ES2836780T3 - Procedimiento de producción de una proteína recombinante - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una proteína recombinante en una célula hospedadora, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de producción de una proteína recombinante

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una proteína recombinante en una célula hospedadora que comprende añadir polietilenimina (PEI) durante el cultivo celular. La adición de PEI al cultivo celular como potenciador de la fermentación puede dar como resultado una reducción de la viscosidad del cultivo celular y/o un aumento de la concentración extracelular de la proteína recombinante y/o una reducción de la duración del cultivo celular hasta el momento de recolección o recuperación de la proteína.

Antecedentes de la invención

La fabricación, recuperación y purificación a gran escala y rentable de proteínas recombinantes son desafíos importantes para la industria biotecnológica.

Las células hospedadoras de E. coli y de ovario de hámster chino (CHO) son dos de los organismos más ampliamente utilizados para la producción de proteínas recombinantes. Las consideraciones durante la producción incluyen crecimiento de células hospedadoras y expresión de proteína recombinante, título de proteínas, localización de proteínas (por ejemplo, intracelular, extracelular, periplásmica, etc.), y recuperación y purificación selectivas desde la localización final de la proteína recombinante. Equilibrar y optimizar estos diferentes factores no es sencillo. En consecuencia, existe la necesidad de procedimientos mejorados para producir, recuperar y purificar proteínas recombinantes.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una proteína recombinante en una célula hospedadora que comprende añadir PEI durante el cultivo celular.

También se proporciona un procedimiento para liberar proteína recombinante expresada por un cultivo de células hospedadoras que comprende añadir PEI durante el cultivo celular.

También se proporciona un procedimiento para reducir la viscosidad de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante, que comprende añadir PEI durante el cultivo celular.

También se proporciona un procedimiento para aumentar la concentración extracelular de una proteína recombinante expresada por el cultivo celular, que comprende añadir PEI durante el cultivo celular.

También se proporciona un procedimiento para reducir el tiempo hasta la recolección de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante, que comprende añadir PEI durante el cultivo celular.

Se describe una composición farmacéutica que comprende una proteína recombinante obtenida usando los procedimientos descritos en el presente documento.

También se proporciona el uso de PEI como un complemento de cultivo celular durante el cultivo celular de un cultivo de células hospedadoras que expresa una proteína recombinante.

También se proporciona el uso de PEI como agente de liberación durante el cultivo celular para aumentar el título de proteínas recombinantes extracelulares expresadas por las células.

Descripción de las figuras

Figura 1: Propiedades reológicas de los caldos de fermentación de E. coli como una función de la concentración de ADN extracelular. (o) antes de la inducción de 0-20 h, concentración celular de 0 a 30 g dwt/l; (•) después de la inducción 20-65 h, concentración celular 30 a 40 g dwt/l. Los datos reológicos son para ajustes de la ley de potencia, t = kYn , (R2 = 0,99), y = 37 a 1200 s-1 para barridos de 30 s tanto de cizallamiento creciente como decreciente (no se observa diferencia significativa en valores de tensión de cizallamiento entre los barridos). Para [ADN] > 1000 mg/ml, algunas muestras parecían mostrar un elevado límite elástico aparente y no había cizallamiento. Temperatura 23 °C.

Figura 2: Producción de DOM0101 (dAb) mediante fermentación y construcción de un gráfico de paridad que relaciona dAb y la liberación de ADN. A- Perfil del peso celular seco (DCW), capacitancia y tasa de evolución del dióxido de carbono (CER); B- Perfiles de dAb extracelular, intracelular y total; C- Perfiles de ADN liberado al espacio extracelular; D- Gráfico de paridad que compara la liberación en el entorno extracelular de dAb y ADN.

100 % de liberación de ADN = 0,031 * DCW máximo de la célula. Construcción: la línea de paridad (_) es la línea de una liberación idéntica de dAb y ADN desde la inducción (0 % de dAb, 17 % de ADN); el límite de liberación del ADN (-----) se refiere al límite superior más allá del cual las proteínas reológicas del caldo son tales que la centrifugación se considera demasiado compleja.

Figura 3: Efecto de suplementos de cultivo celular EDTA, EDTA-urea y Tween™ 20 en la producción de dAb (DOM01010) y concentraciones extracelulares relativas de dAb y ADN. Perfiles de tiempo de A- peso celular seco (DCW), B- capacitancia a 1000 KHz C- tasa de evolución de dióxido de carbono (CER), D- liberación de ADN al espacio extracelular E- concentración de dAb extracelular, F- concentración de dAb intracelular y G-concentración total de dAb y H- gráfico de paridad que compara la liberación al medio extracelular tanto del producto dAb como de ADN para el cultivo de control, cultivos tratados con EDTA 125 mM a 5 ml/l/h hasta [EDTA] final de 18 mM, tratados con EDTA 125 mM y urea 7,5 M a 5 ml/l/h hasta [EDTA] final de 18 mM y [urea] de 1 M, y TweenTM 20 incrementalmente durante 23 h (hecho de una manera controlada para evitar la formación excesiva de espuma) a una concentración final de 20 ml/l. La línea en el tiempo de proceso de 35 h significa el comienzo de la alimentación con EDTA y EDTA-urea. Para la figura 3H, los puntos cerrados corresponden al % de liberación de dAb extracelular frente al nivel máximo alcanzado en las fermentaciones con EDTA o EDTA-urea; los puntos abiertos corresponden al % de liberación de dAb frente el máximo como se obtiene en el control. Figura 4: Efecto del suplemento de cultivo celular PEI sobre la producción de dAb (DOM0101) y las concentraciones extracelulares relativas de dAb y ADN. Perfiles de tiempo de A - peso celular seco (DCW), B -capacitancia a 1000 KHz, C - tasa de evolución de dióxido de carbono (CER), D - liberación de ADN al espacio extracelular, E - concentración de dAb extracelular, F - concentración de dAb intracelular y G - concentración total de dAb, y H - gráfico de paridad que compara la liberación al medio extracelular tanto del producto dAb como de ADN para el cultivo de control, cultivos tratados con PEI hasta una concentración final de alrededor de 5 g/l, añadida a granel, a baja y alta velocidad de alimentación (0,09 g/l/h y 0,16 g/l/h, respectivamente). Las líneas verticales a un tiempo de proceso de 35 h y 42 h significan el inicio de las adiciones de PEI a granel y las adiciones continuas de PEI, respectivamente.

Figura 5: Repercusión del suplemento de cultivo celular en dAb extracelular y contaminantes asociados. Todas las fermentaciones se llevaron a cabo durante 45 horas después de la inducción y alcanzaron una densidad celular final de ~25-30 g dwt/l. Los suplementos se aplicaron como se describe en la figura 4. 5A - dAb total producido y dAb extracelular. Los niveles de contaminantes se comparan con estos niveles de dAb extracelular como una relación en las figuras B-D. 5B - endotoxina; 5C - Proteína de la célula hospedadora (HCP); 5D -ADN.

Figura 6: Efecto del tratamiento con PEI (0,09 g/l/h) sobre el producto de proteína de unión al antígeno extracelular. Figuras 6A, B y C para 5 h, 25 h y 50 h después de la adición de PEI, respectivamente; y concentración de ADN soluble en las figuras 6D, E y F para 5 h, 25 h y 50 h después de la adición de PEI, respectivamente; para cuatro proteínas de unión a antígeno recombinante diferentes (incluyendo DOM0101/TNFR1-dAb), los PM de las proteínas de unión a antígeno varían entre 13 y 25 kDa. El producto extracelular relativo es el aumento proporcional en las proteínas de unión a antígeno liberadas (= proteína de unión a antígeno liberada usando ^p Eⁱ como proporción de proteína de unión a antígeno liberada en la recolección sin PEI). La aplicación de PEI comenzó ~4 h después de la inducción del producto de proteína de unión a antígeno recombinante.

Descripción detallada

La presente divulgación implica el entendimiento de que es posible un procedimiento más rentable y eficaz para producir, recuperar y purificar proteína recombinante usando polietilenimina (PEI) en la fermentación, es decir, añadiendo PEI al medio de cultivo durante el cultivo celular.

