CN107523507A - 一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基及其培养方法，以木蹄层孔菌代谢产胞外多糖为指标，在单因素试验的基础上，首先通过Plackett‑Burman设计从8个影响因素中获得影响多糖产量的3个主要因素：蔗糖、酪蛋白胨、接种量；再利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域；最后依据响应面优化中的BBD设计原理，采用三因素三水平分析，确定影响产木蹄层孔菌胞外多糖的深层发酵因素。实验得到多糖含量为3.67g/L，与理论值3.69g/L接近，比单纯优化培养条件提高1.67倍。

Description

一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基及其培养方法。
背景技术
稀土和先进碳材料为国家绿色技术发展提供原料支撑，新兴市场需求巨大。我国是全球最大的粉煤灰生产国，2015年粉煤灰产量高达6.2亿吨，现阶段粉煤灰主要用于建筑水泥原料、基础工程填料、农业土壤改良等方面，经济附加值低、用途受限。通过前期分析数据表明，我国粉煤灰中稀土元素含量平均值近100μg/g，因此将粉煤灰作为稀土元素新兴来源具有重大战略意义。
目前多糖的开发主要是植物原料，但是植物的过度开采会破坏生态环境，所以人工培养、微生物发酵是资源利用而且经济又环保的方法，不仅如此，微生物具有培养周期短，可工业化生产等优点。木蹄层孔菌多糖虽然具有较高的应用价值，但是木蹄层孔菌的化学成分研究相对较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基及其培养方法，旨在研究深层发酵木蹄层孔菌产多糖，为以后工业化生产多糖提供具有实际价值的参考方案。
其具体技术方案为：
一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基，其配方为：蔗糖15.0g/L、酪蛋白胨7.5g/L、接种量6.0％、KH2PO41.0g/L、MgSO40.5g/L、VB20.625mg/L、pH7.5、
一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基的培养方法，培养温度为31℃、摇床转速为150rpm、培养时间为10d、培养基容量为200mL/500mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明以木蹄层孔菌代谢产胞外多糖为指标，综合发酵培养基及培养条件，在单因素试验的基础上，首先通过Plackett-Burman设计从8个影响因素中获得影响多糖产量的3个主要因素：蔗糖、酪蛋白胨、接种量；再利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域；最后依据响应面优化中的BBD(Box-Behnken Design)设计原理，采用三因素三水平分析，确定影响产木蹄层孔菌胞外多糖的深层发酵因素，实验得到多糖含量为3.67g/L，与理论值3.69g/L接近，比单纯优化培养条件提高1.67倍。
附图说明
图1是葡萄糖的标准曲线；
图2是碳源对木蹄层孔菌EPS产量的影响其中：A:葡萄糖；B:麦芽糖；C:乳糖；D:果糖；E:甘露醇；F:山梨醇；G:蔗糖；H:木糖；I:可溶性淀粉；
图3是氮源对木蹄层孔菌EPS产量的影响，其中：A:NH4CL；B:NH4NO3；C:(NH4)2SO4；D:尿素；E:L-赖氨酸；F:L-天冬氨酸；G:L-精氨酸；H:胰蛋白胨；I:酵母膏；J:酪蛋白胨；K:NaNO3；L:牛肉膏；
图4是碳氮比对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图5是矿物质对木蹄层孔菌EPS产量的影响，其中：A:KH2PO4；B:MgSO4；C:CaCl2；D:FeSO4；E:Na2SO3；F:ZnSO4；G:KH2PO4+MgSO4；H:KH2PO4+CaCl2；I:未添加，和未添加空白对照组(I)相比，#p<0.05，#p<0.01；
