CN107406831A

CN107406831A - 宿主细胞蛋白质修饰

Info

Publication number: CN107406831A
Application number: CN201680012054.7A
Authority: CN
Inventors: D·巴拉科夫; M·格伦; 陈刚
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-11-28
Also published as: EA201791918A1; CA2976669A1; MX2017011012A; HUE045862T2; JP6751402B2; MY180896A; EP3262168A1; WO2016138467A1; TW201702380A; KR20170120126A; SG11201706335TA; HK1248272A1; DK3262168T3; AU2016224988A1; EP3262168B1; BR112017018149A2; IL253863A0; JP2018506295A; ES2751670T3; US20160251411A1

Abstract

提供用于工程化细胞系和表达系统的组合物和方法，所述组合物和方法允许在真核细胞中表达重组蛋白及其容易分离。还提供细胞表达系统，其能够表达基本上不含结合型宿主细胞蛋白的目的蛋白。

Description

宿主细胞蛋白质修饰

序列表

本申请包含在2016年2月26日创建的名为10143US01_ST25.txt的文件中计算机可读取形式的序列表，所述序列表通过引用的方式并入本文。

发明领域

本发明提供在真核细胞中表达和纯化重组蛋白的细胞和方法。特别地，本发明包括在真核细胞、尤其中国仓鼠(Cricetulus griseus)细胞系中利用下调内源蛋白的基因表达以控制这类“棘手”的不利宿主细胞蛋白产生而表达蛋白质的方法和组合物。本发明包括促进纯化外源重组目的蛋白的多核苷酸和修饰的细胞。本发明的方法有效地靶向中国仓鼠细胞基因组中的宿主细胞蛋白，旨在促进由修饰的细胞表达的重组蛋白的增强和稳定表达。

背景

细胞表达系统旨在为制造供治疗使用的生物制药产物提供可靠和有效的来源。纯化这类系统中真核或原核细胞产生的任何重组蛋白是一项持续存在的挑战，原因在于例如，需要从药用级成品中消除的宿主细胞蛋白和核酸分子过多。

已经在生物加工的多种阶段期间研究了视为杂质副产物的宿主细胞蛋白的某些动力学。进行高级液相色谱/质谱(LC/MS)以检测并监测伴随细胞培养物所产生的肽体(peptibody)的大肠杆菌HCP(Schenauer,MR.等人,2013,Biotechnol Prog 29(4):951-7)。通过HCP谱获得的信息可用于监测工艺开发并评估产品质量和纯度，旨在评估任一种或多种HCP带来的安全风险。

已经证实真核细胞的细胞培养条件的变化影响所制造蛋白质的纯度，如下游生物加工改变时CHO细胞的HCP量增加所见(Tait等人,2013,Biotechnol Prog 29(3):688-696)。任何产品中剩余HCP的有害作用可能影响产品的总体质量或数量或者其质量和数量。当前方案寻求改变细胞产生的目的蛋白(例如，治疗性抗体)，以消除与目的蛋白和宿主细胞蛋白的差异性结合或相互作用(Zhang,Q.等人,mAbs,Published online:11Feb 2014)。

尽管众多细胞表达系统可用，并未不利影响所表达目的蛋白的生物学特性的工程化细胞系和系统是特别有利的。因此，本领域需要为下游生物加工及随后商业使用制备蛋白质质量样品的改进方法。

发明简述

构思基因编辑工具消除杂质宿主细胞蛋白的用途，并且因此，为更高效的蛋白质生产工艺提供工程化的宿主细胞。

在一个方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其中细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中酯酶表达水平减少酯酶表达水平。

在另一个方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其中细胞经修饰以不表达靶酯酶。

在一些实施方案中，酯酶是磷脂酶，尤其磷脂酶B样蛋白。在其他实施方案中，磷脂酶是磷脂酶B样2蛋白。

在一些实施方案中，将目的基因外源添加至重组宿主细胞。在其他实施方案中，外源添加的基因编码目的蛋白(POI)，例如，POI选自抗体重链、抗体轻链、抗原结合片段和Fc-融合蛋白。

本发明提供包含无功能的PLBD2蛋白的细胞。

本发明提供通过破坏PLBD2靶而产生细胞。在一些实施方案中，该方法包括在靶位点或序列处破坏或编辑细胞基因组的位点特异性核酸酶。在一些实施方案中，PLBD2靶位点包含在SEQ ID NO:33内部或与SEQ ID NO:33内部位置毗邻的位置，所述位置选自涵盖以下编号之位置的核苷酸：SEQ ID NO:33的1-20、10-30、20-40、30-50、30-60、30-70、40-60、40-70、50-70、60-80、70-90、80-100、90-110、110-140、120-140、130-150、140-160、150-170、160-180、160-180、170-190、180-200、180-220、190-230、190-210、200-220、210-230、220-240、230-250、240-260和250-270。

在另一个实施方案中，在SEQ ID NO:33内部或与SEQ ID NO:33内部位置毗邻的位置处的靶位点选自涵盖以下编号之位置的核苷酸：SEQ ID NO:33的37-56、44-56、33-62、40-69、110-139、198-227、182-211和242-271。在这个方面，PLBD2靶位点部分地或完全位于本文提供的SEQ ID NO:33的核苷酸位置内部或由其涵盖，并且在靶位点或序列处破坏或编辑细胞基因组可以由本文提供的SEQ ID NO:33的核苷酸位置内部缺失或插入一个或多个核苷酸组成，而与转录自野生型细胞(即无基因组破坏或基因编辑的细胞)的转录物相比，破坏或编辑过程改变后续的转录物。在一些实施方案中，改变的基因的后续转录物导致翻译的蛋白质移码。在一些实施方案中，改变的基因的后续转录物导致改变的蛋白，所述蛋白质遭受降解、通过标准方法如质谱法检不可测或没有可检测的活性。在一些实施方案中，定向破坏或编辑在基因的两个等位体上出现。

在某些实施方案中，细胞还整合外源核酸序列。在其他实施方案中，细胞能够产生外源目的蛋白。在另外的实施方案中，因破坏的基因产生的改变的蛋白质不与该细胞产生的目的蛋白结合。

在另一个方面，提供分离的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述细胞包含了包含PLBD2基因变体(如SEQ ID NO:33的变体)的工程化核酸序列。在一个实施方案中，PLBD2基因包含GACAGTCACG TGGCCCGACT GAGGCACGCG，SEQ ID NO:33的核苷酸1-30(SEQ ID NO:44)。在另一个实施方案中，PLBD2基因经工程化以破坏可读框的表达。在其他实施方案中，本发明提供分离的CHO细胞，所述细胞包含(a)破坏的PLBD2基因，其包含GACAGTCACG TGGCCCGACTGAGGCACGCG(SEQ ID NO:44，还包含SEQ ID NO:33的核苷酸1-30)、(b)破坏的酯酶基因，其包含编码表1中任一个氨基酸序列的核苷酸或(c)由破坏的PLBD2基因表达的表1蛋白质片段；和包含目的基因的外源核酸序列。

在另一个方面，提供一种使用重组宿主细胞产生目的蛋白的方法，其中宿主细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中酯酶表达水平减少酯酶表达水平。

在另一个实施方案中，该方法包括具有减少的酯酶表达的修饰的宿主细胞和包含目的基因(GOI)的外源核酸序列。

在某些实施方案中，外源核酸序列包含一个或多个目的基因。在一些实施方案中，一个或多个目的基因选自第一GOI、第二GOI和第三GOI。

在另一个方面，本发明提供了包含重组宿主细胞的表达系统，所述重组宿主细胞包含修饰的或无功能的酯酶。

在又一个实施方案中，细胞包含与能够驱动GOI表达的启动子有效连接的GOI，其中启动子包含可以受激活物或抑制物调节的真核启动子。在其他实施方案中，真核启动子与原核操纵基因有效连接，并且真核细胞任选地还包含原核阻遏蛋白。

在另一个实施方案中，一个或多个选择标记由修饰的宿主细胞表达。在一些实施方案中，目的基因和/或一种或多种选择标记与启动子有效连接，其中启动子可以相同或不同。在另一个实施方案中，启动子包括真核启动子(如，例如，CMV启动子或SV40晚期启动子)，任选地受原核操纵基因(如，例如，tet操纵基因)控制。在其他实施方案中，细胞还包含编码原核阻遏蛋白(如，例如，tet阻遏蛋白)的基因。

在一个方面，提供CHO宿主细胞，其包含重组酶识别位点。在一些实施方案中，重组酶识别位点选自LoxP位点，Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372、Lox5171和frt位点。

在另一个实施方案中，细胞还包含能够表达重组酶的基因。在一些实施方案中，重组酶是Cre重组酶。

在一个实施方案中，选择标记基因是耐药基因。在另一个实施方案中，耐药基因是新霉素耐药基因或潮霉素耐药基因。在另一个实施方案中，第二和第三选择标记基因编码两种不同的荧光蛋白。在一个实施方案中，两种不同的荧光蛋白选自香菇珊瑚(Discosomacoral)(DsRed)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、氰基荧光蛋白(CFP)、增强氰基荧光蛋白(eCFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)和红外荧光蛋白(mKate)。

在一个实施方案中，第一、第二和第三启动子相同。在另一个实施方案中，第一、第二和第三启动子彼此不同。在另一个实施方案中，第一启动子与第二和第三启动子不同，并且第二和第三启动子相同。在更多实施方案中，第一启动子是SV40晚期启动子，并且第二和第三启动子各自是人CMV启动子。在其他实施方案中，第一和第二启动子与原核操纵基因有效连接。

在一个实施方案中，宿主细胞系具有外源添加的编码重组酶的基因，所述基因整合入其基因组，与启动子有效连接。在另一个实施方案中，重组酶是Cre重组酶。在另一个实施方案中，宿主细胞系具有整合入其基因组、与启动子有效连接的编码调节蛋白的基因。在更多实施方案中，调节蛋白是tet阻遏蛋白。

在一个实施方案中，第一GOI和第二GOI编码抗体的轻链、或其片段或抗体的重链或其片段。在另一个实施方案中，第一GOI编码抗体的轻链并且第二GOI编码抗体的重链。

在某些实施方案中，第一、第二和第三GOI编码选自第一轻链或其片段、第二轻链或其片段和重链或其片段的多肽。在又一个实施方案中，第一、第二和第三GOI编码选自轻链或其片段、第一重链或其片段和第二重链或其片段的多肽。

