CN107567284B - 含有渗透蛋白肽作为有效成分的用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分。更详细而言，所述渗透蛋白肽是由9个氨基酸组成的渗透蛋白肽，当用渗透蛋白肽处理时，神经细胞的生长率会增加，而且几乎没有细胞毒性，并会抑制细胞凋亡，施用于动物模型时，所述渗透蛋白肽渗透到脑的海马、大脑皮质、作为脑的深部的下丘脑，从而能够有效地利用为用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物。

Description

含有渗透蛋白肽作为有效成分的用于预防、改善或治疗神经 疾病的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分。
背景技术
退行性神经疾病是指神经细胞(神经元)的逐步的结构性、功能性损失。退行性神经疾病主要侵犯神经系统的特定部位而伴随痴呆症、锥体外束异常、小脑异常、感觉障碍、运动障碍等症状，而且也有可能同时侵犯多个部位而表现出复合性症状。根据患者所表现出的临床状态进行诊断，这种情况下，有多种症状，并且相互不同的疾病表现出相同的临床症状的情况较多，因此难以进行诊断(Soc.Sci.Med.Vol.40.No.6，pp.847-858，1995)。
作为神经疾病中的一种的痴呆症(dementia)是伴随记忆力障碍、丧失判断力等全身功能的整体障碍的疾病。作为50岁以前几乎不会表现出症状，但60岁以后发生频度逐渐增加的老人性疾病，随着医学技术的发展和生活质量的提高所带来的老年人口的增加，其不仅是在韩国而且是在世界上发病人口急速增加的疾病。2008年登记的韩国的65岁以上的痴呆症患者数为421,000名，占整体老年人口的8.4％，并且预测了到2030年将达1,135,000名，超过整体老年人口的9.6％。据2008年保健福祉部的痴呆症患病率的调查结果，痴呆症的发病形态非常多样，统计出在韩国发病的痴呆症的约70％左右为阿尔茨海默型痴呆症(dementia of Alzheimer type)，约25％左右为血管性痴呆症(dementia of Vasculartype)，其他酒精性痴呆症和帕金森病痴呆症为5％以下。
痴呆症的最主要发病形态阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)表现出两种特定的病变，一种为脑的大脑皮质和海马部位的神经细胞中因tau蛋白的过磷酸化及凝集而出现的细胞内的神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangle)的形成，另一种为因淀粉样蛋白β-1/42(amyloid β-1/42)的凝集而在细胞外部形成的斑块(plaque)。
阿尔茨海默病的原因目前还没有确切地查明，但是参与凝集的两种蛋白质的凝集形状缠结(tangle)或斑块(plaque)，或者前体沉积于负责脑的记忆及认知的神经细胞部位，由此引起神经细胞的功能降低及凋亡，从而引起阿尔茨海默病。所凝集的tau蛋白负责与微管的稳定化，随着因凝集而减少的tau蛋白无法执行正常的功能，微管的结合力会减弱，并且因长时间的功能异常，导致个别神经细胞的功能降低，进而直到凋亡。
另外，源自植物的渗透蛋白参与脂肪酸氧化的调节、葡萄糖的获取、磷酸化(AMP激酶)及信号变换路径。已知渗透蛋白(24kDa)是包含于与糖分测定蛋白奇异果甜蛋白(sweet-testing protein thaumatin)具有同源性的PR-5家族的稳定的蛋白质，并且在酵母中诱导细胞内的信号传递。渗透蛋白对热、酸性及酶具有抗性，因此不会通过消化被分解，并能够在身体中循环。已知这种渗透蛋白是存在于动物中的脂联素的同源体，脂联素则被查明为有可能具有部分抗炎症、抗糖尿、抗粥样硬化的能力。此外，就渗透蛋白而言，众所周知的效果主要是肥胖或糖尿病相关的效果，韩国授权专利第1308232号中公开了含有渗透蛋白的用于预防及治疗神经疾病的组合物，但是没有公开只通过渗透蛋白肽来用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物。
发明内容
要解决的技术问题
本发明是根据如上所述的要求而导出，确认了由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的渗透蛋白肽增加神经细胞的存活率，几乎没有细胞毒性，抑制细胞凋亡，并且施用于动物模型时，渗透到脑的海马、大脑皮质、作为脑的深部的下丘脑，从而完成了本发明。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供用于预防或改善神经疾病的健康功能食品组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分，所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或改善神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
此外，本发明提供用于预防或治疗神经疾病的药学组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分，所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或治疗神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