图6是生长因子对木蹄层孔菌EPS产量的影响，其中：A:VB1；B:VB2；C:VB5；D:VB6；E:肌醇；F:D-生物素；G:叶酸；H:未添加，和未添加空白对照组(H)相比，#p<0.05，#p<0.01；
图7是培养基pH对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图8是培养温度对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图9是培养基容量对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图10是摇床转速对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图11是接种量对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图12是培养时间对木蹄层孔菌EPS产量的影响；
图13是蔗糖与酪蛋白胨对木蹄层孔菌EPS产量的交互作用；图13A为前边的为响应面的三维立体图，图13B为等高线图；
图14是蔗糖与接种量对木蹄层孔菌EPS产量的交互作用；图14A为前边的为响应面的三维立体图，图14B为等高线图；
图15是酪蛋白胨与接种量对木蹄层孔菌EPS产量的交互作用；图15A为前边的为响应面的三维立体图，图15B为等高线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1供试菌株
木蹄层孔菌(F.fomentarius)：保存于北方民族大学生物科学与工程学院。
1.2培养基
1.2.1保存培养基
木蹄层孔菌菌种保存培养基：78％白桦木屑、20％麦麸、1％CaSO4、1％蔗糖、湿度60％保存于试管中。
马铃薯琼脂培养基(PDA):马铃薯(去皮)200.0g；葡萄糖20.0g；琼脂20.0g；水1000.0mL；初始pH 6.0；温度：28℃；培养10天后保存于4℃冰箱，每2个月活化一次。
1.2.2种子培养液
葡萄糖30.0g，蛋白胨5.0g，KH2PO41.0g，硫酸镁0.5g，维生素B10.5mg，初始pH 6.0，蒸馏水定容至1000.0ml，温度25℃，摇床150rpm，培养7天。
1.3菌种活化
木蹄层孔菌(F.fomentarius)母种木粉培养基上取一块约0.5cm2大小的菌块置于PDA平板培养皿上，28℃培养7天，制得活化菌种。
1.4种子培养
一级摇瓶种子培养：100ml摇瓶装液体种子培养基50ml，接种活化后的活化菌种15块，每块5mm2，摇床培养，转速150rpm，25℃振荡培养7天，即得一级种子培养液；
二级摇瓶种子培养：250ml摇瓶装液体种子培养基100ml，接种量20.0％(摇匀的一级液体摇瓶种子液)，培养条件同上。
发酵培养：按照实验设计,摇床培养，测定多糖含量，进行培养基优化,平行3次，空白对照。
1.5试验药品与仪器设备
表1实验材料及药品
续表1
表2实验仪器及设备
2试验方法
2.1多糖含量的测定2.2.1.1标准曲线的制作：
105℃干燥恒重100.0mg葡萄糖，置于100.0ml容量瓶定容，使其浓度达到1.0000mg/ml。按照如下表格操作：
表3标准曲线制作
置于490nm处测其吸光度，以葡萄糖含量和吸光度做标线。
2.1.2样品的测定
样品测定：采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量，取发酵处理液1.0ml，去离子水补加到2.0ml，空白为蒸馏水2.0ml，各加6％苯酚1.0ml，混匀，加浓硫酸5.0ml，沸水浴2min，室温冷却30min，于490nm测定。
2.2木蹄层孔菌培养基单因素试验
2.2.1碳源的确定
分别选用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、山梨醇、木糖、可溶性淀粉作为碳源，控制10.0g/L，其它条件不变：蛋白胨5.0g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO41.0g/L、维生素B20.5mg/L，pH为6.0，然后接种20块(大小为5mm2)菌种于装100mL液体培养基的250mL的三角瓶中，发酵条件为：培养温度25℃、摇床转速150rpm、培养时间7d。平行3次，培养完成后对发酵液进行离心、透析，最后测定多糖含量。
