KR20170120126A

KR20170120126A - 숙주 세포 단백질 변형

Info

Publication number: KR20170120126A
Application number: KR1020177025651A
Authority: KR
Inventors: 다리야 부라코브; 마이클 고렌; 강 첸
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-10-30
Also published as: EA201791918A1; CA2976669A1; MX2017011012A; HUE045862T2; JP6751402B2; MY180896A; EP3262168A1; WO2016138467A1; TW201702380A; SG11201706335TA; HK1248272A1; DK3262168T3; AU2016224988A1; EP3262168B1; BR112017018149A2; IL253863A0; JP2018506295A; CN107406831A; ES2751670T3; US20160251411A1

Abstract

진핵 세포에서의 재조합 단백질의 발현 및 그것들의 용이한 분리를 허용하는 엔지니어링된 세포주 및 발현 시스템에 대한 조성물 및 방법이 제공된다. 결합된 숙주 세포 단백질이 본질적으로 없는 관심의 단백질을 발현할 수 있는 세포 발현 시스템이 또한 제공된다.

Description

숙주 세포 단백질 변형

서열 목록

본 출원은 2016년 2월 26일에 생성된 파일명 10143US01_ST25.txt (41,768 바이트)의 컴퓨터 판독 형태의 서열 목록을 포함하고, 그것은 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

발명은 진핵 세포에서 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위한 세포 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 발명은 진핵 세포, 특히 차이니즈 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스 (Cricetulus griseus)) 세포주에서, 그런 원치 않는 "점착성" 숙주 세포 단백질의 생성을 제어하기 위하여 내인성 단백질의 하향조절 유전자 발현을 사용하는, 단백질의 발현을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 발명은 관심의 외인성 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 및 변형 세포들을 포함한다. 발명의 방법은 변형 세포에 의해 발현된 재조합 단백질의 증대되고 안정한 발현을 용이하게 하기 위하여 차이니즈 햄스터 세포 게놈의 숙주 세포 단백질을 효과적으로 표적화한다.

세포 발현 시스템은 치료 용도에 대해 생물약제 제품의 제조를 위한 믿을만하고 효과적인 공급원을 제공한다. 그런 시스템에서 진핵 또는 원핵 세포에 의해 생성된 임의의 재조합 단백질의 정제는 예를 들면 최종 제약 등급 생성물로부터 제거될 필요가 있는 숙주 세포 단백질 및 핵산 분자의 과잉으로 인해 도전이 진행 중이다.

불순한 부산물로서 보여지는 숙주 세포 단백질의 특정 동역학은 바이오프로세싱 (bioprocessing)의 다양한 단계들 동안 조사되어 왔다. 진보된 액체 크로마토그래피/질량 분석 (LC/MS)이 세포 배양에 의해 생성된 펩티바디 (peptibody)를 수반하는 대장균 HCP를 검출하고 모니터링하기 위해 실시되었다 (Schenauer, MR., et al, 2013, Biotechnol Prog 29(4):951-7). HCR 프로파일에 의해 얻어진 정보는 임의의 하나 이상의 HCP(들)에 의해 제기된 안전성 위험을 평가하기 위해 방법의 개발을 모니터링하고 생성물의 품질 및 순도를 평가하기에 유용하다.

진핵 세포의 세포 배양 조건의 변화는 하류 바이오프로세싱 변경시 CHO 세포의 HCP의 증가된 양에 의해 알 수 있듯이 (Tait, et al, 2013, Biotechnol Prog 29(3):688-696), 제조된 단백질의 순도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 임의의 생성물에서 잔재하는 HCP의 유해 효과는 생성물의 전체적인 품질 또는 양, 또는 품질과 양 둘 다에 영향을 미칠 수 있다. 현재의 프로토콜은 관심의 단백질 및 숙주 세포 단백질과의 상이한 결합 또는 상호작용을 제거하기 위해 세포에 의해 생성된 관심의 단백질 (예컨대 치료 항체)을 변경시키고자 한다 (Zhang, Q. et al, mAbs, Published online: 11 Feb 2014).

수많은 세포 발현 시스템의 활용성에도 불구하고, 관심의 발현된 단백질의 생물학적 특성에 부정적으로 영향을 미치지 않는 엔지니어링된 세포주 및 시스템이 특히 유리하다. 따라서, 하류 바이오프로세싱 및 후속되는 상업적 사용을 위한 품질의 단백질의 제조를 향한 개선된 방법에 대한 요구가 기술분야에 존재한다.

오염시키는 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 유전자 편집 도구의 사용이 고려되고, 따라서 단백질의 보다 효과적인 제조 프로세싱을 위한 엔지니어링된 숙주 세포가 제공된다.

한 측면으로, 발명은 세포가 미변형 세포에서의 에스테라제의 발현 수준에 비해 에스테라제의 발현 수준을 감소시키기 위해 변형된 재조합 숙주 세포를 제공한다.

다른 측면으로, 발명은 세포가 표적 에스테라제의 발현을 갖지 않도록 변형된 재조합 숙주 세포를 제공한다.

일부 구체예에서, 에스테라제는 포스포리파제, 특히 포스포리파제 B-유사 단백질이다. 추가의 구체예에서, 포스포리파제는 포스포리파제 B-유사 2 단백질이다.

일부 구체예에서, 관심의 유전자는 재조합 숙주 세포에 외인적으로 첨가된다. 다른 구체예에서, 외인적으로 첨가된 유전자는 관심의 단백질 (POI)을 코드화하고, 예를 들어 POI는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및 Fc-융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된다.

발명은 비기능성 PLBD2 단백질을 포함하는 세포를 제공한다.

발명은 PLBD2 표적 붕괴에 의해 세포를 제조하는 것을 제공한다. 일부 구체예에서, 방법은 표적 부위 또는 서열에서 세포 게놈을 붕괴하거나 편집하기 위한 부위-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구체예에서, PLBD2 표적 부위는 SEQ ID NO:33의 번호 1 내지 20, 10 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 50, 30 내지 60, 30 내지 70, 40 내지 60, 40 내지 70, 50 내지 70, 60 내지 80, 70 내지 90, 80 내지 100, 90 내지 110, 110 내지 140, 120 내지 140, 130 내지 150, 140 내지 160, 150 내지 170, 160 내지 180, 160 내지 180, 170 내지 190, 180 내지 200, 180 내지 220, 190 내지 230, 190 내지 210, 200 내지 220, 210 내지 230, 220 내지 240, 230 내지 250, 240 내지 260 및 250 내지 270의 위치에 걸쳐 있는 뉴클레오티드들로 구성된 군으로부터 선택된 SEQ ID NO:33 내에 있거나 또는 SEQ ID NO:33 내의 위치에 인접한 위치를 포함한다.

다른 구체예에서, SEQ ID NO:33 내에 있거나 또는 SEQ ID NO:33 내의 위치에 인접한 위치에 있는 표적 부위는 SEQ ID NO:33의 번호 37 내지 56, 44 내지 56, 33 내지 62, 40 내지 69, 110 내지 139, 198 내지 227, 182 내지 211 및 242 내지 271에 걸쳐 있는 뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이런 점에서, PLBD2 표적 부위는 부분적으로 또는 전체적으로 본원에 제공된 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 위치들 내에 있거나 또는 그 위치들에 의해 포함되고, 그 표적 부위 또는 서열에서의 세포 게놈의 붕괴 또는 편집은 본원에 제공된 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 위치들 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키거나 삽입하는 단계로 구성될 수 있고, 반면에 붕괴 또는 편집은 야생형 세포 (즉 게놈 붕괴 또는 유전자 편집이 없는 세포)로부터 전사된 것과 비교하여 후속적인 전사물을 변경시킨다. 일부 구체예에서, 변경된 유전자의 후속적인 전사물은 번역된 단백질의 프레임시프트를 초래한다. 일부 구체예에서, 변경된 유전자의 후속적인 전사물은, 그것에 대해 변성이 수행되는 변경된 단백질을 초래하고, 질량 분속과 같은 표준 방법에 의해 검출될 수 없거나, 또는 검출 가능한 활성을 갖지 않은다. 일부 구체예에서, 표적화된 붕괴 또는 편집은 유전자의 두 대립유전자에 대해 발생한다 (즉 이중대립유전자 붕괴 또는 이중대립유전자 변경).

특정 구체예에서, 세포는 추가로 외인성 핵산 서열을 통합시킨다. 다른 구체예에서, 세포는 관심의 외인성 단백질을 생성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 붕괴된 유전자로부터 유발되는 변경된 단백질은 세포에 의해 생성된 관심의 단백질에 결합하지 않는다.

다른 측면으로, PLBD2 유전자의 변이체 (예컨대 SEQ ID NO:33의 변이체)를 포함하는 엔지니어링된 핵산 서열을 포함하는 분리된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 제공된다. 한 구체예에서, PLBD2 유전자는 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 1 내지 30인 GACAGTCACG TGGCCCGACT GAGGCACGCG (SEQ ID NO:44)를 포함한다. 다른 구체예에서, PLBD2 유전자는 오픈 리딩 프레임의 발현을 붕괴하기 위해 엔지니어링된다. 다른 구체예에서, 발명은 (a) GACAGTCACG TGGCCCGACT GAGGCACGCG (SEQ ID NO: 44, 또한 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 1 내지 30)를 포함하는 붕괴된 PLBD2 유전자, (b) 표 1의 아미노산 서열들 중 임의의 하나를 코드화하는 뉴클레오티드를 포함하는 붕괴된 에스테라제 유전자 또는 (c) 붕괴된 PLBD2 유전자에 의해 발현된 표 1의 단백질 단편; 및 관심의 유전자를 포함하는 외인성 핵산 서열을 포함하는 분리된 CHO 세포를 제공한다.

다른 측면으로, 재조합 숙주 세포를 사용하여 관심의 단백질을 제조하는 방법이 제공되는데, 이때 숙주 세포는 미변형 세포에서의 에스테라제의 발현 수준에 비해 에스테라제의 발현 수준을 감소시키기 위해 변형된다.

다른 구체예에서, 방법은 감소된 에스테라제 발현을 가지는 변형된 숙주 세포 및 관심의 유전자 (GOI)를 포함하는 외인성 핵산 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 관심의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 관심의 하나 이상의 유전자는 제1 GOI, 제2 GOI 및 제3 GOI로 구성되는 군으로부터 선택된다.

다른 측면으로, 발명은 변형된 또는 비기능성 에스테라제를 포함하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 발현 시스템을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 세포는 GOI의 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GOI를 포함하고, 이때 프로모터는 활성화제 또는 억제제에 의해 조절될 수 있는 진핵 프로모터를 포함한다. 다른 구체예에서, 진핵 프로모터는 원핵 오퍼레이터에 작동 가능하게 연결되고, 진핵 세포는 선택적으로 원핵 리프레서 단백질을 추가로 포함한다.

다른 구체예에서, 하나 이상의 선택 가능한 마커는 변형된 숙주 세포에 의해 발현된다. 일부 구체예에서, 관심의 유전자 및/또는 하나 이상의 선택 가능한 마커는 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 이때 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터는 원핵 오퍼레이터 (예컨대, tet 오퍼레이터)에 의해 선택적으로 제어된 진핵 프로모터 (예컨대 CMV 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터)를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 추가로 원핵 리프레서 (예컨대 tet 리프레서)를 코드화하는 유전자를 포함한다.

한 측면으로, 재조합효소 인지 부위들을 포함하는 CHO 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 재조합효소 인지 부위는 LoxP 부위, Lox511 부위, Lox2272 부위, Lox2372, Lox5171 및 frt 부위로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 세포는 추가로 재조합효소를 발현할 수 있는 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다.

한 구체예에서, 선택 가능한 마커 유전자는 약물 내성 유전자이다. 다른 구체예에서, 약물 내성 유전자는 네오마이신 내성 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 다른 구체예에서, 제2 및 제3 선택 가능한 마커 유전자는 두 개의 상이한 형광 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 두 개의 상이한 형광 단백질은 디스코소마 (Discosoma) 코랄 (DsRed), 그린 형광 단백질 (GFP), 증대된 그린 형광 단백질 (eGFP), 시아노 형광 단백질 (CFP), 증대된 시아노 형광 단백질 (eCFP), 옐로우 형광 단백질 (YFP), 증대된 옐로우 형광 단백질 (eYFP) 및 근적외선 형광 단백질 (mKate)로 구성되는 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 프로모터는 동일하다. 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 프로모터는 서로 상이하다. 다른 구체예에서, 제1 프로모터는 제2 및 제3 프로모터와 상이하고, 제2 및 제3 프로모터는 동일하다. 많은 구체예에서, 제1 프로모터는 SV40 후기 프로모터이고, 제2 및 제3 프로모터는 각각 인간 CMV 프로모터이다. 다른 구체예에서, 제1 및 제2 프로모터는 원핵 오퍼레이터에 작동 가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 숙주 세포주는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈 안에 통합된 재조합효소를 코드화하는 외인적으로 첨가된 유전자를 가진다. 다른 구체예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 게놈 안에 통합된 조절 단백질을 코드화하는 유전자를 가진다. 많은 구체예에서, 조절 단백질은 tet 리프레서 단백질이다.