在一个方面，提供一种制造目的蛋白的方法，所述方法包括(a)向CHO宿主细胞引入目的基因(GOI)，其中GOI整合入特定基因座，如2010年8月10日授予的美国专利号7771997B2中描述的基因座或其他稳定整合和/或增强表达的基因座；(b)在引起GOI表达的条件下培养(a)的细胞；和(c)回收目的蛋白。在一个实施方案中，目的蛋白选自免疫球蛋白的亚基或其片段、和受体或其配体结合片段。在某些实施方案中，目的蛋白选自抗体轻链或其抗原结合片段，和抗体重链或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，CHO宿主细胞基因组包含其他修饰，并且包含一个或多个如上文所述的重组酶识别位点，并且通过识别重组酶识别位点的重组酶的作用，将GOI引入特定基因座。

在一些实施方案中，当CHO宿主细胞基因组在特定基因座内部包含至少一个外源识别序列时，使用用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的导引载体，将GOI引入细胞。

在另一个实施方案中，使用用于同源重组的的导引载体，将GOI引入细胞，并且其中导引载体包含与特定基因座中存在的序列同源的5’同源性臂、GOI、和与特定基因座中存在的序列同源的3’同源性臂。在另一个实施方案中，导引载体还包含两个、三个、四个或五个或更多个目的基因。在另一个实施方案中，一个或多个目的基因与启动子有效连接。

在另一个方面，提供一种修饰CHO细胞基因组以整合外源核酸序列的方法，所述方法包括步骤：向所述细胞引入载体，所述载体包含其中外源核酸在基因组的基因座内部整合的外源核酸序列。

在又一个方面，本发明提供一种用于制造稳定蛋白质制剂的方法，所述方法包括步骤：(a)从具有减少或消除的酯酶表达的本发明修饰的宿主细胞提取蛋白质级分，(b)使包含目的蛋白的蛋白质级分与选自蛋白A亲和(PA)色谱、阳离子交换(CEX)色谱和阴离子交换色谱(AEX)色谱的柱接触，(c)从培养基收集目的蛋白，其中减少的酯酶活性水平与步骤(c)处收集的蛋白质级分相关，因此提供稳定的蛋白质制剂。

在又一个方面，本发明提供一种用于减少蛋白质制剂中酯酶活性的方法，包括步骤：(a)修饰宿主细胞以减少或消除酯酶表达，(b)用目的蛋白转染宿主细胞，(c)从修饰的宿主细胞提取蛋白质级分，(c)使包含目的蛋白的蛋白质级分与选自蛋白A亲和(PA)色谱、阳离子交换(CEX)色谱和阴离子交换(AEX)色谱的柱接触，(d)从培养基收集目的蛋白，并且(e)将目的蛋白与脂肪酸酯和任选地缓冲剂和热稳定剂合并，因此提供基本上不含可检测酯酶活性的蛋白质制剂。在一些实施方案中，蛋白质制剂基本上不含PLBD2蛋白或PLBD2活性。

在又一个方面，提供一种修饰CHO细胞基因组以表达治疗药的方法，所述治疗药包含用于向基因组引入外源核酸的载体，所述载体包含表达治疗药的序列，其中载体包含与SEQ ID NO:33的核苷酸序列中存在的序列同源的5’同源性臂和与SEQ ID NO:33的核苷酸序列中存在的序列同源的3’同源性臂。

在又一个方面，本发明提供了包含修饰的CHO基因组的修饰的CHO宿主细胞，其中通过破坏与SEQ ID NO:33至少90％相同的核苷酸序列内部的靶序列，修饰CHO基因组。

在另一个方面，本发明提供了包含修饰的真核基因组的修饰的真核宿主细胞，其中通过位点特异性核酸酶在PLBD2基因的编码区中的靶序列处修饰真核基因组。在一些实施方案中，位点特异性核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应子结构域融合蛋白、或RNA指导的DNA核酸内切酶。本发明也提供产生这种修饰的真核宿主细胞的方法。

在上文描述的任何方面和实施方案中，靶序列可以按如SEQ ID NO:33中所示的取向或按SEQ ID NO:33的反向取向安置。

在另一个方面，提供了包含改变的PLBD2基因的重组宿主细胞。在一些实施方案中，提供了其中通过破坏编码区改变PLBD2基因的重组宿主细胞。在其他实施方案中，破坏的编码区在选自外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11和外显子12的外显子核苷酸序列中。在某些实施方案中，破坏的编码区在选自外显子1和外显子2的外显子核苷酸序列中。

在一个实施方案中，提供了其中PLBD2基因改变包括双等位基因改变的重组宿主细胞。

在另一个实施方案中，提供一种重组宿主细胞，其中PLBD2基因改变包括缺失1个或多个碱基对、2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对、或20个或更多个碱基对。

除非另外说明或从上下文显而易见，否则本发明的任何方面和实施方案可以与本发明的任何其他方面或实施方案组合使用。

其他目的和优点将从后续详述的综述中变得显而易见。

附图简述

图1描述了检测修饰的克隆的基因组(gDNA)或转录物(mRNA)的定量聚合酶链反应(qPCR)实验的结果。引物和探针是设计成旁侧分布在外显子1内部预测为遭受定向破坏的序列，所述序列始于SEQ ID NO:33的核苷酸37(sgRNA1)或始于其核苷酸44(sgRNA2)。来自被sgRNA1或sgRNA2靶向的克隆的扩增子相对量作图(即相对于衍生自不受sgRNA或非匹配sgRNA作用的阴性对照转染克隆的扩增子)。例如根据靶向的外显子1区域的qPCR，克隆1相对地没有扩增的gDNA和mRNA。选择克隆1和几个其他克隆供追踪分析。

图2A和图2B显示与野生型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞相比，进一步PCR分析克隆1细胞群体的结果。图2A显示与来自野生型细胞的基因组DNA的扩增子相比，来自克隆1的PCR扩增子在长度(bp)上较短。图2B显示与来自野生型细胞的mRNA的扩增子相比，来自克隆1的PCR扩增子在长度(bp)上较短。测序证实，克隆1的PLBD2基因中缺失11bp。

图3显示经历相同补料分批培养条件12天的表达单克隆抗体1(mAb1)的克隆1细胞(RS001)或表达mAb1的野生型CHO细胞(RS0WT)的蛋白质相对滴度。提取每份培养物的条件培养基样品并且在第0、第3、第5、第7、第10和第13天定量蛋白A结合级分。

图4显示在生产培养和使用单一蛋白A(PA)色谱、或PA和阴离子交换(AEX)色谱的蛋白质纯化后RS001细胞或RS0WT细胞的结果。使用胰蛋白酶消化物质谱法，分析来自RS001和RS0WT的PA纯化的mAb1的脂肪酶丰度。因而，将RS001产生的和RS0WT产生的mAb1的胰蛋白酶消化物注入偶联于三重四极杆质谱仪的反相液相色谱柱，所述质谱仪设置成监测特定PLBD2产物片段(如表1中那样)。还分析了含有mAb1的参比样品(无内源PLBD2)的对照反应并对其作图，其中参比样品用不同量的重组PLBD2内标。实验中检出的信号测与对照反应比较，以确定PLBD2的浓度。用PA单独纯化时，从克隆1产生的mAb1未显示可检测量的PLBD2。

发明详述

在描述本发明的方法之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。因此例如，对“一种方法”的称谓包括一种或多种方法和/或本文所述和/或将对本领域技术人员在其阅读本公开时变得显而易见的类型的步骤。

除非另外定义或另外规定，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述具体的方法和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用的方式将其整体并入。

定义

短语“外源添加的基因”或“外源添加的核酸”指在如自然界中那样存在的细胞的基因组内部不存在的任何DNA序列或基因。例如，CHO基因组内部“外源添加的基因”可以是来自任何其他物种的基因(例如，人基因)、嵌合基因(例如，人/小鼠)、或在插入基因的特定CHO基因座内部自然界中不存在的仓鼠基因(即，来自仓鼠基因组中另一个基因座的仓鼠基因)、或在自然界中发现不存在于目的CHO基因座内部的任何其他基因。

当分别描述酯酶(例如磷脂酶)蛋白质或基因如SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33时，同一性百分数意在包括沿连续同源性区域显示所提及的同一性的同源序列，但是计算同一性百分数时不考虑在所比较的序列中无同源物的空位、缺失或插入的存在。

例如在SEQ ID NO:32与物种同源物之间确定“同一性百分数”将不包括比较其中物种同源物在比对结果中无同源序列供比较的序列(即，SEQ ID NO:32与其片段比较，或物种同源物具有空位或缺失，根据具体情况而定)。因此，“同一性百分数”不包括空位、缺失和插入的罚分。

“定向破坏”基因或核酸序列指在基因组DNA中指导切割或断裂(如双链断口)并且因此造成修饰这类基因或核酸序列的编码性序列的基因打靶方法。基因靶位点是经选择供核酸酶切割或断裂的位点。正常情况下通过非同源末端接合(NHEJ)DNA修复途径修复DNA断口。在NHEJ修复期间，插入或缺失(InDel)可能发生，从而，在断口部位随机插入或缺失少数核苷酸并且这些InDel可以移动或破坏靶基因的可读框(ORF)。ORF中的移动可能在DNA断口下游的所得氨基酸序列中造成显著的变化，或可以引入过早终止密码子，因此使得表达的蛋白质，如果有的话，无功能或遭受降解。

“定向插入”指用来将基因或核酸序列直接插入或整合至基因组上的特定位置的基因打靶方法，即，指导DNA至连续多核苷酸链中两个核苷酸之间的特定位点。也可以进行定向插入以引入少数核苷酸或引入包含多个基因、调节元件和/或核酸序列的完整基因盒。“插入”和“整合”互换使用。

“识别位点”或“识别序列”是由结合并指导位点特异性切割DNA主链的核酸酶或其他酶识别的特定DNA序列。核酸内切酶切割DNA分子内部的DNA。识别位点在本领域中也称作识别靶位点。

聚山梨醇酯是脱水山梨糖醇或异山梨醇的脂肪酸酯(聚氧乙烯脱水山梨糖醇或异山梨醇单酯或二酯)。聚氧乙烯充当亲水性头基团并且脂肪酸作为亲脂性疏水尾。聚山梨醇酯作为表面活性剂的有效性取决于(单个分子中)存在亲水性头部和疏水尾部的分子的两性性质。当聚山梨醇酯降解(水解)成其成分头基团和脂肪酸尾时，它丧失其作为蛋白质稳定剂的有效性，可能引起聚集，并且后续的亚可见粒子(SVP)形成是这种降解的指标。SVP可以归因于免疫原性。监管当局如美国食品药品监督管理局(USFDA)对药物制剂中允许的亚可见颗粒(SVP)数目提出限制。美国药典(USP)发布了药物和药物成分以及食物成分和膳食补充剂的规格、纯度和质量的标准。