2.2.2氮源的选择
分别选用NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素、L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸、胰蛋白胨、酵母膏、酪蛋白胨、NaNO3、牛肉膏作为氮源，控制5.0g/L，其它条件不变：蔗糖10.0g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO41.0g/L、维生素B20.5mg/L，pH为6.0，然后接种20块(大小为5mm2)菌种于装100mL液体培养基的250mL的三角瓶中，发酵条件及测量方法同上。
2.2.3碳/氮比的选择
选取上述试验得到的主要氮源和主要碳源作为试验影响因素进行碳/氮比成分综合试验，固定氮源酪蛋白胨为5.0g/L，改变碳源蔗糖含量(其中蔗糖含碳量为42％；酪蛋白胨含氮量14％)，控制碳氮比为：1:1、3:1、6:1、12:1、18:1、24:1、30:1、40:1,每组三个平行，其余方法同2.2.1，然后找出最合适的碳氮比。
2.2.4矿物质元素的选择
分别选取KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、Na2SO3、ZnSO4、KH2PO4+MgSO4、KH2PO4+CaCl2及未添加对照进行发酵，添加量为1.0g/L，其它条件保持不变：蛋白胨5.0g/L、蔗糖10.0g/L、维生素B20.5mg/L，pH为6.0，其余方法同2.2.2.1。
2.2.5生长因子的确定
分别选用维生素B1、B2、B5、B6、肌醇、D-生物素、叶酸、空白对照作为生长因子比较，控制为0.5mg/L，其它条件不变：蔗糖10.0g/L、酪蛋白胨5.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO40.5g/L，pH为6.0，同2.2.2.1进行发酵以及测量。
2.2.6培养基初始pH的影响
调节发酵培养基pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每组3个平行。保持其它条件不变，25℃摇床培养7d，测定方法同2.2.1。图7是培养基pH对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.2.7.培养温度的影响：将250mL(装量100mL)三角瓶接入相同量种子液，在相同转速下分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下恒温摇床内培养，培养时间为7d，各处理3个平行。培养完成后对发酵液进行抽滤、透析，最后测定多糖含量。图8是培养温度对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.2.8.培养基容量的选择：用250mL和500mL三角瓶分别装入发酵液50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL(按照比例)，在接种量、温度、转速相同的条件下培养7d，各处理设置3个平行，培养完成后同上方法测定多糖含量。图9是培养基容量对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.2.9.摇床转速的影响：用250mL(装100mL发酵液)三角瓶接入相同量种子液，在其他条件都相同的条件下，置于转速为50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min的摇床中培养7d，各处理设置5个平行，培养完成同上方法测定多糖含量。图10是摇床转速对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.2.10.接种量的确定：用250mL(装100mL发酵液)三角瓶分别接入3.0％、6.0％、8.0％、12.0％、15.0％、18.0％六个梯度的种子量，在其他条件都相同的条件下，置于恒温摇床培养7d，各处理设5个平行，培养完成同上方法测定多糖含量。图11是接种量对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.2.11.培养时间的影响：用250mL(装100mL发酵液)三角瓶在温度、转速、接种量、培养基容量都相同的条件下，培养2-10天8个梯度，各处理设5个平行，培养完成后用上述方法测定多糖含量。图12是培养时间对木蹄层孔菌EPS产量的影响。