한 구체예에서, 제1 GOI 및 제2 GOI는 항체의 경쇄 또는 그것의 단편 또는 항체의 중쇄 또는 그것의 단편을 코드화한다. 다른 구체예에서, 제1 GOI는 항체의 경쇄를 코드화하고 제2 GOI는 항체의 중쇄를 코드화한다.

특정 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 GOI는 제1 경쇄 또는 그것의 단편, 제2 경쇄 또는 그것의 단편 및 중쇄 또는 그것의 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코드화한다. 또 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 GOI는 경쇄 또는 그것의 단편, 제1 중쇄 또는 그것의 단편 및 제2 중쇄 또는 그것의 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코드화한다.

한 측면으로, (a) CHO 숙주 세포에 관심의 유전자 (GOI)를 도입시키는 단계, 이때 GOI는 2010년 8월 10일에 발행된 미국 특허 제 7771997B2호에서 기술된 유전자좌와 같은 특이한 유전자좌 또는 다른 안정한 통합 및/또는 발현-증대 유전자좌 안으로 통합되는 단계; (b) (a)의 세포를 GOI의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (c) 관심의 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 관심의 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 관심의 단백질은 면역글로불린의 하위유닛, 그것의 단편, 및 수용체 또는 그것의 리간드-결합 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 관심의 단백질은 항체 경쇄 또는 그것의 항원-결합 단편, 및 항체 중쇄 또는 그것의 항원-결합 단편으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특정 구체예에서, CHO 숙주 세포 게놈은 추가의 변형을 포함하고, 상기 기술된 것과 같은 하나 이상의 재조합효소 인지 부위를 포함하며, GOI는 재조합효소 인지 부위를 인지하는 재조합효소의 작용을 통해 특이한 유전자좌 안으로 도입된다.

일부 구체예에서, GOI는 CHO 숙주 세포 게놈이 특이적 유전자좌 내에 적어도 하나의 외인성 인지 서열을 포함할 때 재조합효소-중재된 카세트 교환 (RMCE)에 대한 표적화 벡터를 사용하여 세포 안으로 도입된다.

다른 구체예에서, GOI는 상동 재조합에 대한 표적화 벡터를 사용하여 세포 안으로 도입되고, 표적화 벡터는 특이적 유전자좌, GOI에 존재하는 서열에 상동하는 5' 상동성 아암 (arm), 및 특이적 유전자좌에 존재하는 서열에 상동하는 3' 상동성 아암을 포함한다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 관심의 유전자를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 관심의 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

다른 측면으로, 세포 안에 외인성 핵산 서열을 포함하는 비히클을 도입시키고, 이때 외인성 핵산은 게놈의 유전자좌 내에 통합되는 단계를 포함하는, 외인성 핵산 서열을 통합시키기 위해 CHO 세포 게놈을 변형시키는 방법이 제공된다.

또 다른 측면으로, 발명은 (a) 에스테라제의 발현이 감소되거나 제거된 발명의 변형된 숙주 세포로부터 단백질 부분을 추출하는 단계, (b) 관심의 단백질을 포함하는 단백질 부분을 단백질 A 친화성 (PA), 양이온 교환 (CEX) 및 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피로 구성되는 군으로부터 선택된 칼럼과 접촉시키는 단계, (c) 배지로부터 관심의 단백질을 수집하는 단계, 이때 에스테라제 활성의 감소된 수준은 단계 (c)에서 수집된 단백질 부분과 관련되며, 그로써 안정한 단백질 제형이 제공되는 단계를 포함하는, 안정한 단백질 제형의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 측면으로, 발명은 (a) 에스테라제의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 숙주 세포를 변형시키는 단계, (b) 관심의 단백질로 숙주 세포를 트랜스펙션하는 단계, (c) 변형된 숙주 세포로부터 단백질 부분을 추출하는 단계, (c) 관심의 단백질을 포함하는 단백질 부분을 단백질 A 친화성 (PA), 양이온 교환 (CEX) 및 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피로 구성되는 군으로부터 선택된 칼럼과 접촉시키는 단계, (d) 배지로부터 관심의 단백질을 수집하는 단계, 및 (e) 관심의 단백질을 지방산 에스테르, 및 선택적으로 완충제 및 열 안정화제와 조합함으로써 검출 가능한 에스테라제 활성이 본질적으로 없는 단백질 제형을 제공하는 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 에스테라제 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 단백질 제형은 PLBD2 단백질 또는 PLBD2 활성이 본질적으로 없다.

또 다른 측면으로, 게놈에 치료제의 발현을 위한 서열을 포함하는 외인성 핵산을 도입하기 위한 비히클을 포함하는 치료제를 발현하도록 CHO 세포 게놈을 변형시키는 방법이 제공되는데, 이때 비히클은 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열에 상동하는 5' 상동성 아암, 치료제를 코드화하는 핵산, 및 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열에 존재하는 서열에 상동하는 3' 상동성 아암을 포함한다.

다른 하나의 측면으로, 발명은 변형된 CHO 게놈을 포함하는 변형된 CHO 숙주 세포를 제공하는데, CHO 게놈은 SEQ ID NO:33에 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열 내의 표적 서열의 붕괴에 의해 변형된다.

다른 측면으로, 발명은 변형된 진핵 게놈을 포함하는 변형된 진핵 숙주 세포를 제공하는데, 진핵 게놈은 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 PLBD2 유전자의 코딩 영역의 표적 서열에서 변형된다. 일부 구체예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성화 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), TAL 이펙터 도메인 융합 단백질 또는 RNA-안내된 DNA 엔조뉴클레아제를 포함한다. 발명은 또한 그런 변형된 진핵 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

상기 기술된 측면들 및 구체예들 중 임의의 것에서, 표적 서열이 SEQ ID NO:33에서와 같이 표시된 방향으로, 또는 SEQ ID NO:33의 방향과 정반대로 놓일 수 있다.

다른 측면으로, 변경된 PLBD2 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, PLBD2 유전자가 코딩 영역의 붕괴에 의해 변경되는 재조합 숙주 세포가 제공된다. 다른 구체예에서, 붕괴된 코딩 영역은 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11 및 엑손 12로 구성되는 군으로부터 선택된 엑손 뉴클레오티드 서열 내에 있다. 특정 구체예에서, 붕괴된 코딩 영역은 엑손 1 및 엑손 2로 구성되는 군으로부터 선택된 엑손 뉴클레오티드 서열 내에 있다.

한 구체예에서, PLBD2 유전자 변경이 이중대립유전자 변경을 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

다른 구체예에서, PLBD2 유전자 변경이 1개 이상의 염기쌍, 2개 이상의 염기쌍, 3개 이상의 염기쌍, 4개 이상의 염기쌍, 5개 이상의 염기쌍, 6개 이상의 염기쌍, 7개 이상의 염기쌍, 8개 이상의 염기쌍, 9개 이상의 염기쌍, 10개 이상의 염기쌍, 11개 이상의 염기쌍, 12개 이상의 염기쌍, 13개 이상의 염기쌍, 14개 이상의 염기쌍, 15개 이상의 염기쌍, 16개 이상의 염기쌍, 17개 이상의 염기쌍, 18개 이상의 염기쌍, 19개 이상의 염기쌍 또는 20개 이상의 염기쌍의 결실을 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

발명의 측면 및 구체예들 중 임의의 것은 다르게 명시되거나 맥락으로부터 다르게 나타나지 않는 한, 발명의 임의의 다른 측면 또는 구체예와 함께 사용될 수 있다.

다른 목적 및 장점들은 이어지는 상세한 설명의 개관으로부터 드러나게 될 것이다.

도 1은 변형된 클론들의 게놈 (gDNA) 또는 전사물 (mRNA)을 검출하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 실험의 결과를 도시한다. 프라이머 및 프로브들은 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 37에서 시작하여 (sgRNA1) 또는 뉴클레오티드 44에서 시작하여 (sgRNA2), 엑손 1 내에서 표적화된 붕괴의 대상인 것으로 예측된 서열들이 양옆에 있도록 디자인되었다. sgRNA1 또는 sgRNA2에 의하여 표적화된 클론들로부터의 앰플리콘의 상대적인 양을 그래프화한다 (즉 sgRNA의 대상이 아니거나 매치되지 않은 sgRNA의 대상인 네거티브 대조 트랜스펙션 클론들로부터 유도된 앰플리콘과 비교하여). 예를 들어 클론 1은 표적화된 엑손 1 영역의 qPCR당 증폭된 gDNA 또는 mRNA가 상대적으로 없다. 클론 1 및 여러 다른 클론들이 추후 분석을 위해 선택되었다.
도 2A 및 도 2B는 야생형 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 비교한 클론 1 세포 집단의 추가의 PCR 분석의 결과를 도시한다. 도 2A는 야생형 세포의 게놈 DNA로부터의 앰플리콘과 비교하여 길이 (bp)가 더 짧은 클론 1로부터의 PCR 앰플리콘을 보여준다. 도 2B는 야생형 세포의 mRNA로부터의 앰플리콘과 비교한 길이 (bp)가 더 짧은 클론 1로부터의 PCR 앰플리콘을 보여준다. 서열결정은 클론 1의 PLBD2 유전자에서 11 bp 결실을 확인하였다.
도 3은 12일 동안 동일한 공급-배치 배양 조건이 수행된 단클론성 항체 1 (mAb1)-발현 클론 1 세포 (RS001) 또는 mAb1-발현 야생형 CHO 세포 (RSOWT)의 상대적인 단백질 역가를 도시한다. 조건 배지의 샘플들이 각 배양에 대해 추출되었고, 단백질 A 결합 부분이 0, 3, 5, 7, 10 및 13일에 정량되었다.
도 4는 생성 배양 및 단백질 A (PA) 단독, 또는 PA와 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피를 사용한 단백질 정제 후에 RS001 또는 RSOWT의 결과를 도시한다. RS001 및 RSOWT로부터 PA-정제된 mAb1이 트립신 소화 질량 분석을 사용하여 리파아제 풍부에 대해 분석되었다. 그로써, RS001- 및 RSOWT-제조된 mAb1의 트립신 소화물이 특이적인 PLBD2 생성물 단편 (표 1에서와 같음)을 모니터링하기 위해 설정된 3단 4극 질량 분석기와 결합된 역상 액체 크로마토그래피 칼럼에 주입되었다. 다양한 양의 재조합 PLBD2가 섞인 mAb1의 참조 샘플 (내인성 PLBD2를 포함하지 않음)을 함유한 대조 반응을 또한 분석하고 도표화하였다. 실험들에서 검출된 신호들이 대조 반응과 비교되어 PLBD2의 농도가 측정되었다. 클론 1로부터 생성된 mAb1은 PA 단독으로 정제되었을 때 PLBD2의 검출 가능한 양을 나타내지 않았다.

본 방법을 기술하기 전에, 발명은 기술된 특정 방법들 및 실험 조건들에 제한되지 않는데, 그런 방법 및 조건들이 달라질 수 있기 때문이라는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예들을 기술할 목적을 위한 것으로, 제한하려는 의도는 아닌데, 왜냐하면 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단일한 형태를 나타내는 용어들은 맥락이 분명하게 다르게 가리키지 않는 한 다수의 참조대상을 포함한다. 그러므로 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에서 기술된 및/또는 본 개시를 판독할 때 기술분야의 숙련자들에게 명백해질 유형의 단계들을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 또는 다르게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 인지되는 것과 동일한 의미를 가진다.

비록 본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 물질을 이제 기슬한다. 본원에서 언급된 모든 공개물은 그것들의 전체 내용이 참조에 의해 본원에 포함된다.

정의

구절 "외인적으로 첨가된 유전자" 또는 "외인적으로 첨가된 핵산"은 자연에서 발견되는 대로의 세포의 게놈 내에 존재하지 않는 임의의 DNA 서열 또는 유전자를 나타낸다. 예를 들어, CHO 게놈 내의 "외인적으로 첨가된 유전자"는 임의의 다른 종으로부터의 유전자 (예컨대 인간 유전자), 키메릭 유전자 (예컨대 인간/마우스), 또는 그 유전자가 삽입된 특정 CHO 유전자좌 내에서 자연에서는 발견되지 않는 햄스터 유전자, 또는 관심의 CHO 유전자좌 내에 존재하는 것으로 자연에서는 발견되지 않은 임의의 다른 유전자일 수 있다.

에스테라제, 예컨대 포스포리파제 단백질 또는 유전자, 예컨대 SEQ ID NO:32 또는 SEQ ID NO:33을 기술할 때 퍼센트 동일성은 각각 인접한 상동성의 영역을 따라 인용된 동일성을 나타내는 상동성 서열을 포함하는 것을 의미하지만, 비교된 서열에서 상동체를 갖지 않는 갭, 결실 또는 삽입의 존재는 퍼센트 동일성을 계산할 때 고려하지 않는다.

예컨대 SEQ ID NO:32와 종 상동체 사이의 "퍼센트 동일성" 측정은 종 상동체가 배열에서 비교하기 위해 상동하는 서열을 갖지 않은 경우 서열의 비교를 포함하지 않을 것이다 (즉 SEQ ID NO:32는 그것의 단편, 또는 종 상동체와 비교하여, 경우에 따라 갭 또는 결실을 가진다). 그러므로, "퍼센트 동일성"은 갭, 결실 및 삽입에 대한 불이익을 포함하지 않는다.