短语“酯酶活性”指将酯如脂肪酸酯切割(水解)成酸(即游离脂肪酸)和醇类(即含酯化合物)的水解酶的酶活性。

结合蛋白A的级分指来自表达与蛋白A亲和样式结合的目的蛋白的所培养细胞的细胞裂解物的级分。本领域中充分理解，利用蛋白A亲和色谱如蛋白A色谱介质(如树脂、珠、柱等)来捕获含有Fc的蛋白质，原因在于它们对蛋白A的亲和力。

磷脂酶B样2(PLBD2)指称作NCBI RefSeq.XM_003510812.2(SEQ ID NO:33)的磷脂酶基因或称作NCBI RefSeq.XP_003510860.1(SEQ ID NO:32)的蛋白质的同源物并且在本文中进一步描述。PLBD2在本领域中也称作推定性磷脂酶B样2(PLBL2)、76kDa蛋白、LAMA样蛋白2、PLB同源物2、核纤层蛋白祖先同源物2、甘露糖-6-磷酸蛋白相关蛋白质p76、p76、磷脂酶B样2 32kDa形式、磷脂酶B样2 45kDa形式或溶酶体66.3kDa蛋白。

术语“细胞”或“细胞系”包括适于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和(单细胞或多细胞)真核生物的那些细胞、细菌细胞(例如，大肠杆菌菌株、芽孢杆菌属某些物种(Bacillus spp.)、链霉菌属某些物种(Streptomyces spp.)等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.partoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或细胞融合物，例如，杂交瘤或四合瘤(quadroma)。在某些实施方案中，细胞是人细胞、猴细胞、猿细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在某些实施方案中，细胞是真核细胞并选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞和衍生自前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.细胞)。

一般描述

本发明至少部分地基于减少内源宿主细胞磷脂酶蛋白表达、减少内源宿主细胞磷脂酶蛋白之酶促功能或结合能力或无可检出内源宿主细胞磷脂酶蛋白的重组宿主细胞和其细胞表达系统。发明人发现，破坏PLBD2蛋白表达允许在这类表达系统中优化和高效纯化生物制药产物。本发明可以按几种方式使用，如1)利用基因编辑工具完全敲除磷脂酶表达，因而细胞中因破坏磷脂酶基因而无可测量的全长磷脂酶表达；2)利用基因编辑工具消除或减少酶活性，因而磷脂酶蛋白表达，但因基因内的破坏作用而令其无功能；和3)利用基因编辑工具消除或减少内源宿主细胞磷脂酶蛋白结合细胞产生的外源重组蛋白的能力。在某些产生抗体的细胞的蛋白质级分中测定酯酶活性。将一种特定酯酶(磷脂酶B样(PLBD2))作为这些蛋白质级分中的杂质测定。在仓鼠PLBD2基因中鉴定在仓鼠细胞(即CHO)基因组中能够实现定向破坏基因的基因编辑靶位点。

包含修饰的PLBD2基因的优化宿主细胞可用于生物加工高质量蛋白质并且构思其减少某些纯化步骤的负担，因而减少时间和成本，同时增加生产率。

本发明还基于特异性导引外源性基因至整合位点。本发明的方法允许高效修饰细胞基因组，因此产生修饰的或重组的宿主细胞，所述宿主细胞可用作细胞表达系统生物供加工治疗性或其他商业性蛋白质产物。为此目的，本发明的方法利用细胞基因组基因编辑策略以改变特定的目的基因，其中所述目的基因否则可能削弱或损害重组蛋白制剂的质量或需要多个纯化步骤。

本发明的组合物，例如基因编辑工具，也可以纳入表达构建体中，例如，纳入表达载体克隆和工程化的新细胞系中。这些细胞系包含本文所述的修饰，并且构思了出于蛋白质表达目的供最佳并入表达构建体的其他修饰。包含多核苷酸的表达载体可以用来瞬时表达目的蛋白，或可以通过随机或定向重组，例如，同源重组或由识别特异性重组位点的重组酶介导的重组(例如，Cre-lox-介导重组)，整合入细胞基因组。

一般在考虑基因破坏或插入作用最大的情况下鉴定用于破坏或插入DNA的靶位点。例如，可以靠近目的基因的编码区N端选择靶序列，而在基因的第一或第二外显子内部引入DNA断口。一般不靶向内含子(非编码区)供破坏，因为修复该区域内的DNA断口可能不破坏靶基因。通过这些修饰引入的变化对生物的基因组DNA而言是永久性的。

基本上，在鉴定SEQ ID NO:33的靶位点后，基因编辑方案用来造成无功能的基因。一旦消除杂质性宿主细胞蛋白，还使用本领域已知用于引入可表达目的基因(GOI)如多亚基抗体，连同任何其他所需元件，例如启动子、增强子、标记、操纵基因、核糖体结合位点(例如，内部核糖体进入位点)等的方案。

所得到的重组细胞系便利地提供相对于可表达外源目的基因(GOI)而言更高效的下游生物加工方法，因为外源目的蛋白的纯化步骤因不存在杂质性宿主细胞蛋白而消除。消除或精制纯化程序还产生量(滴度)更高的回收的目的蛋白。

修饰的CHO细胞的物理及功能表征

申请人已经发现，酶活性与聚山梨醇酯(包括聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯-80)的去稳定化相关。发现这种活性与酯酶如包含选自表1中所列出序列中的氨基酸序列的多肽相关。对那些肽序列的BLAST检索揭示与推定性磷脂酶B样2(PLBD2，也称作PLBL2)的同一性。PLBD2在仓鼠(SEQ ID NO:32)、小鼠(SEQ ID NO:34)、大鼠(SEQ ID NO:35)、人(SEQ IDNO:36)和牛(SEQ ID NO:37)中高度保守。申请人发现，PLBD2(在某些过程下随某些类别在哺乳动物细胞系中制造的目的蛋白一起共纯化)具有负责水解聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80的酯酶活性。申请人预见，其他酯酶种类(PLBD2是其例子)可以促成聚山梨醇酯不稳定性，这取决于具体目的蛋白和/或宿主细胞的遗传/表观遗传背景。哺乳动物酯酶片段、尤其PLBD2的片段在表1中例举的多个物种之间具有同一性。

表1

最近报道了聚山梨醇酯-80的酯水解(参见Labrenz,S.R.,“Ester hydrolysis ofpolysorbate 80in mAb drug product:evidence in support of the hypothesizedrisk after observation of visible particulate in mAb formulations,”J.Pharma.Sci.103(8):2268-77(2014))。该论文报道含有IgG的制剂中形成可视粒子。作者推测，胶态IgG颗粒因聚山梨醇酯-80的油酸酯的酶促水解而形成。尽管没有直接鉴定酯酶，但作者推测，随IgG共纯化的脂肪酶或吐温酶是降解聚山梨醇酯-80的原因。有趣的是，用聚山梨醇酯20配制的IgG未形成粒子并且推定性酯酶不水解聚山梨醇酯20。作者报道，与IgG缔合的推定性脂肪酶不影响饱和的C12脂肪酸(即，月桂酸酯)(同上文7)。

磷脂酶是催化切割磷脂的酯酶家族。每个磷脂酶亚类具有基于其靶切割位点的不同底物专一性。因存在一个高度保守氨基酸序列基序Gly-Asp-Ser-Leu(GDSL)，确定磷脂酶B(PLB)与一组原核和真核脂肪酶蛋白相关(Upton,C和Buckley,JT.A new family oflipolytic enzymes？Trends Biochem Sci.1995；20:178–179)。但是，磷脂酶B还划分为已知的GDSL(S)水解酶，并且与真实脂肪酶几乎没有序列同源性，通过具有比其他脂肪酶更靠近N端的含有丝氨酸的基序，使其本身在结构上区别于磷脂酶。因此，磷脂酶B样蛋白也划分为N端亲核体(Ntn)水解酶。功能上，磷脂酶B样酶按照与其他磷脂酶相似的方式水解其靶底物(脂肪酸酯如二酰基甘油磷脂)以产生游离脂肪酸和含酯化合物(例如，产生甘油磷酰胆碱)。已经提出PLB样蛋白如磷脂酶B样蛋白1(PLBD1)和磷脂酶B样蛋白2(PLBD2)还具有酰胺酶活性，类似于其他Ntn水解酶(Repo,H.等人,Proteins 2014；82:300-311)。

可以按几种方式完成宿主细胞基因(如酯酶，更具体地磷脂酶B样蛋白2)的敲除。可以通过在磷脂酶基因组序列中、尤其在外显子(编码区)中引入点突变，致使磷脂酶基因无功能或减少靶磷脂酶的功能活性。鉴定了SEQ ID NO:33的核酸序列，并且靶位点上游和下游的序列(即同源臂)可以通过同源重组用来整合包含突变基因的表达盒。根据本发明，本文中描述了其他的基因编辑工具。

缺少酯酶活性、尤其PLBD2活性的细胞系可用于生产待纯化并长期储存的治疗用蛋白质，并且通过维持蛋白质稳定性并减少亚可见粒子(SVP)形成，这类细胞系解决了与含有脂肪酸酯表面活性剂的制剂中长期储存药物组合物相关的问题(还参见2015年10月8日提交的PCT国际申请号PCT/US15/54600)。

检测磷脂酶的酶活性的测定法包括聚山梨醇酯降解(推定性酯酶活性)测量法。对源自CHO细胞的未纯化蛋白质上清液或级分和经历依次纯化步骤时每个步骤或系列步骤的上清液检验聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20或80)的稳定性。报告的完整聚山梨醇酯的百分数量值与杂质性酯酶活性的量成反比。本领域已知检测蛋白质样品中酯酶活性或酯酶存在的其他测量法。可以通过胰蛋白酶消质谱法检测酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶或PLBD2)。

