CN107488599A - 一种霜茸菇菌种制作工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种霜茸菇菌种制作工艺，包括如下步骤：试管培养基制作、试管种转接、试管种挑选、二级菌种制作，平皿培养基制作、平皿转接、平皿种挑选、三级菌种制作，摇瓶培养基制作、摇瓶种接种、摇瓶种培养、摇瓶种挑选、发酵罐制作、灭菌、空桶取样、发酵罐接种、发酵罐种培养与观察、菌液取样检测、发种、镜检、接种管道灭菌、接种。本发明可提高菌丝活率，杜绝菌种接种后再次感染杂菌，增加维生素C、维生素D、叶酸等生长因子，有效提高培菌效率，具有特殊芬芳的桃木粉可增加霜茸菇的口感和风味，提高其食用价值。

Description

一种霜茸菇菌种制作工艺

技术领域

本发明涉及菌种制作技术领域，尤其涉及一种霜茸菇菌种制作工艺。

背景技术

食用蘑菇，又称食用菌、食用蕈菌、食用真菌，是指具有食用价值的子实体的大型真菌的统称。食用蘑菇广泛分布于地球各处，在森林落叶地带最为丰富。食用蘑菇是理想的天然食品或多功能食品。迄今为止在全世界食用最多的食用蘑菇，学名为双孢蘑菇，通称为蘑菇。

霜茸菇含有丰富的蛋白质和氨基酸，其含量是一般蔬菜和水果的几倍到几十倍。含蛋白质为1.5-3.5%，是大白菜的3倍，萝卜的6倍，苹果的17倍。1公斤干蘑菇所含蛋白质相当于2公斤瘦肉，3公斤鸡蛋或12公斤牛奶的蛋白量。霜茸菇中赖氨酸含很丰富，含有组成蛋白质的18种氨基酸，和人体所必需的8种微量元素。谷物食品中含量少的赖氨酸，霜茸菇中含量也相当丰富。霜茸菇脂肪含量很低，约占干品重量的0.2%-3.6%，而其中74-83%是人体健康有益的不饱和脂肪酸。霜茸菇还含有维生素，富含的VB1、V12，都高于肉类，霜茸菇Vc含量为辣椒的1.2～2.8倍，是柚、橙的2～5倍。霜茸菇Vd原含量高达128国际单位，是紫菜的8倍，甘薯的7倍，大豆的21倍。VD原经紫外线照射可转化为VD，促进对钙的吸收。霜茸菇还富含多种矿质元素：磷、钾、钠、钙、铁、锌、镁、锰、等及其他一些微量元素。霜茸菇含有磷，有助于恢复和提高大脑功能。霜茸菇的灰分元素中钾占65%，是碱性食物中的高级食品，可中和肉类食品产生的酸。霜茸菇不仅味美，而且营养丰富，常被人们称作健康食品，不仅含有各种人体必需的氨基酸，还具有降低血液中的胆固醇、治疗高血压的作用。

霜茸菇与大多数食用菌相比，其菌丝萌发定植较缓慢、前期较稀疏、抗杂能力较弱，同等情况下，培菌期较长。

现有的霜茸菇采用普通的菌种制作工艺制作菌种培育的霜茸菇存在着口感较差，难以比拟野生霜茸菇的缺点，而且难以进行大规模的培育种植。

发明内容

本发明的目的在于提供一种霜茸菇菌种制作工艺，具备接种效率高、发菌快的优点，解决了霜茸菇菌种制作的口感差，食用价值低，难以大规模培育种植的问题。

根据本发明实施例的一种霜茸菇菌种制作工艺，包括如下步骤：试管培养基制作、试管种转接、试管种挑选、二级菌种制作，平皿培养基制作、平皿转接、平皿种挑选、三级菌种制作，摇瓶培养基制作、摇瓶种接种、摇瓶种培养、摇瓶种挑选、发酵罐制作、灭菌、空桶取样、发酵罐接种、发酵罐种培养与观察、菌液取样检测、发种、镜检、接种管道灭菌、接种；

其中，试管培养基制作中采用的试管培养基配方为：按重量份计，马铃薯190-210份、葡萄糖和琼脂粉18-22份、蛋白胨9-11份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份；

平皿培养基制作中采用的平皿培养基配方为：按重量份计，马铃薯190-210份、葡萄糖和琼脂粉18-22份、蛋白胨9-11份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份；

发酵罐制作中采用的发酵罐培养基配方为按重量份计，白砂糖18-22份、豆粕粉140-160份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份、消泡剂0.01-0.03份。

在上述方案基础上，所述发酵罐培养基配方中还包括桃木粉10-30份。

在上述方案基础上，所述发酵罐培养基配方中还包括维生素C 0.001-0.003份。

在上述方案基础上，所述发酵罐培养基配方中还包括维生素D 0.001-0.003份。

在上述方案基础上，所述发酵罐培养基配方中还包括叶酸0.001-0.003份。

在上述方案基础上，所述发酵罐种培养与观察步骤中具体操作如下：

1.大桶培养间设定温度为21℃，CO2浓度以工作人员工作时不感到呼吸困难为主，整个培养环境保持洁净；

2.每天发酵罐培养观察至少两次，将日期、通气压力、菌液颜色、透明度、气味、泡沫状态、菌丝球形态及浓度等，以及温度、CO2浓度等信息填入《发酵罐培养观察记录表》中，发酵罐培养的周期控制在6-7天；

3.在接种后的第4-5天，依照发酵罐取样要求对发酵罐进行取样检测，将各项检测结果填入《发酵罐培养观察记录表》中，依据检测结果和培养观察记录评判发酵罐是否合格，若发现平板检测长有菌落，此发酵罐应做处理，并查找污染的原因：检测发酵罐气密性，若罐体无漏气现象，可重新取样做第二次检测，将发酵罐推出再进行发酵罐各部件检测，根据第二次检测的结果，逐一对母种、平皿种、摇瓶种、灭菌、接种、冷却等综合因素作出分析报告，并做出改善措施。

在上述方案基础上，所述菌液取样检测步骤中具体操作如下：

1.将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯提前准备好，放在要取样的发酵罐旁边，同时准备小半桶水备用；

2.取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒，在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口；

3.取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干，用硅胶塞封好取样口；

4.每个发酵罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶，另外一瓶弃掉；

5.检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒，在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

在上述方案基础上，所述镜检步骤中具体操作如下：

1.涂片：用接种针勾取菌液涂抹在洁净无油的载玻片上；

2.干燥：将涂片朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥，避免离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态；

3.染色：将载玻片平放于台面上，滴加结晶紫染色液1-2滴于涂片上，覆盖标本表面，染色1-2min；

4.水洗：倾去染液，用水在载玻片的一端轻轻冲洗，直至涂片上留水无色为止，水洗时，不宜水流直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落；

5.干燥：甩去载玻片的水珠，在酒精灯上方加热干燥即可；

6.镜检：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的区域加香柏油，从侧面注入，用粗调节器将镜筒小心的降低，使油镜浸在油中，并几乎与标本接触时止，将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

在上述方案基础上，所述接种管道灭菌步骤中具体操作如下：

1.冲洗：当天接菌完后将第二天接种的发酵罐发种连管，打开控制箱开关，开启进水管道阀门冲洗，待管道内菌液冲洗干净至排污口出水清澈无菌液，关闭进水开关方可灭菌；

2.检查、灭菌：检查水箱是否有水，各接头有无松动异常情况，开启蒸汽发生器电源，压力升至0.4MPa，打开供气开关，供汽压力保持0.2-0.4MPa，检查各个开关是否正常开启，每根接种枪及相应管道是否正常在灭菌，查看排污管尾端安装的数显温度计温度上升情况，温度达到119℃开始灭菌计时，灭菌时间不低于40min；

3.关汽：当灭菌时间达到40min以上即可停止灭菌，灭菌关汽顺序：排污口开关—控制箱电源开关—取样口开关—输液管开关—蒸汽进气管开关—蒸发器电源开关—供汽开关，关闭注水及电源。

在上述方案基础上，所述接种步骤中具体操作如下：

1．保压：在发酵罐右边排气管安装压力表，接种前先调节发酵罐调压阀压力为0.2-0.3MPa,，关闭1/2左边排气阀，打开右边排气阀，查看压力表保压在0.11-0.14MPa范围；

2．调试：开启控制箱，先用空桶手动喷洒，确定喷头、开关正常，再用量筒分别对喷头称取喷洒量，调整好喷洒时间，用已称重的栽培袋做好标记分别试接种枪，喷洒量标准为30-35g，确认后方可接种，接种前用95%的酒精喷洒接种枪，用喷灯灼烧，消毒要到位；

3．接种：随着罐内菌液量的减少，接种过程对喷洒时间进行调整，每接半个小时对接种枪灼烧消毒并不定时采用75%酒精喷洒消毒，并检测一次接种量，每罐可接14000-17000袋栽培袋，接菌完成后将接种枪安装好，洗净后灭菌；