2.3深层发酵木蹄层孔菌的培养基及培养条件优化
2.3.1Plackett-Burman设计
Plackett-Burman是一种两水平的实验设计方法，主要对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，尽量用最少实验次数达到使主要因素得到精确的估计，它适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，本试验由于考虑因素较多，故选用PB对各因素进行筛选。
本试验在前期单因素试验的基础上选用N＝12的Plackett-Burman实验设计，对蔗糖(A)、酪蛋白胨(B)、KH2PO4(D)、MgSO4(E)、维生素B2(G)、初始PH(H)、温度(J)、接种量(K)8个因素进行试验(其中发酵条件单因素试验参考同学)，设计高(+)和低(-)两个水平，高水平为低水平的1.25倍，响应值为总粗多糖产量(Y)。试验设计如下：
表4 Plackett-Burman实验设计及参数水平
续表4
2.3.2最陡爬坡实验
响应面拟合方程只有在考察的相互接近邻域里才充分的近似真实，因此只有先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。首先根据PB设计各显著因素效应值的大小，确定变化步长，然后设计最陡爬坡实验以快速、经济地逼近最佳区域。而其他因素则根据各因素效应值的大小以及正负来确定取值，若为正效应，则因素取值均取较高值；反之，若为负效应，则因素取值就都取较低值。
2.3.3产木蹄层孔菌胞外多糖的发酵培养基及条件优化
响应面分析法(Response Surface Methodology，RSM)依据最陡爬坡实验结果，确定主要因素的水平，然后利用Design-Expert软件进行Box-Behnken Design设计发酵培养基，进行三因素三水平的响应面分析(如下表5)，通过建立二次多项式模型来确定试验最佳条件，并进行验证实验的一种实验条件寻优的方法。因素水平表如下：
表5响应面分析因素水平
2.4统计分析
实验每组至少3个平行，所有数据经GraphPad Prism 5统计软件处理后用平均值±标准差表示。Design Expert软件对优化实验进行数据处理和分析，确定最佳条件。
3试验结果与分析
3.1多糖的标准曲线制备
由图1可得出多糖标准曲线为
Y＝8.6643X+0.0035 R2＝0.9989 (2-1)
式中：X--多糖含量；
Y--酶标仪测得吸光度值；
R2--相关系数。
相关系数，就是用来反映变量之间相关关系密切程度的一种统计指标，由图1可知，标准曲线的相关系数为0.9989，则标准液在试验范围内标样质量与吸光度呈线性相关。
3.2单因素试验结果分析
(1)碳源对发酵产多糖含量的影响
从图2可以看出，在其它条件不变的情况下，不同碳源下多糖含量最为显著的影响因素为蔗糖，其次是果糖，不同碳源对多糖产量的影响较明显；由此可知蔗糖为木蹄层孔菌发酵培养基最好的碳源，胞外多糖含量可达1.58g/L。蔗糖利用率较高这可能是由于木蹄层孔菌具有较高的蔗糖酶活性，能很好地分解并且利用蔗糖；最不显著的影响因素为可溶性淀粉，这可能是由于可溶性淀粉是大分子物质，发酵时首先将其分解为可溶性糖和一些小分子物质，才能利用。
(2)氮源对发酵产多糖含量的影响
从图3可看出，固定其他条件不变，当改变氮源时，发酵产多糖量相对较多的是有机氮源，而无机氮源相对较差。从图3上显见，酪蛋白胨是提供木蹄层孔菌发酵产多糖的最好的氮源，其胞外多糖含量为2.95g/L，这可能是酪蛋白胨含有丰富的蛋白质，氨基酸，糖类等，都是能够促进多糖合成的。
(3)碳/氮比对多糖含量的影响
