JP2018515104A - 組換えタンパク質の生成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組換えタンパク質は、抗原結合タンパク質、例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、又はドメイン抗体(dAb)を含み得る。
好適な宿主細胞としては、哺乳動物細胞、例えばCHO(例えば、CHOK1及びCHO-DG44)、PerC6;及び微生物細胞、例えばグラム陰性細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)(例えば、W3110及びBL21)、シュードモナス(Pseudomonas)及びサルモネラ(Salmonella)が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。一実施形態では、大腸菌株はW3110である。
組換えタンパク質の発現は細胞質で起こるが、組換えタンパク質の最終的な位置は、組換えタンパク質の性質、使用される宿主細胞及び使用される発酵条件に依存して、細胞質、ペリプラズム又は細胞外であり得る。
採取は発酵の終了である。採取は、発酵プロセスを終了させ、発現される組換えタンパク質を回収するのに十分であると考えられる発酵中の任意の時点におけるものであってよい。採取は、組換えタンパク質を発現するための細胞ブロスの誘導後10〜60時間に起こり得る。例えば、採取は、誘導後15〜50時間で起こり得る。採取時に、微生物細胞集団の固形物量は、5〜30%湿細胞重量(WCW)であり得る。哺乳動物細胞培養物(例えば、CHO、PerC6など)については、大腸菌と比較してより遅い分裂速度のために、組換えタンパク質採取は、典型的には8〜500時間で起こり得る。
(i)約10,000リットル;約5,000リットル;約2,000リットル;約1,000リットル;約500リットル;約125リットル;約50リットル;約20リットル;約10リットル;約5リットル;又は
(ii)5〜10,000リットル;10〜5,000リットル;20〜2,000リットル;50〜1,000リットル
であってよい。
宿主細胞及び組換えタンパク質に応じて、採取物の前処理は、採取物を調整する方法である。このステップは、発酵槽内で、又は発酵槽から採取物を取り出した後に行い得る。前処理としては、採取物を熱的、機械的又は化学的に溶解すること(例えば、ホモジナイゼーション、凍結融解、溶解);及びペリプラズム抽出が挙げられる。少なくとも1つのペリプラズム抽出物は、当技術分野で公知の方法を用いて抽出され得る。あるいは、十分な生成物が既に細胞外環境に存在する場合、このような前処理は必要とされなくてもよい。
清澄化は、固体微粒子を除去するプロセスである。清澄化は、精製中のその後のクロマトグラフィーステップにおける負担を軽減することができる。典型的な清澄化ステップは、沈降(sedimentation)(例えば重力による)としても知られる沈降(settling)ステップ、及び/又は遠心分離ステップ、及び/又はろ過ステップを含む。
組換えタンパク質は、培養培地から直接回収され得る。組換えタンパク質の回収に続いて、組換えタンパク質の十分な純度を確保するための精製が行われる。1つ以上のクロマトグラフィーステップ、例えば1つ以上のクロマトグラフィー樹脂;及び/又は1つ以上のろ過ステップが、精製に使用され得る。例えば、プロテインA又はLなどの樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて、組換えタンパク質を精製し得る。あるいは、又はこれに加えて、陽イオン交換などのイオン交換樹脂を用いて、組換えタンパク質を精製し得る。
大腸菌発現系
ペリプラズムへの分泌のためのOmpAリーダー配列を有する、約13.1kDaの分子量のVHドメイン抗体ドメインであるTNFR1 dAb(DOM0101、配列番号1)を有するプラスミドpAVE011を有する大腸菌(E. coli)W3110株を使用した。[大腸菌W3110-pAVE011-ompA-DOM0101、遺伝子型:大腸菌(F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 ラムダ]。
大腸菌細胞をグリセロール(20%、v/v)中に-80℃で保存した。バイオリアクター実験のための接種物を調製するために、1mlのグリセロールストックを、400mlのvLB接種培地(vLB Lennox:セレクトソイトン10g/l、酵母抽出物5g/L、NaCl 5g/l、pH7.0)を含有する各1000mlのバッフル付きフラスコ(UltraYield Flask、Thomson Instrument Company、Kent、UK)に接種した。このフラスコを、OD600が1に達するまで、回転振とうインキュベーター内で37℃で220rpmで増殖させた。種培養の変動性を避けるために、バイオリアクター実験の各セットについて同じ接種物を用いた。