此外，本发明提供神经疾病的预防或治疗方法，其包括将包含渗透蛋白肽的组合物施用于动物的步骤，其中所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或治疗神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
发明效果
使用本发明的含有渗透蛋白肽的组合物时，能够保护神经细胞，使神经细胞免受阻碍其正常发生、发达及生长的外部的刺激或毒性，从而能够有效地用作用于预防、改善或治疗神经疾病的组合物。此外，本发明的渗透蛋白肽由9个氨基酸序列组成，因此通过蛋白质合成等的生产性高，从而产业利用价值很高。
附图说明
图1是示出用0.5～20μM浓度的渗透蛋白肽对人成神经细胞系SH-SY5Y(A)及海马细胞系HT22(B)进行处理，并于24小时后确认的细胞存活率的结果。
图2是用1、5及10μg的渗透蛋白肽-异硫氰酸荧光素(FITC)对人成神经细胞系SH-SY5Y进行处理，并确认荧光图像的结果。钴蓝色是成神经细胞系SH-SY5Y，绿色为渗透蛋白肽结合的状态。
图3是通过尾巴静脉注射(IV)(a～c)及腹腔注射(IP)(d～f)将渗透蛋白肽-FITC施用于小鼠，并确认移动至脑的海马部位的渗透蛋白肽-FITC的荧光图像。
图4是通过静脉注射将渗透蛋白肽-FITC施用于小鼠，并示出所施用的渗透蛋白肽-FITC移动至脑的大脑皮质(a～c)及下丘脑(d～f)的荧光图像。a是以低倍率观察大脑皮质的结果，b及c是以高倍率观察大脑皮质的结果，d是以低倍率观察下丘脑的结果，e及f是以高倍率观察下丘脑的结果。
图5是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理，并确认大脑皮质和海马部位的Tau-46蛋白的表达减少的结果。***表示与WT(正常对照组)相比APP/PS1模型中的Tau-46的表达在统计学上明显增加，p值小于0.001。此外，###表示与APP/PS1模型相比用渗透蛋白肽处理时的Tau-46的表达在统计学上明显减少，p值小于0.001。
图6是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理，并确认大脑皮质和海马部位的p-Tau(Ser404)蛋白质的表达减少的结果。***表示与WT(正常对照组)相比APP/PS1模型中的p-Tau(Ser404)的表达在统计学上明显增加，p值小于0.001。此外，###表示与APP/PS1模型相比用渗透蛋白肽处理时的p-Tau(Ser404)的表达在统计学上明显减少，p值小于0.001。
图7是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认脑的海马部位CA1和DG区域的Aβ斑块(plaque)显著减少。**、***表示与WT(正常对照组)相比APP/PS1模型中的Aβ斑块(plaque)的表达在统计学上明显增加，**时的p值小于0.01，***时的p值小于0.001。此外，##、###表示与APP/PS1模型相比用渗透蛋白肽处理时的Aβ斑块(plaque)的表达在统计学上明显减少，##时的p值小于0.001，###时的p值小于0.001。
图8是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认大脑皮质部位的Aβ斑块(plaque)减少的结果。***表示与WT(正常对照组)相比APP/PS1模型中的Aβ斑块(plaque)的表达在统计学上明显增加，***时的p值小于0.001。此外，###表示与APP/PS1模型相比用渗透蛋白肽处理时的Aβ斑块(plaque)的表达在统计学上明显减少，###时的p值小于0.001。
图9是确认通过渗透蛋白肽的处理，APP/PS1小鼠的脑的海马(hippocampus)及大脑皮质(cortex)中生成的p-Tau(Ser413)及p-Tau(Ser404)蛋白质减少的结果。
图10是确认通过渗透蛋白肽的处理，APP/PS1小鼠的脑的海马(hippocampus)及大脑皮质(cortex)中生成的淀粉样蛋白-β低聚物(amyloid-βoligomer，Aβ低聚物)、APP及BACE-1蛋白质减少的结果。
图11是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认通过突触功能(synapticfunction)的提高所表达的SNAP25及PSD95蛋白质的表达量增加的结果。
图12是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认AdipoR1、pAMPK及总AMPK的表达量增加的结果。
图13是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认p-JNK、TNF-α、NF-κB及pIKKβ蛋白质的表达量减少的结果。
图14是用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠进行处理并确认p-PI3K及pAkt(Ser473)蛋白质的表达量增加的结果。