유전자 또는 핵산 서열의 "표적화된 붕괴"는 게놈 DNA의 절단 또는 파괴 (예컨대 이중 가닥의 파괴)를 지시하고 그로써 그런 유전자 또는 핵산 서열의 코딩 서열에 대해 변형을 유발하는 유전자 표적화 방법을 나타낸다. 유전자 표적 부위는 뉴클레아제에 의한 절단 또는 파괴를 위해 선태된 부위들이다. DNA 파괴는 비-상동성 단부-결합 (NHEJ) DNA 복구 경로에 의해 정상적으로 복구된다. NHEJ 복구 동안에, 삽입 또는 결실 (InDel)이 발생할 수 있고, 그로써 적은 수의 뉴클레오티드가 파괴 부위에 무작위로 삽입 또는 결실되고 이들 InDel은 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 이동시키거나 붕괴할 수 있다. ORF의 이동은 DNA 파괴의 하류의 결과적인 아미노산 서열의 유의미한 변화를 유발하거나, 또는 조기성숙 중지 코돈을 도입시킬 수 있어서, 만약 있다면 발현된 단백질이 비기능성이 되거나 분해되기 쉽다.

"표적화된 삽입"은 게놈의 특이적인 위치에 유전자 또는 핵산 서열의 삽입 또는 통합을 지시하기 위해, 즉 근접한 폴리뉴클레오티드 사슬의 두 뉴클레오티드 사이의 특이적인 부위에 DNA를 지시하기 위해 사용된 유전자 표적화 방법을 나타낸다. 표적화된 삽입은 또한 작은 수의 뉴클레오티드를 도입하기 위해 또는 다중 유전자, 조절 요소 및/또는 핵산 서열을 포함하는, 전체 유전자 카세트를 도입하기 위해 수행될 수 있다. "삽입" 및 "통합"은 상호교환적으로 사용된다.

"인지 부위" 또는 "인지 서열"은 DNA 골격에 결합하고 DNA 골격의 부위-특이적 절단을 지시하기 위해 뉴클레아제 또는 다른 효소에 의해 인지된 특이적인 DNA 서열이다. 엔도뉴클레아제는 DNA 분자 내에서 DNA를 절단한다. 인지 부위는 또한 기술분야에서 인지 표적 부위로서 언급된다.

폴리소르베이트는 소르비탄 또는 아이소-소르바이드의 지방산 에스테르이다 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 또는 아이소-소르바이드 모노- 또는 다이-에스테르). 폴리옥시에틸렌은 친수성 헤드기로서 작용하고 지방산은 친유성 소수성 꼬리로서 작용한다. 폴리소르베이트의 계면활성제로서의 유효성은 (단일 분자에) 친수성 헤드 및 소수성 꼬리 존재 둘 다를 가지는 분자의 양친매성 성질에 좌우된다. 폴리소르베이트가 그것의 성분인 헤드기와 지방산 꼬리로 분해 (가수분해)될 때, 단백질 안정화제로서의 유효성을 잃게 되고, 잠재적으로 응집 및 후속되는, 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자 (SVP) 형성이 허용되어 그런 분해의 지표가 된다. SVP는 면역원성에 기여할 수 있다. 미국 식품의약관리국 (USFDA)과 같은 규제 기관이 제약학적 제형에서 허용된 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자 (SVP)의 수에 대한 제한을 제시한다. 미국 약전 (USP)은 약물 및 약물 성분들, 뿐만 아니라 식품 성분 및 식이보충제의 강도, 순도 및 품질에 대한 기준을 발간한다.

구절 "에스테라제 활성"은 에스테르, 예컨대 지방산-에스테르를 산 (즉 유리 지방산) 및 알코올 (즉 에스테르-함유 화합물)로 절단 (가수분해)하는 하이드롤라제 효소의 효소적 활성을 나타낸다.

단백질 A-결합 부분은 단백질 A 친화성 포맷에 결합하는 관심의 단백질을 발현하는 배양된 세포로부터의 세포 용해물의 부분을 나타낸다. 기술분야에는 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 크로마토그래피 매질, 예컨대 수지, 비즈, 칼럼 등이 단백질 A에 대한 친화성으로 인해 Fc-함유 단백질을 포획하는 데 활용되는 것으로 잘 인지된다.

포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2)는 NCBI RefSeq. XM_003510812.2 (SEQ ID NO:33)로서 알려져 있는 포스포리파제 유전자 또는 NCBI RefSeq. XP_003510860.1 (SEQ ID NO:32)로서 알려져 있는 단백질, 및 추가로 본원에서 기술된 상동체를 나타낸다. PLBD2는 또한 기술분야에서 추정되는 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 76 kDa 단백질, LAMA-유사 단백질 2, PLB 상동체 2, 라미나 조상 상동체 2, 만노오스-6-포스페이트 단백질 관련 단백질 p76, p76, 포스포리파제 B-유사 2 32 kDa 형태, 포스포리파제 B-유사 2 45 kDa 형태 또는 리소솜성 66.3 kDa 단백질로서 언급된다.

용어 "세포" 또는 "세포주"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예컨대 대장균, 바실러스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 스트레인들), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예컨대 맥주효모균, 스트렙토마이세스 폼베, P. 파르토리스, P. 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플러시아 니, 등), 비-인간 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 예를 들면 하이브리도마 또는 콰드로마와 같은 세포 융합물을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 진핵 세포이고 다음의 세포들로부터 선택된다: CHO (예컨대 CHO K1 , DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예컨대 COS-7), 망막 세포, Vera, CV1, 신장 (예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1 , U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 세포주. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예컨대 PER.C6® 세포)를 포함한다.

일반적 설명

발명은 적어도 부분적으로는 내인성 숙주 세포 포스포리파제 단백질의 발현을 감소시키거나, 내인성 숙주 세포 포스포리파제 단백질의 효소 기능 또는 결합 능력을 감소시키거나, 또는 검출 가능한 내인성 숙주 세포 포스포리파제 단백질을 갖지 않는 재조합 숙주 세포 및 세포 발현 시스템을 기반으로 한다. 본 발명자들은 PLBD2 단백질 발현의 붕괴가 그런 발현 시스템에서 생물제약학적 생성물의 최적화되고 효과적인 정제를 허용한다는 것을 발견하였다. 발명은 여러 방법에서, 예컨대 1) 전체적으로 포스포리파제 발현을 녹아웃시키는 번면, 측정 가능한 전-길이 포스포리파제가 포스포리파제 유전자의 붕괴로 인해 세포에서 발현되지 않도록 유전자 편집 도구를 활용하는 데서; 2) 효소적 활성을 제거 또는 감소시키는 반면, 포스포리파제 단백질은 발현되지만 유전자에서의 붕괴로 인해 비기능성이 되도록 유전자 편집 도구를 활용하는 데서; 및 3) 내인성 숙주 세포 포스포리파제 단백질이 세포에 의해 생성된 외인성 재조합 단백질에 결합하는 능력을 제거 또는 감소시키기 위하여 유전자 편집 도구를 활용하는 데서 사용될 수 있다. 에스테라제 활성은 특정 항체-생성 세포의 단백질 부분에서 측정되었다. 한 가지 특별한 에스테라제, 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2)가 이들 단백질 부분에서 오염물로서 측정되었다. 유전자 편집 표적 부위는 햄스터 세포 (즉 CHO) 게놈에서 유전자의 표적화된 붕괴를 가능하게 하는 햄스터 PLBD2 유전자에서 확인되었다.

변형된 PLBD2 유전자를 포함하는 최적화된 숙주 세포는 고-품질 단백질의 바이오프로세싱에 유용하며 특정 정제 단계들의 부담을 줄일 수 있고, 그로써 시간 및 비용을 절약하는 한편 생산 수율을 증가시킬 것으로 전망된다.

발명은 또한 통합 부위로의 외인성 유전자의 특이적인 표적화를 기반으로 한다. 발명의 방법은 세포 게놈의 효과적인 변형을 허용함으로써, 치료용 또는 다른 상업용 단백질 생성물의 바이오프로세싱을 위한 세포 발현 시스템으로서 유용한 변형된 또는 재조합 숙주 세포를 생성한다. 이 목적을 위해, 발명의 방법은 그렇지 않으면 재조합 단백질 제형의 품질을 감소시키거나 오염시킬 수 있는 또는 다중 정제 단계를 필요로 할 수 있는 관심의 특별한 유전자들의 변경을 위한 세포 게놈 유전자 편집 전략을 사용한다.

발명의 조성물, 예컨대 유전자 편집 도구는 또한 예를 들면 새로운 세포주를 클로닝하고 엔지니어링하기 위한 발현 벡터에서 발현 구성물에 포함될 수 있다. 이들 세포주는 본원에 기술된 변형을 포함하고, 나아가 단백질 발현의 목적을 위한 발현 구성물의 최적의 통합을 위한 변형이 그려진다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 관심의 단백질을 일시적으로 발현시키기 위해 사용될 수 있고, 또는 세포 게놈 안에 무작위 또는 표적화된 재조합, 예컨대 상동성 재조합 또는 특이적인 재조합 부위를 인지하는 재조합 효소에 의해 중재된 재조합 (예컨대 Cre-lox-중재된 재조합)에 의해 통합될 수 있다.

DNA의 붕괴 또는 삽입을 위한 표적 부위는 전형적으로 유전자 붕괴 또는 삽입의 최대 효과를 염두에 두고 확인될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 관심의 유전자의 코딩 영역의 N-말단 가까이에서 선택될 수 있는 반면 DNA 파괴는 유전자의 제1 또는 제2 엑손 내에 도입된다. 인트론 (비-코딩 영역)은 그 영역에서의 DNA 파괴의 수복이 표적 유전자를 붕괴시킬 수 없기 때문에 붕괴에 대해 전형적으로 표적화되지 않는다. 이들 변형에 의해 도입된 변화들은 유기체의 게놈 DNA에 대해 영구적이다.

본질적으로, SEQ ID NO:33의 표적 부위의 확인에 이어서, 유전자 편집 프로토콜이 비기능성 유전자를 만들기 위해 사용되었다. 일단 오염시키는 숙주 세포 단백질이 제거되면, 관심의 발현 가능한 유전자 (GOI), 예컨대 다중-하위유닛 항체를 도입시키기 위해 기술분야에 알려져 있는 프로토콜이 예컨대 프로모터, 인핸서, 마커, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위 (예컨대 내부 리보솜 유입 부위) 등의 임의의 다른 바람직한 요소들과 함께 또한 사용된다.

그 결과의 재조합 세포주는 편리하게도 관심의 발현 가능한 외인성 유전자 (GOI)와 관하여 더 효과적인 하류 바이오프로세스를 제공하는데, 관심의 외인성 단백질질에 대한 정제 단계가 오염물인 숙주 세포 단백질의 부재로 인해 제거되기 때문이다. 제거 또는 정제하는 정제 과정은 또한 더 많은 양 (역가)의 관심의 회수된 단백질을 초래한다.

변형된 CHO 세포의 물리적 및 기능적 특성확인

본 출원인은 폴리소르베이트 (폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함함)의 탈안정화와 관련된 효소적 활성을 발견하였다. 그 활성은 에스테라제, 예컨대 표 1에 열거된 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 그런 펩티드 서열의 BLAST 연구는 추정되는 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2, PLBL2로도 언급됨)와의 동일성을 나타냈다. PLBD2는 햄스터 (SEQ ID NO:32), 마우스 (SEQ ID NO:34), 래트 (SEQ ID NO:35), 인간 (SEQ ID NO:36) 및 소 (SEQ ID NO:37)에서 고도로 보존된다. 출원인은 포유류 세포주에서 제조된 관심의 단백질의 일부 부류를 사용한 특정 방법 하에서 공동으로 정제되는 PLBD2가 폴리소르베이트 20 및 80의 가수분해에 기여하는 에스테라제 활성을 가지는 것을 발견하였다. 다른 에스테라제 종, 예컨대 PLBD2가 관심의 특정 단백질 및/또는 숙주 세포의 유전적/후생유전적 배경에 따라 폴리소르베이트 비안정성에 기여할 수 있다고 예상한다. 다수의 종 중에서 동일성을 가진 포유류 에스테라제, 특히 PLBD2의 단편들이 표 1에 예시된다.

폴리소르베이트 80의 에스테르 가수분해는 최근에 보고되었다 (Labrenz, S.R., "Ester hydrolysis of polysorbate 80 in mAb drug product: evidence in support of the hypothesized risk after observation of visible particulate in mAb formulations," J. Pharma. Sci. 103(8):2268-77 (2014) 참조). 그 논문은 IgG를 함유하는 제형에서 가시적인 입자들의 형성을 보고하였다. 저자는 콜로이드상 IgG 입자가 폴리소르베이트 80의 올레에이트 에스테르의 효소적 가수분해로 인해 형성되었다고 상정하였다. 비록 에스테라제가 직접적으로 확인되지는 않았지만, 저자는 리파제 또는 트위나제 (tweenase)가 IgG와 공동으로 정제되고, 그것이 폴리소르베이트 80의 분해의 원인이었다고 추측한다. 흥미롭게도, 폴리소르베이트 20으로 제형된 IgG는 입자를 형성하지 않았고 추정되는 에스테라제는 폴리소르베이트 20을 가수분해하지 않았다. 저자는 IgG와 관련된 추정되는 리파제가 포화된 C12 지방산 (즉 라우레이트)에 영향을 미치지 않았다고 보고하였다 (7.에서 Id).