dAb生成物の濃度は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー法を用いて測定した。調査中のサンプル中の生成物の濃度を、プロテインAクロマトグラフィー(1mL HiTrap MabSelectR Xtra、GE Healthcare Life Sciences、Buckinghamshire、UKをフィットさせたHPLC Agilent 1200、Agilent Technologies UK Ltd、West Lothian、UK)を用いて分析した。ローディング及び平衡化は、pH7.2の0.1M PBS緩衝液を用いて行った。サンプルを平衡緩衝液中で適切に希釈し、0.22μmのPVDFシリンジフィルターを用いてろ過した。20mM HClを用いて溶出を行った。溶出した生成物の量を、220nmにおける吸光度を記録することによって測定した。生成物ピーク面積は自動的に統合された(Empower、Waters、Milford、USA)。
図1は、溶解した細胞ブロスを含むある範囲の懸濁液のレオロジー特性を、可溶性DNA濃度の関数として特徴付けている。すべての溶液は、時間に依存せず、完全に可逆的である特徴的な擬塑性流動挙動を示す。べき乗則式は得られたデータを十分に表し、コンシステンシー指数(剪断速度1s-1での見かけの粘度に等しい)は、遠心分離によって清澄化しようとする際に直面する課題の示唆を与える。600mg/lのDNA濃度で得られた約0.03N sn m-2のコンシステンシー指数は、困難な遠心分離を定義する限界とみなされる。
図2は、本研究で使用した標準発酵の例を提供する。誘導後時間を用いて、発酵の進行を追う。キャパシタンスによって記録されたインタクト細胞濃度は15時間でピークに達し、その後、乾燥細胞重量のピーク及び約30時間での細胞呼吸低下(より低いCER)がすぐ後に続く(図2A)。このプロファイルは、細胞外ドメイン抗体(dAb)の顕著な上昇の開始、及び15時間での細胞内dAbの並行した減少、及び30時間での全dAbの最大レベルの達成と一致する(図2B)。DNAの放出(図2C)は、DCWの減少の開始時に急激に増加し、誘導の開始時に存在する初期の高レベルのDNAを除いて、dAbの放出と並行しているようである。
誘導後の炭素源供給速度、及び結果として得られる、dAbと核酸放出とのバランスを変化させる効果を調べた。この実施例のデータは図には示されていないが、本明細書に記載される。選択された供給速度の範囲は、過剰なグリセロール蓄積を避けるためのハイ・エンド値、及び発酵が誘導50時間後に下回るロー・エンド値に基づいた。より高い供給速度は、最初には、バイオマスレベルの小さな増加(DCWベース)又は無増加(キャパシタンスベース)をもたらし、次いでより早期の溶解、及び最終的にはより低いバイオマスレベルをもたらすようである。CER値は、供給速度増加に伴う、バイオマス活性の増加(20時間まで)及びより早い溶解開始を反映する。前述のように、DNA放出は細胞溶解の程度を反映する。最終総細胞内及び細胞外dAbレベルは、供給速度の選択にほとんど影響されないが、より大きな供給速度でのdAb生成のより高い速度は、より高いバイオマス活性を反映し、より大きな供給速度での細胞外空間へのより早い放出は、細胞溶解のより早い開始を反映する。得られたパリティプロットは、供給速度が大きいほど、DNAと比較したdAbの放出の程度が高いことを示す。達成された改善は、60%のDNA放出に対して約35%から約58%へdAb収率を増加させる。標的がdAbのほぼ完全な回収である場合には改善はない。したがって、さらなる前処理なしでdAbのより早い採取及び直接回収の機会を実現する場合、発酵中のdAbとDNA放出との関係を変える方法を探求する必要がある。
採取時にEDTA、尿素及びTween(商標)を使用して、宿主細胞からのタンパク質回収を増加させることができる。ここでは、本発明者らは、細胞培養中のそれらの使用を調べて、組換えタンパク質の細胞外濃度への影響を調べた。EDTAは細胞膜を透過性にすることができ、細胞に対して毒性である。尿素は膜の完全性に影響を与えることができ、細胞に対して毒性である。Tween(商標)は、細胞膜を透過性にすることができ、細胞培養物の発泡を引き起こす。
採取された発酵ブロスの処理を助けるためのPEIの使用は公知である(WO2014118220)。ここでは、本発明者らは、発酵自体の間のPEIの使用及び生細胞への影響に関心がある。PEIは細胞膜を透過性にすることができ、抗菌活性及び細胞傷害性を示すことができる。ここに示した結果は、驚くべきことに、PEIが細胞生存率に無視できる影響を有するようであることを示している。
細胞外dAb及び総dAb収量を図5Aに示す。培養上清中のエンドトキシン、DNA、及びHCPレベルは、プロセス関連の不純物、及びしたがって生成物品質の重要な指標である。エンドトキシンは発熱性であり、医薬品において所定の最小濃度未満に保たれなければならない。
25kDa分岐状PEIを用いた実験は、750kDa分岐状PEIと同じ効果を示さなかった。これは、25kDaのPEIがタンパク質の精製のためのタンパク質アフィニティー法を妨害するためであり得る。25kDaのPEIは、750kDaの形態よりも細胞に対してより毒性が高いようであった。呼吸データは、PEI処置の開始後、酸素消費速度及び二酸化炭素発生速度の両方が、750kDa PEIが適用された場合よりも急速に減少したことを示し、これは、細胞が死んでいることを表す。したがって、細胞がより早い段階で死滅し、結果として、より少ない生成物が生成され、上清中のほとんどすべての生成物は、おそらく細胞透過性よりも細胞溶解によるものであった。したがって、どの形態及び濃度(例えば、連続添加又はバルク添加による供給速度)がより好ましいかを同定するために、本明細書に記載のアプローチを介してPEIバリアントをスクリーニングすべきであると結論付けられた。