图15是示出通过腹腔注射(IP)将本发明的脂联素受体活性化新型肽(5AA1)施用于阿尔茨海默小鼠45天后，为了确认行为学变化，测定莫里斯水迷宫实验的潜伏期(latency)的结果(A)、测定莫里斯水迷宫实验的探针测试中通过平台交叉路的次数的结果(B)、测定莫里斯水迷宫实验中停留在目标象限的时间的结果(C)及测定Y-迷宫测试的自发性交更(SpontaneousAlteration(％))的结果(D)。
图16是培养模型小鼠的海马神经细胞并通过电生理学的方法测定LTP的结果，其中确认了用本发明的渗透蛋白肽处理的组中mEPSC频率(Hz)得到提高。
图17是测定体内(In vivo)LTP的结果，其中确认了正常组、APP/PS1小鼠模型组及用渗透蛋白肽对APP/PS1小鼠模型组进行处理的组中的EPSC增强程度。
具体实施方式
本发明涉及用于预防或改善神经疾病的健康功能食品组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分，所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或改善神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
本发明中，渗透蛋白(osmotin)是葡萄等成熟的水果中大量含有的蛋白质，是根据个体由约150个至250个氨基酸组成的蛋白质。由所述SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的渗透蛋白肽是渗透蛋白的序列中自第157个到第165个的9个氨基酸组成的肽(SEQ ID NO：1)。
本发明的渗透蛋白肽可以是精制的天然生成物或化学合成的生成物，或者可以利用再组合方法由原核或真核宿主细胞(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫及哺乳类细胞)制得。
本发明中，渗透蛋白肽是指与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比5个以下的氨基酸，最优选为3个以下的氨基酸被具有相关或类似特性的氨基酸取代的肽。
所述神经疾病优选为选自阿尔茨海默病、痴呆症、帕金森病、癫痫、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、神经发生障碍、自闭症、脑卒中、卢伽雷氏(Lou Gehrig)症、亨廷顿舞蹈症及多发性硬化症中的一种以上的疾病，更优选为阿尔茨海默病，但并不限定于此。相对于组合物的总重量，所述渗透蛋白肽的含量优选为0.1～100重量％。
所述组合物的特征在于，减少脑的海马和大脑皮质中的Aβ低聚物、p-Tau(Ser413)及BACE-1蛋白质的表达量，增加SNAP25及PSD95蛋白质的表达量，增加AdipoR1、pAMPK、总AMPK、p-PI3K或pAkt(Ser473)蛋白质的表达量，减少pJNK或TNF-α蛋白质的表达量。
所述健康功能食品组合物可以制成选自饮料、丸剂、片剂(tablet)、胶囊剂(capsule)、散剂中的任一种食品，或者可以添加到其他食品或食品的成分中来制备，可以通过通常的方法来适当地制备。
可添加本发明的组合物的食品的例子可以是选自肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、包含冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料及维生素复合剂中的任一种形态，通常意义上的健康食品均包含在其中。
所述健康功能食品组合物可以含有多种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成及天然风味剂、着色剂及增进剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等。另外，可以含有用于制备天然果汁及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用，可以含有多种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物为诸如葡萄糖、果糖的单糖；诸如麦芽糖、蔗糖的二塘；以及诸如糊精、环糊精的多糖；木糖醇、山梨糖醇及赤藓醇等糖醇。甜味剂可以使用诸如奇异果甜蛋白、甜菊提取物的天然甜味剂或诸如糖精、阿斯巴甜的合成甜味剂等。
此外，本发明涉及用于预防或治疗神经疾病的药学组合物，其含有渗透蛋白肽作为有效成分，所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或治疗神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
所述药学组合物中，除了所述有效成分以外，还可以进一步含有选自药学上可接受的食盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油中的一种以上的载体，并且除了所述有效成分以外，还可以进一步含有选自药学上可接受的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、稀释剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保存剂中的一种以上的助剂。
