CN107551066B - 一种采用脱脂茶粕制成的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业领域,公开了一种采用脱脂茶粕制成的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元及其制备方法和应用。制备方法包括:将脱脂茶粕先用水浸泡,加入复合酶和表面活性剂,30~50℃保温2~8h,过滤,得到滤液;向滤液中加入浓盐酸,40~80℃保温3~6h,离心,收集上清液和沉淀;向沉淀中加入氢氧化钠水溶液,40~80℃保温3~6h,离心,沉淀水洗至中性,得到沉淀物1;上清液用浓盐酸调节pH至中性,离心,得到沉淀物2;沉淀物1和沉淀物2中分别加入水、卵磷脂、胆固醇、吐温‑80,均质后再过滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元和纳米黄酮苷元。本发明产品可用于制备抗菌消炎、提高动物免疫力的药物制剂和饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于农业领域,具体涉及一种采用脱脂茶粕制成的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元及其制备方法和应用。
背景技术
脱脂茶粕中含有约15%的皂苷和2%的黄酮。皂苷和黄酮具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。
皂苷和黄酮的提取方法较多,一般采用溶剂法,有机溶剂的大量使用易导致挥发性有机物(VOCs)的排放超标而污染环境。中国专利CN 103509062 A公开了一种酶法酶解茶叶籽粉,再用酸性乙醇水制备茶籽黄酮的方法,但也采用了有机溶剂,且只获得了一种黄酮产品。中国专利CN 103450316 A公开了一种原料采用水提取、调酸和大孔树脂分离可同时提取茶皂素、茶籽黄酮苷和茶多糖的方法,但是茶皂苷和黄酮在茶粕中的存在形式有两种,分别是水溶性糖苷和水不溶的苷元。该方法只能得到其中一种,从而使提取率降低。
皂苷和黄酮味苦,入口性差,难以用作饲料。以脱脂茶粕为原料采用复合酶法同时制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,及其在饲料中的应用未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述方法制备得到的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元。
本发明的再一目的在于提供一种上述纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现:
一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,包括下述步骤:
(1)将脱脂茶粕先用其质量8~20倍的水浸泡2~5h,加入复合酶和表面活性剂,30~50℃保温2~8h,过滤,得到滤液;所述表面活性剂的用量为脱脂茶粕质量的0.05~0.5%;所述复合酶的用量为每100克脱脂茶粕加入活性单位200~1000U的复合酶;
(2)向滤液中加入其体积分数2~10%的浓盐酸,40~80℃保温3~6h,离心,收集上清液和沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入其质量3~10倍的氢氧化钠水溶液,40~80℃保温3~6h,离心,沉淀水洗至中性,得到沉淀物1;所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为5~20%;
(4)步骤(2)所得上清液用浓盐酸调节pH至中性,离心,得到沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量10~20倍的水、其质量3~8倍的卵磷脂、其质量0.05~0.5倍的胆固醇、其质量0.01~0.1%的吐温-80,然后以5000~20000转/min的速度均质30~90min;再过0.10~0.45μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元和纳米黄酮苷元。
步骤(1)中,所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶按质量比1:0.1~1复配而成。
步骤(1)中,所述表面活性剂为单甘酯、吐温-20、司盘-60和蔗糖脂肪酸酯的一种或两种以上。
步骤(2)、(3)和(4)中,所述的离心速度为5000~10000转/min,离心时间15~60min。
所得纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的粒径为50~400nm,包封率80~90%。
一种由上述的方法制备而成的纳米皂苷元。
所述纳米皂苷元在制备抗菌消炎或提高动物免疫能力的药物制剂和饲料添加剂中的应用。
一种由上述的方法制备而成的纳米黄酮苷元。
所述的纳米黄酮苷元在制备抗菌消炎或提高动物免疫能力的药物制剂和饲料添加剂中的应用。
所述药物制剂可为口服或注射用药剂型,可为单方或复方制剂。
本发明的原理如下:
皂苷元和黄酮苷元分别是茶籽皂苷和黄酮分子结构中基本结构单元,是茶籽茶皂苷和黄酮经水解、分离制备后形成的产品。皂苷元与茶籽茶皂苷、黄酮苷元与茶籽黄酮在活性上有较大的不同;皂苷元较茶皂苷、黄酮苷元较茶籽黄酮性质稳定、脂溶性强,制成纳米颗粒不仅改善其风味,而且有利于机体吸收和利用;本发明利用黄酮苷元在碱性条件下易溶,而皂苷元难溶的性质,通过酸碱转溶而分离,得到的就是皂苷元和黄酮苷元,再以卵磷脂和胆固醇为囊材分别制成纳米粒。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明经复合酶破解阻碍有效成分溶出的细胞壁和胶质,加速茶籽皂苷和黄酮的溶出;采用适量的表面活性剂,可将水难溶的苷元和水溶性的糖苷一并提取出来,从而提高了提取率。
(2)本发明方法不使用有机溶剂,因而不会有挥发性有机物(VOCs)排放。
(3)本发明制备工艺简单,反应条件温和,便于工业化生产。
(4)本发明制备方法得到的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元有非常好的抗炎和提高免疫力作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)1kg脱脂茶粕先用8kg水浸泡5h,加入活性单位2000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:0.5)和0.5g的吐温-20,50℃保温8h,过滤,得滤液6.5L;