假设在蛋白质(例如，抗体)制剂中非离子型去垢剂(即表面活性剂如聚山梨醇酯)的稳定性与亚可见粒子的形成直接相关。因此，聚山梨醇酯的降解引起表面活性剂活性的损失，因此引起蛋白质聚集并形成亚可见粒子。额外地或可选地，通过降解山梨糖醇酐的脂肪酸酯释放的脂肪酸还可以促成亚可见粒子作为不溶混性脂肪酸液滴形成。因此，可以在蛋白质制剂中计数直径≥10微米的亚可见粒子的水平，旨在检测酯酶活性。

本领域已知用于检测磷脂酶活性的其他测定法。例如，可以通过薄层色谱法确定在温育磷脂酰[³H]胆碱和蛋白质上清液后从磷脂酰[³H]胆碱形成甘油磷脂酰[³H]胆碱(遵循根据Kanoh,H.等人.1991Comp Biochem Physiol 102B(2):367-369的相似方案)。

从CHO细胞中表达的蛋白质确定本文公开的SEQ ID NO:32。发现其他哺乳动物种类(例如，人、大鼠、小鼠)与鉴定的酯酶具有高度同源性。同源序列也可以在衍生自中国仓鼠(Cricetulus griseus)或其他同源物种的其他组织类型的细胞系中存在并且可以通过本领域熟知的技术鉴定和分离。例如，可以通过交叉物种杂交或基于PCR的技术，鉴定其他同源序列。此外，随后可以如本文所述那样检验PLBD2变体的酯酶活性。在核酸同一性方面与SEQ ID NO:32至少约80％相同并具有酯酶活性的DNA或其变体预计对生物制药组合物显示出其酯酶活性并且是工程化的细胞系中供定向破坏的候选物。因此，本发明的实施方案还涵盖SEQ ID NO:32的同源物或其变体和表达这类同源物的细胞。

哺乳动物PLBD2序列(核酸和氨基酸)在仓鼠、人、小鼠和大鼠基因组当中保守。表2鉴定了示例性哺乳动物PLBD2蛋白及其同源性程度。

表2：PLBD2同源物的氨基酸同一性

在某些实施方案中，对SEQ ID NO:33的定向破坏涉及这样的区域，所述区域选自涵盖以下编号之位置的核苷酸：SEQ ID NO:33的1-20、10-30、20-40、30-50、30-60、30-70、40-60、40-70、50-70、60-80、70-90、80-100、90-110、110-140、120-140、130-150、140-160、150-170、160-180、160-180、170-190、180-200、180-220、190-210、190-230、200-220、210-230、220-240、230-250、240-260、250-270、33-62、37-56、40-69、44-63、110-139、198-227、182-211和242-271。

在另一个实施方案中，靶序列完全或部分地位于这样的区域内，所述区域选自涵盖以下编号之位置的核苷酸：SEQ ID NO:33的1-20、10-30、20-40、30-50、30-60、30-70、40-60、40-70、50-70、60-80、70-90、80-100、90-110、110-140、120-140、130-150、140-160、150-170、160-180、160-180、170-190、180-200、180-220、190-210、190-230、200-220、210-230、220-240、230-250、240-260、250-270、33-62、37-56、40-69、44-63、110-139、198-227、182-211和242-271。

在另一个实施方案中，酯酶的核酸序列与SEQ ID NO:33的序列或其靶序列至少约80％相同、至少约81％相同、至少约82％相同、至少约83％相同、至少约84％相同、至少约85％相同、至少约86％相同、至少约87％相同、至少约88％相同、或至少约89％相同、至少约90％相同、至少约91％相同、至少约92％相同、至少约93％相同、至少约94％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、或至少约99％相同。

使用本文提供的细胞系和方法，可以开发出表达增强水平的目的蛋白的细胞群体。由本发明细胞产生的分离的商用蛋白质、其蛋白质上清液或级分无可检测的酯酶或酯酶活性。预计用整合在本发明的修饰细胞的基因组内部的外源序列进一步修饰的细胞汇集物随时间推移稳定，并且可以作为稳定细胞系处理用于大多数目的。重组步骤也可以在开发本发明细胞系的过程中推迟至稍后。

遗传地修饰靶宿主细胞蛋白

在特定位置基因工程化宿主细胞基因组(即靶宿主细胞蛋白)的方法可以按几种方式实现。基因编辑技术用来修饰真核细胞中的核酸序列，其中核酸序列是正常情况下存在于这类细胞中并表达杂质性宿主细胞蛋白的内源序列。有必要克隆性扩充以确保细胞后代将共有工程化细胞系的相同基因型和表型特征。在一些例子中，通过同源重组技术修饰天然细胞以整合无功能或突变的编码宿主细胞蛋白(如SEQ ID NO:33的变体)的靶核酸序列。

这样一种编辑CHO PLBD2基因组序列的方法包括使用导向RNA和II型Cas酶以特异性靶向PLBD2外显子。已经在如本文所述的位点特异性核酸酶编辑方法中使用针对CHOPLBD2的外显子1的特异性导向RNA(例如，参见表4)。修饰PLBD2基因的其他定向基因组编辑方法，例如核酸酶、基于重组的方法或RNA干扰，可以用于定向破坏CHO基因组。

在一个方面，敲除或下调核酸分子的方法和组合物是借助同源重组，其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO:33相同90％的宿主细胞蛋白或其结合抗体的变体。可以通过同源重组或通过使用特异性靶向宿主细胞基因组中酯酶表达位点处序列的位点特异性核酸酶方法，靶向核酸分子(例如编码目的酯酶)。对于同源重组，同源多核苷酸分子(即同源臂)对齐并交换它们的一段序列。如果转基因旁侧分布有同源基因组序列，可以在这种交换期间引入转基因。在一个例子中，也可以将重组酶识别位点在整合位点引入宿主细胞基因组。

可以通过在染色体DNA中整合位点处引入断口，促进真核细胞中的同源重组。模型系统具有显示，如果在染色体靶序列内部引入双链断口，则基因打靶期间同源重组的频率增加。这可以通过导引某些核酸酶至特定整合位点完成。在靶基因处识别DNA序列的DNA结合蛋白是本领域已知的。还使用基因打靶载体促进同源重组。在不存在基因打靶载体供同源性指导的修复情况下，细胞频繁地通过非同源末端接合(NHEJ)封闭双链断口，这可以导致在切割位点处缺失或插入多个核苷酸。基因打靶载体结构和核酸酶选择处于本发明所属领域的技术人员能力范围内。

在一些例子中，具有模块结构并含有独立锌指结构域的锌指核酸酶(ZFN)识别靶序列中的特定3-核苷酸序列。一些实施方案可以利用具有靶向多个靶序列的独立锌指结构域的组合的ZFN。本发明还体现导引PLBD2基因破坏(例如，在外显子1或外显子2处)的ZFN方法。

转录激活物样(TAL)效应核酸酶(TALENs)也可以用于位点特异性基因组编辑。TAL效应子蛋白DNA结合结构域一般与限制性核酸酶(如FokI)的非特异性切割结构域组合使用。在一些实施方案中，包含TAL效应子蛋白DNA结合结构域和限制性核酸酶切割结构域的融合蛋白用来在编码靶宿主细胞蛋白(例如酯酶如磷脂酶B样2蛋白、或其他哺乳动物磷脂酶)的基因的外显子内部靶序列处识别并切割DNA。可以通过使用被导引至酯酶基因组DNA的外显子1、外显子2、外显子3等内部位置的TALE核酸酶(TALEN)，定向破坏SEQ ID NO:33编码的CHO蛋白的特定外显子或向其中插入外源序列(参见表3和表4)。可以根据ZiFit.partners.org(ZiFit Targeter版本4.2)选择SEQ ID NO:33内部的TALEN靶切割位点，并且随后基于已知方法设计TALEN(Boch J等人,2009Science326:1509-1512；Bogdanove,A.J.和Voytas,D.F.2011Science 333,1843–1846；Miller,J.C.等人,2011NatBiotechnol 29,143–148)。本发明还体现导引PLBD2基因破坏(例如，在外显子1或外显子2处)的TALEN方法。

RNA指导的核酸内切酶(RGEN)是从细菌适应性免疫装置开发的可编程基因组工程化工具。在这个系统中，成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)免疫应答—蛋白质Cas9与两种RNA(其中之一指导靶选择)复合时，形成一种序列特异性核酸内切酶。RGEN由多种组分(Cas9和tracrRNA)和靶特异性CRISPR RNA(crRNA)组成。DNA靶切割效率和剪切位点的位置均基于前间区序列邻近基序(PAM)的位置(靶识别的额外要求)变动(Chen,H.等人,J.Biol.Chem.2014年3月14日作为手稿M113.539726在线发表)。本发明还体现导引PLBD2基因破坏(例如，在外显子1或外显子2处)的CRISPR-Cas9方法。

另外，其他同源重组方法是技术人员可获得的，如具有精确DNA结合特异性的BuD衍生的核酸酶(BuDN)(Stella,S.等人.Acta Cryst.2014,D70,2042-2052)。单残基至核苷酸代码导引BuDN至SEQ ID NO:33内部的特定DNA靶。

序列特异性核酸内切酶或任何同源重组技术可以针对任一个编码PLBD2的外显子处的靶序列，例如针对CHO-K1基因组NCBI参考序列：NW_003614971.1中以下外显子处的靶序列：核苷酸(nt)175367至175644内部外显子1(SEQ ID NO:47)；nt 168958至169051内部外显子2(SEQ ID NO:48)；nt 166451至166609内部外显子3(SEQ ID NO:49)；nt 164966至165066内部外显子4(SEQ ID NO:50)；nt 164564至164778内部外显子5(SEQ ID NO:51)；nt162682至162779内部外显子6(SEQ ID NO:52)；nt 160036至160196内部外显子7(SEQ IDNO:53)；nt 159733至159828内部外显子8(SEQ ID NO:54)；nt 159491至159562内部外显子9(SEQ ID NO:55)；nt 158726至158878内部外显子10(SEQ ID NO:56)；nt 158082至158244内部外显子11(SEQ ID NO:57)；或核苷酸(nt)157747至157914处的外显子12(SEQ ID NO:58)，其中在基因上描述基因的负链PLBD2外显子1-12并且每个序列的互补序列也随其并入。

基于与SEQ ID NO:33内部独特靶序列相容，从而避免破坏细胞表型的可用工具，选择精确的基因组修饰方法。

目的蛋白

适于在原核或真核细胞中表达的任何目的蛋白可以用于提供的工程化宿主细胞系统中。例如，目的蛋白包括，但不限于抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。目的蛋白可以是由单个亚基组成的简单多肽或包含两个或更多个亚基的复杂多亚基蛋白。目的蛋白可以是生物制药产物、食品添加剂或保存剂、或受纯化品和质量标准品影响的任何蛋白质产物。