포스포리파제는 인지질의 절단을 촉매하는 에스테라제 효소의 패밀리이다. 각각의 포스포리파제 하위부류는 그것의 표적 절단 부위를 기준으로 상이한 기질 특이성을 가진다. 포스포리파제 B (PLB)는 고도로 보존된 아미노산 서열 모티프, Gly-Asp-Ser-Leu (GDSL)의 존재에 의하여 원핵 및 진핵 리파제 단백질의 군에 관련되는 것으로 확인되었다 (Upton, C, and Buckley, JT. A new family of lipolytic enzymes? Trends Biochem Sci. 1995; 20:178-179). 그러나, 포스포리파제 B는 또한 공지된 GDSL(S) 가수분해효소로 분류되고, 진짜 리파제에 대해 거의 서열 상동성을 갖지 않으며, 다른 리파제들보다 N-말단에 더 가까운 세린-함유 모티프를 가짐으로써 포스포리파제들과 구조적으로 구별된다. 그러므로, 포스포리파제 B-유사 단백질은 또한 N-말단 친핵체 (Ntn) 가수분해효소로서 분류된다. 기능적으로, 포스포리파제 B-유사 효소들은 다른 포스포리파제들과 유사한 방식으로, 그것들의 표적 기질 (다이아실글리세로인지질과 같은 지방산 에스테르)를 가수분해하여 유리 지방산과 에스테르-함유 화합물을 생성한다. PLB-유사 단백질, 예컨대 포스포리파제 B-유사 단백질 1 (PLBD1) 및 포스포리파제 B-유사 단백질 2 (PLBD2)는 또한 다른 Ntn 가수분해효소들과 유사하게 아미다제 활성을 가진다 (Repo, H. et al, Proteins 2014; 82:300-311).

숙주 세포 유전자, 예컨대 에스테라제, 보다 구체적으로 포스포리파제 B-유사 단백질 2의 녹아웃은 여러 방법으로 이루어질 수 있다. 포스포리파제 유전자를 비기능적으로 만드는 것, 또는 표적 포스포리파제의 기능적 활성을 감소시키는 것은 점 돌연변이를 포스포리파제 게놈 서열에, 특히 엑손 (코딩 영역)에 도입시킴으로써 실시될 수 있다. SEQ ID NO:33의 핵산 서열이 확인되었고 표적 부위의 상류 및 하류 서열들 (즉 상동성 아암)은 상동 재조합에 의해 돌연변이된 유전자를 포함하는 발현 카세트를 통합시키기 위해 이용될 수 있다. 추가의 유전자 편집 도구는 발명에 따라 본원에서 기술된다.

에스테라제 활성, 특히 PLBD2 활성이 없는 세포주가 정제되고 장기 저장될 수 있는 치료 단백질의 생성에 유용하고, 그런 세포주는 지방산 에스테르 계면활성제를 함유하는 제형으로 제약학적 조성물의 장기간 저장과 관련된 문제들을 단백질 안정성을 유지하고 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자 (SVP) 형성을 감소시킴으로써 해결한다 (또한 2015년 10월 8일에 출원된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US 15/54600 참조, 상기 출원은 전체 내용이 명세서에 포함된다).

포스포리파제의 효소적 활성을 검출하는 분석들은 폴리소르베이트 분해 (추정되는 에스테라제 활성) 측정을 포함한다. CHO 세포로부터의 미정제 단백질 상층액 또는 부분, 및 순차적인 정제 단계들이 수행될 때 각 단계 또는 단계들의 순서에서의 상층액이 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80의 안정성에 대해 시험된다. 보고된 퍼센트 무상 폴리소르베이트의 측정은 오염시키는 에스테라제 활성의 양에 반비례한다. 단백질 샘플 중의 에스테라제 활성 또는 에스테라제 존재의 검출을 위한 다른 측정은 기술분야에 알려져 있다. 에스테라제 (예컨대 리파제, 포스포리파제 또는 PLBD2)의 검출은 트립신 소화 질량 분석에 의해 실시될 수 있다.

비-이온성 계면활성제, 즉 폴리소르베이트와 같은 계면활성제의 단백질 (예컨대 항체) 제형에서의 안정성은 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자들의 형성에 직접적으로 상관되어 있는 것으로 가정된다. 그로써, 폴리소르베이트의 분해는 계면활성제 활성의 손실을 초래하고, 그러므로 단백질이 응집하고 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자들을 형성하는 것을 허용한다. 추가로 또는 다르게는, 소르비탄 지방산 에스테르를 분해시킴으로써 방출된 지방산은 또한 혼합되지 않는 지방산 방울들로서 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자 형성에 기여할 수 있다. 그러므로, 10 마이크로미터보다 큰 직경의 현미경이 아니면 볼 수 없는 입자들의 수준이 에스테라제 활성을 검출하기 위해 단백질 제형에서 카운팅될 수 있다.

포스포리파제 활성을 검출하기 위한 다른 분석들이 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 포스파티딜[³H]콜린 및 단백질 상층액의 인큐베이션 후에 포스파티딜[³H]콜린으로부터의 글리세로포스포[³H]콜린 형성이 박막 크로마토그래피 (Kanoh, H. et al. 1991 Comp Biochem Physiol 102B(2):367-369에 따르는 유사한 프로토콜 후에)에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 개시된 SEQ ID NO:32는 CHO 세포에서 발현된 단백질로부터 확인되었다. 다른 포유류 종 (예컨대 인간, 래트, 마우스)은 확인된 에스테라제에 대해 고도의 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 상동성 서열은 또한 크리세툴루스 그리세우스의 다른 조직 유형으로부터, 또는 다른 상동성 종으로부터 유도된 세포주에서 발견될 수 있고, 기술분야에 잘 알려져 있는 기법들에 의해 확인 및 분리될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 종-교차 혼성화 또는 PCR-기반 기법에 의해 다른 상동성 서열들을 확인할 수 있다. 또한, PLBD2의 변이체가 다음에 본원에서 기술된 대로 에스테라제 활성에 대해 시험될 수 있다. SEQ ID NO:32에 대해 핵산 동일성에서 적어도 약 80% 동일하고 에스테라제 활성을 가지는 DNA, 또는 그것의 변이체가 생물제약학적 조성물에 대해 에스테라제 활성을 나타낼 것으로 예상되고 엔지니어링된 세포주의 표적화된 붕괴에 대한 후보들이다. 따라서, SEQ ID NO:32의 상동체 또는 그것의 변이체, 및 그런 상동체를 발현하는 세포들 또한 발명의 구체예들에 포함된다.

포유류 PLBD2 서열들 (핵산 및 아미노산)은 햄스터, 인간, 마우스 및 래트 게놈 중에서 보존된다. 표 2는 예시적인 포유류 PLBD2 단백질 및 그것들의 상동성 정도를 나타낸다.

PLBD2 상동체의 아미노산 동일성

포유류	SEQ ID NO:	%동일성 인간	%동일성 마우스	%동일성 래트	%동일성 햄스터
햄스터	32	80	89.7	89	-
마우스	34	80.8	-	92.6	89.7
래트	35	-	92.6	-	89
인간	36	-	80.8	-	80

특정 구체예에서, SEQ ID NO:33의 표적화된 붕괴는 SEQ ID NO:33의 위치 번호 1 내지 20, 10 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 50, 30 내지 60, 30 내지 70, 40 내지 60, 40 내지 70, 50 내지 70, 60 내지 80, 70 내지 90, 80 내지 100, 90 내지 110, 110 내지 140, 120 내지 140, 130 내지 150, 140 내지 160, 150 내지 170, 160 내지 180, 160 내지 180, 170 내지 190, 180 내지 200, 180 내지 220, 190 내지 210, 190 내지 230, 200 내지 220, 210 내지 230, 220 내지 240, 230 내지 250, 240 내지 260, 250 내지 270, 33 내지 62, 37 내지 56, 40 내지 69, 44 내지 63, 110 내지 139, 198 내지 227, 182 내지 211 및 242 내지 271에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 영역에 대해 지시된다.

다른 구체예에서, 표적 서열은 SEQ ID NO:33의 위치 번호 1 내지 20, 10 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 50, 30 내지 60, 30 내지 70, 40 내지 60, 40 내지 70, 50 내지 70, 60 내지 80, 70 내지 90, 80 내지 100, 90 내지 110, 110 내지 140, 120 내지 140, 130 내지 150, 140 내지 160, 150 내지 170, 160 내지 180, 160 내지 180, 170 내지 190, 180 내지 200, 180 내지 220, 190 내지 210, 190 내지 230, 200 내지 220, 210 내지 230, 220 내지 240, 230 내지 250, 240 내지 260, 250 내지 270, 33 내지 62, 37 내지 56, 40 내지 69, 44 내지 63, 110 내지 139, 198 내지 227, 182 내지 211 및 242 내지 271에 걸쳐 있는 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 영역 내에 전체적으로 또는 부분적으로 있다.

다른 구체예에서, 에스테라제 핵산 서열은 SEQ ID NO:33의 서열 또는 그것의 표적 서열에 대해 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 81% 동일하거나, 적어도 약 82% 동일하거나, 적어도 약 83% 동일하거나, 적어도 약 84% 동일하거나, 적어도 약 85% 동일하거나, 적어도 약 86% 동일하거나, 적어도 약 87% 동일하거나, 적어도 약 88% 동일하거나, 또는 적어도 약 89% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 91% 동일하거나, 적어도 약 92% 동일하거나, 적어도 약 93% 동일하거나, 적어도 약 94% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나 또는 적어도 약 99% 동일하다.

관심의 단백질의 증대된 수준을 발현하는 세포 집단은 본원에 제공된 세포주 및 방법을 사용하여 발달될 수 있다. 발명의 세포에 의해 생성된, 분리된 상업적 단백질, 그것의 단백질 상층액 또는 부분은 검출 가능한 에스테라제 또는 에스테라제 활성이 없다. 발명의 변형된 세포의 게놈 내에 통합된 외인성 서열(들)로 추가로 변형된 세포 푸울은 시간이 경과함에 따라 안정할 것으로 예상되고, 대부분의 목적에 대해 안정한 세포주로서 처리될 수 있다. 재조합 단계들은 또한 발명의 세포주의 발달의 과정에서 나중까지 지연될 수 있다.

표적 숙주 세포 단백질을 유전적으로 변형하기

특정 위치의 숙주 세포 게놈 (즉 표적 숙주 세포 단백질)을 유전적으로 엔지니어링하는 방법들은 여러 방식으로 이루어질 수 있다. 유전자 편집 기법이 진핵 세포에서 핵산 서열을 변형시키기 위해 사용되었는데, 여기서 핵산 서열은 그런 세포에서 정상적으로 발견되는 내인성 서열이고 오염시키는 숙주 세포 단백질을 발현한다. 세포 자손이 엔지니어링된 세포주의 동일한 유전자형 및 표현형 특성을 공유할 것인지를 확인하기 위해 클론성 팽창이 필수적이다. 일부 실례에서, 천연 세포가 상동성 재조합 기법에 의해 변형되어 숙주 세포 단백질을 코드화하는 비기능적 또는 돌연변이된 표적 핵산 서열, 예컨대 SEQ ID NO:33의 변이체가 통합된다.

CHO PLBD2 게놈 서열을 편집하는 한 가지 그런 방법은 PLBD2 엑손을 특이적으로 표적화하기 위하여 가이드 RNA 및 타입 II Cas 효소의 사용을 포함한다. CHO PLBD2의 엑손 1에 대해 지시된 특이적인 가이드 RNA는 본원에서 기술된 것과 같이 부위-특이적 뉴클레아제 편집에 사용되었다 (예컨대 표 4 참조). PLBD2 유전자를 변형시키기 위한, 표적화된 게놈 편집의 다른 방법, 예를 들면 뉴클레아제, 재조합-기반 방법들 또는 RNA 간섭이 CHO 게놈의 표적화된 붕괴를 위해 사용될 수 있다.

한 측면으로, SEQ ID NO:33에 대해 90%의 동일성을 가지는 숙주 세포 단백질, 또는 그것의 항체-결합 변이체를 코드화하는 핵산 분자의 녹아웃 또는 하향조절을 위한 방법 및 조성물은 상동성 재조합을 경유한다. 예컨대 관심의 에스테라제를 코드화하는 핵산 분자는 상동성 재조합에 의해 또는 숙주 세포 게놈의 에스테라제-발현 부위에서 특이적으로 서열을 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제 방법을 사용함으로써 표적화될 수 있다. 상동성 재조합을 위해, 상동성 폴리뉴클레오티드 분자들 (즉 상동성 아암)이 배열되고 그것들의 서열의 구간이 교환된다. 만약 이식유전자의 양옆에 상동성 게놈 서열이 있다면 이식유전자가 이 교환 중에 도입될 수 있다. 한 실례에서, 재조합 인지 부위가 또한 통합 부위들에서 숙주 세포 게놈에 도입될 수 있다.