El cultivo celular como se usa en la presente divulgación tiene su significado más amplio, a saber, el crecimiento a granel de las células en un medio de crecimiento. «Fermentar» y «cultivar» como se usan en el presente documento significan hacer crecer a granel las células en un medio de crecimiento. Los términos «fermentación» y «cultivo» se usan de manera indistinta en el presente documento. Las células no están en la fase de reposo. La fase exponencial es un período caracterizado por duplicación celular, por lo tanto, crecimiento a granel. El número de nuevas células que aparecen por unidad de tiempo aumenta significativamente y es proporcional a la población existente. La fase estacionaria es donde la tasa de crecimiento y la tasa de mortalidad de las células es igual a menudo debido a un factor limitante del crecimiento tal como el agotamiento de un nutriente esencial y/o la formación de un producto inhibidor tal como un ácido orgánico. Para mantener una biomasa constante en la fase estacionaria y, por lo tanto, el crecimiento a granel, las células deben seguir creciendo. En un modo de realización, se añade PEI durante el cultivo celular mientras que las células están creciendo activamente y expresan proteína recombinante, es decir, las células no están en reposo. En un modo de realización, la adición de PEI es anterior a la recolección.

Las expresiones medio extracelular, caldo de cultivo, sobrenadante, medio extracelular, espacio extracelular, medio de cultivo y medio de fermentación, se usan todos en el presente documento para describir el medio externo de las células durante el cultivo celular y en el momento de recolección.

El término recolección se usa en el presente documento para indicar el final de la fermentación. La recolección puede ser en cualquier momento durante la fermentación que se considere suficiente para finalizar el proceso de fermentación y recuperar la proteína recombinante que se expresa, es decir, la recuperación de proteína comienza en el momento de recolección. El tiempo de recolección puede depender de la concentración óptima de proteína recombinante en el sobrenadante. La proteína recombinante puede recuperarse y purificarse directamente del medio extracelular del cultivo celular en la recolección. De forma alternativa, las células pueden separarse del medio extracelular antes de la recuperación y purificación del producto del medio extracelular.

La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico formado por aminas primarias, secundarias y terciarias, (C2H5N)n.

La PEI no se usa en el presente documento como un agente de transfección, ni se usa la PEI en el presente documento como un factor de unión para el cultivo celular.

En consecuencia, los procedimientos en el presente documento describen el uso de PEI como potenciador del cultivo celular (o suplemento de cultivo celular) que da como resultado múltiples ventajas, que incluyen una o más de las siguientes: reducción de la viscosidad del cultivo celular; y/o aumento del título de proteína recombinante extracelular; y/o localización del producto en el sobrenadante en un punto temporal anterior; y/o reducción del tiempo hasta la recolección del cultivo celular; y/o un nivel menor de contenido de impurezas (por ejemplo, ADN, HCP) en el sobrenadante, y/o recuperación más simple y procesamiento posterior. Por lo tanto, PEI se usa en los procedimientos del presente documento como potenciador de la fermentación (o cultivo celular). La PEI se añade al cultivo celular como un suplemento (o agente) de cultivo celular. En un aspecto, describimos el uso de PEI como un suplemento de cultivo celular antes de la recolección de un cultivo de células hospedadoras que expresa una proteína recombinante para reducir la viscosidad del cultivo celular. En otro aspecto, describimos el uso de PEI como un suplemento de cultivo celular antes de la recolección de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante para aumentar la concentración extracelular de la proteína recombinante. En un aspecto adicional, describimos el uso de PEI como un suplemento de cultivo celular antes de la recolección de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante para reducir el tiempo hasta la recolección.

La PEI puede usarse en el presente documento como un agente permeabilizante de membrana (también denominado agente de liberación; los términos se usan de forma indistinta) para aumentar el título de proteína recombinante extracelular. La PEI como agente de liberación puede usarse cuando la proteína recombinante se dirige al periplasma de una bacteria gramnegativa, tal como E. Coli , para liberar proteína expresada/localizada periplásmicamente al medio extracelular.

Los procedimientos en el presente documento describen el uso de PEI como potenciador de cultivo celular que puede dar como resultado mayores cantidades de producto de proteína recombinante en el sobrenadante, y/o localización del producto en el sobrenadante en un punto temporal anterior. Por lo tanto, el momento de recolección puede cambiarse a un punto temporal anterior porque se localiza suficiente proteína recombinante en el medio extracelular en presencia de PEI.

La concentración de proteína recombinante en el medio extracelular puede ser al menos 2 veces mayor en presencia de PEI. Por ejemplo, la concentración de proteína recombinante es al menos 3 veces, o al menos 4 veces, o al menos 5 veces, o al menos 6 veces, o al menos 7 veces, o al menos 8 veces, o al menos 9 veces, o al menos 10 veces, mayor en presencia de PEI. Esto puede ser en cualquier punto temporal durante la fermentación o en el momento de recolección.

El punto temporal de recolección puede ser al menos 5 horas antes en presencia de PEI que en ausencia de PEI, sin afectar significativamente al rendimiento del producto. Por ejemplo, la recolección puede ocurrir al menos 10 horas, al menos 15 horas, al menos 20 horas, al menos 25 horas, al menos 30 horas, al menos 35 horas, al menos 40 horas, al menos 45 horas o al menos 50 horas, antes en presencia de PEI que en ausencia de PEI sin afectar significativamente al rendimiento del producto. El rendimiento del producto se determina midiendo la concentración de proteína recombinante en presencia de PEI y en ausencia de PEI. No se observa un impacto significativo en los resultados rendimiento del producto cuando se observa un mayor rendimiento del producto en un punto temporal anterior en presencia de PEI, en comparación con un rendimiento del producto significativamente similar en un punto temporal posterior en ausencia de PEI.

La PEI se puede añadir como adiciones a granel únicas o múltiples o como una adición continua durante la totalidad o parte de la fermentación. Por ejemplo, la PEI se puede añadir antes de la recolección. Se puede añadir PEI en el momento de la inducción de la expresión de la proteína recombinante o después de inducir la expresión de la proteína recombinante. La PEI se puede añadir en cualquier momento desde la inducción de la expresión de la proteína recombinante hasta aproximadamente 30 minutos antes de la recolección.

La PEI se puede añadir al cultivo celular al menos 30 minutos antes de la recolección. La PEI se puede añadir al cultivo celular al menos 1 hora, o al menos 2, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50 horas antes de la recolección.

La PEI se puede añadir al cultivo celular en cualquier momento entre la inducción y la recolección en un sistema de expresión celular inducible. La PEI se puede añadir en el momento de la inducción de la expresión de la proteína recombinante. De forma alternativa, la PEI se puede añadir al menos 1 hora, o al menos 2, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25; o al menos 30; o al menos 40; o al menos 50; o al menos 60 horas después de inducir la expresión de la proteína recombinante.

La PEI puede estar presente en el cultivo celular durante al menos 30 minutos. La PEI puede estar presente en el cultivo celular durante 1-60 horas, o entre 1-50 horas, o entre 1-40 horas.

La PEI puede añadir de forma continua durante el cultivo celular. Esto es similar a la «alimentación» o «velocidad de alimentación» de medios, nutrientes y factores de crecimiento, que pueden añadir de forma continua al cultivo celular. En un modo de realización, la PEI se añade al cultivo celular a una velocidad de aproximadamente 0,01 a 1 g/l/hora, o de 0,03 a 0,3 g/l/hora, o de 0,05 a 0,2 g/hora/hora. En otro modo de realización, la PEI se añade a una velocidad de 0,09 g/l/hora o 0,16 g/l/hora. En un modo de realización, la PEI se añade al cultivo celular a una velocidad de aproximadamente 0,1 a 10 ml/l/hora, o de 0,5 a 5 ml/l/hora, o de 1 a 3 ml/l/hora. En otro modo de realización, la PEI se añade a una velocidad de 1,5 ml/l/h o 2,5 ml/l/h.

La PEI puede añadirse al cultivo celular como una adición a granel. Puede ser una adición a granel única o adiciones a granel múltiples.

La cantidad total de PEI añadida al cultivo celular mediante adiciones continuas o a granel puede ser de aproximadamente 10 g/l o menos. Por lo tanto, en el momento de recolección (el final de la fermentación) la PEI puede tener una concentración en el cultivo celular de aproximadamente 10 g/l o menos. En otro modo de realización, la cantidad total de PEI añadida al cultivo celular es aproximadamente 5 g/l, o 4 g/l, o 3 g/l, o 2,5 g/l, o 2 g/l o menos. En células de mamífero, la concentración total de PEI en el cultivo celular puede estar entre 0,025 y 250 |jg/ml.

La PEI utilizada en los procedimientos de la divulgación puede ser ramificada o lineal. En un modo de realización, la PEI es ramificada.

El peso molecular (PM) de la PEI para uso en los procedimientos de la divulgación está entre aproximadamente 600 Da y aproximadamente 1000 kDa. En un modo de realización, el PM de la PEI está entre 50 y 1000 kDa. En un modo de realización, el PM de la PEI es aproximadamente 750 kDa. En un modo de realización, la PEI está ramificada y tiene un PM de 50 a 1000 kDa. De forma alternativa, la PEI está ramificada y tiene un PM de aproximadamente 750 kDa.

