA释放而将dAb产率从~35%增加至~58%；如果靶标是dAb的几乎完全回收，则不存在改进。因此，如果在无进一步预处理的情况下有机会实现dAb的较早收获和直接回收，则存在探索改变在发酵期间dAb和DNA释放之间的关系的方式的需要。
实施例5 细胞培养补充剂部分A：EDTA、尿素、Tween TM 20
EDTA、尿素和TweenTM可在收获时用于增加从宿主细胞的蛋白回收。此处我们研究其在细胞培养期间研究对重组蛋白的细胞外浓度的任何影响的用途。EDTA可透化细胞膜并对细胞是有毒的。尿素可影响膜完整性并对细胞是有毒的。TweenTM可透化细胞膜并引起细胞培养物发泡。
在图3中探索EDTA、尿素和TweenTM的使用。使用的浓度基于对15至75mM EDTA、0.5至2M尿素和10至20ml/l TweenTM20的最终浓度范围的基于实验室的研究(此处未显示结果)。EDTA或EDTA-尿素的使用导致生物量降低，如通过细胞干重(图3A)和电容(图3B)的较低值和降低的CER值(图3C)所证明。所得的效应是低释放的DNA水平和总dAb水平(图3D和图3G)，但由于增加的细胞壁透化，伴随大比例的dAb明显地出现在细胞外(图3E)。因此，最终dAb与最终DNA释放的比率总体增加~3倍。这种改善很大程度上归因于降低的dAb滴度，且实际上相对于在对照中形成的dAb水平的dAb释放的再校准使所有EDTA和EDTA-尿素数据点返回至同位线。
TweenTM的使用导致比对照更早开始减少活性生物量(图3A-3C)，但dAb概况的释放DNA中的极小差异(图3D-G)并不引起dAb与DNA释放的比率的改善(图3H)。还经历高水平的发泡。由于小规模筛选试验表明用于用这些特定试剂改进的空间极小，所以不会进一步探寻这些策略。
实施例6 细胞培养补充剂部分B：PEI
已知使用PEI以帮助加工收获的发酵液(WO2014118220)。此处我们关注在发酵自身期间PEI的使用和对活细胞的影响。PEI可透化细胞膜且可显示抗微生物活性和细胞毒性。此处呈现的结果令人惊讶地显示，PEI似乎对细胞活力具有可忽略的作用。
相比于对照培养物，添加大量PEI显著增加培养物的细胞干重。类似地，在其中存在PEI的逐步连续添加的培养物中，观察到显著更高的DCW，直至过程的结束(参见图4A)。尽管对照培养物在47.5h后急剧地下降，但PEI连续培养物将DCW保持接近于42g/l，且具有PEI的大量添加的培养物将水平保持在约45g/l。有趣地，在电容读数中观察到类似效应，其中在添加PEI溶液后，读数突然增加(图4B)。当进行PEI的大量添加时，这尤其明显(电容读数从8.6pF/cm增加至11.5pF/cm)。呼吸性数据显示，PEI处理的培养物遵循与对照培养物相同的概况且其不受PEI添加的影响(图4C)。对于在生产阶段期间的所有培养物，将CER维持在约65mM/h且仅在60h处理时间后开始减少。
大量添加的PEI培养物的细胞外滴度概况类似于对照，而PEI培养物的连续添加展现从进料的开始时直至结束的显著更高的细胞外dAb浓度，其中所有培养物在培养物上清液中达到近似相同的产物量(约6.5g/l，参见图4E)。例如，在47.5h处理时间，连续PEI添加培养物具有4.7g/l的细胞外dAb浓度，而对照和大量PEI添加的培养物仅分别具有2g/l和2.2g/l的细胞外dAb浓度。图4F显示，对于具有PEI的连续添加的培养物，细胞内产物浓度较低，其对应于增加的细胞外产物浓度，即，由于以连续模式添加时更早添加PEI，细胞变得更渗漏。对于所有培养物，产生的产物的总量是类似的，并且在培养结束时，其范围为8.5至9.2g/l (图4G)。对照培养物的DNA浓度在诱导后20h之后急剧增加，在过程即将结束之际达到1140mg/l。PEI非常有效地降低培养物上清液中的DNA的量，将其保持在低于或约200mg/l的水平(图4D)。在图4H中，容易显而易见的是，PEI的添加改变培养物上清液中产物和DNA之间的平衡。当DNA浓度在发酵期间保持稳定而产物正逐渐从周质释放至细胞外空间，PEI处理的培养物的线几乎与x (DNA)轴垂直。因此，PEI不会引起细胞质膜的明显破坏，表明细胞保持存活，同时变成可透化的，允许产物渗漏出至细胞外空间。这与可溶性DNA浓度的非常急剧的消除一起允许更早收获且导致其中固体易于通过连续流动、试验性规模离心分离的培养液。可能的是，在细胞培养期间通过PEI添加引起的重组蛋白从周质的早期释放还将降低对宿主细胞生理的压力。
实施例7 细胞培养补充剂对细胞外dAb和相关污染物的影响
在图5A中显示细胞外dAb和总dAb产量。培养物上清液中的内毒素、DNA和HCP水平是过程相关杂质且因此产物质量的重要指标。内毒素是致发热的并在药品中必须保持低于预定最小浓度。
图5概述了图3和图4中使用的各种细胞培养补充剂在获得的最终培养液的质量方面的性能。对于对照培养物、TweenTM20和PEI处理的培养物，收获时的dAb浓度保持类似，而EDTA和EDTA-尿素具有显著较低的总值和细胞外值(~3倍)。图5B显示EDTA和EDTA-尿素培养物的内毒素:细胞外dAb比率的约3倍增加。PEI处理的培养物具有类似于对照和TweenTM20培养物的内毒素水平。释放的或在培养液中剩余的HCP不受TweenTM影响(相比于对照)，但对于EDTA降低~2倍、对于EDTA-尿素降低~3倍且对于PEI降低~1.3倍。图5C显示对于EDTA而非EDTA-尿素处理的培养物，HCP:细胞外dAb比率显著较高。PEI处理的培养物展现HCP:细胞外dAb比率的减少水平，其可归因于在PEI处理期间的更低细胞裂解或归因于通过聚阳离子沉淀这些蛋白中的一些。相比于对照和TweenTM20培养物，对于PEI培养物，发酵培养液中的最终可溶性DNA低~5倍。由于细胞外dAb低3倍，EDTA和EDTA-尿素处理的培养物展现略低的DNA:细胞外dAb比率。
实施例8：25kDa支链PEI
使用25kDa支链PEI的实验并未显示与750kDa支链PEI相同的效应。这可能是由于25kDaPEI干扰用于纯化蛋白的蛋白亲和方法。25kDa PEI似乎比750kDa形式对细胞更有毒性。呼吸数据显示在开始PEI处理后，氧消耗速率和二氧化碳释放速率两者都比当施加750kDaPEI时更快速地下降，表示细胞正在死亡。因此，细胞在更早阶段死亡且因此产生较少产物，且上清液中的几乎所有产物可能是由于细胞裂解而非细胞透化。因此，得出结论：应当经由如本文所述的方法筛选PEI变体以鉴定哪些形式和浓度(例如，经由连续添加的进料速率、或大量添加)是更优选的。
实施例9：PEI与其他抗原结合蛋白的使用
我们证实PEI发酵策略可应用于多于一种重组蛋白且其不是构建体(例如，载体或细胞系)或产物特异性的。用PEI的低进料添加(0.09g/l/h)处理与3种不同抗原(也不同于DOM0101)结合的抗原结合蛋白2、3和4，其MW近似分别为约25、14和17kDa，如实施例6中所述。在开始PEI处理之后5h、25h和50h移取用于滴度和可溶性DNA浓度的样品。