진핵 세포에서 상동성 재조합은 통합 부위에서 염색체 DNA에 파괴를 도입시킴으로써 용이해질 수 있다. 모델 시스템은 만약 이중-가닥 파괴가 염색체 표적 서열 내에 도입된다면 유전자 표적화 동안 상동 재조합의 빈도가 증가하는 것을 증명하였다. 이것은 특정 뉴클레아제를 특이적인 통합 부위로 표적화함으로써 이루어질 수 있다. 표적 유전자에서 DNA 서열을 인지하는 DNA-결합 단백질들은 기술분야에 알려져 있다. 유전자 표적화 벡터가 또한 상동 재조합을 용이하게 하기 위해 사용된다. 상동성 지시된 수복을 위해 유전자 표적화 벡터가 없을 때, 세포는 자주 이중-가닥 파괴를 비상동성 단부-결합 (NHEJ)에 의해 닫는데, 그것은 절단 부위에서 다중 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 유도할 수 있다. 유전자 표적화 벡터 구성 및 뉴클레아제 선택은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자의 기술 내에 있다.

일부 실례에서, 모듈러 구조를 가지며 개별적인 징크 핑거 도메인을 함유한 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 표적 서열에서 특별한 3-뉴클레오티드 서열을 인지한다. 일부 구체예는 다중 표적 서열을 표적화하는, 개별적인 징크 핑거 도메인들의 조합을 가진 ZFN을 활용할 수 있다. PLBD2 유전자의 붕괴 (예컨대 엑손 1 또는 엑손 2에서)를 표적화하기 위한 ZFN 방법이 또한 발명에 의해 사용된다.

전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)가 또한 부위-특이적 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인은 전형적으로 제한 뉴클레아제, 예컨대 Fok1의 비-특이적 절단 도메인과 함께 이용된다. 일부 구체예에서, TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인 및 제한 뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이 표적 숙주 세포 단백질, 예를 들면 에스테라제, 예컨대 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 또는 다른 포유류 포스포리파제를 코드화하는 유전자의 엑손 내의 표적 서열에서 DNA를 인지하고 절단하기 위해 사용된다. 외인성 서열의 표적화된 붕괴 또는 SEQ ID NO:33에 의해 코드화된 CHO 단백질의 특이적인 엑손 안으로의 삽입은 에스테라제 게놈 DNA의 엑속 1, 엑손 2, 엑손 3 등 내의 위치에 표적화된 TALE 뉴클레아제 (TALEN)를 사용함으로써 실시될 수 있다 (표 3 및 4 참조). SEQ ID NO:33 내의 TALEN 표적 절단 부위는 ZiFit.partners.org (ZiFit Targeter 버전 4.2)를 기준으로 선택될 수 있고 다음에 TALEN은 공지된 방법들을 기반으로 디자인된다 (Boch J et al., 2009 Science 326:1509-1512; Bogdanove, A. J. & Voytas, D. F. 2011 Science 333, 1843-1846; Miller, J. C. et al., 2011 Nat Biotechnol 29, 143-148). PLBD2 유전자 (예컨대 엑손 1 또는 엑손 2)의 붕괴를 표적화하기 위한 TALEN 방법들이 또한 발명에 의해 구체화된다.

RNA-안내된 엔도뉴클레아제 (RGEN)는 박테리아 적응 면역 기계로부터 개발된 프로그래밍 가능한 게놈 엔지니어링 도구이다. 이 시스템에서 - 클러스터 형성되고 규칙적으로 사이에 틈이 있는 짧은 재발성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-관련된 (Cas) 면역 반응 - 단백질 Cas9는 그 중 하나가 표적 선택을 안내하는 두 개의 RNA와 복합체를 형성할 때 서열-특이적 엔도뉴클레아제를 형성한다.RGEN은 성분들 (Cas9 및 tracrRNA) 및 표적-특이적 CRISPR RNA (crRNA)로 구성된다. DNA 표적 절단의 효율 및 절단 부위의 위치는 둘 다 표적 인지에 대한 추가의 요구조건인, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 위치를 기준으로 달라진다 (Chen, H. et al, J. Biol. Chem. published online March 14, 2014, as Manuscript M1 13.539726). PLBD2 유전자 (예컨대 엑손 1 또는 엑손 2)의 붕괴를 표적화하기 위한 CRISPR-Cas9 방법 또는 발명에 의해 구체화된다.

또 다른 상동 재조합 방법, 예컨대 정확한 DNA-결합 특이성을 가지는 BuD-유도된 뉴클레아제 (BuDN)가 숙련된 당업자에게 활용될 수 있다 (Stella, S. et al. Acta Cryst. 2014, D70, 2042-2052). 단일 잔기-대-뉴클레오티드 코드가 SEQ ID NO:33 내의 특이적인 DNA 표적으로 BuDN을 안내한다.

서열-특이적 엔도뉴클레아제, 또는 임의의 상동 재조합 기법은 PLBD2를 코드화하는 엑손들, 예를 들면 CHO-K1 게놈, NCBI 기준 서열: NW_003614971.1에서, 뉴클레오티드 (nt) 175367 내지 175644 (SEQ ID NO:47) 내의 엑손 1; nt 168958 내지 169051 (SEQ ID NO:48) 내의 엑손 2; nt 166451 내지 166609 (SEQ ID NO:49) 내의 엑손 3; nt 164966 내지 165066 (SEQ ID NO:50) 내의 엑손 4; nt 164564 내지 164778 (SEQ ID NO:51) 내의 엑손 5; nt 162682 내지 162779 (SEQ ID NO:52) 내의 엑손 6; nt 160036 내지 160196 (SEQ ID NO:53) 내의 엑손 7; nt 159733 내지 159828 (SEQ ID NO:54) 내의 엑손 8; nt 159491 내지 159562 (SEQ ID NO:55) 내의 엑손 9; nt 158726 내지 158878 (SEQ ID NO:56) 내의 엑손 10; nt 158082 내지 158244 (SEQ ID NO:57) 내의 엑손 11; 또는 뉴클레오티드 (nt) 157747 내지 157914 (SEQ ID NO:58)에 있는 엑손 12 (여기서 PLBD2 엑손 1 내지 12는 마이너스 가닥 유전자에 대해 기술되고 각 서열의 상보물 또한 함께 통합된다) 중 임의의 하나에서 표적 서열에 대해 지시될 수 있다.

정확한 게놈 변형 방법은 SEQ ID NO:33 내의 특유한 표적 서열과 부합하는 활용 가능한 도구를 기반으로 선택되어서 세포 표현형의 붕괴를 피할 수 있다.

관심의 단백질

원핵 또는 진핵 세포에서 발현에 적합한 관심의 임의의 단백질은 제공된 엔지니어링된 숙주 세포 시스템에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심의 단백질은, 한정하는 것은 아니지만, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, ScFv 또는 그것의 단편, Fc-융합 단백질 또는 그것의 단편, 성장 인자 또는 그것의 단편, 사이토킨 또는 그것의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외재성 도메인 또는 그것의 단편을 포함한다. 관심의 단백질은 단일 하위유닛으로 구성되는 간단한 폴리펩티드 또는 둘 이상의 하위유닛을 포함하는 복잡한 다중하위유닛 단백질일 수 있다. 관심의 단백질은 생물제약학적 생성물, 식품 첨가제 또는 보존제, 또는 정제 및 품질 표준이 수행된 임의의 단백질 생성물일 수 있다.

숙주 세포 및 트랜스펙션

발명의 방법에 사용된 숙주 세포는 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 세포, 래트 세포 및 마우스 세포를 포함하여, 진핵 숙주 세포이다. 바람직한 구체예에서, 발명은 SEQ ID NO:33의 붕괴된 핵산 서열 단편을 포함하는 세포를 제공한다.

발명은 관심의 외인성 유전자를 포함하는 발현 벡터로 추가로 트랜스펙션된 엔지니어링된 포유류 숙주 세포를 포함하고, 그런 유전자는 생물제약학적 생성물을 코드화한다. 임의의 포유류 세포가 사용될 수 있지만, 한 특정 구체예에서 숙주 세포는 CHO 세포이다.

트랜스펙션된 숙주 세포는 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포를 포함한다. 발현된 단백질은 바람직하게 발명에 사용하기 위해, 선택된 핵산 서열에 따라, 배양 배지 안으로 분비되겠지만, 세포에 보유되거나 세포막에 쌓일 수 있다. 다양한 포유류 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 특이적인 선택 또는 증폭 계획을 위해 개발된 다른 세포주 또한, SEQ ID NO:33에 대해 적어도 80%의 상동성을 가지는 에스테라제 유전자가 하향조절되거나, 녹아웃 되거나 또는 그렇지 않으면 발명에 따라 붕괴된다면, 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 유용할 것이다. 구체화된 세포주는 K1로 표시된 CHO 세포주이다. 재조합 단백질의 고부피 생성을 이루기 위하여, 숙주 세포주는 적절한 경우에 생체반응기 배지에 대해 사전-적응될 수 있다.

여러 트랜스펙션 프로토콜이 기술분야에 공지이며, Kaufman (1988) Meth. Enzymology 185:537에서 검토된다. 선택된 트랜스펙션 프로토콜은 숙주 세포 유형 및 GOI의 성질에 따라 좌우될 것이고, 기본적인 실험을 기반으로 선택될 수 있다. 임의의 그런 프로토콜의 기본적인 요구조건은 먼저 적합한 숙주 세포 안에 관심의 단백질을 코드화하는 DNA를 도입하고, 다음에 상대적으로 안정한, 발현 가능한 방식으로 이종성 DNA를 통합한 숙주 세포를 확인하고 분리하는 것이다.

한 가지 통상적으로 사용되는 이종성 DNA의 세포 안으로의 도입 방법은 예를 들면 Wigler 등에 의해 기술된 것과 같이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980) 칼슘 포스페이트 침전이다. 이 방법에 의해 숙주 세포 안에 도입된 DNA는 자주 재배열을 진행하여, 이 과정이 독립적인 유전자들의 공트랜스펙션에 유용하도록 만든다.

박테리아 원형질체와 포유류 세포와의 폴리에틸렌-유도된 융합 (Schaffner et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163)은 이종성 DNA를 도입시키는 또 다른 유용한 방법이다. 원형질체 융합 프로토콜은 자주 포유류 숙주 세포 게놈 안에 통합된 플라스미드 DNA의 다수의 복사물을 생성하고, 이 기법은 GOI와 동일한 플라스미드 상에 있을 선택 및 증폭 마커를 필요로 한다.

전기 천공법 또한 예를 들면 Potter 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161, 1988) 또는 Shigekawa 등 (BioTechniques 6:742, 1988)에 의해 기술된 것과 같이, DNA를 직접 숙주 세포의 세포질 안으로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 원형질체 융합과 달리, 전기 천공법은 동일한 플라미스미드 상에 선택 마커 및 GOI를 필요로 하지 않는다.

이종성 DNA를 포유류 세포 안에 도입시키기에 유용한 다른 시약, 예컨대 리포펙틴^TM 시약 및 리포펙타민^TM 시약 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)이 기술되어 있다. 이들 두 가지 상업적으로 입수 가능한 시약은 배양된 세포에 적용될 때 핵산의 세포 안으로의 흡수를 용이하게 하는 지질-핵산 복합체 (또는 리포솜)를 형성하기 위해 사용된다.

GOI를 증폭시키기 위한 방법이 또한 관심의 재조합 단백질의 발현에 바람직하고, 전형적으로는 선택 마커의 사용을 포함한다 (Kaufman (상기 동일)에서 검토됨). 세포독성 약물에 대한 내성이 선택 마커로서 가장 빈번하게 사용된 특징이고, 우성 소질 (예컨대 숙주 세포 유형과 무관하게 사용될 수 있음) 또는 열성 소질 (예컨대 활성이 어느 것에 대해 선택되든 결핍성인 특정 숙주 세포 유형에 유용함)의 결과일 수 있다. 여러 증폭 가능한 마커가 발명의 세포주에 사용하기에 적합하고 기술분야에 잘 알려져 있는 발현 벡터 및 기법들에 의해 도입될 수 있다 (예컨대 Sambrook, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; pgs 16.9-16.14에 기술된 것과 같이).

앞서 기술되었거나 기술분야에서 알려져 있는, 조절 요소와 같은 유용한 선택 가능한 마커 및 유전자 증폭을 위한 다른 도구들이 또한 포유류 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용된 핵산 구성물에 포함될 수 있다. 선택된 트랜스펙션 프로토콜 및 그것에 사용하기 위해 선택된 요소들은 사용된 숙주 세포의 유형에 좌우될 것이다. 기술분야의 숙련자들은 특정 용도에 대해 발명을 적응시키기 위해 수많은 상이한 프로토콜 및 숙주 세포를 알고 있고, 세포 배양 시스템의 요구조건을 기준으로, 원하는 단백질의 발현을 위한 적절한 시스템을 선택할 수 있다.