本発明者らは、PEI発酵戦略が2つ以上の組換えタンパク質に適用可能であり、構築物(例えば、ベクター又は細胞株)又は生成物に特異的でないことを確認する。約25、14及び17kDaのそれぞれの分子量を有する、3つの異なる抗原(DOM0101とも異なる)に結合する抗原結合タンパク質2、3及び4を、実施例6に記載されるようにPEI(0.09g/l/h)の低供給添加で処理した。力価及び可溶性DNA濃度のためのサンプルを、PEI処理開始5、25時間及び50時間後に回収した。
PEIは、細胞生理学にほとんど負の影響を及ぼさず、同時に、培養物からDNAを除去し、粘性を低下させると思われる。さらに、細胞外空間へのより早い生成物の放出/分泌があり、膜透過性を示唆する。したがって、組換えタンパク質生成中の供給又は細胞培養エンハンサーとしてのPEIの添加は、細胞外生成物の力価を増加させ、発酵時間を短縮し、発酵中のより低い粘度に起因して電力入力を低下させる。さらに、PEIの存在は、試験した他の細胞培養補助剤と比較して、可溶性HCPレベルの低下をもたらす。750kDa PEI処理は、4種の異なる組換えタンパク質の処理に有効であった。すべての場合において、PEIは生成物の放出に正の効果を有し、可溶性DNAに対する生成物の比が高められ、最終生成物力価は対照と比較して変化せず、最終タンパク質の完全放出が達成されたとき、残存する可溶性DNAのレベルは、製造規模での連続的遠心分離による清澄化に適した採取ブロスを得るための限界をはるかに下回っていた。さらに、発酵の初期段階でのPEIの使用は、発酵時間の長さを短縮することができ、結果としてバイオプロセスのコストを低減することができる。
配列番号1:DOM0101のアミノ酸配列
Claims (20)
- 細胞培養期間中にPEIを添加することを含む、宿主細胞において組換えタンパク質を生成する方法。
- 細胞培養期間中にPEIを添加することを含む、宿主細胞培養物によって発現される組換えタンパク質を放出させる方法。
- 細胞培養期間中にPEIを添加することを含む、組換えタンパク質を発現する細胞培養物の粘度を低下させる方法。
- 細胞培養期間中にPEIを添加することを含む、細胞培養物によって発現される組換えタンパク質の細胞外濃度を増加させる方法。
- 細胞培養期間中にPEIを添加することを含む、組換えタンパク質を発現する細胞培養物の採取までの時間の長さを短縮する方法。
- 組換えタンパク質が、細胞外培地から回収される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞又は細胞培養物が、ペリプラズムを有するグラム陰性細菌である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- グラム陰性細菌が、大腸菌(Escherichia coli)である、請求項7に記載の方法。
- PEIが、採取の前に添加される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- PEIが、組換えタンパク質の発現の誘導時又は誘導後に添加される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- PEIが、組換えタンパク質の発現の誘導から採取の約30分前までの任意の時点に添加される、請求項9又は10に記載の方法。
- PEIが、細胞培養期間中、連続的に添加される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- PEIが分岐状である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- PEIの分子量が50〜1000kDaである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- PEIの分子量が約750kDaである、請求項14に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、(i)抗原結合タンパク質である、及び/又は(ii)25kDa以下の分子量(MW)を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる組換えタンパク質を含む、医薬組成物。
- 組換えタンパク質を発現する宿主細胞培養物の細胞培養エンハンサーとしての、PEIの使用。
- 細胞によって発現される細胞外組換えタンパク質力価を増加させるための細胞培養期間中の放出剤としての、PEIの使用。
- 宿主細胞又は細胞培養物が大腸菌(Escherichia coli)であり、及び/又は組換えタンパク質が細胞外培地から回収される、請求項18又は19に記載の使用。
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