En un modo de realización, la cantidad de ADN soluble presente en el medio extracelular en presencia de PEI se reduce en comparación con la ausencia de PEI. En un modo de realización, la cantidad de ADN presente en el medio extracelular en presencia de PEI es al menos 2 veces menor que en ausencia de PEI. Por ejemplo, la concentración de ADN es al menos 3 veces, o al menos 4 veces, o al menos 5 veces, o al menos 6 veces menor en presencia de PEI. Esto puede ser en cualquier punto temporal durante la fermentación o en el momento de recolección.

En un modo de realización, la concentración de ADN soluble que queda en el sobrenadante después de la adición de PEI es inferior a 600 mg/l, inferior a 500 mg/l, inferior a 400 mg/l, inferior a 300 mg/l o inferior a 250 mg/l. En un modo de realización, la concentración de ADN en la recolección es de aproximadamente 250 mg/l.

La divulgación también proporciona un procedimiento para reducir la viscosidad de un cultivo celular cultivando las células en presencia de PEI. En un modo de realización, la viscosidad en presencia de PEI se reduce al menos en un factor de 2 frente a en ausencia de PEI. Por ejemplo, la viscosidad se reduce al menos en un factor de 3, o al menos en un factor de 4, o al menos en un factor de 5, o al menos en un factor de 6 frente a en presencia de PEI. Esto puede ser en cualquier punto temporal durante la fermentación o en el momento de recolección.

Por lo tanto, la PEI actúa como un potenciador de la fermentación para reducir la viscosidad y/o reducir la concentración de ADN en el cultivo celular (i) durante la fermentación y/o (ii) en el momento de recolección. Esto puede dar como resultado muchas ventajas, incluyendo una o más de: contenido de impurezas más bajo en el medio extracelular, manipulación más eficiente, recuperación más sencilla de las células/producto en el momento de recolección y procesamiento posterior mejorado.

«Aproximadamente» como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor mensurable, tal como una cantidad, se entiende que un peso molecular, una duración temporal y similares, abarca variaciones de un ±1 %, un ±0,75 %, un ±0,5 %, un ±0,25 % , un ±0,2 % y un ±0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos descritos.

Proteína recombinante

La proteína recombinante puede comprender una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de dominio (dAb).

La proteína recombinante puede comprender una proteína vírica, una toxina bacteriana, un toxoide bacteriano o un antígeno cancerígeno.

Como se usa en el presente documento, una «proteína recombinante» se refiere a cualquier proteína y/o polipéptido que puede administrarse a un mamífero para provocar una respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano. La proteína recombinante puede provocar más de una respuesta biológica o médica. Además, la expresión «cantidad terapéuticamente eficaz» significa cualquier cantidad que, en comparación con un sujeto correspondiente que no ha recibido dicha cantidad, da como resultado, sin limitarse a él, una curación, prevención o mejoría de una enfermedad, trastorno o efecto secundario, o una disminución en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno. El término también incluye dentro de su alcance cantidades eficaces para mejorar la función fisiológica normal así como cantidades eficaces para causar una función fisiológica en un paciente que potencia o ayuda en el efecto terapéutico de un segundo agente farmacéutico.

La expresión «proteína de unión a antígeno» como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteínas, tales como dominios, que son capaces de unirse a un antígeno.

El término «anticuerpo» se usa en el presente documento en el sentido más amplio para referirse a moléculas con un dominio de tipo inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, «dominio de tipo inmunoglobulina» se refiere a una familia de polipéptidos que conservan el plegamiento de la inmunoglobulina característico de las moléculas de anticuerpo, que contienen dos láminas b y, habitualmente, un enlace disulfuro conservado. Esta familia incluye anticuerpos monoclonales (por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados; un único dominio variable, un anticuerpo de dominio, fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunológicamente eficaces, Fab, F(ab')2, Fv, Fv unido a disulfuro, Fv monocatenario, diacuerpos, TANDABS™, etc. (para un resumen de formatos de «anticuerpos» alternativos, véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, ² O⁰⁵ , Vol 23, n.° 9, 1126-1136).

La expresión «único dominio variable» se refiere a un dominio variable de proteína de unión a antígeno (por ejemplo, VH, VHH, VL) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio variable diferente. Un «anticuerpo de dominio» o «dAb» se puede considerar igual que un «único dominio variable». Como se usa en el presente documento, «dominio» se refiere a una estructura de proteína plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas y, en muchos casos, pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Por dominio variable único de anticuerpo o dominio variable único de inmunoglobulina se entiende un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de un dominio variable de anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o dominios variables de anticuerpos que han sido truncados o comprenden extensiones N-terminales o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos en parte la actividad de unión y la especificidad del dominio de longitud completa.

Un anticuerpo de dominio puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables en los que el dominio variable único de inmunoglobulina no requiere las otras regiones o dominios para la unión al antígeno (es decir, en los que el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales).

El anticuerpo de dominio puede ser un dominio variable de anticuerpo humano. El dAbTM puede ser de origen humano. En otras palabras, el dAbTM puede basarse en una secuencia estructural de Ig humana.

Como se usa en el presente documento, la expresión «sitio de unión a antígeno» se refiere a un sitio en una proteína de unión a antígeno que es capaz de unirse específicamente a un antígeno; este puede ser un dominio único, o pueden ser dominios VH/VL emparejados como se puede encontrar en un anticuerpo convencional. Los dominios de Fv monocatenario (ScFv) también pueden proporcionar sitios de unión a antígeno.

La proteína de unión a antígeno puede comprender sitios de unión a antígeno adicionales para diferentes antígenos. Por ejemplo, la proteína de unión al antígeno puede tener especificidad por más de un antígeno, por ejemplo dos antígenos, o por tres antígenos o por cuatro antígenos.

La proteína de unión a antígeno puede consistir, o consistir esencialmente, en una región Fc de un anticuerpo, o una parte del mismo, unida en cada extremo, directa o indirectamente (por ejemplo, a través de una secuencia conectora) a un dominio de unión. Dicha proteína de unión a antígeno puede comprender dos dominios de unión separados por una región Fc, o parte de la misma. Por separado se entiende que los dominios de unión no están directamente conectados entre sí, y pueden estar situados en extremos opuestos (extremos C y N) de una región Fc, o cualquier otra región de armazón.

La proteína de unión a antígeno puede comprender dos regiones de armazón, cada una unida a dos dominios de unión, por ejemplo, en los extremos N y C de cada región de armazón, directa o indirectamente a través de un conector. Cada dominio de unión puede unirse a un antígeno diferente.

La proteína de unión a antígeno puede tomar el formato de armazón de proteína de un mAbdAb. «mAbdAb» y «dAbmAb» se usan indistintamente y se pretende que tengan el mismo significado que el que se usa en el presente documento. Dichas proteínas de unión a antígeno comprenden un armazón de proteína, por ejemplo, un armazón de Ig tal como IgG, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que se conecta a un dominio de unión adicional, por ejemplo, un anticuerpo de dominio. Un mAbdAb tiene al menos dos sitios de unión a antígeno, al menos uno de los cuales es de un anticuerpo de dominio, y al menos uno es de un dominio de VH/VL emparejado.

Los anticuerpos de dominio pueden existir y unirse a la diana en formas monoméricas o multiméricas (por ejemplo, diméricas) y pueden usarse en combinación con otras moléculas para estrategias de formateo y direccionamiento. Por ejemplo, se puede preparar una proteína de unión a antígeno que tiene dominios múltiples en la que uno de los dominios se une a proteínas séricas tales como albúmina. Los anticuerpos de dominio que se unen a la seroalbúmina (AlbudAbs) se describen, por ejemplo, en el documento WO05/118642 y pueden proporcionar al compañero de fusión del dominio una semivida en suero extendida en sí misma.

dAbs también puede conjugarse con otras moléculas, por ejemplo, en forma de un conjugado de dAb o una fusión de dAb con otras moléculas, por ejemplo, un fármaco, otra proteína, una molécula de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, un dAbTM puede estar presente como un dAbTM formateado, por ejemplo, el dAbTM puede estar presente como una fusión o conjugado dAb-Fc como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/149148. De forma alternativa, el dAbTM formateado puede estar presente como un mAbdAb, como se describe en el documento WO 2009/068649. El dAbTM puede estar presente como una fusión o conjugado con proteínas o polipéptidos que extienden la semivida, por ejemplo, un dAbTM adicional que se une a la albúmina sérica (AlbudAb) o a un resto químico que extiende la semivida tal como polietilenglicol (PEG). El dAbTM puede estar presente como una fusión o conjugado con otras moléculas terapéuticas o activas.