발명의 다른 특징들은 발명의 예시를 위해 제공되고 그것을 제한하는 것으로 의도되지 않은 예시적인 구체예들의 다음 설명의 과정에서 분명해질 것이다.

실시예

다음의 실시예들은 기술분야에 통상의 지식을 가진 사람들에게 본원에 기술된 방법 및 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공하기 위해 제시되고, 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예컨대 양, 온도 등)에 대하여 정확성을 보장하기 위해 많은 노력이 기울여졌지만 일부 실험적 오차 및 편차는 확인되어야 한다. 다르게 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.

실시예 1. 숙주 세포에서 에스테라제 유전자의 표적화된 붕괴

CHO 세포 기원의 표적 에스테라제 유전자, 즉 포스포리파제 B-유사 2 유전자의 붕괴를 사용하기 위하여, 키메라 RNA (즉 가이드 RNA)와 그것의 게놈 표적 사이에 적어도 20 뉴클레오티드 (nt) 상동성을 필요로 하는 타입 II CRISPR/Cas 시스템을 사용하였다. 가이드 RNA 서열을 CHO 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 핵산 (SEQ ID NO:33) 내의 엑손의 특이적 표적화를 위해 디자인하였고 독특한 것으로 여겨진다 (게놈의 오프-표적 효과를 모방하기 위함). 다수의 작은 가이드 RNA (sgRNA)를 표 3에 열거한 다음의 PLBD2의 게놈 절편들을 표적화하는 게놈 편집 과정에 사용하기 위해 합성하였다.

SEQ ID NO:	SEQ ID NO:33 뉴클레오티드 번호	SEQ ID NO:47 (게놈 유전자좌에 있는 엑손 1의 nt 번호)	게놈 DNA 서열
38	110 - 139	170 - 199	5'-CTGAGGTGTTGCTGAATTGCCCGGCGGGCG-3'
39	227 - 198	82 - 111	5'-GACGCGGCGTCCAGCAGCACCGAGCGGACG-3'
40	182 - 211	98 - 127	5'-ACCCGCCGGTCTCCCGCGTCCGCTCGGTGC-3'
41	242 - 271	212 - 241	5'-TGGTGGACGGCATCCATCCCTACGCGGTGG-3'
42	33 - 62	3 - 32	5'-GGCGGCCCCCATGGACCGGAGCCCCGGCGG-3'
43	40 - 69	10 - 39	5'-CCCATGGACCGGAGCCCCGGCGGCCGGGCG-3'

sgRNA 발현 플라스미드 (System Biosciences, CAS940A-1)는 작은 가이드 RNA및 sgRNA에 이어지는 tracrRNA의 발현을 구동하는 인간 H1 프로모터를 함유한다. 불멸화된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를, CHO PLBD2의 제1 엑손을 표적화하기 위해 디자인한, Cas9-H1 효소와 이어서 sgRNA 서열들 중 하나, 예를 들면 sgRNA1 (SEQ ID NO:45) 또는 sgRNA2 (SEQ ID NO:46)를 코드화하는 플라스미드로 트랜스펙션하였다. sgRNA1 및 sgRNA2는 각각 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 53 및 59에서 또는 그 주변에서 이중 가닥 파괴 (DSB)를 생성하는 것으로 예측되었다. 그러므로 DSB는 PLBD2 출발 코돈의 하류로 대략 23 또는 29 뉴클레오티드에서 발생하는 것으로 예측되었다. (SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 1 내지 30은 신호 펩티드를 코드화하는 것을 주지하기 바람). 원래의 CHO 주를 선행하는 sgRNA, 또는 CHO 게놈에 존재하지 않는 유전자 서열을 코드화하는 sgRNA 없이 Cas9-H1 효소를 코드화하는 플라스미드로 트랜스펙션하는 네거티브 대조 트랜스펙션을 수행하였다.

sgRNA 표시	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:33 뉴클레오티드 번호	SEQ ID NO:47 (게놈 유전자좌에서 엑손 1의 nt 번호)	sgRNA (표적화 벡터 nt 서열)
sgRNA1	45	37 -56	7 -26	5'-GCCCCCATGGACCGGAGCCC-3'
sgRNA2	46	44 - 63	14 - 33	5'-TGGACCGGAGCCCCGGCGGC-3'

트랜스펙션에 이어서, 세포를 6일 동안 혈청-유리 배지에서 배양한 후, 유동 세포분석을 사용하여 단일 세포 클론하였다. 배양한 지 12일 후에 바람직한 성장 특성을 나타낸 안정한 클론들을 분리하고, 혈청-유리 배지에서 팽창시키고, 세포 펠릿을 유전형 분석을 위해 수집하고 클론 세포주를 모아두었다.

게놈 DNA (gDNA) 및 메신저 RNA (mRNA)를 클론성 세포 펠릿으로부터 분리하고 정량 PCR (qPCR)에 의해 분석하였다. 게놈 DNA와 그것의 전사의 붕괴를 검출하기 위하여, qPCR 프라이머 및 프로브를 이중 가닥 파괴 표적화 사건에 대해 사용된 sgRNA 서열과 중복하도록 디자인하였다. 후보 클론 중의 PLBD2 유전자 또는 전사물의 상대적인 풍부를 상대적인 qPCR 방법을 사용하여 측정하엿는데, 이때 네거티브 대조 트랜스펙션으로부터 유도된 클론들을 캘리브레이터로서 사용하였다. 도 1 참조. qPCR 프라이머 및 프로브들을 PLBD2 엑손 1의 sgRNA1 또는 sgRNA2 위치의 서열을 검출하기 위해 디자인하였다. 클론 1으로부터 분리된 gDNA 및 RNA는 둘 다 sgRNA1 또는 sgRNA2 영역에서 PLBD2 엑손 1의 qPCR 증폭을 지지하지 못하였지만, 하우스키핑 유전자, GAPDH의 증폭이 검출되었다. 이 데이터를 기반으로, 클론 1을 엑손 1의 두 개의 게놈 대립유전자가 붕괴되어 있는 PLBD2의 잠재적인 녹 아웃으로서 확인하였다. 게놈 DNA 및 mRNA의 증폭은 sgRNA2와 중복하는 프라이머들을 사용하여 클론 8에서 검출되지 않았지만, sgRNA1 프라이머/프로브는 대조값 이상으로 게놈 DNA를 검출하였다. 클론 8, 및 다른 것들을 부위-특정된 뉴클레아제 방법의 성능을 이해하기 위해 추가로 분석하였다.

클론 1의 전체 PLBD2 엑손 1의 크기를 gDNA 또는 RNA 유도된 주형으로부터 PCR에 의하여 분석하고 야생형 CHO 세포로부터 증폭된 것과 비교하였다. 암플리콘 단편의 길이를 Caliper GX 기기를 사용하여 측정하였다 (도 2). 클론 1로부터의 gDNA 및 mRNA 증폭은 둘 다 야생형 대조 세포로부터 증폭된 것보다 더 짧은 단일 PCR 단편을 초래하였다.

증폭 생성물을 서열 결정하였고, 결과적으로 클론 1이 PLBD2 녹 아웃으로서 확인되었는데, 여기서 PLBD2 유전자가 이동을 초래하는 11 bp 결실을 가지는 것으로 발견되었다.

발명자들은 또한 게놈 DNA 단편이 sgRNA 서열과 중복하는 qPCR 프라이머들에 의해 확인되었다는 사실에도 불구하고 예상외로 클론 8을 PLBD2 녹아웃으로서 확인하였다. 검출할 수 있는 포스포리파제 활성을 갖지 않거나 검출할 수 있는 포스포리파제 단백질을 갖지 않는 클론의 확인은 기술적으로 도전적이고 시간-소모적이었다. 부위-특정된 뉴클레아제 기법은 용이한 사용을 제공할 수 있지만, 조심스러운 스크리닝 및 잘못된 포지티브의 제거가 필요하고 여전히 두 개의 붕괴된 대립유전자를 갖는 단일 클론의 정체성에 관련하여 예측할 수 없는 결과가 있을 수 있다. 놀랍게도, 상기 기술된 기법을 사용하여 스크리닝된 클론들의 단지 1%만이 성공 가능한 PLBD2 녹아웃 클론으로서 확인되었다. 표 5 참조.

		클론의 수	총 수의 %
조사된 클론	모든 클론	191	100.0%
	sgRNA1 클론	96	50.3%
	sgRNA2 클론	95	49.7%
qPCR	조사된 191 클론으로부터의 포지티브 히트	14	7.3%
	sgRNA1 히트	7	3.7%
	sgRNA2 히트	7	3.7%
PCR에 의한 엑손 1 크기	모든 qPCR 히트	14	7.3%
	qPCR 폴스 포지티브	6	3.1%
	sgRNA1 히트	5	2.6%
	sgRNA2 히트	3	1.6%
서열 결정	모든 히트	8	4.2%
	KO + WT	1	0.5%
	선명하지 않은 이형접합체	3	1.6%
	프레임-내 붕괴	2	1.0%
	KO 붕괴	2	1.0%

실시예 2. 후보 클론성 세포주에서 단클론성 항체 (mAb1)의 도입 및 발현

클론 1 및 야생형 대조 숙주 세포주를 mAb1의 경쇄 및 중쇄, 전체 인간 IgG를 코드화하는 플라스미드로, Cre 재조합효소의 존재하에 트랜스펙션하여 EESYR 유전자좌 안으로의 재조합 중재된 카세트 교환 (RMCE) (미국 특허 제 7771997B2, 2010년 8월 10일에 발행됨)을 용이하게 하였다. 트랜스펙션된 배양물을 400 ug/mL의 하이그로마이신을 함유한 혈청-유리 배지에서 11일 동안 선택하였다. RMCE가 진행된 세포들을 유동 세포분석에 의해 분리하였다. PLBD2 녹 아웃 클론 1 및 야생형 숙주 세포주가 동등한 관찰된 재조합 집단을 생성하였다 (데이터는 제시하지 않음). mAb1을 발현하는 클론 1 유도된 동질유전자형의 세포주를 RS001로서 표시하였고, PLBD2 야생형 숙주로부터 기원한 mAb1 발현 세포주를 RSOWT로 표시하였다.

RS001 또는 RSOWT로부터의 mAb1의 공급-배치 생성을 표준 12일 과정으로 수행하였다. 각 생성 배양에 대한 조건화 배지를 0, 3, 5, 7, 10 및 13일에 샘플화하고 단백질-A 결합 부분을 정량하였다 (도 3). RS001 배양으로부터의 mAb1의 단백질 역가는 RSOWT로부터 생성된 것과 비교할만하였고, 예상외로 두 배양물과 관련하여 세포의 행동의 차이는 관찰할 수 없었다. CHO 숙주 세포에서 PLBD2 또는 임의의 내인성 유전자의 붕괴가 외인성 재조합 단백질, 특히 치료용 단클론성 항체의 생성에 관찰할 수 있을 정도의 유해한 효과를 미치지 않을 것이라고는 예측할 수 없다.

실시예 3. 미변형 CHO 세포에서 에스테라제 활성 검출

폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 분해를 측정하여 PLBD2 돌연변이의 상층액 중의 추정되는 에스테라제 활성을 검출하였다. CHO 세포로부터의 미정제된 단백질 상층액, 및 순차적인 정제 단계들을 수행했을 때 각 단계에서 또는 단계들의 순서대로 취한 상층액을 폴리소르베이트의 안정성에 대해 시험하였다. 보고된 퍼센트 무상 폴리소르베이트는 오염되는 에스테라제 활성의 양에 반비례하였다. 미정제된 단백질 상층액, 및 순차적인 정제 단계들을 수행했을 때 각 단계에서 또는 단계들의 순서대로 취한 상층액을 폴리소르베이트 분해를 측정하는 분석에서 시험하였다. 보고된 무상 폴리소르베이트의 상대적인 수준은 오염되는 에스테라제 활성의 수준에 반비례한다.

폴리소르베이트 20의 분해를 조사하여 단클론성 항체 제형 중의 폴리소르베이트 20 분해에 기여하는 병인성 제제를 측정하였다. 완충된 항체 (150 mg/mL)를 10 kDa 여과에 의해 2 부분으로 분리하였다: 단백질 부분 및 완충제 부분. 이들 두 부분, 뿐만 아니라 무상 완충 항체를 0.2% (w/v)의 고도로 정제된 폴리소르베이트 20 (PS20-B)으로 스파이킹하고 45℃에서 14일 동안 스트레스를 주었다. 연구는 (표 6, 파트 A, 칼럼 1-2) 완충제 부분이 아닌 단백질 부분이 소르비탄 라우레이트 (즉 폴리소르베이트 20의 주요 성분)의 분해에 영향을 미쳤고, 폴리소르베이트 20의 분해는 항체의 농도와 상관이 있었음 (표 6, 파트 B, 칼럼 3-4)을 보였다.