所述药学组合物可以通过通常的方法以口服或非口服的剂型来施用，进行制剂化时，使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。用于口服施用的固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是在所述组合物中混合至少一种以上的赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖、乳糖、明胶等来制备。此外，除了单纯的赋形剂以外，还使用诸如硬脂酸镁、滑石的润滑剂。用于口服施用的液体制剂有悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，可以包含作为通常使用的单纯稀释剂的水、液体石蜡，除此之外还可以包含多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非口服施用的制剂中包含无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻结干燥制剂、栓剂。此外，非水性溶剂、悬浮剂可以使用诸如丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油的植物性油，诸如油酸乙酯的可注射的酯等。栓剂的基剂可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
此外，本发明涉及神经疾病的预防或治疗方法，其包括将包含渗透蛋白肽的组合物施用于动物的步骤，其中所述渗透蛋白肽选自(a)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的渗透蛋白肽，或(b)由能够预防或治疗神经疾病的(a)衍生的渗透蛋白肽，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个以上的氨基酸残基的取代、缺失或插入。
以下，利用实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，本发明的范围并不限定于此，这对本技术领域的具有通常知识的技术人员来说是显而易见的。
实施例1.人成神经细胞系SH-SY5Y细胞的培养
使用100μl的含有10％(v/v)的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及1％(w/v)的抗生素(青霉素-链霉素)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco Modified EagleMedium，DMEM)，在37℃的温度、5％的CO2条件下培养了人成神经细胞系SH-SY5Y细胞。
实施例2.ApoTox-GloTM三重(Triplex)实验
装有生长培养基[包含10％的FBS、100单位/ml的青霉素(Penicillin)及100mg/ml的链霉素(Streptomycin)的DMEM培养基]的96孔板中，分别以100μl进行分株，使得包含2×104个细胞，并在37℃、5％的CO2条件下进行了培养。当细胞密集至70～90％左右时，根据制备者的指示，利用脂质体3000(Lipofectamine 3000)由pCAX-APP Swe/Ind转化8个小时。然后，以吸入的方式去除培养基，并换为100μl的包含0.5～20μm的渗透蛋白肽的新鲜的生长培养基，进行24小时的培养。
24小时之后，为了确认细胞存活率(Cell viability)、细胞毒性(cytotoxicityassay)及caspase-3的活性度，根据制备者的指示实施了利用Glomax多重检测(MultiDetection)系统的ApoTox-GloTM三重实验(普洛麦格(promega))。
结果如图1所示，确认了细胞的存活率(cell viability)与渗透蛋白肽的处理浓度成比例地增加。
实施例3.利用体外(in vitro)免疫荧光法的形态学分析(MorphologicalAnalysis)
为了形态学分析，将人成神经细胞系SH-SY5Y细胞以2×104细胞/孔分株到96孔板，然后用不同浓度(1、5及10μg)的渗透蛋白肽进行处理，在37℃、5％的CO2条件下，每天规律性地换培养基[包含10％的FBS、100单位/ml的青霉素(Penicillin)及100mg/ml的链霉素(Streptomycin)的DMEM培养基]7次，并培养24小时。
所述细胞密集生长至70～90％左右时，将培养基换为包含FITC-标记的渗透蛋白肽(1、5及10μg)的新鲜的培养基，并进一步培养24小时。将所述细胞用PBS缓冲溶液洗涤，然后在常温下用4％(v/v)的多聚甲醛(Paraformaldehyde)固定30分钟。去除4％(v/v)的多聚甲醛(Paraformaldehyde)后，用PBS缓冲溶液对细胞进行洗涤5分钟，并在常温下用0.1％(v/v)的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)进行渗透15分钟。之后，在常温下用1％的BSA(牛血清白蛋白)封闭液处理1小时。安装盖玻片后，用共聚焦显微镜(Flouview FV1000)观察了切片。
结果如图2所示，可以确认渗透蛋白肽结合于所述细胞的细胞质。