宿主细胞和转染

本发明方法中使用的宿主细胞是真核宿主细胞，例如，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人细胞、大鼠细胞和小鼠细胞。在一个优选实施方案中，本发明提供一种细胞，所述细胞包含破坏的SEQ ID NO:33的核酸序列片段。

本发明包括一种工程化的哺乳动物宿主细胞，所述细胞进一步用包含外源性目的基因的表达载体转染，这种基因编码生物制药产物。尽管可以使用任何哺乳动物细胞，但在一个具体实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。

转染的宿主细胞包括已经用表达载体转染的细胞，所述表达载体包含编码蛋白质或多肽的序列。表达的蛋白质将优选地分泌入本发明中所用的培养基，这取决于选择的核酸序列，但可以留在细胞中或沉积在细胞膜中。各种哺乳动物细胞培养物系统可以用来表达重组蛋白。为了特异性选择或扩增方案所开发的其他细胞系也将随本文提供的方法和组合物一起使用，前提是与SEQ ID NO:33具有至少80％同源性的酯酶基因已经根据本发明下调、敲除或否则破坏。体现的细胞系是命名为K1的CHO细胞系。为了实现重组蛋白的大容量生产，在适宜情况下，宿主细胞系可以预适应于生物反应器培养基。

几种转染方案是本领域已知的，并且在Kaufman(1988)Meth.Enzymology 185:537中综述。转染方案选择将取决于宿主细胞类型和GOI的性质，并且可以基于例行实验选择。对这类方案中任一者的基本要求是首先将编码目的蛋白的DNA引入合适的宿主细胞并且随后鉴定并分离已经以相对稳定、可表达方式并入异源DNA的宿主细胞。

一种将异源DNA引入细胞的常用方法是磷酸钙沉淀法，例如，如Wigler等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567,1980)所描述。通过这种方法向宿主细胞引入的DNA往往发生重排，这令这种方法可用于共转染独立的基因。

聚乙烯诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞融合(Schaffner等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2163)是另一种引入异源DNA的有用方法。原生质体融合法往往导致多拷贝质粒DNA整合入哺乳动物宿主细胞基因组，并且这项技术需要选择并扩增与GOI在相同的质粒上的标记。

电穿孔法也可以用来将DNA直接引入细胞质宿主细胞，例如，如Potter等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7161,1988)或Shigekawa等人(BioTechniques 6:742,1988)描述。不同于原生质体融合法，电穿孔法不需要选择标记和GOI位于相同质粒上。

已经描述了可用于将异源DNA引入哺乳动物细胞的其他试剂，如Lipofectin^TM试剂和Lipofectamine^TM试剂(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)。这两种市售试剂均用来形成脂质-核酸复合体(或脂质体)，后者在施加至培养的细胞时促进核酸摄入细胞中。

用于扩增GOI的方法还需要表达目的重组蛋白，并且一般涉及使用选择标记(综述见Kaufman上文)。细胞毒药物抗性是最频繁作为选择标记使用的特征，并且可以是显性性状(例如，可以独立于宿主细胞类型使用)或隐性性状(例如，可用于无论正在选择什么活性都缺陷的特定宿主细胞类型中)的结果。几种可扩增标记适用于本发明的细胞系中并且可以通过本领域熟知的表达载体和技术引入(例如，如Sambrook,Molecular Biology:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1989；第16.9-16.14页中所述)。

先前描述的或本领域已知的用于扩增基因的可用选择标记和其他工具如调节元件也可以纳入用来转染哺乳动物细胞的核酸构建体。为本文中使用所选择的转染方案和所选定的元件将取决于所用宿主细胞的类型。本领域技术人员是知晓旨在适应于本发明特定用途的多种不同方案和宿主细胞，并且可以基于细胞培养系统的要求，选择适宜的系统以表达所需的蛋白质。

本发明的其他特征将在以下描述示例性实施方案的过程中变得显而易见，所述实施方案为说明并且不意在限制本发明而给出。

实施例

提供以下实施例，从而为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本文所述的方法和组合物，并且不意在限制本发明的范围。已经作出努力以确保所用数字(例如量、温度等)方面的准确度，但是应当考虑一些实验性误差和偏差。除非另外指明，否则份数是以重量计的份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压或接近大气压。

实施例1.定向破坏宿主细胞中的酯酶基因

为了利用对CHO细胞源的靶酯酶基因即磷脂酶B样2基因的破坏，使用了要求嵌合RNA(即导引RNA)及其基因组靶之间至少20个核苷酸(nt)同源性的II型CRISPR/Cas系统。设计导引RNA序列以特异性靶向CHO磷脂酶B样2(PLBD2)核酸(SEQ ID NO:33)内部的外显子并且视其为独特(以最大限度减少基因组中的脱靶效应)。合成多种小导引RNA(sgRNA)用于靶向表3中列出的以下PLBD2基因组节段的基因组编辑方法。

表3

sgRNA表达质粒(System Biosciences,CAS940A-1)含有驱动小导引RNA和sgRNA之后的tracrRNA表达的人H1启动子。用质粒转染永生化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述质粒编码Cas9-H1酶，随后是设计成靶向CHO PLBD2的第一外显子的sgRNA序列之一，例如sgRNA1(SEQ ID NO:45)或sgRNA2(SEQ ID NO:46)。预测sgRNA1和sgRNA2分别在SEQ ID NO:33的核苷酸53和59处或附近产生双链断口(DSB)。因此预测DSB在PLBD2起始密码子下游大约23个或29个核苷酸出现。(注意，SEQ ID NO:33的核苷酸1-30编码信号肽)。进行阴性对照转染，其中亲本CHO系用质粒转染，所述质粒在没有接续性sgRNA或编码CHO基因组中不存在的基因序列的sgRNA的情况下编码Cas9-H1酶。

表4

在转染后，将细胞在无血清培养基中培养6天，并且随后使用流式细胞术，克隆单一细胞。在培养12天后，分离具有所需生长特性的稳定克隆，在无血清培养基中扩充，收集细胞沉淀物供基因分型并将克隆细胞系入库。

将基因组DNA(gDNA)和信使RNA(mRNA)与克隆细胞沉淀物分离并通过定量PCR(qPCR)分析。qPCR引物和探针设计成与用于双链断口导引事件的sgRNA序列重叠，旨在检测基因组DNA的破坏及其转录。使用相对qPCR方法，确定候选克隆中PLBD2基因或转录物的相对丰度，其中使用衍生自阴性对照转染的克隆作为校准物。参见图1。qPCR引物和探针设计成检测PLBD2外显子1中sgRNA1或sgRNA2位置内的序列。从克隆1分离gDNA和RNA均不支持sgRNA1或sgRNA2区域内PLBD2外显子1的qPCR扩增，但是检测到持家基因GAPDH的扩增。基于该数据，鉴定克隆1为其中破坏外显子1的PLBD2的两个基因组等位体的PLBD2潜在敲除。应当指出使用与sgRNA2重叠的引物，克隆8中未检出基因组DNA和mRNA的扩增，然而，sgRNA1引物/探针检测到高于对照值的基因组DNA。进一步分析克隆8和其他克隆，旨在理解位点定向核酸酶方法的表现。

通过PCR分析从gDNA或RNA衍生的模板分析克隆1中完整PLBD2外显子1的大小并且与扩增自野生型CHO细胞的大小比较。使用Caliper GX仪测定扩增子片段的长度(图2)。来自克隆1的gDNA扩增和mRNA扩增均产生单一PCR片段，其短于扩增自野生型对照细胞的相应片段。

对扩增产物测序，导致确定克隆1为PLBD2敲除，其中发现PLBD2基因具有导致移码的11bp缺失。

即便通过与sgRNA1序列重叠的qPCR引物鉴定基因组DNA片段的事实，但发明人还出乎意料地确定克隆8为PLBD2敲除。鉴定无可检测磷脂酶活性或无可检测磷脂酶蛋白的克隆在技术上有挑战性且费时。位点定向核酸酶技术可以提供易用性，然而，有必要细致筛选和消除假阳性，并且就具有两个破坏的等位基因的单个克隆的身份而言，仍可以存在不可预测的结果。令人惊讶地，确定仅1％使用上述技术筛选的克隆为有活力的PLBD2敲除克隆。参见表5。

表5

实施例2.在候选克隆细胞系中引入并表达单克隆抗体(mAb1)

在促进重组介导的盒交换(RMCE)入EESYR基因座的Cre重组酶存在下，将克隆1和野生型对照宿主细胞系用编码mAb1(全人IgG)轻链和重链的质粒转染(美国专利号7771997B2，2010年8月10日授予)。在含有400ug/mL潮霉素的无血清培养基中选择转染的培养物11天。通过流式细胞术分离发生RMCE的细胞。PLBD2敲除克隆1和野生型宿主细胞系产生等同的观测重组群体(数据未显示)。克隆1衍生的表达mAb1的同基因细胞系命名为RS001，并且源自PLBD2野生型宿主的表达mAb1的细胞系命名为RS0WT。

按标准12天工艺从RS001或RS0WT实施mAb1的补料分批生产。在第0、第3、第5、第7、第10和第13天采样用于每种生产培养的条件培养基，并且对结合蛋白A的级分定量(图3)。来自RS001培养物的mAb1的蛋白质滴度与产生自RS0WT的蛋白质滴度相当，并且出乎意料地，就两种培养物而言，不存在可观察的细胞行为差异。不能预测破坏CHO宿主细胞中PLBD2或任何内源性基因是否对外源重组蛋白、尤其治疗用单克隆抗体的生产未造成可观察的有害影响。

实施例3.未修饰的CHO细胞中检测酯酶活性

测量聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯-80的降解以检测PLBD2突变体的上清液中的推定性酯酶活性。对源自CHO细胞的未纯化蛋白质上清液和接受依次纯化步骤时在每个步骤或系列步骤取得的上清液检验聚山梨醇酯的稳定性。报告的完整聚山梨醇酯的百分数与杂质性酯酶活性的量成反比。在测量聚山梨醇酯降解的测定法中检验源自CHO细胞的未纯化蛋白质上清液和接受依次纯化步骤时每个步骤或系列步骤的上清液。报告的完整聚山梨醇酯的相对水平与杂质性酯酶活性的水平成反比。