4．大桶留样：接菌完后进行大桶取样检测观察；

5.卫生清洁：使用TCCA消毒粉兑水对接种室进行清洁，不能有菌液残留，清洁完成后，关闭照明灯，开启紫外灯。

本发明与现有技术相比具有的有益效果是：

1、本发明通过优化发酵罐培养基配方组成，可提高菌丝活率，杜绝菌种接种后再次感染杂菌，增加维生素C、维生素D、叶酸等生长因子，可降低废种率10%～15%，提高接种效率10%～20%。

2、本发明通过往发酵罐培养基内添加适量豆粕粉和桃木粉，可提前激活菌丝纤维素和木质素降解酶类，加快菌种定植、盖面速度，可使得培菌前1周感染杂菌的可能性大大降低，并且具有特殊芬芳的桃木粉可增加霜茸菇的口感和风味，提高其食用价值。

3、本发明的菌种与木屑菌种相比：接种效率高8%～12%，菌种最大生长距离短40%～100%，培菌效率高30%～70%，且使用本菌种，菌包上下菌龄较为一致，利于菌包营养集中释放，首批菇产量可增加20%～35%。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段及所达到的具体功能，下面以具体实施方式对本发明做进一步详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种霜茸菇菌种制作工艺，包括如下步骤：试管培养基制作、试管种转接、试管种挑选、二级菌种制作，平皿培养基制作、平皿转接、平皿种挑选、三级菌种制作，摇瓶培养基制作、摇瓶种接种、摇瓶种培养、摇瓶种挑选、发酵罐制作、灭菌、空桶取样、发酵罐接种、发酵罐种培养与观察、菌液取样检测、发种、镜检、接种管道灭菌、接种；

其中，试管培养基制作中采用的试管培养基配方为：按重量份计，马铃薯190份、葡萄糖和琼脂粉18份、蛋白胨9份、硫酸镁1.3份、磷酸二氢钾2.8份；

平皿培养基制作中采用的平皿培养基配方为：按重量份计，马铃薯190份、葡萄糖和琼脂粉18份、蛋白胨9份、硫酸镁1.3份、磷酸二氢钾2.8份；

发酵罐制作中采用的发酵罐培养基配方为按重量份计，白砂糖18份、豆粕粉140份、硫酸镁1.3份、磷酸二氢钾2.8份、消泡剂0.01份、桃木粉10份、维生素C 0.001份、维生素D0.001份、叶酸0.001份。

具体操作步骤如下：

试管培养基制作

1.称量药品 按试管培养基配方表将每样药品的使用量写在试管培养基制备记录表上，准确称取制作试管培养基的药品，搅拌均匀，置于工作台备用。

2.取1000ml去离子水，用电磁炉加热煮至沸腾，将去皮马铃薯切成1cm见方的小方块，置于锅内，然后再用小火煮沸20分钟,达到熟而不烂的程度。

3.用6层纱布过滤马铃薯汁液，取清液，并定容至1000ml，不足加洁净水补齐。

4.将量取好的马铃薯清液倒入干净锅内，煮沸，捞净泡沫，然后将准备好的配料用马铃薯汁液溶解，倒入锅内，煮至微沸至完全溶解，即可等待分装试管。

5.分装及灭菌 分装试管时，应趁培养基未凝固前，用漏斗倒入事先备好的干净试管中，根据试管用途不同，要求菌种保藏的试管每支装培养基 20ml(21×200ml)，经常使用的试管每支装培养基18ml(21×200ml)，分装完毕后塞紧硅胶塞，放在试管架上，用称量纸每把7支捆绑好，放入灭菌锅中灭菌。在121℃下灭菌20分钟，整个过程需要60分钟。

4.摆斜面 待温度降到55℃(手心不烫，手背烫)再摆斜面，将试管放置在干净宽敞、平整的台面上，一次性摆放定位，要求菌种保藏的试管底端培养基留有2cm，经常使用的试管底端培养基留有1cm长，摆放完毕后，其上覆盖一层保暖物，使其温度慢慢降下冷却，这样可以减少试管冷凝水的产生。

5.检查、存放及选用 待试管凝固后，将全部试管放入26±1℃恒温培养箱烘48h，若发现有杂菌生长，即弃去。将检测好的试管放置于干净、避光、低温的环境中备用，在使用时应选择试管壁及基面无水汽，培养基颜色未发生变化，未失水脱壁，未生长杂菌的试管，且遵循先配先用的原则，标记好配制日期。

试管种转接

1.接种前应将超净工作台全面擦拭干净，把接种使用的工具及挑选合格的试管培养基经75%的酒精消毒后一起放入工作台中，关闭照明灯及风机，打开工作台紫外灯消毒30分钟以上。

2.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。将75%的酒精棉，打火机、活化后的试管母种经75%的酒精消毒后放入工作台内待用。对双手、手臂及胸前喷洒75%的酒精消毒后，进入工作台内进行接种操作。

3.点燃酒精灯，将试管母种封口的石蜡及保鲜膜在工作台的一角落除去，灼烧试管口三圈后拧松塞子放在一旁待用，将即将转接试管培养基管口灼烧三圈后拧松塞子，待用，将接种针用75%酒精棉全面擦拭后过火灼烧灭菌，要求先将针尖在酒精灯外焰上烧红烧透，然后将接种针来回的灼烧均匀，放入盛75%酒精的杯中冷却，备用。

4.在酒精灯形成的无菌区范围内，用灼烧冷却后的接种针刮去试管前端1厘米处的薄弱菌丝及爬壁菌丝，选用前端及后端偏上一段的部分切割成绿豆大小均匀的小块（3*3mm），勾取一块接入一旁备用的试管培养基，注意接种块应避免碰到试管内壁及斜面培养基表面，接种块要离火焰一定的距离，避免灼伤接种块，试管管口在转接时随接种块左右移动，应以最快的速度接入试管内，将试管塞塞好，放在一旁，依次操作。

5.接种完成后，在转接的试管上标好批次，放入筐中，用报纸遮好后放入生化培养箱中培养，生化培养箱设定温度为杏鲍菇21-22℃，填写完整《试管种培养记录表》

6.在培养过程中，应每天观察做好生长记录，及时将长势差、生长不均、杂菌感染等不合格的试管种弃掉。试管种的培养天数在7-8天，长至试管八分满，可使用、保存。

试管种挑选

优良食用菌品种应具有均一性，这种均一性具备了才能进行其他形态特征特性的鉴别，简单鉴别品种质量主要从以下4方面进行：

1.长相均一性。任何一个品种都有其特有的形态特征。菌丝洁白，爬壁力强，菌丝壮、旺，培养基无干缩、气生菌丝不倒伏，反面观察除接种块点外无任何斑点、条纹或阴影。如果在继代（转管）培养中出现个别或部分培养物长势有变化，则这一批菌种都不可使用。

2.长速均一性。优良品种进行继代培养时长速均一，若培养期间出现个体间长速不一，参差不齐，则不能使用。

3.外观均一性。对一支试管斜面母种进行观察，菌丝以接种点为中心向周围均匀辐射生长，形态和长速均匀连贯，边缘整齐则为优良品种。

4.菌丝洁白、粗壮、浓密，细胞生命力强是优良品种的重要标志。否则表明该品种已老化，不能使用。

这只是基本的、初步的，品种质量还要以出菇结果为标准进行检验和鉴别。

平皿培养基制作

1.称量药品 按平皿培养基配方表将每样药品的使用量写在平皿培养基制备记录表上，准确称取制作试管培养基的药品，搅拌均匀，置于工作台备用。

2.取1000ml去离子水，用电磁炉加热煮至沸腾，将去皮马铃薯切成1cm见方的小方块，置于锅内，然后再用小火煮沸20分钟,达到熟而不烂的程度。

3.用6层纱布过滤马铃薯汁液，取清液，并定容至1000ml，不足加洁净水补齐。

4.将量取好的马铃薯清液倒入干净锅内，煮沸，捞净泡沫，然后将准备好的配料用马铃薯汁液溶解，倒入锅内，煮至微沸至完全溶解，即可分装三角瓶。

5.分装及灭菌 当培养基煮的透明时，分装到干净的500ml三角瓶中，用硅胶塞塞好，包好称量纸后和平皿一起放入灭菌锅中灭菌，在121℃下灭菌20分钟，整个过程需要60分钟。

6.当灭菌结束后，利用锅内余温烘干物品表面水汽。拿出三角瓶、平皿一起摆入超净工作台内灭菌30分钟

7.将三角瓶内培养基分装入平皿中，培养基高度在平皿高度的三分之一以上，重叠放置冷却凝固

8.待平皿凝固后，用封口膜密封，放入36℃的培养箱内烘干，24小时后取出备用。

平皿转接

1.接种前应将超净工作台全面擦拭干净，把接种使用的工具及挑选合格的平皿培养基经75%的酒精消毒后一起放入工作台中，关闭照明灯及风机，打开工作台紫外灯消毒30分钟以上。