实施例4.利用动物模型进行渗透蛋白肽的腹腔注射及尾巴静脉注射后的脑的免疫荧光分析
对10周龄的APP/PS1小鼠的腹腔(IP)，用渗透蛋白肽以一天一次的频率处理45天，然后制备了载玻片切片。用于观察淀粉样蛋白斑块(amyloid plaques)的硫磺素(thioflavin)-S染色是利用了在流动的自来水中洗涤数分钟的冷冻切片(cryosection)。
在0.25％的高锰酸钾(potassium permanganate)中培养5分钟，然后使切片在包含1％的K2S2O5及1％(v/v)的草酸(oxalic acid)的溶液中培养5分钟，然后在0.02％的硫磺素-S溶液中静置8分钟。
之后，对于脑切片，用80％(v/v)的乙醇洗涤两次，每次洗涤1分钟，然后在缓慢流动的自来水中洗涤4～5分钟。然后依次增加乙醇的含量(70、80及95％(v/v))，同时用二甲苯(xylene)进行无水化。安装盖玻片(slip)，并用共聚焦激光-扫描显微镜(Flouview FV1000)观察了切片。
此外，通过腹腔注射(IP)及尾巴静脉注射(IV)将渗透蛋白肽-FITC施用于小鼠。4小时后，用4％(v/v)的冰冷(ice-cold)多聚甲醛(paraformaldehyde)以心脏灌注的方式对小鼠进行灌注，然后采集脑并在4％(v/v)的多聚甲醛(paraformaldehyde)中进行事后固定72小时，最后移至20％(w/v)的蔗糖中72小时并收集。
在液氮环境下，将脑浸润于最佳切割温度化合物(OCT，optimal cuttingtemperature compound)中，并将14μm的冠状(coronal)切片置于ProbeOn Plus载玻片上。
用于免疫荧光分析的载玻片是用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤2次，每次洗涤15分钟。用蛋白酶(proteinase K(蛋白酶K))盖住所述切片，并在37℃的湿润的腔室内培养5分钟。在包含溶解于PBS缓冲溶液的5％(v/v)的正常山羊血清和0.3％(v/v)的Triton X-100的封闭液中进行培养1小时。封闭过程以后，安装盖玻片并在共聚焦激光-扫描显微镜(FlouviewFV 1000)下观察了切片。
如图3所示，可以确认本发明的渗透蛋白肽在对小鼠进行腹腔注射(IP)及尾巴静脉注射(IV)后移动至脑的海马部位，并且可以确认进行静脉注射时移动至脑的大脑皮质部位及下丘脑(图4)。
此外，如图5至图8所示，确认了通过渗透蛋白肽的处理，脑的海马及大脑皮质部位中生成的Tau-46、p-Tau(Ser404)及淀粉样蛋白β(Aβ)斑块显著减少。
实施例5.蛋白质印迹法(Western Blot)分析
根据制备者的指示在4℃下在600μl的PRO-PRO-PREP(Intron Biotech公司)蛋白质提取溶液中提取10mg的组织。蛋白质浓度是利用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒来决定。20mg的蛋白质分解物是用4-12％(v/v)的SDS-PAGE分离。之后，将所述SDS-PAGE凝胶(gel)移动至膜，并用5％的脱脂乳(skim milk)进行了封闭。
在4℃下用一次抗体处理并过夜培养，并与融合有HRP(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidase)的二次抗体进行反应，用ECL溶液进行处理并观察了蛋白质。一次抗体使用了磷酸化(phospho)Tau(Ser413)、磷酸化(phospho)Tau(Ser404)、BACE-1(β-分泌酶1，Beta-secretase 1)、淀粉样蛋白β(Aβ)低聚物、APP、BACE-1、突触素(synaptophysin)、SNAP25(突触相关蛋白25，Synaptosomal-Associated Protein 25)、PSD95(突触后密度蛋白95，postsynaptic density protein 95)、AdipoR1(脂联素受体1，Adiponectin receptor 1)、磷酸化(phospho)AMPK、AMPK(AMP-活化蛋白激酶，AMPK-activated protein kinase)、β-肌动蛋白(actin)、磷酸化(phospho)JNK、TNF-α、NF-κB、磷酸化(phospho)IKKβ。
阴性对照组使用了没有供给APP的正常培养基，阳性对照组使用了供给APP的培养基，实验组使用了供给渗透蛋白(0.1～20μM)的培养基。
结果如图9至图11所示，优先确认了海马和大脑皮质中的p-Tau(Ser413)、p-Tau(Ser404)、Aβ低聚物、APP及BACE-1蛋白质的表达量显著减少(图9及图10)，并且还可以确认提高突触功能的蛋白质SNAP25及PSD95蛋白质的表达量增加(图11)。
此外，确认了通过渗透蛋白肽的处理，AdipoR1、pAMPK及总AMPK蛋白质的表达量增加(图12)，pJNK、TNF-α、NF-κB及p-IKKβ蛋白质的表达量减少(图13)，p-PI3K及pAkt(Ser473)蛋白质的表达量增加(图14)，由此可以知道渗透蛋白肽调节神经细胞内的信号传递。
实施例6.行为分析
1)模型动物及药物处理