从图4可看出，在其它条件不变的情况下，随着碳氮比逐渐的增大，多糖含量先是逐渐增大，当碳氮比为6:1时，发酵产胞外多糖量达到最高，随后多糖含量又快速下降。其原因可能是过高的碳氮比导致木蹄层孔菌代谢不平衡，影响了代谢物多糖的累积。实验中确定碳
氮比为6:1时，即蔗糖为10.0g/L、酪蛋白胨为5.0g/L时其胞外多糖含量达到了1.012g/L，可知最适合于木蹄层孔菌发酵产胞外多糖的碳氮比为6:1。
(4)矿物质元素对多糖含量的影响
从图5中明显看出，相比于不添加矿物质元素，培养基中添加不同矿物质元素发酵产多糖量极显著的增加。在其它条件不变的时候，改变矿物质元素，发酵时能促进多糖合成的最适矿物质为KH2PO4+MgSO4，胞外多糖含量高达1.121g/L，二价离子比一价离子更能促进代谢物多糖的产生。如果培养基中不添加任何矿物质元素，则发酵时木蹄层孔菌代谢产胞外多糖相对较低，因此说矿物质元素对木蹄层孔菌代谢产多糖是起到促进作用的。
(5)生长因子对多糖含量的影响
从图6中可以看出，在其它条件不变的情况下，相比于培养基中不添加生长因子，除肌醇外，添加不同的维生素对发酵产多糖都具有极显著的影响。其中维生素B2促进代谢产生多糖量最大，胞外多糖产量可达到1.065g/L。
(6)培养基初始pH对多糖含量影响
从图7中可看出，在其它条件不变的情况下，随着培养基初始pH的增高，多糖含量也逐渐的增多，当pH达到6.0时，多糖含量最大为0.75g/L，随后，多糖含量随着pH的增高显著下降。由此说明在中性偏酸的条件下，是比较适合木蹄层孔菌的菌丝体胞外多糖的累积，较高或较低的pH均不利于菌丝体的生长。
3.3主要影响因子的确定
经过Plackett-Burman实验设计得到实验结果如下表：
表6 Plackett-Burman实验设计及结果
由表6可知，第十组的多糖含量相对较多，所以可以将此水平值作为最陡爬坡实验设计响应面的中心点。
表7 Plackett-Burman实验分析结果
由表7Plackett-Burman实验分析结果可知，发酵木蹄层孔菌产多糖的过程中，在α＝0.05的显著水平上，蔗糖、酪蛋白胨、接种量这3个因素对多糖的产量影响显著，可以考虑将这3个因素作为主要因素做进一步的响应面分析实验。
3.4最陡爬坡实验结果分析
根据表7Plackett-Burman实验分析结果，选择蔗糖、酪蛋白胨、接种量这3个主要影响因素进行最陡爬坡实验。其它因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。也即是KH2PO4取1.0g/L、MgSO4取0.5g/L、VB2取0.625mg/L、pH调节7.5、培养温度基本保持31℃。
根据表6Plackett-Burman实验结果可知第10组多糖含量相对最多，因此以第10组的水平值作为响应面实验的中心点，即蔗糖10.0g/L、酪蛋白胨5.0g/L、接种量6.0％。实验结果如表8，可以看出在第3组实验条件下多糖含量最高，说明其比较接近最大响应值区域，因此选择这组实验水平值(蔗糖10.0g/L、酪蛋白胨5.0g/L、接种量6.0％)作为下一步响应面分析实验设计的中心点，进一步对试验进行优化。
表8最陡爬坡实验设计及结果
3.5最佳深层培养培养基及培养条件的确定
3.5.1响应面回归方程的确定
依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验确定实验因素和水平，然后采用BBD实验设计对产多糖主要影响因素进行3因素3水平的响应面分析，结果如下：
表9 Box-Benhnken实验设计及结果
续表9
由表9的结果可看出，实际的多糖含量与预测值基本吻合。
由BBD设计结果进行试验，设A＝z1，B＝z2，C＝z3，响应因素即多糖量为Y，得到方差分析表如下表：
表10 Box-Behnken实验设计回归方程方差分析表
续表10
表11 Box-Behnken回归分析表
从表10中可得出，在模型项中F值等于21.45时，P＝0.0018<0.01表明该模型是极显著的，说明因变量(多糖含量)与自变量z1，z2，z3间的回归方程关系是极显著的，所以方程可用。失拟项表示的是所得回归方程与实际拟合中非正常误差所占的比值，失拟项对应的P值越大越好，在该表中，失拟项对应P值为0.1429＞0.05不显著，表11可知该模型的相关系数R2＝0.9747,校正决定系数R2 Adj＝0.9293，说明模型的拟合程度高，实验数据及分析结果可信。