(2)向滤液中加入130mL浓盐酸,80℃保温3h,5000转/min离心60min,得上清液和210g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入630g的质量浓度为20%的氢氧化钠水溶液,40℃保温6h,5000转/min离心60min,沉淀水洗至中性,得到120g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得上清液用浓盐酸调节pH至中性,5000转/min离心60min,得到23g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量10倍的水、3倍的卵磷脂、0.5倍的胆固醇、0.01%的吐温-80,10000转/min均质30min;再过0.10μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元490g和纳米黄酮苷元65g。
实施例2
(1)1kg脱脂茶粕先用20kg水浸泡2h,加入活性单位10000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:1)和5g的单甘酯,30℃保温3h,过滤得滤液17L;
(2)向滤液中加入510mL浓盐酸,40℃保温3h,10000转/min离心15min,得上清液和260g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入其质量2.6kg质量浓度为5%的氢氧化钠水溶液,80℃保温3h,10000转/min离心15min,沉淀水洗至中性,得到140g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得上清液用浓盐酸调节pH至中性,10000转/min离心15min,得到27g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量20倍的水、8倍的卵磷脂、0.05倍的胆固醇、0.1%的吐温-80,20000转/min均质30min;再过0.45μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元980g和纳米黄酮苷元136g。
实施例3
(1)1kg脱脂茶粕先用10kg水浸泡3h,加入活性单位5000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:0.5)和1g的司盘-60,40℃保温4h,过滤得滤液8L;
(2)向滤液中加入400mL的浓盐酸,50℃保温4h,8000转/min离心30min,得上清液和170g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入850g质量浓度为10%的氢氧化钠水溶液,60℃保温4h,8000转/min离心30min,沉淀水洗至中性,得到134g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得离心上清液用浓盐酸调节pH至中性,8000转/min离心30min,得到26g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量15倍的水、5倍的卵磷脂、0.1倍的胆固醇、0.05%的吐温-80,10000转/min均质60min;再过0.3μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元630g和纳米黄酮苷元78g。
实施例4
(1)1kg脱脂茶粕先用12kg水浸泡3h,加入活性单位3000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:0.3)和2g的蔗糖脂肪酸酯,45℃保温5h,过滤得滤液10L;
(2)向滤液中加入600mL浓盐酸,60℃保温4h,6000转/min离心45min,得上清液和220g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入1.32kg质量浓度为8%的氢氧化钠水溶液,70℃保温4h,6000转/min离心45min,沉淀水洗至中性,得到142g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得离心上清液用浓盐酸调节pH至中性,6000转/min离心45min,得到25g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量12倍的水、4倍的卵磷脂、0.08倍的胆固醇、0.03%的吐温-80,7000转/min均质45min;再过0.4μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元590g和纳米黄酮苷元89g。
实施例5
(1)1kg脱脂茶粕先用16kg水浸泡4h,加入活性单位8000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:0.6)和2g的单甘酯、2g蔗糖脂肪酸酯,50℃保温5h,过滤得滤液12L;
(2)向滤液中加入480mL浓盐酸,60℃保温4h,10000转/min离心20min,得上清液和245g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入1.16kg质量浓度为15%的氢氧化钠水溶液,50℃保温5h,10000转/min离心20min,沉淀水洗至中性,得到142g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得离心上清液用浓盐酸调节pH至中性,10000转/min离心20min,得到28g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量16倍的水、6倍的卵磷脂、0.3倍的胆固醇、0.06%的吐温-80,10000转/min均质40min;过0.22μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元985g和纳米黄酮苷元145g。
实施例6
(1)1kg脱脂茶粕先用18kg水浸泡3h,加入活性单位7000U的复合酶(纤维素酶与果胶酶质量比1:0.8)和4g的单甘酯、1g司盘-60,45℃保温6h,过滤得滤液15L;
(2)向滤液中加入1.2L的浓盐酸,50℃保温5h,8000转/min离心30min,得上清液和255g沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入1.53kg质量浓度为12%的氢氧化钠水溶液,60℃保温4h,8000转/min离心30min,沉淀水洗至中性,得到147g沉淀物1;