为了确认用本发明的有效成分渗透蛋白肽处理所引起的行为分析，雄性C57BL/6J野生型小鼠和双转基因(double transgenic)B6.Cg-Tg(APPswe，PSENdE9)85Dbo/Mmjax(APP/PS1)AD-模型小鼠购自杰克逊实验室(巴尔港(Bar Harbor)，缅因州(ME)，美国)。所述双转基因小鼠的脑中不仅表达包含瑞典型突变(Swedish mutation)的嵌合的小鼠-人淀粉样前体蛋白(chimeric mouse-human amyloid precursor protein，Mo/HuAPP695swe)，而且还表达突变的人早老素1蛋白(mutant human presenilin 1 protein，PS1-dE9)，购买后在大学的动物饲养场中以12h/12h的明暗周期在23℃、60±10％的相对湿度条件下饲养所述小鼠，饲养过程中无限制地供给了食物和水。所述小鼠达到10周龄时，为了驯化进行了1周的注射并移至行为观察室，小鼠的维持管理及处理是根据韩国庆尚大学生物学科应用生命科学部发布的动物伦理委员会(IACUC)的指南来实施。本发明中，根据韩国庆尚大学生物学科应用生命科学部的动物伦理委员会(IACUC)认可的指南(认可ID：125)实施了小鼠实验。
对本发明的实施例6中使用的动物进行了如下分组。
1)正常组：野生型(WT)组(group)，没有用本发明的渗透蛋白肽进行处理的组；
2)APP/PS1转化组，没有用本发明的渗透蛋白肽进行处理的组；
3)对APP/PS1转化组用本发明的有效成分渗透蛋白肽进行处理的组；以及
4)对野生型组用本发明的有效成分渗透蛋白肽进行处理的组。
将本发明的渗透蛋白肽溶解于去离子双蒸馏水(bi-deionised distilledwater)，最终制备后通过生理盐水来施用。将本发明的渗透蛋白肽根据体重以5mg/kg/天的用量施用于APP/PS1及野生型(WT)小鼠的腹腔内(i.p)，施用45天。对于野生型小鼠及APP/PS1转化小鼠，用相同体积的生理盐水进行了处理，行为分析后，为了进一步的生物化学及免疫组织化学分析，牺牲了所述实验动物。
本实施例6的行为分析(Behavioral study)是通过下述方法来进行：每组利用13只小鼠，并利用莫里斯水迷宫(Marris water maze；MWM)试验和Y-迷宫试验。
1)莫里斯水迷宫试验
莫里斯水迷宫试验装置由直径为100cm、高度为40cm的圆形水槽构成，其中盛有添加白色墨水而变得不透明的15.5cm深度的水(水温为23±1℃)。透明的逃脱平台(直径为10cm，高度为20cm)隐藏在离水面1cm以下位置，并位于其中一个象限的中央。各老鼠利用旋转启动的三个象限(three quadrants of rotational starting)和隐藏在一个象限中的一个平台连续训练5天。每次尝试时都会计算从水迷宫逃脱的延迟时间(寻找隐藏的逃脱平台所需的时间)。在第5天的24小时后，为了进行记忆强化评价，实施了探针(probe)实验。探针实验中，去除平台并允许各老鼠自由地游泳60秒，并测定了小鼠在目标象限中消耗的时间和错过的平台的位置(在隐藏平台的训练期间平台所处的位置)的数量。在目标象限中消耗的时间作为显示记忆强化程度的基准。所有数据是使用视频-跟踪软件(SMART，PanlabHarward Apparatus，Bioscience Company，霍利斯顿(Holliston)，马萨诸塞州(MA)，美国)进行了记录。
结果如图15所示，就作为从水迷宫逃脱的延迟时间(寻找隐藏的逃脱平台所需的时间)的潜伏期(Latency)而言，可以确认正常小鼠经过5天的训练后潜伏期时间显著减少，为20秒以内，但是APP/PS1模型小鼠的潜伏期时间约为45秒左右，并且可以确认用本发明的脂联素受体活性化渗透蛋白肽进行处理的APP/PS1模型小鼠的潜伏期时间减少至约33秒(图15A)。此外，在探针实验结果中也确认了停留在平台所处位置的APP/PS1模型小鼠的数量比正常小鼠显示出显著减少的倾向，并且可以确认用渗透蛋白肽对上述APP/PS1模型小鼠进行处理时，停留在平台所处位置的数量会比APP/PS1模型小鼠增加(图15B)。APP/PS1模型小鼠在目标象限中消耗的时间比正常小鼠显著减少，但是用本发明的有效成分渗透蛋白肽处理的小鼠在目标象限中消耗的时间增加至与正常小鼠几乎相似的水平(图15C)。
2)Y-迷宫试验
Y-迷宫是由刷上黑色油漆的木头制作，所述Y-迷宫的各分支(arm)是由50cm的长度、20cm的高度及10cm宽度的底部和上端组成。各小鼠位于迷宫装置的中央，并使小鼠在迷宫中自由地移动3次，每次移动8分钟。用肉眼观察了各迷宫分支的连续进入(series ofarm entries)。自发性变更(Spontaneous alteration)定义为将重复的三次为一组(overlapping triplet sets)时小鼠依次进入三个不同分支的情况。
变更行为比率(％)是用[重复的三次为一组(连续进入三个不同分支的情况)/总进入次数-2]×100计算。将高的自发性变更行为比率视为记忆功能得到提高。
Y-迷宫实验结果如图15D所示，可以确认APP/PS1模型小鼠的自发性变更(spontaneous alteration)比正常小鼠减少，并且通过渗透蛋白肽的处理得到恢复。
从APP模型小鼠的行为分析判断出用本发明的渗透蛋白肽处理时提高认知或记忆等。
实施例 7.体外(In vitro)电生理学分析(LTP；长时程增强效应(Long TermPotentiation))
