CN107460178A - 一种甘露聚糖酶制备方法及其提取精制装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘露聚糖酶制备方法及其提取精制装置，先采用毕赤酵母工程菌种通过液体发酵得到发酵液，然后进行提取精制，具体提取精制步骤为：1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；2）浓缩一段时间后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/5‑1/10时，加入淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。本发明采用陶瓷膜过滤不但拦截了生产菌，还起到了过滤除菌的作用，加上与超滤膜浓缩的偶联，缩短了工艺时长，降低了微生物的增殖风险，得到的成品卫生指标合格率大幅提高至99%，产品得率提高至83%以上。

Description

一种甘露聚糖酶制备方法及其提取精制装置
技术领域
本发明属于甘露聚糖酶技术领域，尤其涉及一种甘露聚糖酶制备方法及其提取精制装置。
背景技术
甘露聚糖酶（β-1,4-D-Mannanase，EC3.2.1.78）是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1,4-糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露寡糖，其作用底物包括β-甘露聚糖、半乳甘露聚糖及葡萄甘露聚糖。β-甘露聚糖酶也可以降解甘露聚糖为甘露寡糖，甘露寡糖能优化肠道微生态区系，增强对宿主的有益保健功能，还能识别、粘附和排除病原微生物，调节机体免疫机能，提高畜禽生产性能。甘露寡糖在动物体内可以竞争性地与某些病原菌结合，促进有益菌的生长繁殖，从而减少有害菌与肠黏膜上皮细胞的联接，使动物的发病率明显降低，增进动物机体健康，达到防病抗病和治病的目的。同时，研究表明，降解产生的甘露低聚糖（甘露寡糖）可通过物理吸附或直接结合霉菌毒素，消除毒素对畜禽动物机体的有害影响。β-甘露聚糖酶可以降解饲料原料中的β-甘露聚糖，消除β-甘露聚糖的抗营养作用，提高了饲料的消化率，同时能促进胰岛素的分泌和胰岛素样生长因子IGF-1的生成，从而促进葡萄糖的吸收和碳水化合物的代谢，提高能量的利用。同时，因为IGF-1是畜禽真正的生长调控因子，生长激素（GH）的促生长作用是IGF-1介导的，IGF-1作用于生长组织，刺激细胞增强对氨基酸的利用从而促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，使动物的蛋白质实现净增长。
甘露聚糖酶现有的生产工艺是采用毕赤酵母工程菌种通过液体发酵得到发酵液，向发酵液中加入硅藻土、珍珠岩等助滤剂，通过板框初过滤、板框复过滤得到滤液。滤液通过真空减压浓缩，得到富集浓度的酶蛋白溶液。在溶液中加入一定的辅料，干燥得到成品。
传统后提取处理工艺采用板框过滤分离菌体，需要添加大量的絮凝剂，劳动强度大，现场环境差，过滤时间长，最终得到的成品卫生指标合格率只有80%，产品得率仅有70%。
发明内容
本发明的目的提供一种甘露聚糖酶制备方法及其提取精制装置，其提高提取精制的收率，提升产品卫生指标合格率。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种甘露聚糖酶制备方法，先采用毕赤酵母工程菌种通过液体发酵得到发酵液，然后进行提取精制，提取精制步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；
2）浓缩一段时间后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/5-1/10时，加入淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。
进一步地，步骤1）中陶瓷膜的孔径为100-800nm，操作压差0.15-0.40MPa，膜面流速2.0-3.5m/s。
进一步地，步骤2）中超滤膜选用截留分子量10000-20000道尔顿的有机膜。
进一步地，步骤1）和2）中过滤浓缩的时间均为4-8小时，循环料液温度控制通过冷冻水进行降温。
进一步地，步骤3）中所述的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉或红薯淀粉，加入量为浓缩液的5-40wt%，混匀时控制温度在20℃以下；喷雾干燥时，进风温度控制在130-160℃，出风温度控制在60-80℃。
进一步地，所述步骤2）浓缩过程中的透析液返回至步骤1）中进行浓缩。
进一步地，发酵液制备工序为：
a、将工程菌种接入灭菌的斜面培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到斜面菌种；
b、将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到摇瓶种子液；
c、将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，在28-32℃培养10-20小时得一级种子液；
d、将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28-32℃培养10-20小时得二级种子液；
e、将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加葡萄糖和甲醇，通入无菌空气，采用氨水控制pH 值4.6-4.8，在28-32℃条件下，培养120-200小时得到富含甘露聚糖酶产品的发酵液。
本发明还涉及一种含甘露聚糖酶的发酵液的提取精制装置，包括依次设置的发酵液储罐、陶瓷膜设备、滤清液储罐和超滤膜设备，所述发酵液储罐与陶瓷膜设备构成循环管路；滤清液储罐和超滤膜设备之间构成循环管路。
进一步地，超滤膜设备的透析液出口连接至发酵液储罐。
采用陶瓷膜过滤时，需要筛选合适材料、合适孔径的陶瓷膜，在优选的温度、PH条件下，既能有效拦截生产菌及杂菌，又能得到高收率、高浓度、低微生物的甘露聚糖酶溶液，同时要有抗污染，高通量的特性以利于工业产业化。
采用超滤膜过滤同样需要筛选合适的材料、孔径，在甘露聚糖酶稳定的温度、PH条件下，不对甘露聚糖酶产生吸附、破坏作用，具有较高的拦截率、抗污染能力，能将甘露聚糖酶溶液浓缩5-10倍，同时要有高通量的特性以利于工业产业化。
本发明具有以下有益效果：
1、无需投加大量的助滤剂、絮凝剂，减少了劳动强度，改善了劳动环境。