(4)将步骤(2)所得离心上清液用浓盐酸调节pH至中性,8000转/min离心30min,得到26g沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量16倍的水、4倍的卵磷脂、0.4倍的胆固醇、0.07%的吐温-80,15000转/min均质60min;过0.45μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元580g和纳米黄酮苷元87g。
实施例7
实施例1-6制得的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的粒径和包封率实验
方法:采用2015版《中华人民共和国兽药典》第一部附录0982粒度和粒度分布测定法第三法——光散射法(附录170页),测定纳米囊粒径;采用丙酮溶解囊材,过滤,称量挥发丙酮后的物质重量,包封率=(纳米囊重量-丙酮挥发后物质重量)/纳米囊重量。
结果:纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的粒径范围在50~400nm之间,包封率在80~90%。结果见表1。这表明该采用实施例1~6法制得的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元粒径分布较均匀,具有较高的包封率。
表1纳米皂苷和纳米黄酮的粒径分布和包封率
实施例8
称取实施例1制得的纳米黄酮苷元10g和纳米皂苷元10g,加入甘油10g,注射用大豆油980g,高速搅拌,制成2%乳剂。该乳剂可静脉注射动物,用以抗炎和提高动物免疫功能。注射剂量:0.1~1mg/kg体重。
实施例9
称取实施例3制得的纳米皂苷元50g,加入低聚木糖100g和鸡或猪饲料850g,混合均匀,加水制粒,过20目筛,晾干。即得纳米皂苷元复配饲料添加剂,用于家禽、家畜类提高免疫功能作用。添加量为每公斤饲料,加10~20g。
实施例10
称取实施例5制得的纳米黄酮苷元50g,加入药用淀粉、糖粉和糊精按质量比7:2:1组成的混合物450g,混合均匀,用水调节,造粒,即得含纳米黄酮苷元10%的颗粒剂,可用于动物饲料添加,有防治动物菌痢的作用,每公斤饲料添加量牛10~20g,猪2~5g,家禽3~6g。
实施例11
采用实施例1所得纳米皂苷元和纳米黄酮苷元进行抗炎性和淋巴细胞增殖能力实验
方法:取雄性小鼠80只,随机分为8组,每组10只。第1组给生理盐水,灌胃,为阴性对照组;第2组给阿司匹林200mg/kg,灌胃,为阳性对照组;第3~4组分别为纳米皂苷元的低、高剂量组;第5~6组分别为纳米黄酮苷元低、高剂量组,第7组为茶皂苷元原药组,第8组为黄酮苷元原药组。给药组均灌胃给药,每天1次,10天后,于末次给药1h后,在每只动物右耳前后两面涂二甲苯0.02mL致炎。各组致炎1h后,将动物颈椎脱臼致死,沿耳廓基线剪下两耳,用7mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,称重。计算公式:
肿胀度=右耳片重量-左耳片的重量
另无菌取脾,分离单个脾细胞,用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106个/mL。按MTT法用酶标仪,以570nm波长测定光密度(OD值)。用加ConA(刀豆蛋白)孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力。比较给药组和对照组的差异情况。
结果:致炎1h后,各组小鼠右耳均可见明显红肿。纳米皂苷元组和纳米黄酮苷元组对二甲苯致小鼠耳肿胀较阴性组均有明显的抑制作用,淋巴增殖能力也显著增强,效果优于茶皂苷元原药组和黄酮苷元原药组。说明本发明的纳米皂苷元和纳米黄酮苷元有更好的抗炎和提高免疫力作用。结果见表2。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,其特征在于包括下述步骤:
(1)将脱脂茶粕先用其质量8~20倍的水浸泡2~5h,加入复合酶和表面活性剂,30~50℃保温2~8h,过滤,得到滤液;所述表面活性剂的用量为脱脂茶粕质量的0.05~0.5%;所述复合酶的用量为每100克脱脂茶粕加入活性单位200~1000U的复合酶;所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶按质量比1:0.1~1复配而成;
(2)向滤液中加入其体积分数2~10%的浓盐酸,40~80℃保温3~6h,离心,收集上清液和沉淀;
(3)向步骤(2)所得沉淀中加入其质量3~10倍的氢氧化钠水溶液,40~80℃保温3~6h,离心,沉淀水洗至中性,得到沉淀物1;所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为5~20%;
(4)步骤(3)所得上清液用浓盐酸调节pH至中性,离心,得到沉淀物2;
(5)向沉淀物1和沉淀物2中分别加入其质量10~20倍的水、其质量3~8倍的卵磷脂、其质量0.05~0.5倍的胆固醇、其质量0.01~0.1%的吐温-80,然后以5000~20000转/min的速度均质30~90min;再过0.10~0.45μm的滤膜,冷冻干燥,分别得到纳米皂苷元和纳米黄酮苷元。
2.根据权利要求1所述的一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述表面活性剂为单甘酯、吐温-20、司盘-60和蔗糖脂肪酸酯的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,其特征在于:步骤(2)、(3)和(4)中,所述的离心速度为5000~10000转/min,离心时间15~60min。
4.根据权利要求1所述的一种采用脱脂茶粕制备纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的方法,其特征在于:所得纳米皂苷元和纳米黄酮苷元的粒径为50~400nm,包封率80~90%。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的纳米皂苷元。
6.根据权利要求5所述的纳米皂苷元在制备抗菌消炎或提高动物免疫能力的药物制剂和饲料添加剂中的应用。
7.一种根据权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的纳米黄酮苷元。
8.根据权利要求7所述的纳米黄酮苷元在制备抗菌消炎或提高动物免疫能力的药物制剂和饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求6或8所述的应用,其特征在于:所述药物制剂为口服或注射用药剂型,为单方或复方制剂。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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