Como se usa en el presente documento, «fármaco» se refiere a cualquier compuesto (por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido) que se puede administrar a un individuo para producir un efecto terapéutico o de diagnóstico beneficioso mediante la unión y/o alteración de la función de una molécula diana biológica en el individuo. La molécula diana puede ser una molécula diana endógena codificada por el genoma del individuo (por ejemplo, una enzima, un receptor, un factor de crecimiento, una citocina codificada por el genoma del individuo) o una molécula diana exógena codificada por el genoma de un patógeno. El fármaco puede ser un dAbTM o mAb.

Un «conjugado dAb» se refiere a una composición que comprende un dAbTM con el que un fármaco se conjuga químicamente por medio de un enlace covalente o no covalente. Preferentemente, el dAbTM y el fármaco se unen covalentemente. Dicho enlace covalente podría ser a través de un enlace peptídico u otro medio tal como a través de una cadena lateral modificada. La unión no covalente puede ser directa (por ejemplo, interacción electrostática, interacción hidrófoba) o indirecta (por ejemplo, a través de unión no covalente de socios de unión complementarios (por ejemplo, biotina y avidina), en la que un compañero se une covalentemente al fármaco y el compañero de unión complementario se une covalentemente al dAbTM). Cuando se emplean compañeros de unión complementarios, uno de los compañeros de unión se puede unir covalentemente al fármaco directamente o a través de un resto conector adecuado, y el compañero de unión complementario se puede unir covalentemente al dAbTM directamente o a través de un resto conector adecuado.

Como se usa en el presente documento, «fusión de dAb» se refiere a una proteína de fusión que comprende un dAbTM y un fármaco polipeptídico (que podría ser un polipéptido, un dAbTM o un mAb). El dAbTM y el fármaco polipeptídico están presentes como partes separadas (restos) de una única cadena polipeptídica continua.

Por lo tanto, los procedimientos de la divulgación se pueden aplicar a una o más de: una proteína terapéutica, un anticuerpo monoclonal (mAb), un anticuerpo de dominio (dAbTM), un conjugado dAbTM, una fusión dAbTM, un mAbdAb, o cualquier otra proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento.

En un modo de realización, la proteína de unión a antígeno es un dAbTM que interfiere en la señalización del TNFa. En un modo de realización, el dAbTM neutraliza el TNFa. En un modo de realización, el dAbTM se une específicamente al TNFa o a un receptor del TNFa. En un modo de realización, el dAbTM se une específicamente al TNFR1. En un modo de realización, la proteína de unión a antígeno es VH dAbTM (anti-TNFR1)/DOM0101) de SEQ ID NO: 1 (DOM0101); o SEQ ID NO: 3 (DOM0101 C-terminal con alanina extendida).

Expresión de proteína: Célula hospedadora

Las células hospedadoras adecuadas incluyen células de mamífero tales como CHO (por ejemplo, CHOK1 y CHO-DG44), PerC6; y células microbianas tales como bacterias gramnegativas, por ejemplo, Escherichia coli (por ejemplo, W3110y BL21), Pseudomonas y Salmonella . En un modo de realización específico, la célula hospedadora es E. coli. En un modo de realización, la cepa de E. coli es W3110.

En el presente documento también se describe un vector que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína recombinante. Dichos vectores se emplean para diseñar genéticamente células para expresar el producto de proteína deseado. El vector puede ser un vector de expresión que comprende uno o más elementos o secuencias de control de la expresión que están unidos operativamente al ácido nucleico recombinante. Los ejemplos de vectores incluyen plásmidos y fagémidos.

Los vectores de expresión adecuados pueden contener varios componentes, por ejemplo, un origen de replicación, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de la expresión, como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, promotor, potenciador, terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia de señal o secuencia líder. Los elementos de control de expresión y una secuencia de señal, si están presentes, pueden ser proporcionados por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control de la transcripción y/o la traducción de un ácido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo pueden usarse para dirigir la expresión.

Se puede proporcionar un promotor para la expresión en una célula deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede unirse operativamente a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, cadena de anticuerpo o una porción del mismo, de manera que dirige la transcripción del ácido nucleico. Se puede usar varios promotores adecuados para bacterias gramnegativas (por ejemplo, promotores lac, tac, trp, phoA, lambdapL, T3, T7 (T7A1, T7A2, T7A3) para E. coli). Las secuencias de operador que pueden emplearse incluyen lac, gal, deo y gin. Se pueden emplear una o más secuencias perfectas de operador palindrómico. En un modo de realización, la expresión de la proteína recombinante de la divulgación está bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, los promotores lac, tac y trc para E.coli son inducibles con lactosa o el análogo de lactosa no hidrolizable, isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y los promotores phoA, trp y araBAD son inducibles por fosfato, triptófano y L-arabinosa, respectivamente.

La expresión «expresión inductora» como se usa en el presente documento se refiere al momento en el que se inicia la inducción, por ejemplo, mediante la adición de un inductor o un cambio de temperatura en el que la inducción depende de la temperatura. La expresión «después de la inducción» se usa en este documento para describir el tiempo transcurrido después del momento en el que se inicia la inducción.

Además, los vectores de expresión comprenden normalmente un marcador seleccionable para la selección de células que portan el vector y, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o a fármacos son marcadores seleccionables frecuentes y pueden usarse (por ejemplo, gen de lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en varias células.

Se puede usar un vector de expresión como se describe en el documento WO2007/088371 (por ejemplo, pAVE037, pAVE007 o pAVE011) para expresar la proteína. En un modo de realización, el vector es pAVE011. De forma alternativa, un vector tal como pJExpress401 puede usarse para expresar la proteína.

También se conocen ejemplos de vectores de expresión alternativos y metodologías (por ejemplo, para usar con CHO, PerC6, etc.).

La célula hospedadora comprende la molécula o vector de ácido nucleico recombinante descrito anteriormente. Los cultivos de células hospedadoras de la presente divulgación se pueden cultivar en cualquier medio que soporte el crecimiento de la célula hospedadora y la expresión de la proteína recombinante. Dichos medios se conocen bien por los expertos en la técnica.

Direccionamiento de proteínas

Aunque la expresión de una proteína recombinante tiene lugar en el citoplasma, la localización final de la proteína recombinante puede ser citoplásmica, periplásmica o extracelular dependiendo de la naturaleza de la proteína recombinante, la célula hospedadora utilizada y las condiciones de fermentación utilizadas.

El uso de PEI en la presente invención puede ser con respecto a una proteína recombinante que está dirigida a (i) el periplasma de la célula o (ii) el medio extracelular, mediante una secuencia líder. La proteína recombinante se puede dirigir a través de una secuencia líder al medio extracelular (por ejemplo, en células de mamífero) o al periplasma (por ejemplo, en bacterias gramnegativas).

En células de mamífero, se usa una secuencia líder secretora para dirigir la proteína recombinante al medio extracelular. En las bacterias gramnegativas, algunas proteínas secretadas se exportan a través de las membranas internas y externas en una sola etapa a través de las vías de secreción tipo I, tipo III, tipo IV o tipo VI, mientras que otras proteínas se exportan primero al periplasma a través de las vías Sec o Tat universales y luego se translocan a través de la membrana externa principalmente a través de la maquinaria de tipo II o tipo V. El sistema de tipo II implica un proceso de dos etapas en el que una proteína prematura que contiene una secuencia líder Sec se exporta al periplasma mediante la vía Sec. La secuencia líder se elimina mediante proteólisis, lo que da como resultado una proteína madura procesada que está presente en el periplasma y si la proteína se secreta o no al medio de cultivo depende en gran medida de las características de la secuencia líder, proteína, célula y condiciones de cultivo. También en el caso de la lisis celular (autólisis) se puede suponer que la mayor parte de la proteína en el medio de cultivo se origina en el periplasma y, por lo tanto, se procesa. La proteína recombinante puede secretarse activamente al medio de cultivo a través de la secuencia líder; o pasivamente desde el periplasma al medio de cultivo a través de otras vías celulares conocidas en la técnica.

El procesamiento de la secuencia líder incluye la escisión y la eliminación de la secuencia líder de la proteína. Sin embargo, se sabe que algunos aminoácidos de la secuencia líder permanecen en el extremo N de la proteína, de forma que la secuencia líder no se procesa adecuadamente. La secuencia líder puede procesarse al 90 % o más, de forma que el 10 % o menos de la secuencia permanece en el extremo N de la proteína. La secuencia líder puede procesarse al menos un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %. La secuencia líder puede procesarse aproximadamente un 100 %, de forma que no quede nada en el extremo N de la proteína después del paso a través de la vía secretora de la célula.