2、产品得率大幅提高至83%以上，产品成本大幅下降。
3、陶瓷膜过滤和超滤膜浓缩偶联工艺降低了一半的工艺耗水量，同时也降低了一半的污水排放量，节能环保；由于陶瓷膜过滤不但拦截了生产菌，还起到了过滤除菌的作用，加上与超滤膜浓缩的偶联，缩短了工艺时长，降低了微生物的增殖风险，成品卫生指标合格率大幅提高；采用本工艺制得产品微生物含量小于1000CFU/g，而市面上产品卫生指标中的微生物含量通常大于50000CFU/g，本发明产品卫生指标合格率大幅提高至99%，产品卫生指标达到食品级要求，如果在生产过程中使用食品级原料，综合产品质量达到食品级，扩宽了产品销售范围，提升了产品价值。
附图说明
图1为本发明所述装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1：
一种甘露聚糖酶提取精制方法，步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；陶瓷膜的孔径为100nm，操作压差0.40MPa，膜面流速3.5m/s。滤液澄清、透明，含渣量＜ 0.05%，收率88.8%。
2）浓缩4h后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；其中超滤膜选用截留分子量10000道尔顿的有机膜。超滤得到的浓缩液依然澄清、透明，体积减少至滤液体积的1/5，收率97.5%。
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/5时，加入5 wt %玉米淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。喷雾干燥进风温度控制在130℃，出风温度控制在60℃，经瞬间干燥后得到成品，收率96.2%。综合后提取工艺成品收率达到83.3%，微生物含量900 CFU/g。
实施例2：
一种甘露聚糖酶提取精制方法，步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；陶瓷膜的孔径为200nm，操作压差0.40MPa，膜面流速2.5m/s。滤液澄清、透明，含渣量＜ 0.07%，收率89.3%。
2）浓缩8h后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；其中超滤膜选用截留分子量10000道尔顿的有机膜。超滤得到的浓缩液依然澄清、透明，体积减少至滤液体积的1/7，收率97.3%。
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/7时，加入15 wt %小麦淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。喷雾干燥进风温度控制在140℃，出风温度控制在65℃，经瞬间干燥后得到成品，收率96.0%。综合后提取工艺成品收率达到83.4%，微生物含量950 CFU/g。
实施例3：
一种甘露聚糖酶提取精制方法，步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；陶瓷膜的孔径为500nm，操作压差0.30MPa，膜面流速2.5m/s。滤液澄清、透明，含渣量＜ 0.08%，收率89.7%。
2）浓缩6h后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；其中超滤膜选用截留分子量20000道尔顿的有机膜。超滤得到的浓缩液依然澄清、透明，体积减少至滤液体积的1/8，收率97.0%。
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/8时，加入25 wt %土豆淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。喷雾干燥进风温度控制在150℃，出风温度控制在70℃，经瞬间干燥后得到成品，收率95.8%。综合后提取工艺成品收率达到83.4%，微生物含量730 CFU/g。
实施例4：
一种甘露聚糖酶提取精制方法，步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；陶瓷膜的孔径为800nm，操作压差0.15MPa，膜面流速2.0m/s。滤液澄清、透明，含渣量＜ 0.1%，收率90.3%。
2）浓缩6h后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；其中超滤膜选用截留分子量20000道尔顿的有机膜。超滤得到的浓缩液依然澄清、透明，体积减少至滤液体积的1/10，收率96.5%。
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/10时，加入浓缩液的40wt%的红薯淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，喷雾干燥时，进风温度控制在160℃，出风温度控制在80℃，得到甘露聚糖酶。喷雾干燥进风温度控制在160℃，出风温度控制在80℃，经瞬间干燥后得到成品，收率95.5%。综合后提取工艺成品收率达到83.2%，微生物含量550 CFU/g。
上述酵母发酵液是采用毕赤酵母工程菌种通过液体发酵得到的；具体发酵步骤为：
a、将工程菌种接入灭菌的斜面培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到斜面菌种；
b、将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到摇瓶种子液；
c、将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，在28-32℃培养10-20小时得一级种子液；
d、将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28-32℃培养10-20小时得二级种子液；
e、将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加葡萄糖和甲醇，通入无菌空气，采用氨水控制pH 值4.6-4.8，在28-32℃条件下，培养120-200小时得到富含甘露聚糖酶产品的发酵液。
另外，循环料液温度控制通过冷冻水进行降温。
更为优选的方案，步骤2）浓缩过程中的透析液返回至步骤1）中进行浓缩。
实施例5：
甘露聚糖酶制备方法包括发酵液的制备和提取精制；其中发酵液的制备采用毕赤酵母工程菌；菌株性能稳定、产酶能力强、比酶活高、酶学性质优良。