检查聚山梨醇酯20的降解以确定造成单克隆抗体制剂中聚山梨醇酯20降解的致病因素。通过10kDa过滤，将缓冲的抗体(150mg/mL)分成两种级分：蛋白质级分和缓冲剂级分。将这两种级分以及缓冲的完整抗体用0.2％(w/v)超级精制聚山梨醇酯20(PS20-B)内标并且在45℃应激长达14天。研究显示(表6，A部分，第1-2栏)，蛋白质级分，而非缓冲剂级分，影响失水山梨糖醇月桂酸酯(即，聚山梨醇酯20的主要组分)的降解，并且聚山梨醇酯20的降解与抗体的浓度相关(表6，第B部分，第3-4列)。

在未修饰的CHO细胞中产生单克隆抗体并通过不同方法纯化，并且如表7中那样，依据完整聚山梨醇酯20的百分数度量酯酶活性。

表7

工艺编号	纯化步骤	完整聚山梨醇酯20百分数
			1	蛋白A亲和色谱(PA)	54％
2	PA>阳离子交换(CEX)	25％
			3	PA>CEX>阴离子交换(AEX)	86％
4	PA>CEX>疏水相互作用(HIC)	90％
			5	PA>AEX	83％
6	PA>AEX>HIC	92％

疏水相互作用色谱(HIC)最高效地移除残余PLBD2。在一些情况下，可以实现减少纯化步骤的数目和降低成本。因此，构思了磷脂酶表达水平减少的修饰的CHO细胞减少纯化步骤，并且例如可以消除HIC纯化的需求。

实施例4.与未修饰的CHO细胞相比从修饰的CHO细胞纯化的mAb1中的酯酶蛋白丰度和活性检测。

从RS001和RS0WT产生mAb1并且使用单独的PA或者PA和AEX色谱从条件培养基纯化之。使用胰蛋白酶消化物质谱法，分析来自RS001和RS0WT的PA纯化的mAB1的脂肪酶丰度。将RS001和RS0WT mAb1的胰蛋白酶消化物注入偶联于三重四极杆质谱仪的反相液相色谱柱，所述质谱仪设置成监测从SEQ ID NO:32片段化的特定产物离子。同时，通过将不同量的重组PLBD2内标入无内源PLBD2的mAb1，配制一系列PLBD2标准品。实验反应和对照反应的信号用来对源自RS001和RS0WT的mAb1中PLBD2的丰度定量(图4)。用单独的PA纯化时在克隆8产生的mAb1的纯化样品中未观察到可检测量的PLBD2蛋白(数据未显示)。

本发明可以体现在其他的具体实施方案中。

序列表

<110> 瑞泽恩制药公司

<120> 宿主细胞蛋白质修饰

<130> 10143WO01

<140> 随附递交的PCT

<141> 2016-02-26

<150> US 62/126,213

<151> 2015-02-27

<150> US 62/298,869

<151> 2016-02-23

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 1

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1 5 10 15

Arg

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<223> Synthetic

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Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu

1 5 10 15

Ala Cys Ile Pro Lys Pro

20

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1 5 10 15

Lys

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1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr

20

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1 5 10 15

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Pro Lys Pro Asn Ala

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Arg Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro

1 5 10 15

Pro Phe Gln

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1 5 10 15

Ala Asp Lys Thr Glu Asp

20

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Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg

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<211> 16

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Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro

1 5 10 15

Phe Gln

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1 5

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Ile Ile Lys Lys Tyr Gln Leu Gln Phe Arg

1 5 10

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<211> 19

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Ala Gln Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asn Ser

1 5 10 15

Met Val Arg

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<211> 22

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Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu

1 5 10 15

Ala Cys Ile Pro Lys Pro

20

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<211> 13

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Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg

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Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu

1 5 10 15

Arg

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<211> 21

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<220>

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Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile

1 5 10 15

Pro Lys Pro Asn Ala

20

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Arg Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro

1 5 10 15

Pro Phe Gln

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Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr Phe Ser Pro Ile

1 5 10 15

Ser Val Pro

<210> 29

<211> 18

<212> PRT

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<220>

<223> Synthetic

<400> 29

Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro

1 5 10 15

Phe Gln

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 30

Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg

1 5 10

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 31

Gln Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg

1 5

<210> 32

<211> 585

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 32

Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Val Arg Ala

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Val Leu Leu Asn

20 25 30

Cys Pro Ala Gly Ala Leu Pro Thr Gln Gly Pro Gly Arg Arg Arg Gln

35 40 45

Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Ile His Pro Tyr Ala Val

65 70 75 80

Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr

85 90 95

Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr

100 105 110

Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met

115 120 125

His Trp Met Asn Thr Met Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu

130 135 140

Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ile Asn Leu Glu

145 150 155 160

Trp Met Gln Arg Glu Met Glu Leu Ser Gln Asp Ser Pro Tyr Trp His

165 170 175

Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr

180 185 190

Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Pro Leu

195 200 205

Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Gln

210 215 220

Ala Leu Asn Lys Thr Ser Thr Lys Leu Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys

225 230 235 240

Ser Ala Ile Ile Lys Leu Leu Pro Gly Ala Arg Asp Leu Leu Val Ala

245 250 255

His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys

260 265 270

Tyr Gln Leu Gln Phe Arg Gln Gly Pro Gln Glu Ala Tyr Pro Leu Ile

275 280 285

Ala Gly Asn Asn Leu Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser

290 295 300

Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr

305 310 315 320

Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln

325 330 335

Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala

340 345 350

Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys Gln Phe Asn Ser Gly

355 360 365

Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro

370 375 380

Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile

385 390 395 400

Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Glu Asp Leu Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Phe Phe Glu Ile Val Phe Asn

420 425 430

Ala Ser Gly Leu Gln Asp Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser

435 440 445

Tyr Thr Lys Asn Pro Arg Ala Gln Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu

450 455 460

Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe

465 470 475 480

Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile Pro Lys Pro Asn

485 490 495

Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly

500 505 510

Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Tyr Gln Arg Pro His Gly Gly Ile Asp

515 520 525

Val Lys Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys Arg Met Ser Met Leu Ala

530 535 540

Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Leu

545 550 555 560

Ser Pro Phe Arg Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr

565 570 575

Phe Ser Pro Ile Ser Val Pro Trp Asp

580 585

<210> 33

<211> 2218

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 33

gacagtcacg tggcccgact gaggcacgcg atggcggccc ccatggaccg gagccccggc 60

ggccgggcgg tccgggcgct gaggctagcg ctggcgctgg cctcgctgac tgaggtgttg 120

ctgaattgcc cggcgggcgc cctccccacg caggggcccg gcaggcggcg ccaaaacctc 180

gacccgccgg tctcccgcgt ccgctcggtg ctgctggacg ccgcgtcggg tcagctgcgc 240

ctggtggacg gcatccatcc ctacgcggtg gcctgggcca acctcaccaa cgccattcgc 300

gagaccgggt gggcctatct ggacttgggt acaaatggaa gctacaatga cagcctgcag 360

gcctatgcag ctggtgtggt ggaggcttct gtgtctgagg agctcatcta catgcactgg 420

atgaacacaa tggtcaacta ctgtggcccc ttcgagtatg aagttggcta ctgtgagaag 480

ctcaagagct tcctggagat caacctggag tggatgcaga gggagatgga actcagccag 540

gactctccat attggcacca ggtgcggctg accctcctgc agctgaaagg cctagaggac 600

agctacgaag gccgtttgac cttcccaact gggaggttca ccattaaacc cttggggttc 660

ctcctgctgc agattgccgg agacctggaa gacctagagc aagccctgaa taagaccagc 720

accaagcttt ccctgggctc cggttcctgc tccgctatca tcaagttgct gccaggcgca 780

cgtgacctcc tggtggcaca caacacatgg aactcctacc agaacatgct acgcatcatc 840

aagaagtacc agctgcagtt ccggcagggg cctcaagagg cgtaccccct gattgctggc 900

aacaatttgg tcttttcgtc ttacccgggc accatcttct ctggcgatga cttctacatc 960

ctgggcagtg ggctggtcac cctggagacc accattggca acaagaatcc agccctgtgg 1020

aagtacgtgc agccccaggg ctgtgtgctg gagtggattc gaaacatcgt ggccaaccgc 1080

ctggccttgg acggggccac ctgggcagac atcttcaagc agttcaatag tggcacgtat 1140

aataaccaat ggatgattgt ggactacaag gcattcatcc ccaacgggcc cagccctgga 1200

agccgagtgc ttaccatcct agaacagatc ccgggcatgg tggtggtggc cgacaagact 1260

gaagatctct acaagacaac ctactgggct agctacaaca tcccgttctt tgagattgtg 1320

ttcaacgcca gtgggctgca ggacttggtg gcccaatatg gagattggtt ttcctacact 1380

aagaaccctc gagctcagat cttccagagg gaccagtcgc tggtggagga catgaattcc 1440

atggtccggc tcataaggta caacaacttc cttcacgacc ctctgtcact gtgtgaagcc 1500

tgtatcccga agcccaatgc agagaatgcc atctctgccc gctctgacct caatcctgcc 1560

aatggctcct acccatttca agccctgtac cagcgtcccc acggtggcat cgatgtgaag 1620

gtgaccagct tttcactggc caagcgcatg agcatgctgg cagccagtgg cccaacgtgg 1680

gatcagttgc ccccattcca gtggagttta tcgccgttcc gcagcatgct tcacatgggc 1740

cagcctgatc tctggacatt ctcacccatc agtgtcccat gggactgaga ctttgcctcc 1800

acccagttgc cttcattctg tgtggccagt agggtcacac acctgctacc caccctttgg 1860

ggctctgtcc tcactggact ctggtctgtg tggtctcctc tgcagggaca caaacccagt 1920

aggctcagag ctgactccat ccccaagtct tctgccctcc atcactcctt ctctctgccc 1980

ctgtcaccag tgggctgggg cttgtgcttg gctgtgggcc tggtgggatt ctgggcgcca 2040

ttttcctagt gctggtccct cagtgtgtgt gtgggggaca ttgatagggc ttatcattgc 2100

tgtcactact agcctgcggg cccatctcct cagggagcag tccatgtccc cttctctggg 2160

cagctttcct gaggatagaa gcttgaaaac aaaaaaccaa agtttctggc tgctttta 2218

<210> 34

<211> 594

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

Met Ala Ala Pro Val Asp Gly Ser Ser Gly Gly Trp Ala Ala Arg Ala

1 5 10 15

Leu Arg Arg Ala Leu Ala Leu Thr Ser Leu Thr Thr Leu Ala Leu Leu

20 25 30

Ala Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Ser Gly Pro Ala Gly Ala Leu Pro