La secuencia líder puede ser una secuencia líder de mamífero o humano; o una secuencia de señal de direccionamiento periplásmico, por ejemplo, una secuencia de direccionamiento periplásmico N-terminal. Se conocen en la técnica secuencias de señal para dirigir proteínas al periplasma o el entorno extracelular. Por ejemplo, se usa una secuencia de señal MalE. De forma alternativa, se usa una secuencia de señal PelB u OmpA. En un modo de realización, la secuencia de señal es OmpA.

Recolección

La recolección es el final de la fermentación. La recolección puede ser en cualquier punto temporal durante la fermentación que se considere suficiente para finalizar el proceso de fermentación y recuperar la proteína recombinante que se está expresando. La recolección puede ocurrir entre 10 y 60 horas después de la inducción del caldo celular para expresar la proteína recombinante. Por ejemplo, la recolección puede ocurrir entre 15 y 50 horas después de la inducción. En la recolección, el contenido sólido de la población de células microbianas puede estar entre un 5-30 % del peso celular seco (WCW). Para cultivos de células de mamíferos (por ejemplo, CHO, PerC6, etc.), la recolección de proteínas recombinantes puede ocurrir normalmente entre 8 y 500 horas, debido a velocidades de división más lentas en comparación con E. Coli.

El volumen del fermentador puede ser:

(i) aproximadamente 10000 litros; aproximadamente 5000 litros; aproximadamente 2000 litros; aproximadamente 1000 litros; aproximadamente 500 litros; aproximadamente 125 litros; aproximadamente 50 litros; aproximadamente 20 litros; aproximadamente 10 litros; aproximadamente 5 litros; o

(ii) entre 5 y 10000 litros; entre 10 y 5000 litros; entre 20 y 2000 litros; entre 50 y 1000 litros.

La recolección puede comprender células que se han lisado naturalmente, también conocida como autólisis. Por ejemplo, un 1-50 % de las células en la recolección pueden haberse sometido a autólisis. De forma alternativa, un 20-50 %; o un 30-50 %; o un 40-50 % de las células en la recolección se han autolisado. De forma alternativa, un 10 % o más; un 20 % o más; un 30 % o más; un 40 % o más; o un 50 % o más de las células en la recolección se han autolisado. La autólisis puede determinarse indirectamente por la concentración de ADN en una recolección clarificada, o por capacitancia, como se describe en los ejemplos.

La recolección puede incluir la etapa opcional de vaciar el fermentador de las células y los medios extracelulares (es decir, el cultivo celular o el caldo de cultivo).

Pretratamiento opcional de la recolección

Dependiendo de la célula hospedadora y la proteína recombinante, el pretratamiento de la recolección es un procedimiento de acondicionamiento de la recolección. Esta etapa puede llevarse a cabo en el fermentador o después de que la recolección se haya eliminado del fermentador. El pretratamiento incluye: lisis térmica, mecánica o química de la recolección (por ejemplo, por homogeneización, congelación-descongelación, lisis); y extracción periplásmica. Al menos un extracto periplásmico se puede extraer usando procedimientos conocidos en la técnica. De forma alternativa, si ya está presente suficiente producto en el medio extracelular, dicho pretratamiento puede no ser necesario.

Clarificación

La clarificación es el proceso para eliminar partículas sólidas. La clarificación puede reducir la carga en etapas cromatográficas posteriores durante la purificación. Las etapas de clarificación típicas comprenden una etapa de asentamiento, también conocida como sedimentación (por ejemplo, por gravedad), y/o una etapa de centrifugación, y/o una etapa de filtración.

La etapa de centrifugación puede ser una centrifugación continua (por ejemplo, con una zona de alimentación continua). La centrífuga puede funcionar en sí misma «por lotes» o «intermitentemente» o «continuamente» con respecto a la descarga de los sólidos. Por ejemplo, se puede usar una centrífuga de taza tubular como la etapa de centrifugación continua.

Purificación de la proteína recombinante:

La proteína recombinante puede recuperarse directamente del medio de cultivo. A la recuperación de la proteína recombinante le sigue la purificación para garantizar la pureza adecuada de la proteína recombinante. Se pueden usar una o más etapas cromatográficas en la purificación, por ejemplo, una o más resinas cromatográficas; y/o una o más etapas de filtración. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de afinidad que usa resinas tales como proteína A o L para purificar la proteína recombinante. De forma alternativa, o además de, se puede usar una resina de intercambio iónico tal como un intercambio catiónico para purificar la proteína recombinante.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos

Sistema de expresión de E. coli

Se usó la cepa E. coli W3110 con el plásmido pAVE011 que alberga un dAB de TNFR1 (DOM0101, SEQ ID NO: 1), un dominio de anticuerpo de dominio VH de aproximadamente 13,1 kDa de peso molecular, con una secuencia líder OmpA para la secreción al periplasma. [E.coli W3110-pAVE011-ompA-DOM0101, genotipo: E.coli (F mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1 lambda].

Configuración de cultivo y biorreactor

Las células de E. coli se almacenaron en glicerol (20 %, v/v) a -80 °C. Para preparar el inóculo para los experimentos del biorreactor, se inoculó 1 ml de solución madre de glicerol en cada matraz con deflectores de 1000 ml (matraz UltraYield, Thomson Instrument Company, Kent, Reino Unido) que contiene 400 ml de medio de inoculación vLB (vLB Lennox: 10 g/l de peptona de soja seleccionada, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, a pH 7,0). Los matraces se cultivaron en una incubadora de agitación rotatoria a 220 rpm y a 37 °C hasta alcanzarse una DO⁶⁰⁰ de 1. Se usó el mismo inóculo para cada conjunto de experimentos de biorreactores para evitar la variabilidad del cultivo de siembra.

El sistema 8-biorreactor paralelo tenía reactores con un volumen de trabajo de 1 l (biorreactor SR1000DLL, diámetro del recipiente 100 mm, relación de aspecto 2,4:1), impulsores dobles de Rushton con 6 paletas con accionamiento superior (46 mm de diámetro, DASGIP AG, Julich, Alemania).

Los biorreactores se inocularon en una relación de volumen de 1:50 para producir una densidad celular inicial equivalente a DO⁶⁰⁰ = 0,02.

Las células de E. coli se cultivaron en un medio complejo que contenía glicerol como principal fuente de carbono, extracto de levadura y peptona de soja. El pH se mantuvo a 7,0 ± 0,05 mediante la adición automática de NH⁴OH al 25 % (v/v) y H³PO⁴2 M. La temperatura se mantuvo a 30 °C antes de la inducción y después de la inducción se redujo a 26 °C. El punto de referencia de oxígeno disuelto (OD) se ajustó a un 30 ± 5 % y se controló automáticamente mediante un sistema en cascada que aumentaba la velocidad del impulsor secuencialmente (400­ 1600 rpm) y luego el caudal de gas (1 vvm-2 vvm) (vvm = volumen por volumen por minuto) y luego el contenido de oxígeno en el gas (21-100 %), cuando el OD cayó por debajo del punto de referencia para tratar de mantener el nivel mínimo de OD.

Después del consumo de glicerol, se observó un pico de OD, en cuyo momento se inició una alimentación de glicerol (714 g/l) que contenía extracto de levadura (50 g/l). La velocidad de adición de la alimentación fue de 3,6 ml/l/h a menos que se indique lo contrario.

Para el ejemplo 4: las velocidades de alimentación después de las inducciones fueron de 3, 3,6, 4,2 y 4,8 ml/l/h. Para el ejemplo 5: La adición continua de EDTA 125 mM (pH 7) y EDTA 125 mM- urea 7 M (pH 7) se inició aproximadamente 15 h después de la inducción a un caudal de 5 ml/h. La adición de Tween™ 20 se inició 15 h después de la inducción y se hizo incrementalmente durante 23 h (hecho de una manera controlada para evitar la formación de espuma) hasta una concentración final de 20 ml/l.

Para el ejemplo 6: La PEI usada fue de 750 kDa ramificada (adquirida de BASF - N.° cat. 11736).

La adición de la cantidad a granel de PEI tuvo lugar 23 h después de la inducción (40 ml de PEI al 6,25 % p/v) que dio lugar a una concentración final de PEI en el reactor de un 0,25 % (p/v). La adición continua de PEI se inició 15 h después de la inducción a velocidades de 1,5 ml/l/h, que corresponde a 0,09 g/l/h (bajo en la figura 4) y 2,5 ml/l/h que corresponde a 0,16 g/l/h (alto en la figura 4), (esto dio como resultado una concentración de PEI en la fermentación después del final de la fermentación de alrededor de 3 y 5 g/l, respectivamente).