发酵液的制备包括下述的步骤：
斜面培养 ：将工程菌种接入灭菌的斜面培养基，在28-32℃培养，20-30 小时得到斜面菌种；
摇瓶菌种：将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基28-32℃培养20-30 小时得
到摇瓶种子液；
一级种子培养：将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，28-32℃培养10-20小时得一级种子液；
二级种子培养：将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28-32℃培养10-20小时得二级种子液；
将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加葡萄糖和甲醇，通入无菌空气，采用氨水控制pH 值4.6-4.8，在28-32℃条件下，培养120-200 小时得到富含甘露聚糖酶产品的发酵液。
产品的提取精制包括以下步骤：
1）发酵液菌体分离；
2）超滤浓缩；
3）喷雾干燥；
具体为：
1）发酵液菌体分离 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白。陶瓷膜孔径200nm，操作压差0.30MPa，膜面流速2.5m/s。发酵液直接经过陶瓷膜循环过滤，过程采用冷冻水为循环料液降温，循环料液温度控制在20℃以下，浓缩的发酵液中不断加入工序2）的透析液以清洗出残留的产品。过滤时间为4小时，滤液澄清、透明，含渣量＜ 0.1%，收率达到92.1%。
2）超滤浓缩 将步骤1）中得到的滤清液以通过超滤膜设备循环浓缩，超滤膜选用截留分子量10000道尔顿的有机膜，循环浓缩过程中，低分子杂质和水分子透过膜形成透析液，高分子的甘露聚糖酶不能透过膜，浓度不断提高，浓缩至初始料液体积的1/7。浓缩过程中采用冷冻水为循环料液降温，循环料液温度控制在20℃以下，浓缩时间6 小时，浓缩过程中的透析液返回至工序1），与陶瓷膜分离形成偶联，减少废液排放，提高收率。超滤得到的浓缩液依然澄清、透明，体积减少至滤液体积的1/7，收率达到97.3%。
3）喷雾干燥 将超滤浓缩液吸入配料罐中，向其中投入10 wt %的食品级玉米淀粉，控制料液温度在20℃以下、搅拌转速为120rpm，搅拌均有后泵送至喷雾干燥塔进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度控制在135℃，出风温度控制在65℃，经瞬间干燥后得到含水量8%以下的干品，干品在环境为温度22℃-28℃，湿度≤ 50%，100万级洁净控制区内包装得到成品，收率达到96.1%。综合从发酵液算起，后提取工艺成品收率达到86.1%。
实施例6：
本发明还提供一种含甘露聚糖酶的发酵液的提取精制装置，如图1所示，包括依次设置的发酵液储罐1、陶瓷膜设备2、滤清液储罐3和超滤膜设备4，所述发酵液储罐与陶瓷膜设备构成循环管路；滤清液储罐和超滤膜设备之间构成循环管路。
优选的方案中，超滤膜设备4的透析液出口连接至发酵液储罐。

Claims (9)

1.一种甘露聚糖酶制备方法，先采用毕赤酵母工程菌种通过液体发酵得到发酵液，然后进行提取精制，其特征在于，提取精制步骤为：
1）将发酵液采用陶瓷膜循环过滤浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；
2）浓缩一段时间后取陶瓷膜过滤出的滤清液经超滤膜设备循环浓缩，循环料液温度控制在20℃以下；
3）步骤2）中浓缩液的体积减少至滤清液体积的1/5-1/10时，加入淀粉混匀，最后进行喷雾造粒，得到甘露聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中陶瓷膜的孔径为100-800nm，操作压差0.15-0.40MPa，膜面流速2.0-3.5m/s。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中超滤膜选用截留分子量10000-20000道尔顿的有机膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）和2）中过滤浓缩的时间均为4-8小时，循环料液温度控制通过冷冻水进行降温。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉或红薯淀粉，加入量为浓缩液的5-40wt%，混匀时控制温度在20℃以下；喷雾干燥时，进风温度控制在130-160℃，出风温度控制在60-80℃。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2）浓缩过程中的透析液返回至步骤1）中进行浓缩。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵液制备工序为：
a、将工程菌种接入灭菌的斜面培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到斜面菌种；
b、将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基，在28-32℃培养20-30 小时得到摇瓶种子液；
c、将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，在28-32℃培养10-20小时得一级种子液；
d、将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28-32℃培养10-20小时得二级种子液；
e、将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加葡萄糖和甲醇，通入无菌空气，采用氨水控制pH 值4.6-4.8，在28-32℃条件下，培养120-200小时得到富含甘露聚糖酶产品的发酵液。
8.一种含甘露聚糖酶的发酵液的提取精制装置，其特征在于：包括依次设置的发酵液储罐（1）、陶瓷膜设备（2）、滤清液储罐（3）和超滤膜设备（4），所述发酵液储罐与陶瓷膜设备构成循环管路；滤清液储罐和超滤膜设备之间构成循环管路。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于：超滤膜设备（4）的透析液出口连接至发酵液储罐。
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