2.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。将75%的酒精棉，打火机、活化后的试管母种经75%的酒精消毒后放入工作台内待用。对双手及胸前喷洒75%的酒精消毒后伸进工作台内进行接种操作。

3.点燃酒精灯，将试管母种封口的石蜡及保鲜膜除去，灼烧试管口三圈后拧松塞子放在一旁待用，在转接试管种时应将试管口灼烧三圈后拧松塞子，在转接平皿种时，应先将封口膜拆去，放在一旁备用，将接种针用75%酒精棉全面擦拭后过火灼烧灭菌，要求先将针尖在酒精灯外焰上烧红烧透，然后将接种针来回的灼烧均匀，放入盛75%酒精的杯中冷却，备用。

4.在酒精灯形成的无菌区范围内，用灼烧冷却后的接种针刮去试管前端1厘米处的薄弱菌丝及趴壁菌丝，选用前端及后端偏上一段的部分切割成3*3mm大小均匀的小块，勾去一块接入一旁备用的平皿中，注意接种块应避免碰到试管内壁及斜面培养基表面，接种块要离火焰一定的距离，避免灼伤接种块，试管管口在转接时随接种块移动，应以最快的速度接入试管内，一步到位，将试管塞塞好，放在一旁，依次操作。每只试管母种转接14个平皿。

5.接种完成后，在转接的平皿上标好批次，放入筐中，用报纸遮好后放入生化培养箱中培养，生化培养箱温度为22℃，填写完整《平皿种培养记录表》

6.在培养过程中，应每天观察做好生长记录，及时将长势差、生长不均、杂菌感染等不合格的平皿种弃掉。

平皿种挑选

1.感官要求

1.1 外观均一性 菌丝以接种点为中心向周围均匀辐射生长，形态和长速均匀连贯，表面均匀、舒展、平整，无角质，色泽一致。

1.2 外表菌丝浓白、粗壮、浓密，富有弹性，棉絮状；

1.3 长势鉴定长速均一性，菌丝生长快、整齐，浓而健壮。合格优良的菌种培养时长速均一，若培养期间出现个体间长速不一，参差不齐，则不能使用。

1.4 菌丝边缘整齐，无菌丝分泌物，无杂菌菌落，具有特有的杏仁香味，无异味。

2.微生物学要求

菌丝生长粗壮、均匀、分支多，有锁状联合，无杂菌。

摇瓶瓶培养基制作

1称量药品 按标准配方准确（精确度在±0.1范围内）称取制作三角瓶液体培养基的原料，放入1000ml的烧杯中，同时用烧杯盛1L过离子水放入电饭锅内水浴加热

2溶解 把事先预热好的1L过离子水倒入称好的原料中，将原料搅拌均匀后，放入电饭锅内水浴加热至原料完全溶解

3 盛4L过离子水放入洗净的桶中，将溶解后的原料倒入桶中，并混合均匀

4 准备好10个洗净的容积为1L的三角瓶，每个瓶内分别放入一个搅拌子，并加入0.5ml的花生油，分别向内装500ml的桶中的溶解液，分装完成后，用抹布擦干三角瓶瓶口，塞好硅胶塞，用称量纸包好，放入灭菌所用的不锈钢篮中，上面用报纸覆盖。

5 把装好的三角瓶放入灭菌锅中，关闭灭菌锅排气阀和锅盖，这时灭菌锅关门的指示灯会熄灭。按下work工作键，在121℃的环境下灭菌20分钟，整个过程60分钟。灭菌完成后关闭电源，把排气阀打开1/4左右，排气冷却

6 当灭菌锅里的气压降为0时，打开灭菌锅盖，用余热把锅内物品烘干，拿出三角瓶，放在接种不锈钢平台上冷却备用

7选用 在使用摇瓶培养基时，应注意培养基的颜色是否一致，按照先配先用的原则标记好配制日期。

摇瓶种接种

1.接种前对超净工作台用75%酒精棉全面擦拭消毒，将待接种的三角瓶液体培养基放在超净工作台上，取下包瓶口的称量纸，用脱脂棉喷上75%酒精对三角瓶的瓶身擦拭消毒，并将接种工具摆放好，关掉照明灯，开启紫外灯，杀菌30分钟。

2.从培养箱里挑选优质的平皿种，准备使用。

3.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。在超净工作台里准备好一小块75%酒精浸透的脱脂棉。

4.将选好的平皿种，用75%酒精擦拭表面，放入超净工作台备用。

5.点燃酒精灯，用喷有75%酒精的脱脂棉将接种铲擦干净，然后将接种铲放在酒精灯外焰上来回的灼烧，每个面都要灼烧彻底，倒插在广口瓶冷却备用。

6.把三角瓶瓶口在火焰上灼烧三圈，并轻轻拧松硅胶塞，放在一旁，然后将平皿上的封膜除去，右手将接种铲在火焰旁灼烧，放入平皿内沿着菌丝生长的纹路，将生长在前端菌丝分隔成大小均匀的正方形小块，长度约为5-6mm。用接种铲削取薄薄的正方形小块，转接入摇瓶内，并尽量使接种块漂浮在液面上。每瓶转接6个接种块。

7.三角瓶瓶口在火焰上灼烧两圈，将塞子拧紧。接种铲在火焰上灼烧后继续接以下的三角瓶。

8.待摇瓶转接完成后，标记好转接批次，包好称量纸，并填写完整《摇瓶种培养观察记录表》，放在培养室的指定位置进行培养。

摇瓶种培养

1 将已经接的摇瓶种用白色胶筐装好。搬到摇瓶培养室中。在不锈钢平面台上静置培养一天，让菌种适应新的生长环境。

2 已经静置培养一天的摇瓶，在第2天，按照摇瓶上已经编号的序号，将摇瓶放在磁力搅拌器相应的位置上，并打开磁力搅拌器电源开关。

3 将磁力搅拌器转速调到对应档数进行动态培养。培养的操作规则是：前7天转速调到600r/min，最后1天转速调为800r/min，培养到第9天可以使用，最长使用时间不能超过10天。培养过程温度控制在22℃。

4.每天及时填写《摇瓶培养观察记录表》。

摇瓶种挑选

1.菌球的形态：菌种培养好后会看到大小均匀、活力旺盛、毛刺明显的大量的菌球，静止5分钟后菌球占菌液浓度的80%以上或不分层。若菌球很少或大小不一，则可能是质量有问题。

2.菌液澄清度：菌液中除菌球外无其它固形物，菌液由前期的微浑浊变得澄清或橙黄色。如变得浑浊不清则很可能是染菌。

3.菌液气味：到培养后期菌液的糖香味会逐渐消失，取而代之的是或有或无的菌种特有的清香味（杏仁味）。若有臭味、酸味、霉味则是染菌。

4.微生物检测：培养到第5天取样做PDA和NA平皿检测，检测合格的摇瓶才能接液态罐。

在超净工作台内用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，放在生化培养箱中培养72小时（26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿）若表面菌丝萌发明显，且无其它颜色的孢子，无菌落，则多为正常，若有其它特殊颜色孢子、菌落，则为污染。

液态灌制作

1.准备空罐：需检查发酵罐各零配件是否便于使用、罐的气密性是否良好，并维修更换相应的零配件，以及罐子清洁是否达到标准

2.配料：按照培养基配方称量所需的原料放入配料桶中，填写好每桶相对应的配料表，至少两人操作，一人称料，一人确认，避免配料失误

3.装罐：将罐底快速接头盖合严密，关闭排液阀，打开法兰口，先加水至300L，放上过滤网兜，向各配料桶加水搅拌，将已溶解的部分倒入罐中，未溶解的再加水搅拌，这样多次加水溶解分批倒入罐中（除豆粕粉易受热结块的配料用常温水溶解之外，其他均可用加热的水以加快溶解速度），向罐内加入90ml消泡剂，补水至发酵罐的指定刻度。将法兰口附近的残料清洗干净，将法兰口螺丝对角拧合、快开式接种口盖合严密，再将罐子外壁冲洗干净

4.检查实罐气密性：发酵罐装料后，打开排气阀，先通气5min，使发酵罐内的溶质混匀，再关闭排气阀，用泡沫水检查发酵罐气密性（有漏气立即处理），用量杯取出一部分培养液（注意取样后将排液阀处的培养液清理干净），倒出一点培养液测灭菌前PH值。

5.灭菌：灭菌前将上一步检查发酵罐气密性时罐内的气压卸掉（打开排气阀），接压缩空气快速接头，关闭炉门

6.拉炉：开炉门，关闭发酵罐排气阀，拉入放冷室，并对接种口处用95%酒精燃烧消毒，无菌操作连接压缩空气，打开排气阀即可。

灭 菌

1 在液态罐推进灭菌炉之前，先通知锅炉送蒸汽，启动灭菌炉进入程序，手动开启进洁净空气开关，再用泡泡水检查灭菌炉内室的洁净空气管道是否密封严实，打开蒸汽管道上的手动排气阀，检查蒸汽压力是否在0.4-0.6MPa，冷却水炉外开关是否处于开启状态。