Para el ejemplo 7: El material de recolección de un cultivo de control como se describe en el ejemplo 3, Tween™ 20, EDTA tratado, EDTA-urea tratado como se describe en el ejemplo 5 y adición de alimentación baja de PEI (0,09 g/l/h) como se describe en el ejemplo 6 se analizaron para determinar el título extracelular pero también los contaminantes tales como endotoxina, HCP y ADN en el sobrenadante del cultivo usando la expresión por gramo de producto extracelular. La endotoxina, el HCP y el ADN se determinaron como se describe a continuación (procedimientos analíticos).

Para el ejemplo 8: PEI de 25 kDa (Aldrich 408727), con la misma administración de alimentación baja continua (0,09 g/l/h) que la PEI de 750 kDa.

La producción de dAb DOM0101 se indujo cuando la concentración de biomasa había alcanzado un nivel correspondiente a DO600 = 80 ± 2, cuando se añadió IPTG a una concentración final en el reactor de 250 pM. Los valores en tiempo real de pH, oxígeno disuelto, velocidad de agitación, temperatura, caudal de aire, porcentaje de oxígeno, velocidad de absorción de oxígeno, tasa de evolución de dióxido de carbono durante las fermentaciones se registraron automáticamente por el software del biorreactor (DASGIP Control, Julich, Alemania).

Todos los tratamientos de fermentación se realizaron por duplicado; ejecutándose cada conjunto de experimentos al mismo tiempo usando el mismo inóculo. Las barras de error en las figuras representan la desviación típica entre al menos dos biorreactores replicados.

Procedimientos analíticos

La concentración del producto dAb se midió usando un procedimiento de cromatografía de afinidad con proteína A. La concentración del producto en muestras en investigación se analizó usando cromatografía con proteína A (HPLC Agilent 1200, Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, Reino Unido, equipado con 1 ml de HiTrap MabSelectR Xtra, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Reino Unido). La carga y el equilibrado se realizaron usando un tampón PBS 0,1 M a pH 7,2. Las muestras se diluyeron apropiadamente en tampón de equilibrado y se filtraron usando un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 pm. La elución se realizó usando 20 mM de HCl. La cantidad de producto eluido se midió registrando la absorbancia a 220 nm. Las áreas de pico de producto se integraron automáticamente (Empower, Waters, Milford, EE. UU.).

Con respecto a la concentración de dAb intracelular, se centrifugó 1 ml de cultivo extraído a 24200 * g durante 10 minutos y se recuperó el sobrenadante del cultivo celular. El sedimento se resuspendió en 1 ml de volumen final con Tris 50 mM pH 8, se sometió a 4 ciclos de congelación-descongelación (congelación en nieve carbónica seguida de incubación en baño seco durante 5 minutos a 37 °C) y 2 ciclos de congelación-sonicación (congelación en nieve carbónica seguida de sonicación durante 15 minutos) usando un baño de sonicación (Camsonix C275, Elma Electronic GmbH, Singen, Alemania). Las muestras sonicadas se centrifugaron a 24200 * g durante 10 minutos y el lisado celular se recuperó y se sometió a prueba para determinar el título tal como se ha descrito anteriormente. Las mediciones de viscosidad se llevaron a cabo usando un reómetro de copa y bobina (viscosímetro Brookfield DV-2+ equipado con husillo 40, Brookfield Engineering Laboratories, MA), exponiendo 0,5 ml de caldo celular a velocidades de cizallamiento de 37,5 a 1500 s_1 en siete incrementos con interrupción de 30 segundos en cada incremento. Se realizaron barridos de cizallamiento tanto crecientes como decrecientes. La temperatura se mantuvo a 23 °C en el viscosímetro usando un circuito de agua de refrigeración.

La concentración del ADN bicatenario en el medio extracelular se determinó usando un fluorímetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se añadieron 10 pl de sobrenadante de cultivo diluido apropiadamente en 190 pl de solución de trabajo Qubit (que contenía reactivo BR de ADNbc Quant-i 1:200 en tampón ^bR de ADNbc QuantiT™). Los tubos se agitaron en vórtex y la absorbancia se midió después de exactamente 2 minutos. El mismo procedimiento se aplicó para los dos patrones de ADN prediluidos a una concentración de 0 y 100 ng/pl.

El crecimiento del cultivo se midió como densidad óptica a 600 nm y gravimétricamente como peso celular seco (DCW). Se colocaron muestras de 1 ml en Eppendorfs previamente pesados, y luego se centrifugaron en una minicentrífuga a 24200 * g durante 3 minutos, se descartó el sobrenadante y los sedimentos recuperados se resuspendieron y lavaron dos veces en agua destilada y luego se secaron hasta el peso constante en un horno a 105 °C durante 24 h. Los Eppendorfs se pesaron de nuevo y la diferencia entre el peso final y los Eppendorfs vacíos se consideró el DCW.

La capacitancia del cultivo se midió en línea a 1000 KHz utilizando sondas Aber (Aber Instruments, Aberystwyth, Reino Unido) conectadas mediante un amplificador a un detector.

Los niveles de endotoxina de las muestras de recolección diluidas apropiadamente se midieron usando un sistema comercial de prueba portátil con cartuchos desechables que contenían lisado de amebocitos de Limulus (LAL) siguiendo las instrucciones del fabricante (Charles Rivers Laboratories, EE. UU.).

La concentración de las proteínas de la célula hospedadora (HCP) en el sobrenadante del caldo se midió usando un procedimiento ELISA de tipo sándwich de E. coli anti-HCP.

Ejemplo 2 Concentración de ADN y viscosidad

La figura 1 caracteriza las propiedades reológicas de un intervalo de suspensiones, incluyendo caldos de células lisadas, como una función de la concentración de ADN soluble. Todas las soluciones muestran un comportamiento de flujo seudoplástico característico que es independiente del tiempo y totalmente reversible. Las expresiones de la ley de potencia describen adecuadamente los datos obtenidos y el índice de consistencia (equivalente a la viscosidad aparente a velocidad de cizallamiento de 1 s_1) da una indicación de la dificultad a la que habrá que hacer frente al tratar de clarificar por centrifugación. Un índice de consistencia de ~0,03 N sn itt2 obtenido a una concentración de ADN de 600 mg/l se considera el límite que define la centrifugación compleja.

Ejemplo 3 Viabilidad celular: Capacitancia y peso celular seco

La figura 2 proporciona un ejemplo de la fermentación convencional utilizada en este estudio. El tiempo posterior a la inducción se usa para seguir la progresión de la fermentación. La concentración de células intactas según se registra por capacitancia alcanza su pico a las 15 h; a este le sigue poco después un pico en el peso celular seco y una caída en la respiración celular (CER más baja) a ~30 h (figura 2A). Este perfil se corresponde con el inicio de un aumento significativo en el anticuerpo de dominio extracelular (dAb) y la reducción paralela de dAb intracelular a las 15 h y la consecución de un nivel máximo de dAb total a las 30 h (figura 2B). La liberación de ADN (figura 2C) aumenta bruscamente al inicio de una reducción del DCW y parece ser paralela a la liberación de dAb, excepto por un alto nivel inicial de ADN presente al inicio de la inducción.

Un gráfico de paridad (figura 2D) sigue la liberación de dAb con liberación de ADN. La línea de paridad sigue la liberación de dAb y ADN desde el valor inicial en la inducción hasta el máximo disponible en la destrucción completa de células enteras y fantasmas celulares. Los valores máximos son por medición de dAb y por estimación para ADN por estimación a partir del peso celular seco máximo; esto se debe a las dificultades en la liberación de todo el ADN en una forma intacta para la medición. Se traza un límite aceptable de liberación de ADN de un 60 %; este se basa en un análisis de los datos reológicos de suspensiones lisadas (figura 1) que muestran que los niveles de ADN superiores a ~600 mg/l en el caldo darán lugar a una clarificación deficiente en condiciones de centrifugación a escala de proceso típicas y también, por observación, a evidencia de una mala mezcla, por ejemplo, por la aparición de grandes burbujas de aire. Con este límite de liberación de ADN, solo se ha liberado ~40 % de dAb y la dificultad es encontrar formas de avanzar por encima de la línea de paridad para lograr una alta recuperación de dAb con una liberación de ADN limitada aceptable.