图6表明PEI进料对细胞外产物具有直接正面作用。在所有情况下，对照培养物的细胞外产物最终赶上处理的培养物。随着PEI添加后经过的时间，“较重”抗原结合蛋白产物Ab2似乎不大优先释放。然而，细胞外产物滴度的组合性增加和将细胞外可溶性DNA有效维持在远低于600mg/l(其为对于在离心阶段中的有效固体分离的限值)的水平可导致具有显著增强的细胞培养物质量的更短过程。
实施例的结论
PEI似乎对细胞生理具有极小的负面作用，且同时将DNA从培养物移除，使得其不太粘稠。另外，存在至细胞外空间的更早的产物释放/分泌，这表明膜透化。因此，在重组蛋白产生期间添加PEI作为进料或细胞培养增强剂提高细胞外产物滴度、减少发酵时间且由于在发酵期间的更低粘度而降低功率输入。此外，PEI的存在导致可溶性HCP的水平相比于测试的其他细胞培养补充剂降低。在四种不同重组蛋白的处理中，750kDa PEI处理是有效的。在所有情况下，PEI对产物的释放具有正面作用，产物:可溶性DNA的比率增强，最终产物滴度相比于对照不变，且当实现最终蛋白的完全释放时，剩余的可溶性DNA的水平远低于限值以得到适合用于通过生产规模下的连续离心而澄清的收获培养液。此外，在发酵的早期使用PEI可减少发酵时间的长度且因此降低生物过程的成本。
序列表
SEQ ID NO:1：DOM0101的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：DOM0101的DNA序列 – (无信号序列)
SEQ ID NO:3：丙氨酸延伸的DOM0101的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：C-端丙氨酸延伸的DOM0101的DNA序列 – (无信号序列)
序列表
<110> Glaxo Group Limited
<120> 产生重组蛋白的方法
<130> PB65796
<160> 4
<170> FastSEQ用于Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM101的氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu
20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DOM101的DNA序列
<400> 2
gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg 60
tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac attcctccag atggccagga cccattctat 180
gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300
aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 丙氨酸延伸的DOM101的氨基酸序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu
20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 丙氨酸延伸的DOM101的DNA序列
<400> 4
gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg 60
tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac attcctccag atggccagga cccattctat 180
gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300
aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagcgcg 360

Claims (20)

1.在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
2.释放由宿主细胞培养物表达的重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
3.降低表达重组蛋白的细胞培养物的粘度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
4.提高由细胞培养物表达的重组蛋白的细胞外浓度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
5.减少收获表达重组蛋白的细胞培养物的时间长度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白回收自细胞外培养基。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞或细胞培养物为具有周质的革兰氏阴性细菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在收获之前添加PEI。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在诱导时或诱导所述重组蛋白表达之后添加PEI。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中在从诱导所述重组蛋白的表达至收获前约30分钟的任何时间点添加PEI。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在细胞培养期间持续添加PEI。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PEI是支链的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PEI的分子量为50-1000 kDa。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PEI的分子量为约750 kDa。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白(i)是抗原结合蛋白；和/或(ii)具有25 kDa或更低的分子量(MW)。
17.药物组合物，其包含如使用权利要求1至16中任一项所述的方法获得的重组蛋白。
18.PEI作为表达重组蛋白的宿主细胞培养物的细胞培养增强剂的用途。
19.PEI作为细胞培养期间的释放剂以提高由所述细胞表达的细胞外重组蛋白滴度的用途。
20.根据权利要求18或19的用途，其中所述宿主细胞或细胞培养物是大肠杆菌和/或所述重组蛋白从细胞外培养基回收。
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