2 进炉：打开灭菌炉炉门，将罐子推入炉内，把罐子上的快速头与炉内空气管道连接起来，保证炉内空气管道不漏气，再次确认液态罐的出气阀是否打开，如没有打开，在灭菌过程中有可能发生事故。6个发酵罐进入炉后，用干净湿抹布将炉门框、密封圈擦拭一遍，再关好炉门，即可启动灭菌程序，随即观察压力、温度是否在上升，炉门四周是否有空气或水蒸气冒出，若有，则需退出灭菌程序，将炉门打开，清查一遍再关炉门，直至不漏气为止。

3 灭菌：灭菌设定参数：保温1设定110度，保持20分钟；保温2设定115度，保持30分钟；灭菌设定123度，保持90分钟。核对灭菌参数无误后，启动开关，进入灭菌程序。启动灭菌炉后，每隔20分钟巡查一次，确保灭菌炉正常运行，防止异常情况发生导致灭菌不彻底和生产事故发生。

4 出炉：从显示屏上观察灭菌炉运行阶段，必须是在冷却行程，冷却温度都低于42度，压力表指针指向零。此时将后门打开，将炉门铁板放下，一进入炉内先关掉液态罐出气口阀门，拔掉洁净空气接头，把液态罐依次从炉内拉出，用气枪将酒精槽内和四个脚轮上的水吹干（不能对着接口处吹），每个液态罐贴上制作日期和灭菌位置的标识。

5 放冷：推入水淋室，用75%的酒精对罐体和轮子喷雾消毒后拉入放冷室指定位置摆放整齐。

6 清洁：出炉后将地面用水冲洗及炉内的积水用刮水板刮开，将灭菌炉的门半掩，以利于内保持干燥。填写好灭菌记录，有异常情况的也需做好记录。

空桶取样

1 放冷第2天做空桶取样检测。

2 将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯等所需物品提前准备好。放在要取样的液态罐旁边。同时准备小半桶水备用。

3 取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

4 取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干。用硅胶塞封好取样口。

5 每个液态罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶（这瓶要编好取样的编号），另外一瓶弃掉。

6 检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒。在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，（接种针在取菌液前要在酒精灯火焰上稍微烧一下），在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

液态灌接种

1 用75%的酒精对无菌罩四周喷雾消毒，打开新风开关，并用手在无菌罩下感觉是否有风从上面往下吹，检查无菌罩内4只紫外灯是否都是正常运行。如没有，要及时反应，找相关部门维修。

2 用水桶装半桶水和放一条毛巾在内，做好防火措施。

3 新风开启30分钟后，关闭紫外灯，，5分钟后开启照明灯，准备接菌，先把已经培养合格的三角瓶液体菌种从三角瓶培养室端过来，用75%的酒精擦拭瓶身，并按接种的先后顺序放好

4 用温度计测量每个液态罐，检查是否已经达到接菌温度20-23℃，并记录。同时用快速接头对当天培养要通气的地方进行放气。

6 把冷却好可以接菌的液态罐推到无菌罩的正下方，连接洁净空气并打开液态罐出气阀门,用75%酒精喷洒罐顶部以及四周。

7 此过程需要三人合作，一人协助递喷灯，75%酒精，三角瓶，防火手套，开关洁净空气进气。一人接种,一人开盖和关盖。接种完成后，用湿毛巾扑灭火焰，关闭排气阀，推出无菌罩，推到指定位置。

8 接菌完成后，关闭无菌罩开关，用75%酒精把接菌台面擦拭干净。

9.发酵罐连接压缩空气后，打开排气阀，确认连接OK。

填写发酵罐培养记录表，按项目如实填写。

发酵罐种培养与观察

1.大桶培养间设定温度为21℃，CO2浓度以工作人员工作时不感到呼吸困难为主，整个培养环境保持洁净。

2.每天发酵罐培养观察至少两次，将日期、通气压力、菌液颜色、透明度、气味、泡沫状态、菌丝球形态及浓度等，以及温度、CO2浓度等信息填入《发酵罐培养观察记录表》中，发酵罐培养的周期控制在6天。

通气压力：通常调为0.15MPa，其通气压力应根据菌丝形态等异常做实际调节。

菌液颜色及透明度：由于发酵罐培养液的营养物质会随着菌丝量的增多而减少，培养液的颜色由浅黄色逐渐变为米汤色，菌液透明度逐渐变得透彻。

气味：接种第一天，由于发酵罐刚制备出来的培养液味道透有咸味，称豆粕味，第二天咸味消失，透出豆粕味，随菌丝量的增多在第4天以后，豆粕味逐渐变淡，透出菌丝味，并越来越浓。

菌丝形态及浓度：接种的前3天处于菌丝恢复期及萌发期，菌丝量较少，形态不明显，从第4天开始菌丝形态开始明显，菌丝生长较快。

温度和CO2浓度：培养期间温度会有所升高，CO2会逐渐增加趋于平稳，而后逐渐降低。

3.在接种后的第4天，依照发酵罐取样要求对发酵罐进行取样检测（具体工序参看发酵罐取样检测），将各项检测结果填入《发酵罐培养观察记录表》中。依据检测结果和培养观察记录评判发酵罐是否合格，若发现平板检测长有菌落，此发酵罐应做处理，并查找污染的原因：检测发酵罐气密性（依据发酵罐制作气密性检查的要求进行检查），若罐体无漏气现象，可重新取样做第二次检测，将发酵罐推出再进行发酵罐各部件检测，根据第二次检测的结果，逐一对母种、平皿种、摇瓶种、灭菌、接种、冷却等综合因素作出分析报告，并做出改善措施。

4. 随时关注异常情况并采取相应措施做好详细记录，比如停电停气、干燥机是否运行正常、发酵罐明显泄漏、气压不稳定等情况。

菌液取样检测

1 将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯等所需物品提前准备好。放在要取样的液态罐旁边。同时准备小半桶水备用。

2 取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

3 取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干。用硅胶塞封好取样口。

5 每个液态罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶（这瓶要编好取样的编号），另外一瓶弃掉。

6 检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒。在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，（接种针在取菌液前要在酒精灯火焰上稍微烧一下），在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

发种

1.检查：发种前先检查确认当天所准备发的菌种微生物检测是否合格（接种头天发桶）。检查当天准备发种的发酵罐菌丝形态、罐温、CO2浓度、气味是否正常，确认OK并填写培养观察记录表和发种记录表。

2.发桶、连管：先关闭排气阀，进行闷罐，保压后关闭发酵罐进气，有序的将当天使用的发酵罐拉至接种指定位置摆放整齐，连接洁净空气，打开排气阀，连接灭菌蒸汽管和输液管。

3.检查、取样：接种前检查确认菌种微生物检测是否合格，检查发酵罐菌丝形态、罐温、CO2浓度、气味是否正常，确认OK并填写培养观察记录表；用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口用75%酒精消毒，用准备好的栽培瓶接取三瓶液态罐内的菌液倒掉,再用三角瓶接取液态罐内的菌液（用于平皿检测和镜检），另外一人用75%酒精喷洒三角瓶，并用喷灯对三角瓶瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

4.镜检：接种前发酵罐取样镜检确认合格后才能接种。

镜检

1 涂片：用接种针勾取菌液涂抹在洁净无油的载玻片上。

2 干燥：将涂片朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态。

3 染色：将载玻片平放于台面上，滴加结晶紫染色液1-2滴于涂片上，覆盖标本表面，染色1-2min。

4 水洗：倾去染液，用水在载玻片的一端轻轻冲洗，直至涂片上留水无色为止，水洗时，不宜水流直接冲洗涂面。水流不宜 宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

5 干燥：甩去载玻片的水珠，在酒精灯上方加热干燥即可。

6 镜检：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的区区域加香柏油，从侧面注入，用粗调节器将镜筒小心的降低，使油镜浸在油中，并几乎与标本接触时止，（注意：切不可将油油镜压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗 粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

接种管道灭菌

1 冲洗：当天接菌完后将第二天接种的发酵罐发种连管，打开控制箱开关，开启进水管道阀门冲洗，待管道内菌液冲洗干净（排污口出水清澈无菌液），关闭进水开关方可灭菌。

2 检查、灭菌：检查水箱是否有水，各接头有无松动异常情况，开启蒸汽发生器电源，压力升至0.4MPa，打开供气开关，供汽压力保持0.2MPa，检查各个开关是否正常开启，每根接种枪及相应管道是否正常在灭菌（手触摸管道感观温度是否发烫），查看排污管尾端安装的数显温度计温度上升情况，温度达到119℃开始灭菌计时，灭菌时间不低于40min。