35 40 45

Thr Leu Gly Pro Gly Trp Gln Arg Gln Asn Pro Asp Pro Pro Val Ser

50 55 60

Arg Thr Arg Ser Leu Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu

65 70 75 80

Glu Asp Gly Phe His Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn

85 90 95

Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr Leu Asp Leu Ser Thr Asn Gly

100 105 110

Arg Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala

115 120 125

Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met His Trp Met Asn Thr Val Val

130 135 140

Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu

145 150 155 160

Lys Asn Phe Leu Glu Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Arg Glu Met Glu

165 170 175

Leu Asn Pro Asp Ser Pro Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu

180 185 190

Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro

195 200 205

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile

210 215 220

Ser Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Pro Ala Leu Asn Lys Thr Asn Thr

225 230 235 240

Lys Pro Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu

245 250 255

Pro Gly Gly His Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr

260 265 270

Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys Tyr Arg Leu Gln Phe Arg Glu

275 280 285

Gly Pro Gln Glu Glu Tyr Pro Leu Val Ala Gly Asn Asn Leu Val Phe

290 295 300

Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu

305 310 315 320

Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro

325 330 335

Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile

340 345 350

Arg Asn Val Val Ala Asn Arg Leu Ala Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala

355 360 365

Asp Val Phe Lys Arg Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met

370 375 380

Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Leu Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser

385 390 395 400

Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala

405 410 415

Asp Lys Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn

420 425 430

Ile Pro Tyr Phe Glu Thr Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu

435 440 445

Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Lys Asn Pro Arg Ala

450 455 460

Lys Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asp Ala Met

465 470 475 480

Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu

485 490 495

Cys Glu Ala Cys Asn Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala

500 505 510

Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu

515 520 525

His Gln Arg Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Phe Thr

530 535 540

Leu Ala Lys Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp

545 550 555 560

Gln Cys Pro Pro Phe Gln Trp Ser Lys Ser Pro Phe His Ser Met Leu

565 570 575

His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Met Phe Ser Pro Ile Arg Val Pro

580 585 590

Trp Asp

<210> 35

<211> 585

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 35

Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Thr His Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala

1 5 10 15

Leu Arg Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ser

20 25 30

Gly Leu Ala Gly Ala Leu Pro Thr Leu Gly Pro Gly Trp Arg Arg Gln

35 40 45

Asn Pro Glu Pro Pro Ala Ser Arg Thr Arg Ser Leu Leu Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Glu Tyr Gly Phe His Pro Asp Ala Val

65 70 75 80

Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr

85 90 95

Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr

100 105 110

Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met

115 120 125

His Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu

130 135 140

Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ala Asn Leu Glu

145 150 155 160

Trp Met Gln Arg Glu Met Glu Leu Ser Pro Asp Ser Pro Tyr Trp His

165 170 175

Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr

180 185 190

Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg Phe Asn Ile Lys Pro Leu

195 200 205

Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ser Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Pro

210 215 220

Ala Leu Asn Lys Thr Asn Thr Lys Pro Ser Val Gly Ser Gly Ser Cys

225 230 235 240

Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Ser His Asp Leu Leu Val Ala

245 250 255

His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys

260 265 270

Tyr Arg Leu Gln Phe Arg Glu Gly Pro Gln Glu Glu Tyr Pro Leu Ile

275 280 285

Ala Gly Asn Asn Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser

290 295 300

Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr

305 310 315 320

Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln

325 330 335

Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala

340 345 350

Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Val Phe Arg Arg Phe Asn Ser Gly

355 360 365

Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro

370 375 380

Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile

385 390 395 400

Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Tyr Phe Glu Ser Val Phe Asn

420 425 430

Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser

435 440 445

Tyr Thr Arg Asn Pro Arg Ala Lys Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu

450 455 460

Val Glu Asp Val Asp Thr Met Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe

465 470 475 480

Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ser Pro Lys Pro Asn

485 490 495

Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly

500 505 510

Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg Ala His Gly Gly Ile Asp

515 520 525

Val Lys Val Thr Ser Val Ala Leu Ala Lys Tyr Met Ser Met Leu Ala

530 535 540

Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Lys

545 550 555 560

Ser Pro Phe His Asn Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Met

565 570 575

Phe Ser Pro Val Lys Val Pro Trp Asp

580 585

<210> 36

<211> 589

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Met Val Gly Gln Met Tyr Cys Tyr Pro Gly Ser His Leu Ala Arg Ala

1 5 10 15

Leu Thr Arg Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Val Gly

20 25 30

Pro Phe Leu Ser Gly Leu Ala Gly Ala Ile Pro Ala Pro Gly Gly Arg

35 40 45

Trp Ala Arg Asp Gly Gln Val Pro Pro Ala Ser Arg Ser Arg Ser Val

50 55 60

Leu Leu Asp Val Ser Ala Gly Gln Leu Leu Met Val Asp Gly Arg His

65 70 75 80

Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr

85 90 95

Gly Trp Ala Phe Leu Glu Leu Gly Thr Ser Gly Gln Tyr Asn Asp Ser

100 105 110

Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ala Val Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Ile Tyr Met His Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro

130 135 140

Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Glu

145 150 155 160

Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Glu Glu Met Glu Ser Asn Pro Asp Ser

165 170 175

Pro Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg Val Ser Phe Pro Ala Gly Lys Phe Thr

195 200 205

Ile Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gly Asp Leu Glu

210 215 220

Asp Leu Glu Leu Ala Leu Asn Lys Thr Lys Ile Lys Pro Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Gln Ser Asp

245 250 255

Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Asn Tyr Gln His Met Leu Arg

260 265 270

Val Ile Lys Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Arg Glu Gly Pro Trp Gly Asp

275 280 285

Tyr Pro Leu Val Pro Gly Asn Lys Leu Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly

290 295 300

Thr Ile Phe Ser Cys Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr

325 330 335

Val Arg Pro Arg Gly Cys Val Leu Glu Trp Val Arg Asn Ile Val Ala

340 345 350

Asn Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys Arg

355 360 365

Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys

370 375 380

Ala Phe Ile Pro Gly Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile

385 390 395 400

Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Ser Glu

405 410 415

Leu Tyr Gln Lys Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Ser Phe Glu

420 425 430

Thr Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln Tyr Gly

435 440 445

Asp Trp Phe Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gln Ile Phe Arg Arg

450 455 460

Asn Gln Ser Leu Val Gln Asp Met Asp Ser Met Val Arg Leu Met Arg

465 470 475 480

Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Lys Ala Cys Asn

485 490 495

Pro Gln Pro Asn Gly Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn

500 505 510

Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg Ser His

515 520 525

Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Met Ser Leu Ala Arg Ile Leu

530 535 540

Ser Leu Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Val Pro Pro Phe

545 550 555 560

Gln Trp Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gly Leu Leu His Met Gly Gln Pro

565 570 575

Asp Leu Trp Lys Phe Ala Pro Val Lys Val Ser Trp Asp

580 585

<210> 37

<211> 589

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 37

Met Val Ala Pro Met Tyr Gly Ser Pro Gly Gly Arg Leu Ala Arg Ala

1 5 10 15

Val Thr Arg Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Val Gly

20 25 30

Leu Phe Leu Ser Gly Leu Thr Gly Ala Ile Pro Thr Pro Arg Gly Gln

35 40 45

Arg Gly Arg Gly Met Pro Val Pro Pro Ala Ser Arg Cys Arg Ser Leu

50 55 60

Leu Leu Asp Pro Glu Thr Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Arg His

65 70 75 80

Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr

85 90 95

Gly Trp Ala Phe Leu Glu Leu His Thr Asn Gly Arg Phe Asn Asp Ser

100 105 110

Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ala Val Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Ile Tyr Met Tyr Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro

130 135 140

Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Arg Leu Lys Asn Phe Leu Glu

145 150 155 160

Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Lys Glu Met Glu Leu Asn Asn Gly Ser

165 170 175

Ala Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Ser Val Ala Phe Pro Thr Gly Lys Phe Thr

195 200 205

Val Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ser Gly Asp Leu Glu

210 215 220

Asp Leu Glu Val Ala Leu Asn Lys Thr Lys Thr Asn His Ala Met Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Gln Arg Asp

245 250 255

Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp His Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Arg

260 265 270

Ile Met Lys Lys Tyr Trp Phe Gln Phe Arg Glu Gly Pro Gln Ala Glu

275 280 285

Ser Thr Arg Ala Pro Gly Asn Lys Val Ile Phe Ser Ser Tyr Pro Gly

290 295 300

Thr Ile Phe Ser Cys Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr

325 330 335

Val Gln Pro Thr Gly Cys Val Leu Glu Trp Met Arg Asn Val Val Ala

340 345 350

Asn Arg Leu Ala Leu Asp Gly Asp Ser Trp Ala Asp Ile Phe Lys Arg

355 360 365

Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys

370 375 380

Ala Phe Val Pro Gly Gly Pro Ser Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Val

385 390 395 400

Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Arg Thr Ser Glu

405 410 415

Leu Tyr Gln Lys Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Ser Phe Glu

420 425 430

Ser Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Pro Ala Leu Val Ala Arg Tyr Gly

435 440 445

Pro Trp Phe Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gln Ile Phe Arg Arg

450 455 460

Asn His Ser Leu Val His Asp Leu Asp Ser Met Met Arg Leu Met Arg

465 470 475 480

Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Lys Ala Cys Thr

485 490 495

Pro Lys Pro Asn Gly Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn

500 505 510

Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu His Gln Arg Ser His

515 520 525

Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Thr Ala Leu Ala Lys Ala Leu

530 535 540

Arg Leu Leu Ala Val Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe

545 550 555 560

Gln Trp Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gly Met Leu His Met Gly Gln Pro