表12木蹄层孔菌发酵条件优化的系数估计
由响应面统计分析得出响应面回归方程如下：
Y＝-7.37125+0.42858z1+0.65617z2+1.82815z3+0.07980z1z2+0.02350z1z3-9.00×103z2z3-0.042017z1 2-0.11047z2 2-0.17323z3 2
3.5.2响应面因素的交互作用
(1)蔗糖和酪蛋白胨
由图13可看出，当接种量一定，将酪蛋白胨设定为某一个值时，随着蔗糖的逐步增加，木蹄层孔菌EPS含量先呈现增加的趋势后又减小。从等高线图形可看出形状趋向为椭圆形，表明两个因素间的交互作用显著，由等高线变化密集程度可知，蔗糖和酪蛋白胨对EPS含量的影响强度几乎一样。
(2)蔗糖和接种量
由图14可知，在固定酪蛋白胨条件下，将蔗糖设定为某一值时，其EPS含量先是随着接种量的增大而逐渐增加，随后又逐渐减小。其图形的等高线形状趋于圆形，表明蔗糖与接种量交互作用不显著。
(3)酪蛋白胨和接种量
由图15可知，在固定蔗糖的条件下，将接种量设定为某一值时，随着酪蛋白胨的增加，其EPS含量先呈现大幅度增加，随后又出现小幅度的下降。由等高线图形可知其图形接近圆形，可知酪蛋白胨和接种量两个影响因素之间交互作用不显著。
3.6响应面模型的验证
(1)优化最佳影响因素
采用响应面分析法得到最佳影响因素水平值如下表：
表13响应面分析的最佳影响因素水平
(2)影响因素参数的验证
由响应面分析可知，木蹄层孔菌发酵培养基及条件的最佳影响参数是序号3对应的发酵参数，即蔗糖15.0g/L，酪蛋白胨7.5g/L，接种量为6.0％，在此最佳的发酵条件下多糖产量为3.69g/L。为了验证该参数，设计了5组平行实验，得到的多糖产量为3.67g/L，与模型的理论值基本符合，说明该模型能够较好的预测实际发酵中多糖的产量。
4小结
(1)由响应面优化实验得出响应面回归方程如下
Y＝-7.37125+0.42858z1+0.65617z2+1.82815z3+0.07980z1z2+0.02350z1z3-9.00×103z2z3-0.042017z1 2-0.11047z2 2-0.17323z3 2
(2)由响应面分析可知，木蹄层孔菌发酵培养基及条件的最佳工艺参数是序号3对应的发酵参数，即蔗糖用量15.0g/L，酪蛋白胨用量7.5g/L，接种量为6.0％，在此最佳的发酵条件下多糖产量为3.69g/L。由验证得到多糖产量为3.67g/L，与理论较相符，说明实验可行。
5结论
本发明以木蹄层孔菌代谢产胞外多糖为考查指标，对其深层发酵的培养基及培养条件综合进行了探讨，得出的结论如下：
(1)首先在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman设计从8个影响因素中获得影响多糖产量的3个主要因素：蔗糖、酪蛋白胨、接种量；
(2)利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，确定了响应面优化的中心点；
(3)依据响应面优化中的BBD(Box-Behnken Design)设计原理，采用三因素三水平分析，确定影响产木蹄层孔菌胞外多糖的深层发酵因素为：蔗糖15.0g/L，酪蛋白胨7.5g/L，接种量6.0％、KH2PO41.0g/L、MgSO40.5g/L、VB20.625mg/L、pH7.5、培养温度为31℃、摇床转速为150rpm、培养时间为10d、培养基容量为200mL/500mL。在此条件下，实验得到多糖含量为3.67g/L，与理论值3.69g/L接近，比单纯优化培养条件提高1.67倍。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基，其特征在于，其配方为：蔗糖15.0g/L、酪蛋白胨7.5g/L、接种量6.0％、KH2PO41.0g/L、MgSO40.5g/L、VB20.625mg/L、pH7.5。
2.一种木蹄层孔菌深层发酵的培养基的培养方法，其特征在于，培养温度为31℃、摇床转速为150rpm、培养时间为10d、培养基容量为200mL/500mL。
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