3 关汽：当灭菌时间达到40min以上即可停止灭菌，灭菌关汽顺序：排污口开关—控制箱电源开关—取样口开关—输液管开关—蒸汽进气管开关—蒸发器电源开关—供汽开关，关闭注水及电源。

4 记录：将整个灭菌过程按《接种管道灭菌记录表》要求填写，并确认签字。

接种

1．保压：在发酵罐右边排气管安装压力表，接种前先调节发酵罐调压阀压力为0.2MPa,，关闭1/2左边排气阀，打开右边排气阀，查看压力表保压在0.11-0.14MPa范围。

2．调试：开启控制箱，先用空桶手动喷洒，确定喷头、开关正常，再用量筒分别对喷头A、B、C称取喷洒量，调整好喷洒时间，用已称重的栽培袋做好标记分别试接种枪，喷洒量标准为30g，确认OK方可接种（接种前用95%的酒精喷洒接种枪，用喷灯灼烧，消毒要到位）。

3．接种：随着罐内菌液量的减少，接种过程对喷洒时间进行调整，每接半个小时对接种枪灼烧消毒（不定时75%酒精喷洒消毒），并检测一次接种量，每罐可接14000袋栽培袋。接菌完成后将接种枪安装好，洗净后灭菌。

4．大桶留样：接菌完后进行大桶取样检测观察

卫生清洁：使用TCCA消毒粉兑水对接种室进行清洁，不能有菌液残留，清洁完成后，关闭照明灯，开启紫外灯。

实施例2

本实施例提供了一种霜茸菇菌种制作工艺，试管培养基制作、试管种转接、试管种挑选、二级菌种制作，平皿培养基制作、平皿转接、平皿种挑选、三级菌种制作，摇瓶培养基制作、摇瓶种接种、摇瓶种培养、摇瓶种挑选、发酵罐制作、灭菌、空桶取样、发酵罐接种、发酵罐种培养与观察、菌液取样检测、发种、镜检、接种管道灭菌、接种；

其中，试管培养基制作中采用的试管培养基配方为：按重量份计，马铃薯210份、葡萄糖和琼脂粉22份、蛋白胨11份、硫酸镁1.7份、磷酸二氢钾3.2份；

平皿培养基制作中采用的平皿培养基配方为：按重量份计，马铃薯210份、葡萄糖和琼脂粉22份、蛋白胨11份、硫酸镁1.7份、磷酸二氢钾3.2份；

发酵罐制作中采用的发酵罐培养基配方为按重量份计，白砂糖22份、豆粕粉160份、硫酸镁1.7份、磷酸二氢钾3.2份、消泡剂0.03份、桃木粉30份、维生素C 0.003份、维生素D0.003份、叶酸0.003份。

具体操作步骤如下：

试管培养基制作

1.称量药品 按试管培养基配方表将每样药品的使用量写在试管培养基制备记录表上，准确称取制作试管培养基的药品，搅拌均匀，置于工作台备用。

2.取1000ml去离子水，用电磁炉加热煮至沸腾，将去皮马铃薯切成1cm见方的小方块，置于锅内，然后再用小火煮沸30分钟,达到熟而不烂的程度。

3.用8层纱布过滤马铃薯汁液，取清液，并定容至1000ml，不足加洁净水补齐。

4.将量取好的马铃薯清液倒入干净锅内，煮沸，捞净泡沫，然后将准备好的配料用马铃薯汁液溶解，倒入锅内，煮至微沸至完全溶解，即可等待分装试管。

5.分装及灭菌 分装试管时，应趁培养基未凝固前，用漏斗倒入事先备好的干净试管中，根据试管用途不同，要求菌种保藏的试管每支装培养基 20ml(21×200ml)，经常使用的试管每支装培养基18ml(21×200ml)，分装完毕后塞紧硅胶塞，放在试管架上，用称量纸每把7支捆绑好，放入灭菌锅中灭菌。在121℃下灭菌20分钟，整个过程需要60分钟。

4.摆斜面 待温度降到60℃(手心不烫，手背烫)再摆斜面，将试管放置在干净宽敞、平整的台面上，一次性摆放定位，要求菌种保藏的试管底端培养基留有2cm，经常使用的试管底端培养基留有1cm长，摆放完毕后，其上覆盖一层保暖物，使其温度慢慢降下冷却，这样可以减少试管冷凝水的产生。

5.检查、存放及选用 待试管凝固后，将全部试管放入26±1℃恒温培养箱烘48h，若发现有杂菌生长，即弃去。将检测好的试管放置于干净、避光、低温的环境中备用，在使用时应选择试管壁及基面无水汽，培养基颜色未发生变化，未失水脱壁，未生长杂菌的试管，且遵循先配先用的原则，标记好配制日期。

试管种转接

1.接种前应将超净工作台全面擦拭干净，把接种使用的工具及挑选合格的试管培养基经75%的酒精消毒后一起放入工作台中，关闭照明灯及风机，打开工作台紫外灯消毒30分钟以上。

2.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。将75%的酒精棉，打火机、活化后的试管母种经75%的酒精消毒后放入工作台内待用。对双手、手臂及胸前喷洒75%的酒精消毒后，进入工作台内进行接种操作。

3.点燃酒精灯，将试管母种封口的石蜡及保鲜膜在工作台的一角落除去，灼烧试管口三圈后拧松塞子放在一旁待用，将即将转接试管培养基管口灼烧三圈后拧松塞子，待用，将接种针用75%酒精棉全面擦拭后过火灼烧灭菌，要求先将针尖在酒精灯外焰上烧红烧透，然后将接种针来回的灼烧均匀，放入盛75%酒精的杯中冷却，备用。

4.在酒精灯形成的无菌区范围内，用灼烧冷却后的接种针刮去试管前端1厘米处的薄弱菌丝及爬壁菌丝，选用前端及后端偏上一段的部分切割成绿豆大小均匀的小块（3*3mm），勾取一块接入一旁备用的试管培养基，注意接种块应避免碰到试管内壁及斜面培养基表面，接种块要离火焰一定的距离，避免灼伤接种块，试管管口在转接时随接种块左右移动，应以最快的速度接入试管内，将试管塞塞好，放在一旁，依次操作。

5.接种完成后，在转接的试管上标好批次，放入筐中，用报纸遮好后放入生化培养箱中培养，生化培养箱设定温度为杏鲍菇22℃，填写完整《试管种培养记录表》

6.在培养过程中，应每天观察做好生长记录，及时将长势差、生长不均、杂菌感染等不合格的试管种弃掉。试管种的培养天数在7-8天，长至试管八分满，可使用、保存。

试管种挑选

优良食用菌品种应具有均一性，这种均一性具备了才能进行其他形态特征特性的鉴别，简单鉴别品种质量主要从以下4方面进行：

1.长相均一性。任何一个品种都有其特有的形态特征。菌丝洁白，爬壁力强，菌丝壮、旺，培养基无干缩、气生菌丝不倒伏，反面观察除接种块点外无任何斑点、条纹或阴影。如果在继代（转管）培养中出现个别或部分培养物长势有变化，则这一批菌种都不可使用。

2.长速均一性。优良品种进行继代培养时长速均一，若培养期间出现个体间长速不一，参差不齐，则不能使用。

3.外观均一性。对一支试管斜面母种进行观察，菌丝以接种点为中心向周围均匀辐射生长，形态和长速均匀连贯，边缘整齐则为优良品种。

4.菌丝洁白、粗壮、浓密，细胞生命力强是优良品种的重要标志。否则表明该品种已老化，不能使用。

这只是基本的、初步的，品种质量还要以出菇结果为标准进行检验和鉴别。

平皿培养基制作

1.称量药品 按平皿培养基配方表将每样药品的使用量写在平皿培养基制备记录表上，准确称取制作试管培养基的药品，搅拌均匀，置于工作台备用。

2.取1000ml去离子水，用电磁炉加热煮至沸腾，将去皮马铃薯切成1cm见方的小方块，置于锅内，然后再用小火煮沸30分钟,达到熟而不烂的程度。

3.用8层纱布过滤马铃薯汁液，取清液，并定容至1000ml，不足加洁净水补齐。

4.将量取好的马铃薯清液倒入干净锅内，煮沸，捞净泡沫，然后将准备好的配料用马铃薯汁液溶解，倒入锅内，煮至微沸至完全溶解，即可分装三角瓶。

5.分装及灭菌 当培养基煮的透明时，分装到干净的500ml三角瓶中，用硅胶塞塞好，包好称量纸后和平皿一起放入灭菌锅中灭菌，在121℃下灭菌20分钟，整个过程需要60分钟。

6.当灭菌结束后，利用锅内余温烘干物品表面水汽。拿出三角瓶、平皿一起摆入超净工作台内灭菌30分钟

7.将三角瓶内培养基分装入平皿中，培养基高度在平皿高度的三分之一以上，重叠放置冷却凝固

8.待平皿凝固后，用封口膜密封，放入36℃的培养箱内烘干，24小时后取出备用。

平皿转接

1.接种前应将超净工作台全面擦拭干净，把接种使用的工具及挑选合格的平皿培养基经75%的酒精消毒后一起放入工作台中，关闭照明灯及风机，打开工作台紫外灯消毒30分钟以上。