本实施例7中，为了体外(In vitro)电生理学分析，将分离自E19斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠(Rat)的一次海马神经元培养至150细胞/mm2的密度。使用现有的全细胞技术(whole-cell techniques)记录了AMPA受体(AMPAR)介导的微型兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs)。由内部溶液(internalsolution)装满时，电极电阻显示多种为3～5MΩ。
本实施例7中，利用Axopatch 200A膜片钳放大器(Molecular Devices公司，森尼韦尔(Sunnyvale)，加利福尼亚)测定了电流。
膜电压和电流的电压、控制及数字化是利用与IBM兼容电脑上的pClamp软件包的Clampex 9.2(Molecular Devices公司，森尼韦尔(Sunnyvale)，加利福尼亚)连接的Digidata 1322A来进行调节，并利用Clampfit(Molecular Devices公司，森尼韦尔(Sunnyvale)，加利福尼亚)和Prism 4.0(GraphPad公司，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚)分析了数据，并且利用放大器的4极贝塞尔滤波器(four-pole Bessel filter)在2kHz下对电流进行低通(low-pass)滤波。
AMPAR-mEPSCs是添加1mM的河豚毒素并在本发明的内部及外部溶液配置中维持作为Cl-平衡电势(equilibrium potential)的膜电势-70mV的情况下以电生理学方法分离出。细胞内记录溶液(膜片电极)包含125mM的甲磺酸铯、8mM的NaCl、10mM的HEPES、0.5mM的EGTA、4mM的Mg-ATP、0.3mM的Na-GTP及5mM的QX-315 C1(pH为7.25，用CsOH滴定，285mosmol-1)。细胞外记录溶液包含134mM的NaCl、5.4mM的KCl、2.5mM的CaCl2、1.2mM的MgCl2、10mM的D-葡萄糖及10mM的HEPES(pH为7.4，用NaOH滴定)。对于各细胞，数据是在2kHz下进行过滤，并且使用Clampfit 9.0软件(Molecular Devices公司，联合市(Union City)，加利福尼亚)中实施的基于模板的微型突触电流检测算法(template-based miniature synapticcurrent detection algorithms)进行了分析。通过软件检测出的各个推定的mEPSC是基于视觉上其一般形态相对于突触现象是否与预计相同来被接受或被拒绝。在各细胞中分析符合上升时间标准(rise time criteria)的300个连续的mEPSC。AMPAR介导的EPSC振幅(amplitude)是在-70mV下在电流的顶点测定的(图16)。
mEPSCs的累积概率曲线(cumulative probability curves)是通过Clampfit 9.0软件和Prism 4.0(GraphPad公司，圣地亚哥，加利福尼亚)来计算的。如图16所示，本实施例7中Aβ组的频率(frequency)(Hz)比正常组(Vehicle(对照组))显著减少，并且所减少的频率(Hz)通过渗透蛋白肽的处理得到提高的效果在统计学上很明显。本发明人为了对两组进行比较，使用了Student′s t-检验。p＜0.05时，视为差异在统计学上很明显。
实施例8.体内(In vivo)电生理学及LTP(长时程增强效应，Long TermPotentiation)分析
为了在海马切片(400μM厚度)中从横断谢弗侧枝(schaffer collateral，SC)输入(input)调查CA1回路，从成体小鼠准备了海马切片。简单而言，用异氟烷(isoflurane)麻醉小鼠，然后通过利用冰冷蔗糖-人工脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)的心脏灌注(transcardiac perfusion)对脑进行迅速冷却。去除所述脑后，保管在冰冷蔗糖-人工CSF中。将冠状(coronal)切片在35℃的人工CSF中培养30分钟，然后移至记录腔室之前在常温(23～25℃)的人工CSF中培养1～4小时。所述标准人工CSF包含由95％的O2和5％的CO2饱和的119mM的NaCl、2.5mM的KCl、2.5mM的CaCl2、1.3mM的MgSO4、1.0mM的NaH2PO4、26.2mM的NaH2CO3、11mM的葡萄糖、1mM的丙酮酸钠、0.4mM的抗坏血酸钠，蔗糖-人工CSF包含由95％的O2和5％的CO2饱和的198mM的蔗糖、2.5mM的KCl、1mM的NaH2PO4、26.2mM的NaHCO3、11mM的葡萄糖、1mM的丙酮酸钠、0.4mM的抗坏血酸钠。