565 570 575

Asp Leu Arg Lys Phe Ser Pro Ile Glu Val Ser Trp Asp

580 585

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 38

ctgaggtgtt gctgaattgc ccggcgggcg 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 39

gacgcggcgt ccagcagcac cgagcggacg 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 40

acccgccggt ctcccgcgtc cgctcggtgc 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 41

tggtggacgg catccatccc tacgcggtgg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 42

ggcggccccc atggaccgga gccccggcgg 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 43

cccatggacc ggagccccgg cggccgggcg 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 44

gacagtcacg tggcccgact gaggcacgcg 30

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 45

gcccccatgg accggagccc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 46

tggaccggag ccccggcggc 20

<210> 47

<211> 278

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 47

ccggtctcgc gaatggcgtt ggtgaggttg gcccaggcca ccgcgtaggg atggatgccg 60

tccaccaggc gcagctgacc cgacgcggcg tccagcagca ccgagcggac gcgggagacc 120

ggcgggtcga ggttttggcg ccgcctgccg ggcccctgcg tggggagggc gcccgccggg 180

caattcagca acacctcagt cagcgaggcc agcgccagcg ctagcctcag cgcccggacc 240

gcccggccgc cggggctccg gtccatgggg gccgccat 278

<210> 48

<211> 94

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 48

ctcctcagac acagaagcct ccaccacacc agctgcatag gcctgcaggc tgtcattgta 60

gcttccattt gtacccaagt ccagataggc ccac 94

<210> 49

<211> 159

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 49

ctggtgccaa tatggagagt cctggctgag ttccatctcc ctctgcatcc actccaggtt 60

gatctccagg aagctcttga gcttctcaca gtagccaact tcatactcga aggggccaca 120

gtagttgacc attgtgttca tccagtgcat gtagatgag 159

<210> 50

<211> 101

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 50

aggaacccca agggtttaat ggtgaacctc ccagttggga aggtcaaacg gccttcgtag 60

ctgtcctcta ggcctttcag ctgcaggagg gtcagccgca c 101

<210> 51

<211> 215

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 51

cttgaggccc ctgccggaac tgcagctggt acttcttgat gatgcgtagc atgttctggt 60

aggagttcca tgtgttgtgt gccaccagga ggtcacgtgc gcctggcagc aacttgatga 120

tagcggagca ggaaccggag cccagggaaa gcttggtgct ggtcttattc agggcttgct 180

ctaggtcttc caggtctccg gcaatctgca gcagg 215

<210> 52

<211> 98

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 52

cagcccactg cccaggatgt agaagtcatc gccagagaag atggtgcccg ggtaagacga 60

aaagaccaaa ttgttgccag caatcagggg gtacgcct 98

<210> 53

<211> 161

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 53

gtgccactat tgaactgctt gaagatgtct gcccaggtgg ccccgtccaa ggccaggcgg 60

ttggccacga tgtttcgaat ccactccagc acacagccct ggggctgcac gtacttccac 120

agggctggat tcttgttgcc aatggtggtc tccagggtga c 161

<210> 54

<211> 96

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 54

gggatctgtt ctaggatggt aagcactcgg cttccagggc tgggcccgtt ggggatgaat 60

gccttgtagt ccacaatcat ccattggtta ttatac 96

<210> 55

<211> 72

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 55

gggatgttgt agctagccca gtaggttgtc ttgtagagat cttcagtctt gtcggccacc 60

accaccatgc cc 72

<210> 56

<211> 153

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 56

cttatgagcc ggaccatgga attcatgtcc tccaccagcg actggtccct ctggaagatc 60

tgagctcgag ggttcttagt gtaggaaaac caatctccat attgggccac caagtcctgc 120

agcccactgg cgttgaacac aatctcaaag aac 153

<210> 57

<211> 163

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 57

cttcacatcg atgccaccgt ggggacgctg gtacagggct tgaaatgggt aggagccatt 60

ggcaggattg aggtcagagc gggcagagat ggcattctct gcattgggct tcgggataca 120

ggcttcacac agtgacagag ggtcgtgaag gaagttgttg tac 163

<210> 58

<211> 168

<212> DNA

<213> Cricetulus griseus

<400> 58

tcagtcccat gggacactga tgggtgagaa tgtccagaga tcaggctggc ccatgtgaag 60

catgctgcgg aacggcgata aactccactg gaatgggggc aactgatccc acgttgggcc 120

actggctgcc agcatgctca tgcgcttggc cagtgaaaag ctggtcac 168

<210> 59

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 59

gggcuccggu ccaugggggc 20

<210> 60

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 60

gccgccgggg cuccggucca 20

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.重组宿主细胞，其包含在编码磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白的多核苷酸的编码性序列中的修饰，其中相对于缺少所述修饰的细胞中PLBD2蛋白的表达水平，所述修饰减少PLBD2蛋白的表达水平。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中编码磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白的多核苷酸的编码性序列的全部等位基因均包含所述修饰。

3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述细胞不表达可检测的磷脂酶B样2蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述修饰包含在编码PLBD2蛋白的多核苷酸的编码性序列的外显子1中的核苷酸插入或缺失。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述PLBD2蛋白包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述PLBD2蛋白包含选自SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的宿主细胞，其中所述修饰包含在SEQ ID NO:47中的核苷酸插入或缺失。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其还包含编码外源目的蛋白的多核苷酸。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述外源目的蛋白选自抗体重链、抗体轻链、抗原结合片段、抗原结合蛋白和Fc-融合蛋白。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的宿主细胞，其中细胞产生结合蛋白A的级分，所述级分没有可检测的酯酶活性。

11.产生重组蛋白的方法，所述方法包括：(a)从宿主细胞获得包含重组蛋白和多种宿主细胞蛋白的样品，所述宿主细胞经修饰以产生与未修饰的细胞相比水平减少的酯酶；和(b)使样品经历至少一个纯化步骤以移除至少一种宿主细胞蛋白。

12.根据权利要求11所述的方法，其中多种宿主细胞蛋白不包含可检测量的磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述宿主细胞包含在编码磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白的多核苷酸的编码序列中的修饰。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述纯化步骤选自蛋白A亲和色谱(PA)、阳离子交换(CEX)色谱和阴离子交换(AEX)色谱。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述纯化步骤不包括疏水相互作用色谱。

16.用于减少蛋白质制剂中酯酶活性的方法，所述方法包括步骤：(a)修饰宿主细胞以减少或消除磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白表达，(b)用编码目的蛋白的多核苷酸转染所述宿主细胞，(c)从所述宿主细胞提取包含目的蛋白的蛋白质级分，(c)使所述蛋白质级分与选自蛋白A亲和(PA)介质、阳离子交换(CEX)介质和阴离子交换(AEX)介质的色谱介质接触，(d)从培养基收集目的蛋白，以及(e)将目的蛋白与脂肪酸酯以及任选地缓冲剂和热稳定剂合并。

17.根据权利要求16所述的方法，其中修饰宿主细胞以减少或消除磷脂酶B样2(PLBD2)蛋白表达的步骤包括在编码PLBD2蛋白的多核苷酸的外显子1中插入或缺失至少一个核苷酸。

18.根据权利要求17所述的方法，其中编码PLBD2蛋白的多核苷酸包含与SEQ ID NO:32至少80％相同的核酸序列。

19.重组宿主细胞，其包含改变的PLBD2基因。

20.根据权利要求19所述的重组宿主细胞，其中通过破坏编码区改变PLBD2基因。

21.根据权利要求18或19所述的重组宿主细胞，其中PLBD2基因改变包括双等位基因改变。

22.重组根据权利要求19-21中任一项所述的宿主细胞，其中PLBD2基因改变包括缺失PLBD2基因的1个或多个碱基对、2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对、或20个或更多个碱基对。

Claims

1.重组宿主细胞，其中细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中磷脂酶表达水平减少磷脂酶表达水平。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中修饰的细胞不表达任何可检测的磷脂酶。

3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中细胞还包含外源目的蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞包含改变的磷脂酶基因并且表达的磷脂酶不能够与目的蛋白结合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞包含改变的磷脂酶基因并且表达的磷脂酶没有可检测的酯酶活性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中细胞产生结合蛋白A的级分，已经对所述级分消除磷脂酶蛋白或其变体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的宿主细胞，其中细胞产生结合蛋白A的级分，所述级分没有可检测的磷脂酶蛋白或其变体。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其中细胞产生结合蛋白A的级分，所述级分没有可检测的酯酶活性。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的宿主细胞，其中细胞能够产生纯化之前基本上不含结合型磷脂酶的外源表达的目的蛋白。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的宿主细胞，其中目的蛋白是多亚基蛋白。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的宿主细胞，其中目的蛋白选自抗体重链、抗体轻链、抗原结合片段和Fc-融合蛋白。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的宿主细胞，其中磷脂酶包含选自表1中氨基酸序列的氨基酸序列。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的宿主细胞，其中磷脂酶包含磷脂酶B样蛋白(PLBD2)或其变体。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的宿主细胞，其中细胞包含PLBD2蛋白的片段。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的宿主细胞，其中细胞包含无功能的PLBD2蛋白。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的宿主细胞，其中细胞包含不能够展示酯酶活性的PLBD2蛋白。

17.产生目的重组蛋白的方法，包括在其中磷脂酶表达水平相对于未修饰的细胞中磷脂酶表达水平减少的修饰的宿主细胞中表达目的重组蛋白。

18.表达系统，包含根据此前任何权利要求所述的重组宿主细胞，所述表达系统还包含修饰的或无功能的酯酶。

19.用于制造稳定蛋白质制剂的方法，包括步骤：(a)从根据前述权利要求任一项所述的修饰的宿主细胞提取蛋白质级分，(b)使包含目的蛋白的蛋白质级分与选自蛋白A亲和(PA)色谱、阳离子交换(CEX)色谱和阴离子交换色谱(AEX)色谱的柱接触，(c)从培养基收集目的蛋白，其中减少的酯酶活性水平与步骤(c)处收集的具有减少的磷脂酶表达水平的蛋白质级分相关。

20.用于减少蛋白质制剂中酯酶活性的方法，包括步骤：(a)修饰宿主细胞以减少或消除酯酶表达，(b)用目的蛋白转染宿主细胞，(c)从修饰的宿主细胞提取蛋白质级分，(c)使包含目的蛋白的蛋白质级分与选自蛋白A亲和(PA)色谱、阳离子交换(CEX)色谱和阴离子交换(AEX)色谱的柱接触，(d)从培养基收集目的蛋白，并且(e)将目的蛋白与脂肪酸酯和任选地缓冲剂和热稳定剂合并，因此提供基本上不含可检测酯酶活性的蛋白质制剂。

21.重组宿主细胞，包含改变的PLBD2基因。

22.根据权利要求21所述的重组宿主细胞，其中通过破坏编码区改变PLBD2基因。

23.根据权利要求21-22中任一项所述的重组宿主细胞，其中PLBD2基因改变包括双等位基因改变。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的重组宿主细胞，其中PLBD2基因改变包括缺失1个或多个碱基对、2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对、或20个或更多个碱基对。