2.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。将75%的酒精棉，打火机、活化后的试管母种经75%的酒精消毒后放入工作台内待用。对双手及胸前喷洒75%的酒精消毒后伸进工作台内进行接种操作。

3.点燃酒精灯，将试管母种封口的石蜡及保鲜膜除去，灼烧试管口三圈后拧松塞子放在一旁待用，在转接试管种时应将试管口灼烧三圈后拧松塞子，在转接平皿种时，应先将封口膜拆去，放在一旁备用，将接种针用75%酒精棉全面擦拭后过火灼烧灭菌，要求先将针尖在酒精灯外焰上烧红烧透，然后将接种针来回的灼烧均匀，放入盛75%酒精的杯中冷却，备用。

4.在酒精灯形成的无菌区范围内，用灼烧冷却后的接种针刮去试管前端1厘米处的薄弱菌丝及趴壁菌丝，选用前端及后端偏上一段的部分切割成3*3mm大小均匀的小块，勾去一块接入一旁备用的平皿中，注意接种块应避免碰到试管内壁及斜面培养基表面，接种块要离火焰一定的距离，避免灼伤接种块，试管管口在转接时随接种块移动，应以最快的速度接入试管内，一步到位，将试管塞塞好，放在一旁，依次操作。每只试管母种转接14个平皿。

5.接种完成后，在转接的平皿上标好批次，放入筐中，用报纸遮好后放入生化培养箱中培养，生化培养箱温度为23℃，填写完整《平皿种培养记录表》

6.在培养过程中，应每天观察做好生长记录，及时将长势差、生长不均、杂菌感染等不合格的平皿种弃掉。

平皿种挑选

1.感官要求

1.1 外观均一性 菌丝以接种点为中心向周围均匀辐射生长，形态和长速均匀连贯，表面均匀、舒展、平整，无角质，色泽一致。

1.2 外表菌丝浓白、粗壮、浓密，富有弹性，棉絮状；

1.3 长势鉴定长速均一性，菌丝生长快、整齐，浓而健壮。合格优良的菌种培养时长速均一，若培养期间出现个体间长速不一，参差不齐，则不能使用。

1.4 菌丝边缘整齐，无菌丝分泌物，无杂菌菌落，具有特有的杏仁香味，无异味。

2.微生物学要求

菌丝生长粗壮、均匀、分支多，有锁状联合，无杂菌。

摇瓶瓶培养基制作

1称量药品 按标准配方准确（精确度在±0.1范围内）称取制作三角瓶液体培养基的原料，放入1000ml的烧杯中，同时用烧杯盛1L过离子水放入电饭锅内水浴加热

2溶解 把事先预热好的1L过离子水倒入称好的原料中，将原料搅拌均匀后，放入电饭锅内水浴加热至原料完全溶解

3 盛4L过离子水放入洗净的桶中，将溶解后的原料倒入桶中，并混合均匀

4 准备好10个洗净的容积为1L的三角瓶，每个瓶内分别放入一个搅拌子，并加入0.5ml的花生油，分别向内装500ml的桶中的溶解液，分装完成后，用抹布擦干三角瓶瓶口，塞好硅胶塞，用称量纸包好，放入灭菌所用的不锈钢篮中，上面用报纸覆盖。

5 把装好的三角瓶放入灭菌锅中，关闭灭菌锅排气阀和锅盖，这时灭菌锅关门的指示灯会熄灭。按下work工作键，在121℃的环境下灭菌20分钟，整个过程60分钟。灭菌完成后关闭电源，把排气阀打开1/4左右，排气冷却

6 当灭菌锅里的气压降为0时，打开灭菌锅盖，用余热把锅内物品烘干，拿出三角瓶，放在接种不锈钢平台上冷却备用

7选用 在使用摇瓶培养基时，应注意培养基的颜色是否一致，按照先配先用的原则标记好配制日期。

摇瓶种接种

1.接种前对超净工作台用75%酒精棉全面擦拭消毒，将待接种的三角瓶液体培养基放在超净工作台上，取下包瓶口的称量纸，用脱脂棉喷上75%酒精对三角瓶的瓶身擦拭消毒，并将接种工具摆放好，关掉照明灯，开启紫外灯，杀菌30分钟。

2.从培养箱里挑选优质的平皿种，准备使用。

3.待30分钟后关闭紫外灯，打开风机，5分钟后开启照明灯，用75%酒精对双手进行消毒，戴上已消毒好的一次性医用橡胶手套。在超净工作台里准备好一小块75%酒精浸透的脱脂棉。

4.将选好的平皿种，用75%酒精擦拭表面，放入超净工作台备用。

5.点燃酒精灯，用喷有75%酒精的脱脂棉将接种铲擦干净，然后将接种铲放在酒精灯外焰上来回的灼烧，每个面都要灼烧彻底，倒插在广口瓶冷却备用。

6.把三角瓶瓶口在火焰上灼烧三圈，并轻轻拧松硅胶塞，放在一旁，然后将平皿上的封膜除去，右手将接种铲在火焰旁灼烧，放入平皿内沿着菌丝生长的纹路，将生长在前端菌丝分隔成大小均匀的正方形小块，长度约为6mm。用接种铲削取薄薄的正方形小块，转接入摇瓶内，并尽量使接种块漂浮在液面上。每瓶转接6个接种块。

7.三角瓶瓶口在火焰上灼烧两圈，将塞子拧紧。接种铲在火焰上灼烧后继续接以下的三角瓶。

8.待摇瓶转接完成后，标记好转接批次，包好称量纸，并填写完整《摇瓶种培养观察记录表》，放在培养室的指定位置进行培养。

摇瓶种培养

1 将已经接的摇瓶种用白色胶筐装好。搬到摇瓶培养室中。在不锈钢平面台上静置培养一天，让菌种适应新的生长环境。

2 已经静置培养一天的摇瓶，在第2天，按照摇瓶上已经编号的序号，将摇瓶放在磁力搅拌器相应的位置上，并打开磁力搅拌器电源开关。

3 将磁力搅拌器转速调到对应档数进行动态培养。培养的操作规则是：前7天转速调到600r/min，最后1天转速调为800r/min，培养到第9天可以使用，最长使用时间不能超过10天。培养过程温度控制在23℃。

5.每天及时填写《摇瓶培养观察记录表》。

摇瓶种挑选

1.菌球的形态：菌种培养好后会看到大小均匀、活力旺盛、毛刺明显的大量的菌球，静止5分钟后菌球占菌液浓度的80%以上或不分层。若菌球很少或大小不一，则可能是质量有问题。

2.菌液澄清度：菌液中除菌球外无其它固形物，菌液由前期的微浑浊变得澄清或橙黄色。如变得浑浊不清则很可能是染菌。

3.菌液气味：到培养后期菌液的糖香味会逐渐消失，取而代之的是或有或无的菌种特有的清香味（杏仁味）。若有臭味、酸味、霉味则是染菌。

4.微生物检测：培养到第5天取样做PDA和NA平皿检测，检测合格的摇瓶才能接液态罐。

在超净工作台内用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，放在生化培养箱中培养72小时（26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿）若表面菌丝萌发明显，且无其它颜色的孢子，无菌落，则多为正常，若有其它特殊颜色孢子、菌落，则为污染。

液态灌制作

1.准备空罐：需检查发酵罐各零配件是否便于使用、罐的气密性是否良好，并维修更换相应的零配件，以及罐子清洁是否达到标准

2.配料：按照培养基配方称量所需的原料放入配料桶中，填写好每桶相对应的配料表，至少两人操作，一人称料，一人确认，避免配料失误

3.装罐：将罐底快速接头盖合严密，关闭排液阀，打开法兰口，先加水至300L，放上过滤网兜，向各配料桶加水搅拌，将已溶解的部分倒入罐中，未溶解的再加水搅拌，这样多次加水溶解分批倒入罐中（除豆粕粉易受热结块的配料用常温水溶解之外，其他均可用加热的水以加快溶解速度），向罐内加入90ml消泡剂，补水至发酵罐的指定刻度。将法兰口附近的残料清洗干净，将法兰口螺丝对角拧合、快开式接种口盖合严密，再将罐子外壁冲洗干净

4.检查实罐气密性：发酵罐装料后，打开排气阀，先通气5min，使发酵罐内的溶质混匀，再关闭排气阀，用泡沫水检查发酵罐气密性（有漏气立即处理），用量杯取出一部分培养液（注意取样后将排液阀处的培养液清理干净），倒出一点培养液测灭菌前PH值。