Ejemplo 4 Velocidad de alimentación

Se exploró el efecto de cambiar la velocidad de alimentación de la fuente de carbono después de la inducción y el balance resultante de dAb con respecto a la liberación de ácido nucleico. Los datos para este ejemplo no se muestran en las figuras, pero se describen en el presente documento. El intervalo de velocidades de alimentación elegido se basó en un valor en el extremo alto para evitar el exceso de acumulación de glicerol y un valor en el extremo bajo por debajo del cual la fermentación supera las 50 h después de la inducción. Las tasas de alimentación más altas parecen dar como resultado inicialmente un aumento pequeño (según el DCW) o ningún aumento (capacitancia) de los niveles de biomasa y posteriormente una lisis más temprana y, en última instancia, niveles más bajos de biomasa. Los valores de CER reflejan el aumento de la actividad de la biomasa (hasta 20 h) y el inicio más temprano de la lisis a medida que aumenta la velocidad de alimentación. Como antes, la liberación de ADN refleja el grado de lisis celular. Los niveles de dAb totales, intracelulares y extracelulares finales no se ven afectados en gran medida por elección de la velocidad de alimentación, pero las mayores tasas de producción de dAb a mayores velocidades de alimentación reflejan la mayor actividad de la biomasa, y la liberación más temprana al espacio extracelular a velocidades mayores de alimentación refleja el inicio más temprano de la lisis celular. El gráfico de paridad resultante muestra que cuanto mayor es la velocidad de alimentación, mayor es el grado de liberación de dAb en comparación con el ADN. La mejora lograda aumentará el rendimiento de dAb de un ~35 % a un ~58 % para una liberación de ADN de un 60 %; no hay mejora si el objetivo está cerca de la recuperación completa de dAb. Por lo tanto, existe la necesidad de explorar formas de cambiar la relación entre dAb y liberación de ADN durante la fermentación si se van a materializar oportunidades para la recolección temprana y la recuperación directa de dAb sin más pretratamiento.

Ejemplo 5 Suplemento de cultivo celular Parte A: EDTA, Urea, Tween™ 20

EDTA, Urea y Tween™ se pueden usar en la recolección para aumentar la recuperación de proteínas de las células hospedadoras. En el presente documento investigamos su uso durante el cultivo celular para investigar cualquier impacto sobre la concentración extracelular de proteína recombinante. El EDTA puede permeabilizar las membranas celulares y es tóxico para las células. La urea puede afectar la integridad de la membrana y es tóxica para las células. Tween™ puede permeabilizar las membranas celulares y causar la formación de espuma en los cultivos celulares.

El uso de EDTA, Urea y Tween™ se exploró en la figura 3. Las concentraciones utilizadas se basan en investigaciones basadas en laboratorio de intervalos de concentraciones finales de 15 a 75 mM de EDTA, de 0,5 a 2 M de urea y de 10 a 20 ml/l de Tween™ 20 (los resultados no se muestran en el presente documento). El uso de EDTA o EDTA-urea da como resultado una disminución de la biomasa como se evidencia por valores más bajos de peso celular seco (figura 3A) y capacitancia (figura 3B) y valores reducidos de CER (figura 3C). El efecto resultante es niveles bajos de ADN liberado y niveles de dAb totales (figuras 3D y G) pero con una proporción significativa de dAb que aparece extracelularmente (figura 3E) evidentemente como resultado de la permeabilización incrementada de la pared celular. Como resultado, hay un aumento general de ~3 veces en la relación del dAb final con respecto a la liberación final de ADN. Esta mejora se debe en gran medida a los títulos de dAb reducidos y, de hecho, la recalibración de la liberación de dAb frente al nivel de dAb formado en el control devuelve todos los puntos de datos de EDTA y EDTA-urea a la línea de paridad.

El uso de Tween™ dio como resultado un inicio más temprano que el control en la pérdida de biomasa activa (figuras 3A-C) pero poca diferencia en el ADN liberado de los perfiles de dAb (figura 3D-G) lo que dio como resultado una ausencia de mejoría en la relación de dAb con respecto a la liberación de ADN (figura 3H). También se experimentaron altos niveles de formación de espuma. Estas estrategias no se continuaron más, ya que los ensayos de detección a pequeña escala indicaron que había poco margen de mejora con estos reactivos particulares.

Ejemplo 6 Suplemento de cultivo celular Parte B: PEI

El uso de PEI para ayudar a procesar los caldos de fermentación recolectados es conocido (documento WO2014118220). En el presente documento nos referimos al uso de PEI durante la fermentación en sí y el impacto en las células vivas. La PEI puede permeabilizar las membranas celulares y puede mostrar actividad antimicrobiana y citotoxicidad. Los resultados presentados en el presente documento muestran que, sorprendentemente, la PEI parece tener un efecto insignificante sobre la viabilidad celular.

La adición de una cantidad a granel de PEI aumentó el peso celular seco del cultivo significativamente en comparación con el cultivo de control. De forma similar, en el cultivo en el que hubo una adición continua gradual de PEI, se observó un DCW significativamente más alto hasta el final del proceso (véase la figura 4A). Si bien el cultivo de control disminuyó drásticamente después de 47,5 h, el cultivo continuo de PEI conservó un DCW próximo a 42 g/l, y el cultivo con la adición a granel de PEI conservó niveles de alrededor de 45 g/l. Curiosamente, se observó un efecto similar en las lecturas de capacitancia, en las que después de la adición de la solución de PEI hubo un aumento abrupto en las lecturas (figura 4B). Esto fue especialmente obvio cuando se produjo la adición a granel de PEI (la lectura de capacitancia aumentó de 8,6 pF/cm a 11,5 pF/cm). Los datos respiratorios muestran que los cultivos tratados con PEI siguieron perfiles idénticos al cultivo de control y no se vieron afectados por las adiciones de PEI (figura 4C). La CER se mantuvo en aproximadamente 65 mM/h para todos los cultivos durante la fase de producción y comenzó a disminuir solo después de un tiempo de proceso de 60 h.

El perfil del título extracelular para el cultivo de PEI añadido a granel fue similar al control, mientras que la adición continua de cultivos de PEI mostró concentraciones de dAb extracelular significativamente más altas desde el momento del inicio de la alimentación hasta el final, cuando todos los cultivos alcanzaron aproximadamente la misma cantidad de producto en el sobrenadante del cultivo (alrededor de 6,5 g/l, véase la figura 4E). Por ejemplo, a un tiempo de proceso de 47,5 h, los cultivos de adición continua de PEI tenían una concentración de dAb extracelular de 4,7 g/l, mientras que los cultivos de control y de adición de PEI a granel solo tenían 2 g/l y 2,2 g/l, respectivamente. La figura 4F muestra que la concentración de producto intracelular fue menor para el cultivo con adición continua de PEI, que corresponde a la concentración de producto extracelular aumentada, es decir, las células se vuelven más permeables debido a la adición más temprana de PEI cuando se añade en modo continuo. La cantidad total de producto producida fue similar para todos los cultivos y varió de 8,5 a 9,2 g/l al final del cultivo (figura 4G). La concentración de ADN del cultivo de control aumentó drásticamente después de 20 h después de la inducción, alcanzando 1140 mg/l hacia el final del proceso. La PEI redujo muy eficazmente la cantidad de ADN en el sobrenadante del cultivo, manteniéndolo en niveles inferiores o cercanos a 200 mg/l (figura 4D). En la figura 4H, es evidente que la adición de PEI cambió el equilibrio entre el producto y el ADN en el sobrenadante del cultivo. Las líneas de los cultivos tratados con PEI son casi verticales al eje de abscisas (ADN) ya que la concentración de ADN permanece estable durante la fermentación mientras el producto se libera gradualmente desde el periplasma al espacio extracelular. Por lo tanto, la PEI no causa una destrucción significativa de la membrana citoplásmica, lo que sugiere que las células permanecen viables mientras se vuelven permeables, permitiendo que el producto se filtre al espacio extracelular. Esto, junto con la eliminación muy drástica de la concentración de ADN soluble, permite recolecciones más tempranas y da lugar a caldos en los que los sólidos se separan fácilmente, mediante centrifugación a escala piloto de flujo continuo. Es posible que la liberación temprana de la proteína recombinante desde el periplasma causada por la adición de PEI durante el cultivo celular también reduzca la presión sobre la fisiología de la célula hospedadora.

Ejemplo 7 Impacto de suplementos de cultivo celular en dAb extracelular y contaminantes asociados

Los rendimientos de dAb extracelular y de dAb total se muestran en la figura 5A. Los niveles de endotoxina, ADN y HCP en el sobrenadante del cultivo son indicadores importantes de impurezas relacionadas con el proceso y, por lo tanto, de la calidad del producto. La endotoxina es pirógena y debe mantenerse por debajo de una concentración mínima predeterminada en productos farmacéuticos.