LTP实验是在27～29℃下进行。为了进行电生理学实验，使用了具有3～6MΩ的管电阻性的电极，全细胞记录(whole-cell recordings)是利用紫外线(IR)-微分干涉对比(differential interference contrast，DIC)光学指南并在视觉指导下从神经元获得。为了分离CA1病变，进行LTP(长时程增强现象，long-term potentiation)实验之前切断CA3及DG区域。刺激则用于位于离记录的细胞的胞体(soma)100～200mM距离的使用同心双极电极(concentric bipolar electrode)的谢弗侧枝(SC)路径。金细胞记录溶液如下所述：135mM的甲磺酸铯、8mM的NaCl、10mM的HEPES、0.5mM的EGTA、4mM的Mg-ATP、0.3mM的Na-GTP及5mM的QX-315Cl(pH为7.25，用CsOH滴定，285mOsm)。只要没有其他标记，记录期间在-70mV下保持细胞。记录是使用在10kHz下数字化且在2kHz下过滤的Multiclamp 700B(Moleculardevices公司，森尼韦尔(Sunnyvale)，加利福尼亚)制作的。在记录期间继续观察输入电阻和串联电阻(series resistance)。所有EPSC实验的试验刺激设定为0.1Hz，0.2ms的持续时间及其强度(100～900μA)则为了以-70mV的维持电势将EPSC(兴奋性突触后电流，excitatory postsynaptic current)振幅诱导至50～100pA而调整。LTP实验中，利用配对刺激(pairing stimuli，2Hz，刺激2分钟并突触至0mV后去极化)之前，测定基线(baseline)EPSCs 3分钟。配对刺激(2Hz，刺激2分钟并突触至0mV后去极化)后，每隔10分钟收集EPSCs，收集30分钟。
结果如图17所示，确认了正常(Normal)组中通过配对刺激的输入，突触传递长期地得到增强，但是APP/PS1模型组中EPSC的增强在统计学上明显减少，与此相比，对APP/PS1模型组用脂联素受体活性化渗透蛋白肽进行处理的实验组中EPSC的增强与正常组相比显示出几乎相同的水平。
Figure IPA0000247225010000011

Claims (12)

1.渗透蛋白肽作为有效成分在制备用于预防或改善神经疾病的健康功能食品组合物中的用途，所述渗透蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经疾病为选自阿尔茨海默病、痴呆症、帕金森病、癫痫、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、神经发生障碍、自闭症、脑卒中、卢伽雷氏症、亨廷顿舞蹈症及多发性硬化症中的一种以上的疾病。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述渗透蛋白肽的含量为0.1～100重量％。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为选自饮料、丸剂、片剂、胶囊剂、散剂中的任一种剂型。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述渗透蛋白肽减少脑的海马和大脑皮质中的Aβ低聚物、p-Tau(Ser413)或BACE-1蛋白质的表达量。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述渗透蛋白肽增加SNAP25或PSD95蛋白质的表达量。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述渗透蛋白肽增加AdipoR1、pAMPK、总AMPK、p-PI3K或pAkt(Ser473)蛋白质的表达量，并减少pJNK或TNF-α蛋白质的表达量。
8.渗透蛋白肽作为有效成分在制备用于预防或治疗神经疾病的药学组合物中的用途，所述渗透蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经疾病为选自阿尔茨海默病、痴呆症、帕金森病、癫痫、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、神经发生障碍、自闭症、脑卒中、卢伽雷氏症、亨廷顿舞蹈症及多发性硬化症中的一种以上的疾病。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，相对于组合物的总重量，所述渗透蛋白肽的含量为0.1～100重量％。
11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，除了所述有效成分以外，所述组合物还含有选自药学上可接受的食盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油中的一种以上的载体。
12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，除了所述有效成分以外，所述组合物还含有选自药学上可接受的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、稀释剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保存剂中的一种以上的助剂。
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GR01 Patent grant
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