5.灭菌：灭菌前将上一步检查发酵罐气密性时罐内的气压卸掉（打开排气阀），接压缩空气快速接头，关闭炉门

6.拉炉：开炉门，关闭发酵罐排气阀，拉入放冷室，并对接种口处用95%酒精燃烧消毒，无菌操作连接压缩空气，打开排气阀即可。

灭 菌

1 在液态罐推进灭菌炉之前，先通知锅炉送蒸汽，启动灭菌炉进入程序，手动开启进洁净空气开关，再用泡泡水检查灭菌炉内室的洁净空气管道是否密封严实，打开蒸汽管道上的手动排气阀，检查蒸汽压力是否在0.6MPa，冷却水炉外开关是否处于开启状态。

2 进炉：打开灭菌炉炉门，将罐子推入炉内，把罐子上的快速头与炉内空气管道连接起来，保证炉内空气管道不漏气，再次确认液态罐的出气阀是否打开，如没有打开，在灭菌过程中有可能发生事故。6个发酵罐进入炉后，用干净湿抹布将炉门框、密封圈擦拭一遍，再关好炉门，即可启动灭菌程序，随即观察压力、温度是否在上升，炉门四周是否有空气或水蒸气冒出，若有，则需退出灭菌程序，将炉门打开，清查一遍再关炉门，直至不漏气为止。

3 灭菌：灭菌设定参数：保温1设定110度，保持20分钟；保温2设定115度，保持30分钟；灭菌设定123度，保持90分钟。核对灭菌参数无误后，启动开关，进入灭菌程序。启动灭菌炉后，每隔20分钟巡查一次，确保灭菌炉正常运行，防止异常情况发生导致灭菌不彻底和生产事故发生。

4 出炉：从显示屏上观察灭菌炉运行阶段，必须是在冷却行程，冷却温度都低于42度，压力表指针指向零。此时将后门打开，将炉门铁板放下，一进入炉内先关掉液态罐出气口阀门，拔掉洁净空气接头，把液态罐依次从炉内拉出，用气枪将酒精槽内和四个脚轮上的水吹干（不能对着接口处吹），每个液态罐贴上制作日期和灭菌位置的标识。

5 放冷：推入水淋室，用75%的酒精对罐体和轮子喷雾消毒后拉入放冷室指定位置摆放整齐。

6 清洁：出炉后将地面用水冲洗及炉内的积水用刮水板刮开，将灭菌炉的门半掩，以利于内保持干燥。填写好灭菌记录，有异常情况的也需做好记录。

空桶取样

1 放冷第2天做空桶取样检测。

2 将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯等所需物品提前准备好。放在要取样的液态罐旁边。同时准备小半桶水备用。

3 取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

4 取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干。用硅胶塞封好取样口。

5 每个液态罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶（这瓶要编好取样的编号），另外一瓶弃掉。

6 检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒。在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，（接种针在取菌液前要在酒精灯火焰上稍微烧一下），在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

液态灌接种

1 用75%的酒精对无菌罩四周喷雾消毒，打开新风开关，并用手在无菌罩下感觉是否有风从上面往下吹，检查无菌罩内4只紫外灯是否都是正常运行。如没有，要及时反应，找相关部门维修。

2 用水桶装半桶水和放一条毛巾在内，做好防火措施。

3 新风开启30分钟后，关闭紫外灯，，5分钟后开启照明灯，准备接菌，先把已经培养合格的三角瓶液体菌种从三角瓶培养室端过来，用75%的酒精擦拭瓶身，并按接种的先后顺序放好

4 用温度计测量每个液态罐，检查是否已经达到接菌温度23℃，并记录。同时用快速接头对当天培养要通气的地方进行放气。

6 把冷却好可以接菌的液态罐推到无菌罩的正下方，连接洁净空气并打开液态罐出气阀门,用75%酒精喷洒罐顶部以及四周。

7 此过程需要三人合作，一人协助递喷灯，75%酒精，三角瓶，防火手套，开关洁净空气进气。一人接种,一人开盖和关盖。接种完成后，用湿毛巾扑灭火焰，关闭排气阀，推出无菌罩，推到指定位置。

8 接菌完成后，关闭无菌罩开关，用75%酒精把接菌台面擦拭干净。

9.发酵罐连接压缩空气后，打开排气阀，确认连接OK。

填写发酵罐培养记录表，按项目如实填写。

发酵罐种培养与观察

1.大桶培养间设定温度为21℃，CO2浓度以工作人员工作时不感到呼吸困难为主，整个培养环境保持洁净。

2.每天发酵罐培养观察至少两次，将日期、通气压力、菌液颜色、透明度、气味、泡沫状态、菌丝球形态及浓度等，以及温度、CO2浓度等信息填入《发酵罐培养观察记录表》中，发酵罐培养的周期控制在7天。

通气压力：通常调为0.15MPa，其通气压力应根据菌丝形态等异常做实际调节。

菌液颜色及透明度：由于发酵罐培养液的营养物质会随着菌丝量的增多而减少，培养液的颜色由浅黄色逐渐变为米汤色，菌液透明度逐渐变得透彻。

气味：接种第一天，由于发酵罐刚制备出来的培养液味道透有咸味，称豆粕味，第二天咸味消失，透出豆粕味，随菌丝量的增多在第5天以后，豆粕味逐渐变淡，透出菌丝味，并越来越浓。

菌丝形态及浓度：接种的前3天处于菌丝恢复期及萌发期，菌丝量较少，形态不明显，从第4天开始菌丝形态开始明显，菌丝生长较快。

温度和CO2浓度：培养期间温度会有所升高，CO2会逐渐增加趋于平稳，而后逐渐降低。

3.在接种后的第5天，依照发酵罐取样要求对发酵罐进行取样检测（具体工序参看发酵罐取样检测），将各项检测结果填入《发酵罐培养观察记录表》中。依据检测结果和培养观察记录评判发酵罐是否合格，若发现平板检测长有菌落，此发酵罐应做处理，并查找污染的原因：检测发酵罐气密性（依据发酵罐制作气密性检查的要求进行检查），若罐体无漏气现象，可重新取样做第二次检测，将发酵罐推出再进行发酵罐各部件检测，根据第二次检测的结果，逐一对母种、平皿种、摇瓶种、灭菌、接种、冷却等综合因素作出分析报告，并做出改善措施。

5. 随时关注异常情况并采取相应措施做好详细记录，比如停电停气、干燥机是否运行正常、发酵罐明显泄漏、气压不稳定等情况。

菌液取样检测

1 将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯等所需物品提前准备好。放在要取样的液态罐旁边。同时准备小半桶水备用。

2 取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

3 取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干。用硅胶塞封好取样口。

5 每个液态罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶（这瓶要编好取样的编号），另外一瓶弃掉。

6 检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒。在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，（接种针在取菌液前要在酒精灯火焰上稍微烧一下），在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

发种

1.检查：发种前先检查确认当天所准备发的菌种微生物检测是否合格（接种头天发桶）。检查当天准备发种的发酵罐菌丝形态、罐温、CO2浓度、气味是否正常，确认OK并填写培养观察记录表和发种记录表。

2.发桶、连管：先关闭排气阀，进行闷罐，保压后关闭发酵罐进气，有序的将当天使用的发酵罐拉至接种指定位置摆放整齐，连接洁净空气，打开排气阀，连接灭菌蒸汽管和输液管。

3.检查、取样：接种前检查确认菌种微生物检测是否合格，检查发酵罐菌丝形态、罐温、CO2浓度、气味是否正常，确认OK并填写培养观察记录表；用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口用75%酒精消毒，用准备好的栽培瓶接取三瓶液态罐内的菌液倒掉,再用三角瓶接取液态罐内的菌液（用于平皿检测和镜检），另外一人用75%酒精喷洒三角瓶，并用喷灯对三角瓶瓶口灼烧两圈消毒。在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口。

4.镜检：接种前发酵罐取样镜检确认合格后才能接种。

镜检

1 涂片：用接种针勾取菌液涂抹在洁净无油的载玻片上。

2 干燥：将涂片朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态。

3 染色：将载玻片平放于台面上，滴加结晶紫染色液1-2滴于涂片上，覆盖标本表面，染色1-2min。

4 水洗：倾去染液，用水在载玻片的一端轻轻冲洗，直至涂片上留水无色为止，水洗时，不宜水流直接冲洗涂面。水流不宜 宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

5 干燥：甩去载玻片的水珠，在酒精灯上方加热干燥即可。

6 镜检：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的区区域加香柏油，从侧面注入，用粗调节器将镜筒小心的降低，使油镜浸在油中，并几乎与标本接触时止，（注意：切不可将油油镜压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗 粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

接种管道灭菌

1 冲洗：当天接菌完后将第二天接种的发酵罐发种连管，打开控制箱开关，开启进水管道阀门冲洗，待管道内菌液冲洗干净（排污口出水清澈无菌液），关闭进水开关方可灭菌。

2 检查、灭菌：检查水箱是否有水，各接头有无松动异常情况，开启蒸汽发生器电源，压力升至0.4MPa，打开供气开关，供汽压力保持0.2-0.4MPa，检查各个开关是否正常开启，每根接种枪及相应管道是否正常在灭菌（手触摸管道感观温度是否发烫），查看排污管尾端安装的数显温度计温度上升情况，温度达到119℃开始灭菌计时，灭菌时间不低于40min。