파트 A		파트 B
부분	남아 있는 % 에스테르 (45℃에서 12일)	항체 농도 (mg/mL)	남아 있는 % 에스테르 (45℃에서 12일)
약물 물질	75%	150	82%
단백질 부분	75%	75	92%
완충제 부분	100%	25	98%

단클론성 항체를 미변형 CHO 세포에서 제조하고 표 7에서와 같이, 상이한 방법에 의해 정제한 후 퍼센트 무상 폴리소르베이트 20에 의해 에스테라제 활성을 측정하였다.

방법 번호	정제 단계	퍼센트 무상 폴리소르베이트 20
1	단백질 A 친화성 포획 (PA)	54%
2	PA > 양이온 교환 (CEX)	25%
3	PA > CEX > 음이온 교환 (AEX)	86%
4	PA > CEX > 소수성 상호작용 (HIC)	90%
5	PA > AEX	83%
6	PA > AEX > HIC	92%

소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)가 잔류 PLBD2를 제거하는 데 가장 효과적이었다. 일부 상황에서, 정제 단계의 수의 감소 및 저렴한 비용이 실현될 수 있었다. 그러므로, 감소된 수준의 포스포리파제 발현을 가지는 변형된 CHO 세포가 정제 단계의 수를 감소시키고, 예컨대 HIC 정제에 대한 요구를 제거할 수 있는 것으로 고려된다.

실시예 4. 미변형 CHO 세포에 비교하여 변형된 세포로부터 정제된 mAb1에서 에스테라제 단백질 풍부 및 활성 검출

mAb1을 RS001 및 RSOWT로부터 제조하고 PA 단독, 또는 PA 및 AEX 크로마토그래피를 사용하여 조건 배지로부터 정제하였다. RS001 및 RSOWT로부터 PA-정제된 mAB1을 트립신 소화 질량 분광분석을 사용하여 리파제 풍부에 대해 분석하였다. RS001 및 RSOWT mAb1의 트립신 소화물을 삼중 4극 질량 분광분석기 세트에 결합되어 있는 역상 액체 크로마토그래피에 주입하여 SEQ ID NO:32로부터 단편화된 특이적인 생성물 이온을 모니터링하였다. 그것과 나란히, 일련의 PLBD2 표준을 내인성 PLBD2가 없는 mAb1에 달라지는 양의 재조합 PLBD2를 스파이킹함으로써 제조하였다. 실험 및 대조 반응의 신호를 사용하여 RS001 및 RSOWT로부터의 mAb1의 PLBD2의 풍부를 정량하였다 (도 4). PA 단독으로 정제하였을 때 클론 8-생성된 mAb1의 정제된 샘플에서 PLBD2 단백질의 검출 가능한 양을 관찰하지 못하였다 (데이터는 제시하지 않음).