La figura 5 resume el rendimiento de los diversos suplementos de cultivo celular utilizados en las figuras 3 y 4 en términos de la calidad del caldo final obtenido. La concentración de dAb en la recolección sigue siendo similar para el cultivo de control, los cultivos tratados con TweenTM 20 y PEI, mientras que EDTA y EDTA-urea tienen valores significativamente menores tanto totales como extracelulares (~3 veces). La figura 5B muestra un aumento de ~3 veces en las relaciones de endotoxina:dAb extracelular para los cultivos de EDTA y EDTA-urea. Los cultivos tratados con PEI tenían niveles de endotoxinas similares a los cultivos de control y tratados con TweenTM 20. La HCP liberada o sobrante en caldo no se ve afectada por TweenTM (en comparación con el control) pero se reduce por un factor de ~2 para EDTA, de ~3 para EDTA-urea y de ~1,3 para PEI. La figura 5C muestra que las relaciones de HCP:dAb extracelular fueron significativamente mayores para los cultivos tratados con EDTa pero no para los cultivos tratados con EDTA-urea. Los cultivos tratados con PEI mostraron niveles disminuidos de la relación HCP:dAb extracelular, que puede atribuirse a una menor lisis celular durante el tratamiento con PEI o a la precipitación de algunas de estas proteínas por el policatión. Finalmente, el ADN soluble en el caldo de fermentación es ~5 veces menor para el cultivo tratado con PEI en comparación con los cultivos de control y tratados con TweenTM 20. Los cultivos tratados con EDTA y EDTA-urea mostraron relaciones de ADN:dAb extracelular marginalmente inferiores debido a que el dAb extracelular era 3 veces menor.

Ejemplo 8: PEI ramificada de 25 kDa

Los experimentos que utilizan PEI ramificada de 25 kDa no mostraron los mismos efectos que la PEI ramificada de 750 kDa. Esto puede deberse a que la PEI de 25 kDa interfiere en el procedimiento de afinidad de proteínas para la purificación de la proteína. La PEI de 25 kDa parece ser más tóxica para las células que la forma de 750 kDa. Los datos de respiración muestran que, después del inicio del tratamiento con PEI, tanto la tasa de consumo de oxígeno como la tasa de evolución de dióxido de carbono disminuyeron más rápidamente que cuando se aplicó la PEI de 750 kDa, lo que significa que las células se estaban muriendo. En consecuencia, las células murieron en una etapa más temprana y, como resultado, se produjo menos producto y casi todo el producto en el sobrenadante probablemente se debió a la lisis celular en lugar de a la permeabilización celular. Por lo tanto, se concluyó que se debían seleccionar variantes de PEI a través de métodos como se describe en el presente documento para identificar qué formatos y concentraciones (por ejemplo, velocidades de alimentación a través de la adición continua, o la adición a granel) son más preferentes.

Ejemplo 9: Uso de PEI con otras proteínas de unión a antígeno

Confirmamos que la estrategia de fermentación de PEI se puede aplicar a más de una proteína recombinante y no es específica de una construcción (por ejemplo, vector o línea celular) o producto. Las proteínas de unión a antígeno 2, 3 y 4 que se unen a 3 antígenos diferentes (también diferentes a DOM0101), con un PM aproximado de 25, 14 y 17 kDa, respectivamente, se trataron con adición de alimentación baja de PEI (0,09 g/l/h) como se describe en el ejemplo 6. Las muestras para el título y la concentración de ADN soluble se extrajeron 5, 25 h y 50 h después del inicio del tratamiento con PEI.

La figura 6 indica que la alimentación de PEI tiene un efecto positivo inmediato sobre el producto extracelular. En todos los casos, el producto extracelular de los cultivos de control finalmente alcanza a los cultivos tratados. El producto de proteína de unión a antígeno «más pesado» Ab2 parece liberarse de forma menos preferente a medida que transcurre el tiempo después de la adición de PEI. Sin embargo, el aumento combinatorio del título del producto extracelular y el mantenimiento eficiente del ADN soluble extracelular en niveles muy inferiores a los 600 mg/l, que es el límite para la separación eficiente de sólidos en la etapa de centrifugación, puede dar lugar a procesos más cortos con cualidades de cultivo celular significativamente mejoradas.

Conclusiones para ejemplos

La PEI parece tener poco efecto negativo en la fisiología celular y al mismo tiempo elimina el ADN del cultivo haciéndolo menos viscoso. Además, hay una liberación/secreción de producto más temprana al espacio extracelular que sugiere la permeabilización de la membrana. Por lo tanto, la adición de PEI como potenciador de la alimentación o del cultivo celular durante la producción de proteína recombinante aumenta el título del producto extracelular, reduce el tiempo de fermentación y reduce el aporte de energía debido a las menores viscosidades durante la fermentación. Además, la presencia de PEI da lugar a niveles reducidos de HCP soluble en comparación con otros suplementos de cultivo celular sometidos a prueba. El tratamiento con PEI de 750 kDa fue eficaz en el tratamiento de cuatro proteínas recombinantes diferentes. En todos los casos, la PEI tuvo un efecto positivo en la liberación del producto, la relación de producto con respecto a ADN soluble se mejoró, el título del producto final no se modificó en comparación con el control y, cuando se alcanzó la liberación completa de la proteína final, el nivel de ADN soluble remanente estaba muy por debajo del límite para producir caldos de recolección adecuados para clarificación por centrifugación continua a escala de producción. Además, el uso de PEI en una etapa temprana de la fermentación puede reducir la duración del tiempo de fermentación y, en consecuencia, reducir el coste del bioproceso.

Listado de secuencias

SEQ ID NO:1: Secuencia de aminoácidos de DOM0101

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAHETMVWVRQAPGKGLEWVSHIPPDGQDPFYADSVKGRFTISRD

NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCALLPKRGPWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:2: Secuencia de ADN de DOM0101 -(sin secuencia de señal)

GAAGTACAACTGCTGGAGAGCGGTGGCGGCCTGGTTCAACCGGGTGGTTCCCTGCGCCTGTCCTGTGCGGC

ATCTGGTTTCACCTTCGCACACGAAACCATGGTGTGGGTTCGCCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGT

AAGCCACATTCCTCCAGATGGCCAGGACCCATTCTATGCGGATTCCGTTAAGGGTCGCTTTACCATTTCTCGT

GATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGCGCCGAGGATACTGCGGTGTACCATTGT

GCGCTGCTGCCTAAACGTGGCCCGTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGTAAGCAGC

SEQ ID NO:3: Secuencia de aminoácidos de DOM0101 con alanina extendida

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir una proteína recombinante en una célula hospedadora, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

2. Un procedimiento para liberar proteína recombinante expresada por un cultivo de células hospedadoras, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

3. Un procedimiento para reducir la viscosidad de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

4. Un procedimiento para aumentar la concentración extracelular de una proteína recombinante expresada por el cultivo celular, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

5. Un procedimiento para reducir el tiempo hasta la recolección de un cultivo celular que expresa una proteína recombinante, que comprende añadir polietilenimina durante el cultivo celular.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se recupera la proteína recombinante del medio extracelular.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula hospedadora o el cultivo celular son una bacteria gramnegativa con un periplasma, opcionalmente en el que la bacteria gramnegativa es Escherichia coli.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la polietilenimina se añade antes de la recolección, opcionalmente en el que se añade polietilenimina en el momento de la inducción o después de inducir la expresión de la proteína recombinante, opcionalmente en el que se añade polietilenimina en cualquier punto temporal desde la inducción de la expresión de la proteína recombinante hasta aproximadamente 30 minutos antes de la recolección, opcionalmente en el que se añade la polietilenimina de forma continua durante el cultivo celular.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la polietilenimina es ramificada.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el peso molecular de la polietilenimina es de 50-1000 kDa, opcionalmente en el que el peso molecular de la polietilenimina es de aproximadamente 750 kDa.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína recombinante (i) es una proteína de unión a antígeno; y/o (ii) tiene un peso molecular (PM) de 25 kDa o menos.

12. Uso de polietilenimina como complemento de cultivo celular durante el cultivo celular de una célula hospedadora que expresa una proteína recombinante.

13. Uso de polietilenimina como agente de liberación durante el cultivo celular para aumentar el título de proteínas recombinantes extracelulares expresadas por las células.

14. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13, en el que la célula hospedadora o el cultivo celular son Escherichia coli y/o se recupera la proteína recombinante del medio extracelular.