3关汽：当灭菌时间达到40min以上即可停止灭菌，灭菌关汽顺序：排污口开关—控制箱电源开关—取样口开关—输液管开关—蒸汽进气管开关—蒸发器电源开关—供汽开关，关闭注水及电源。

4记录：将整个灭菌过程按《接种管道灭菌记录表》要求填写，并确认签字。

接种

1．保压：在发酵罐右边排气管安装压力表，接种前先调节发酵罐调压阀压力为0.3MPa,，关闭1/2左边排气阀，打开右边排气阀，查看压力表保压在0.11-0.14MPa范围。

2．调试：开启控制箱，先用空桶手动喷洒，确定喷头、开关正常，再用量筒分别对喷头A、B、C称取喷洒量，调整好喷洒时间，用已称重的栽培袋做好标记分别试接种枪，喷洒量标准为30-35g，确认OK方可接种（接种前用95%的酒精喷洒接种枪，用喷灯灼烧，消毒要到位）。

3．接种：随着罐内菌液量的减少，接种过程对喷洒时间进行调整，每接半个小时对接种枪灼烧消毒（不定时75%酒精喷洒消毒），并检测一次接种量，每罐可接17000袋栽培袋。接菌完成后将接种枪安装好，洗净后灭菌。

4．大桶留样：接菌完后进行大桶取样检测观察

卫生清洁：使用TCCA消毒粉兑水对接种室进行清洁，不能有菌液残留，清洁完成后，关闭照明灯，开启紫外灯。

通过对照试验，本发明的菌种与木屑菌种相比：接种效率高8%～12%，菌种最大生长距离短40%～100%，培菌效率高30%～70%，且使用本菌种，菌包上下菌龄较为一致，利于菌包营养集中释放，首批菇产量可增加20%～35%。并且通过此工艺培育出的霜茸菇口感丰富，具有较高的食用价值。

本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于，包括如下步骤：试管培养基制作、试管种转接、试管种挑选、二级菌种制作，平皿培养基制作、平皿转接、平皿种挑选、三级菌种制作，摇瓶培养基制作、摇瓶种接种、摇瓶种培养、摇瓶种挑选、发酵罐制作、灭菌、空桶取样、发酵罐接种、发酵罐种培养与观察、菌液取样检测、发种、镜检、接种管道灭菌、接种；

其中，试管培养基制作中采用的试管培养基配方为：按重量份计，马铃薯190-210份、葡萄糖和琼脂粉18-22份、蛋白胨9-11份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份；

平皿培养基制作中采用的平皿培养基配方为：按重量份计，马铃薯190-210份、葡萄糖和琼脂粉18-22份、蛋白胨9-11份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份；

发酵罐制作中采用的发酵罐培养基配方为按重量份计，白砂糖18-22份、豆粕粉140-160份、硫酸镁1.3-1.7份、磷酸二氢钾2.8-3.2份、消泡剂0.01-0.03份。

2.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述发酵罐培养基配方中还包括桃木粉10-30份。

3.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述发酵罐培养基配方中还包括维生素C 0.001-0.003份。

4.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述发酵罐培养基配方中还包括维生素D 0.001-0.003份。

5.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述发酵罐培养基配方中还包括叶酸0.001-0.003份。

6.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述发酵罐种培养与观察步骤中具体操作如下：

1.大桶培养间设定温度为21℃，CO2浓度以工作人员工作时不感到呼吸困难为主，整个培养环境保持洁净；

2.每天发酵罐培养观察至少两次，将日期、通气压力、菌液颜色、透明度、气味、泡沫状态、菌丝球形态及浓度等，以及温度、CO2浓度等信息填入《发酵罐培养观察记录表》中，发酵罐培养的周期控制在6-7天；

3.在接种后的第4-5天，依照发酵罐取样要求对发酵罐进行取样检测，将各项检测结果填入《发酵罐培养观察记录表》中，依据检测结果和培养观察记录评判发酵罐是否合格，若发现平板检测长有菌落，此发酵罐应做处理，并查找污染的原因：检测发酵罐气密性，若罐体无漏气现象，可重新取样做第二次检测，将发酵罐推出再进行发酵罐各部件检测，根据第二次检测的结果，逐一对母种、平皿种、摇瓶种、灭菌、接种、冷却等综合因素作出分析报告，并做出改善措施。

7.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述菌液取样检测步骤中具体操作如下：

1.将已经灭菌的三角瓶，75%酒精，95%酒精，不锈钢方盘1个，喷灯提前准备好，放在要取样的发酵罐旁边，同时准备小半桶水备用；

2.取样：此步骤由两人协作完成：把一个不锈钢方盘放在取样口下面，用75%酒精对手部喷洒消毒后，一人在取样口四周用75%酒精消毒，取下取样口硅胶塞，用准备好的三角瓶接取液态罐内的菌液体；另外一人用75%酒精喷洒消毒三角瓶口，并用喷灯对两个三角瓶口灼烧两圈消毒，在接取菌液过程中用喷灯火焰封住取样口和三角瓶口；

3.取完菌液后，喷95%酒精在取样口管中冲洗残留的菌液，再用喷灯把取样口内的残余酒精烧干，用硅胶塞封好取样口；

4.每个发酵罐取的两瓶菌液，只要最后一瓶，另外一瓶弃掉；

5.检测：用75%酒精对手部消毒，戴好医用橡胶手套，再次用75%酒精对手部消毒，在已经准备好的超洁净工作台内进行检测：把三角瓶瓶口在酒精灯外焰上灼烧两圈，用接种针快速伸进摇瓶挑取少量菌液在NA和PDA平皿中，规则的画线，在超净工作台内，用封口膜封好，放在生化培养箱中培养72小时，26℃和36℃各放一个PDA和一个NA平皿。

8.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述镜检步骤中具体操作如下：

1.涂片：用接种针勾取菌液涂抹在洁净无油的载玻片上；

2.干燥：将涂片朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥，避免离火焰太近，温度过高会破坏菌体形态；

3.染色：将载玻片平放于台面上，滴加结晶紫染色液1-2滴于涂片上，覆盖标本表面，染色1-2min；

4.水洗：倾去染液，用水在载玻片的一端轻轻冲洗，直至涂片上留水无色为止，水洗时，不宜水流直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落；

5.干燥：甩去载玻片的水珠，在酒精灯上方加热干燥即可；

6.镜检：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的区域加香柏油，从侧面注入，用粗调节器将镜筒小心的降低，使油镜浸在油中，并几乎与标本接触时止，将聚光器升至最高位置并开足光圈，调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

9.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述接种管道灭菌步骤中具体操作如下：

1.冲洗：当天接菌完后将第二天接种的发酵罐发种连管，打开控制箱开关，开启进水管道阀门冲洗，待管道内菌液冲洗干净至排污口出水清澈无菌液，关闭进水开关方可灭菌；

2.检查、灭菌：检查水箱是否有水，各接头有无松动异常情况，开启蒸汽发生器电源，压力升至0.4MPa，打开供气开关，供汽压力保持0.2-0.4MPa，检查各个开关是否正常开启，每根接种枪及相应管道是否正常在灭菌，查看排污管尾端安装的数显温度计温度上升情况，温度达到119℃开始灭菌计时，灭菌时间不低于40min；

3.关汽：当灭菌时间达到40min以上即可停止灭菌，灭菌关汽顺序：排污口开关—控制箱电源开关—取样口开关—输液管开关—蒸汽进气管开关—蒸发器电源开关—供汽开关，关闭注水及电源。

10.根据权利要求1所述的一种霜茸菇菌种制作工艺，其特征在于：所述接种步骤中具体操作如下：

1．保压：在发酵罐右边排气管安装压力表，接种前先调节发酵罐调压阀压力为0.2-0.3MPa,，关闭1/2左边排气阀，打开右边排气阀，查看压力表保压在0.11-0.14MPa范围；

2．调试：开启控制箱，先用空桶手动喷洒，确定喷头、开关正常，再用量筒分别对喷头称取喷洒量，调整好喷洒时间，用已称重的栽培袋做好标记分别试接种枪，喷洒量标准为30-35g，确认后方可接种，接种前用95%的酒精喷洒接种枪，用喷灯灼烧，消毒要到位；

3．接种：随着罐内菌液量的减少，接种过程对喷洒时间进行调整，每接半个小时对接种枪灼烧消毒并不定时采用75%酒精喷洒消毒，并检测一次接种量，每罐可接14000-17000袋栽培袋，接菌完成后将接种枪安装好，洗净后灭菌；

4．大桶留样：接菌完后进行大桶取样检测观察；

5.卫生清洁：使用TCCA消毒粉兑水对接种室进行清洁，不能有菌液残留，清洁完成后，关闭照明灯，开启紫外灯。