본 발명은 다른 특정 구체예들로 구체화될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> HOST CELL PROTEIN MODIFICATION <130> 10143US01 <140> US 15/055,034 <141> 2016-02-26 <150> US 62/126,213 <151> 2015-02-27 <150> US 62/298,869 <151> 2016-02-23 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu 1 5 10 15 Arg <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu 1 5 10 15 Ala Cys Ile Pro Lys Pro 20 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Gln Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Gln Gly Pro Gln Glu Ala Tyr Pro Leu Ile Ala Gly Asn Asn Leu Val 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr 20 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr Phe Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ser Val Pro <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asn Ala 20 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Leu Ala Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Leu Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ala Ile Ile Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Tyr Val Gln Pro Gln Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Arg Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro 1 5 10 15 Pro Phe Gln <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Ser Phe Leu Glu Ile Asn Leu Glu Trp Met Gln Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp 1 5 10 15 Ala Asp Lys Thr Glu Asp 20 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro 1 5 10 15 Phe Gln <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys Arg 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Gln Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Ile Ile Lys Lys Tyr Gln Leu Gln Phe Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Ala Gln Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asn Ser 1 5 10 15 Met Val Arg <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu 1 5 10 15 Ala Cys Ile Pro Lys Pro 20 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu 1 5 10 15 Arg <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Tyr Asn Asn Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asn Ala 20 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Arg Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro 1 5 10 15 Pro Phe Gln <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr Phe Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ser Val Pro <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro 1 5 10 15 Phe Gln <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Gln Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg 1 5 <210> 32 <211> 585 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 32 Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Val Arg Ala 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Val Leu Leu Asn 20 25 30 Cys Pro Ala Gly Ala Leu Pro Thr Gln Gly Pro Gly Arg Arg Arg Gln 35 40 45 Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Ile His Pro Tyr Ala Val 65 70 75 80 Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr 85 90 95 Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr 100 105 110 Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met 115 120 125 His Trp Met Asn Thr Met Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu 130 135 140 Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ile Asn Leu Glu 145 150 155 160 Trp Met Gln Arg Glu Met Glu Leu Ser Gln Asp Ser Pro Tyr Trp His 165 170 175 Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr 180 185 190 Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Pro Leu 195 200 205 Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Gln 210 215 220 Ala Leu Asn Lys Thr Ser Thr Lys Leu Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys 225 230 235 240 Ser Ala Ile Ile Lys Leu Leu Pro Gly Ala Arg Asp Leu Leu Val Ala 245 250 255 His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys 260 265 270 Tyr Gln Leu Gln Phe Arg Gln Gly Pro Gln Glu Ala Tyr Pro Leu Ile 275 280 285 Ala Gly Asn Asn Leu Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser 290 295 300 Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr 305 310 315 320 Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln 325 330 335 Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala 340 345 350 Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys Gln Phe Asn Ser Gly 355 360 365 Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro 370 375 380 Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile 385 390 395 400 Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Glu Asp Leu Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Phe Phe Glu Ile Val Phe Asn 420 425 430 Ala Ser Gly Leu Gln Asp Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser 435 440 445 Tyr Thr Lys Asn Pro Arg Ala Gln Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu 450 455 460 Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe 465 470 475 480 Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile Pro Lys Pro Asn 485 490 495 Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly 500 505 510 Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Tyr Gln Arg Pro His Gly Gly Ile Asp 515 520 525 Val Lys Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys Arg Met Ser Met Leu Ala 530 535 540 Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Leu 545 550 555 560 Ser Pro Phe Arg Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr 565 570 575 Phe Ser Pro Ile Ser Val Pro Trp Asp 580 585 <210> 33 <211> 2218 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 33 gacagtcacg tggcccgact gaggcacgcg atggcggccc ccatggaccg gagccccggc 60 ggccgggcgg tccgggcgct gaggctagcg ctggcgctgg cctcgctgac tgaggtgttg 120 ctgaattgcc cggcgggcgc cctccccacg caggggcccg gcaggcggcg ccaaaacctc 180 gacccgccgg tctcccgcgt ccgctcggtg ctgctggacg ccgcgtcggg tcagctgcgc 240 ctggtggacg gcatccatcc ctacgcggtg gcctgggcca acctcaccaa cgccattcgc 300 gagaccgggt gggcctatct ggacttgggt acaaatggaa gctacaatga cagcctgcag 360 gcctatgcag ctggtgtggt ggaggcttct gtgtctgagg agctcatcta catgcactgg 420 atgaacacaa tggtcaacta ctgtggcccc ttcgagtatg aagttggcta ctgtgagaag 480 ctcaagagct tcctggagat caacctggag tggatgcaga gggagatgga actcagccag 540 gactctccat attggcacca ggtgcggctg accctcctgc agctgaaagg cctagaggac 600 agctacgaag gccgtttgac cttcccaact gggaggttca ccattaaacc cttggggttc 660 ctcctgctgc agattgccgg agacctggaa gacctagagc aagccctgaa taagaccagc 720 accaagcttt ccctgggctc cggttcctgc tccgctatca tcaagttgct gccaggcgca 780 cgtgacctcc tggtggcaca caacacatgg aactcctacc agaacatgct acgcatcatc 840 aagaagtacc agctgcagtt ccggcagggg cctcaagagg cgtaccccct gattgctggc 900 aacaatttgg tcttttcgtc ttacccgggc accatcttct ctggcgatga cttctacatc 960 ctgggcagtg ggctggtcac cctggagacc accattggca acaagaatcc agccctgtgg 1020 aagtacgtgc agccccaggg ctgtgtgctg gagtggattc gaaacatcgt ggccaaccgc 1080 ctggccttgg acggggccac ctgggcagac atcttcaagc agttcaatag tggcacgtat 1140 aataaccaat ggatgattgt ggactacaag gcattcatcc ccaacgggcc cagccctgga 1200 agccgagtgc ttaccatcct agaacagatc ccgggcatgg tggtggtggc cgacaagact 1260 gaagatctct acaagacaac ctactgggct agctacaaca tcccgttctt tgagattgtg 1320 ttcaacgcca gtgggctgca ggacttggtg gcccaatatg gagattggtt ttcctacact 1380 aagaaccctc gagctcagat cttccagagg gaccagtcgc tggtggagga catgaattcc 1440 atggtccggc tcataaggta caacaacttc cttcacgacc ctctgtcact gtgtgaagcc 1500 tgtatcccga agcccaatgc agagaatgcc atctctgccc gctctgacct caatcctgcc 1560 aatggctcct acccatttca agccctgtac cagcgtcccc acggtggcat cgatgtgaag 1620 gtgaccagct tttcactggc caagcgcatg agcatgctgg cagccagtgg cccaacgtgg 1680 gatcagttgc ccccattcca gtggagttta tcgccgttcc gcagcatgct tcacatgggc 1740 cagcctgatc tctggacatt ctcacccatc agtgtcccat gggactgaga ctttgcctcc 1800 acccagttgc cttcattctg tgtggccagt agggtcacac acctgctacc caccctttgg 1860 ggctctgtcc tcactggact ctggtctgtg tggtctcctc tgcagggaca caaacccagt 1920 aggctcagag ctgactccat ccccaagtct tctgccctcc atcactcctt ctctctgccc 1980 ctgtcaccag tgggctgggg cttgtgcttg gctgtgggcc tggtgggatt ctgggcgcca 2040 ttttcctagt gctggtccct cagtgtgtgt gtgggggaca ttgatagggc ttatcattgc 2100 tgtcactact agcctgcggg cccatctcct cagggagcag tccatgtccc cttctctggg 2160 cagctttcct gaggatagaa gcttgaaaac aaaaaaccaa agtttctggc tgctttta 2218 <210> 34 <211> 594 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Met Ala Ala Pro Val Asp Gly Ser Ser Gly Gly Trp Ala Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ala Leu Ala Leu Thr Ser Leu Thr Thr Leu Ala Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Ser Gly Pro Ala Gly Ala Leu Pro 35 40 45 Thr Leu Gly Pro Gly Trp Gln Arg Gln Asn Pro Asp Pro Pro Val Ser 50 55 60 Arg Thr Arg Ser Leu Leu Leu Asp Ala Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu 65 70 75 80 Glu Asp Gly Phe His Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn 85 90 95 Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr Leu Asp Leu Ser Thr Asn Gly 100 105 110 Arg Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala 115 120 125 Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met His Trp Met Asn Thr Val Val 130 135 140 Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu 145 150 155 160 Lys Asn Phe Leu Glu Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Arg Glu Met Glu 165 170 175 Leu Asn Pro Asp Ser Pro Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu 180 185 190 Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro 195 200 205 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile 210 215 220 Ser Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Pro Ala Leu Asn Lys Thr Asn Thr 225 230 235 240 Lys Pro Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu 245 250 255 Pro Gly Gly His Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr 260 265 270 Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys Tyr Arg Leu Gln Phe Arg Glu 275 280 285 Gly Pro Gln Glu Glu Tyr Pro Leu Val Ala Gly Asn Asn Leu Val Phe 290 295 300 Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro 325 330 335 Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile 340 345 350 Arg Asn Val Val Ala Asn Arg Leu Ala Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala 355 360 365 Asp Val Phe Lys Arg Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met 370 375 380 Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Leu Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser 385 390 395 400 Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala 405 410 415 Asp Lys Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn 420 425 430 Ile Pro Tyr Phe Glu Thr Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu 435 440 445 Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Lys Asn Pro Arg Ala 450 455 460 Lys Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Met Asp Ala Met 465 470 475 480 Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu 485 490 495 Cys Glu Ala Cys Asn Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala 500 505 510 Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu 515 520 525 His Gln Arg Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Phe Thr 530 535 540 Leu Ala Lys Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp 545 550 555 560 Gln Cys Pro Pro Phe Gln Trp Ser Lys Ser Pro Phe His Ser Met Leu 565 570 575 His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Met Phe Ser Pro Ile Arg Val Pro 580 585 590 Trp Asp <210> 35 <211> 585 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 35 Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Thr His Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ser 20 25 30 Gly Leu Ala Gly Ala Leu Pro Thr Leu Gly Pro Gly Trp Arg Arg Gln 35 40 45 Asn Pro Glu Pro Pro Ala Ser Arg Thr Arg Ser Leu Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Glu Tyr Gly Phe His Pro Asp Ala Val 65 70 75 80 Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr 85 90 95 Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr 100 105 110 Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met 115 120 125 His Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu 130 135 140 Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ala Asn Leu Glu 145 150 155 160 Trp Met Gln Arg Glu Met Glu Leu Ser Pro Asp Ser Pro Tyr Trp His 165 170 175 Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr 180 185 190 Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg Phe Asn Ile Lys Pro Leu 195 200 205 Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ser Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Pro 210 215 220 Ala Leu Asn Lys Thr Asn Thr Lys Pro Ser Val Gly Ser Gly Ser Cys 225 230 235 240 Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Ser His Asp Leu Leu Val Ala 245 250 255 His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys 260 265 270 Tyr Arg Leu Gln Phe Arg Glu Gly Pro Gln Glu Glu Tyr Pro Leu Ile 275 280 285 Ala Gly Asn Asn Leu Ile Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser 290 295 300 Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr 305 310 315 320 Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln 325 330 335 Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala 340 345 350 Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Val Phe Arg Arg Phe Asn Ser Gly 355 360 365 Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro 370 375 380 Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile 385 390 395 400 Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Ala Glu Leu Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Tyr Phe Glu Ser Val Phe Asn 420 425 430 Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser 435 440 445 Tyr Thr Arg Asn Pro Arg Ala Lys Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu 450 455 460 Val Glu Asp Val Asp Thr Met Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe 465 470 475 480 Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ser Pro Lys Pro Asn 485 490 495 Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly 500 505 510 Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg Ala His Gly Gly Ile Asp 515 520 525 Val Lys Val Thr Ser Val Ala Leu Ala Lys Tyr Met Ser Met Leu Ala 530 535 540 Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Lys 545 550 555 560 Ser Pro Phe His Asn Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Met 565 570 575 Phe Ser Pro Val Lys Val Pro Trp Asp 580 585 <210> 36 <211> 589 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Val Gly Gln Met Tyr Cys Tyr Pro Gly Ser His Leu Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Thr Arg Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Val Gly 20 25 30 Pro Phe Leu Ser Gly Leu Ala Gly Ala Ile Pro Ala Pro Gly Gly Arg 35 40 45 Trp Ala Arg Asp Gly Gln Val Pro Pro Ala Ser Arg Ser Arg Ser Val 50 55 60 Leu Leu Asp Val Ser Ala Gly Gln Leu Leu Met Val Asp Gly Arg His 65 70 75 80 Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr 85 90 95 Gly Trp Ala Phe Leu Glu Leu Gly Thr Ser Gly Gln Tyr Asn Asp Ser 100 105 110 Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ala Val Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Ile Tyr Met His Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro 130 135 140 Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Glu 145 150 155 160 Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Glu Glu Met Glu Ser Asn Pro Asp Ser 165 170 175 Pro Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg Val Ser Phe Pro Ala Gly Lys Phe Thr 195 200 205 Ile Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Leu Ser Gly Asp Leu Glu 210 215 220 Asp Leu Glu Leu Ala Leu Asn Lys Thr Lys Ile Lys Pro Ser Leu Gly 225 230 235 240 Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Gln Ser Asp 245 250 255 Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn Asn Tyr Gln His Met Leu Arg 260 265 270 Val Ile Lys Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Arg Glu Gly Pro Trp Gly Asp 275 280 285 Tyr Pro Leu Val Pro Gly Asn Lys Leu Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly 290 295 300 Thr Ile Phe Ser Cys Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val 305 310 315 320 Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr 325 330 335 Val Arg Pro Arg Gly Cys Val Leu Glu Trp Val Arg Asn Ile Val Ala 340 345 350 Asn Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys Arg 355 360 365 Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys 370 375 380 Ala Phe Ile Pro Gly Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile 385 390 395 400 Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Ser Glu 405 410 415 Leu Tyr Gln Lys Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Ser Phe Glu 420 425 430 Thr Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln Tyr Gly 435 440 445 Asp Trp Phe Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gln Ile Phe Arg Arg 450 455 460 Asn Gln Ser Leu Val Gln Asp Met Asp Ser Met Val Arg Leu Met Arg 465 470 475 480 Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Lys Ala Cys Asn 485 490 495 Pro Gln Pro Asn Gly Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn 500 505 510 Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg Ser His 515 520 525 Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Met Ser Leu Ala Arg Ile Leu 530 535 540 Ser Leu Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Val Pro Pro Phe 545 550 555 560 Gln Trp Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gly Leu Leu His Met Gly Gln Pro 565 570 575 Asp Leu Trp Lys Phe Ala Pro Val Lys Val Ser Trp Asp 580 585 <210> 37 <211> 589 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 37 Met Val Ala Pro Met Tyr Gly Ser Pro Gly Gly Arg Leu Ala Arg Ala 1 5 10 15 Val Thr Arg Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Val Gly 20 25 30 Leu Phe Leu Ser Gly Leu Thr Gly Ala Ile Pro Thr Pro Arg Gly Gln 35 40 45 Arg Gly Arg Gly Met Pro Val Pro Pro Ala Ser Arg Cys Arg Ser Leu 50 55 60 Leu Leu Asp Pro Glu Thr Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Arg His 65 70 75 80 Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr 85 90 95 Gly Trp Ala Phe Leu Glu Leu His Thr Asn Gly Arg Phe Asn Asp Ser 100 105 110 Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ala Val Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Ile Tyr Met Tyr Trp Met Asn Thr Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro 130 135 140 Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu Arg Leu Lys Asn Phe Leu Glu 145 150 155 160 Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Lys Glu Met Glu Leu Asn Asn Gly Ser 165 170 175 Ala Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Ser Val Ala Phe Pro Thr Gly Lys Phe Thr 195 200 205 Val Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ser Gly Asp Leu Glu 210 215 220 Asp Leu Glu Val Ala Leu Asn Lys Thr Lys Thr Asn His Ala Met Gly 225 230 235 240 Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys Leu Leu Pro Gly Gln Arg Asp 245 250 255 Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp His Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Arg 260 265 270 Ile Met Lys Lys Tyr Trp Phe Gln Phe Arg Glu Gly Pro Gln Ala Glu 275 280 285 Ser Thr Arg Ala Pro Gly Asn Lys Val Ile Phe Ser Ser Tyr Pro Gly 290 295 300 Thr Ile Phe Ser Cys Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val 305 310 315 320 Thr Leu Glu Thr Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr 325 330 335 Val Gln Pro Thr Gly Cys Val Leu Glu Trp Met Arg Asn Val Val Ala 340 345 350 Asn Arg Leu Ala Leu Asp Gly Asp Ser Trp Ala Asp Ile Phe Lys Arg 355 360 365 Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys 370 375 380 Ala Phe Val Pro Gly Gly Pro Ser Pro Gly Arg Arg Val Leu Thr Val 385 390 395 400 Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Arg Thr Ser Glu 405 410 415 Leu Tyr Gln Lys Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Ser Phe Glu 420 425 430 Ser Val Phe Asn Ala Ser Gly Leu Pro Ala Leu Val Ala Arg Tyr Gly 435 440 445 Pro Trp Phe Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Arg Ala Gln Ile Phe Arg Arg 450 455 460 Asn His Ser Leu Val His Asp Leu Asp Ser Met Met Arg Leu Met Arg 465 470 475 480 Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Lys Ala Cys Thr 485 490 495 Pro Lys Pro Asn Gly Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn 500 505 510 Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu His Gln Arg Ser His 515 520 525 Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Thr Ala Leu Ala Lys Ala Leu 530 535 540 Arg Leu Leu Ala Val Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe 545 550 555 560 Gln Trp Ser Thr Ser Pro Phe Ser Gly Met Leu His Met Gly Gln Pro 565 570 575 Asp Leu Arg Lys Phe Ser Pro Ile Glu Val Ser Trp Asp 580 585 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 ctgaggtgtt gctgaattgc ccggcgggcg 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 gacgcggcgt ccagcagcac cgagcggacg 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 acccgccggt ctcccgcgtc cgctcggtgc 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 tggtggacgg catccatccc tacgcggtgg 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 ggcggccccc atggaccgga gccccggcgg 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cccatggacc ggagccccgg cggccgggcg 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 gacagtcacg tggcccgact gaggcacgcg 30 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 gcccccatgg accggagccc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 tggaccggag ccccggcggc 20 <210> 47 <211> 278 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 47 ccggtctcgc gaatggcgtt ggtgaggttg gcccaggcca ccgcgtaggg atggatgccg 60 tccaccaggc gcagctgacc cgacgcggcg tccagcagca ccgagcggac gcgggagacc 120 ggcgggtcga ggttttggcg ccgcctgccg ggcccctgcg tggggagggc gcccgccggg 180 caattcagca acacctcagt cagcgaggcc agcgccagcg ctagcctcag cgcccggacc 240 gcccggccgc cggggctccg gtccatgggg gccgccat 278 <210> 48 <211> 94 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 48 ctcctcagac acagaagcct ccaccacacc agctgcatag gcctgcaggc tgtcattgta 60 gcttccattt gtacccaagt ccagataggc ccac 94 <210> 49 <211> 159 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 49 ctggtgccaa tatggagagt cctggctgag ttccatctcc ctctgcatcc actccaggtt 60 gatctccagg aagctcttga gcttctcaca gtagccaact tcatactcga aggggccaca 120 gtagttgacc attgtgttca tccagtgcat gtagatgag 159 <210> 50 <211> 101 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 50 aggaacccca agggtttaat ggtgaacctc ccagttggga aggtcaaacg gccttcgtag 60 ctgtcctcta ggcctttcag ctgcaggagg gtcagccgca c 101 <210> 51 <211> 215 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 51 cttgaggccc ctgccggaac tgcagctggt acttcttgat gatgcgtagc atgttctggt 60 aggagttcca tgtgttgtgt gccaccagga ggtcacgtgc gcctggcagc aacttgatga 120 tagcggagca ggaaccggag cccagggaaa gcttggtgct ggtcttattc agggcttgct 180 ctaggtcttc caggtctccg gcaatctgca gcagg 215 <210> 52 <211> 98 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 52 cagcccactg cccaggatgt agaagtcatc gccagagaag atggtgcccg ggtaagacga 60 aaagaccaaa ttgttgccag caatcagggg gtacgcct 98 <210> 53 <211> 161 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 53 gtgccactat tgaactgctt gaagatgtct gcccaggtgg ccccgtccaa ggccaggcgg 60 ttggccacga tgtttcgaat ccactccagc acacagccct ggggctgcac gtacttccac 120 agggctggat tcttgttgcc aatggtggtc tccagggtga c 161 <210> 54 <211> 96 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 54 gggatctgtt ctaggatggt aagcactcgg cttccagggc tgggcccgtt ggggatgaat 60 gccttgtagt ccacaatcat ccattggtta ttatac 96 <210> 55 <211> 72 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 55 gggatgttgt agctagccca gtaggttgtc ttgtagagat cttcagtctt gtcggccacc 60 accaccatgc cc 72 <210> 56 <211> 153 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 56 cttatgagcc ggaccatgga attcatgtcc tccaccagcg actggtccct ctggaagatc 60 tgagctcgag ggttcttagt gtaggaaaac caatctccat attgggccac caagtcctgc 120 agcccactgg cgttgaacac aatctcaaag aac 153 <210> 57 <211> 163 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 57 cttcacatcg atgccaccgt ggggacgctg gtacagggct tgaaatgggt aggagccatt 60 ggcaggattg aggtcagagc gggcagagat ggcattctct gcattgggct tcgggataca 120 ggcttcacac agtgacagag ggtcgtgaag gaagttgttg tac 163 <210> 58 <211> 168 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 58 tcagtcccat gggacactga tgggtgagaa tgtccagaga tcaggctggc ccatgtgaag 60 catgctgcgg aacggcgata aactccactg gaatgggggc aactgatccc acgttgggcc 120 actggctgcc agcatgctca tgcgcttggc cagtgaaaag ctggtcac 168 <210> 59 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 gggcuccggu ccaugggggc 20 <210> 60 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 gccgccgggg cuccggucca 20

Claims

포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 변형을 포함하는 재조합 숙주 세포로서, 변형이 그 변형이 없는 세포에서의 PLBD2 단백질의 발현 수준에 비하여 PLBD2 단백질의 발현 수준을 감소시키는, 숙주 세포.
제1 항에 있어서, 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 모든 대립 유전자가 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포는 검출 가능한 포스포리파제 B-유사 2 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 PLBD2 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 엑손 1 내에 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, PLBD2 단백질은 SEQ ID NO:32에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, PLBD2 단백질은 SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 SEQ ID NO:47 내에 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 외인성 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 숙주 세포.
제8 항에 있어서, 관심의 외인성 단백질은 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편, 항원-결합 단백질 및 Fc-융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 검출 가능한 에스테라제 활성을 갖지 않는 단백질 A-결합 부분을 생성하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
(a) 미변형 세포와 비교하여 감소된 수준의 에스테라제를 생성하도록 변형된 숙주 세포로부터 재조합 단백질 및 복수의 숙주 세포 단백질을 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (b) 그 샘플에 대하여 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 제거하기 위해 적어도 하나의 정제 단계를 수행하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법.
제11 항에 있어서, 복수의 숙주 세포 단백질은 검출 가능한 양의 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제11 항 또는 제12 항에 있어서, 숙주 세포는 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계는 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 및 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 숙주 세포를 변형시키는 단계, (b) 관심의 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 트랜스펙션하는 단계, (c) 숙주 세포로부터 관심의 단백질을 포함하는 단백질 부분을 추출하는 단계, (c) 단백질 부분을 단백질 A 친화성 (PA) 배지, 양이온 교환 (CEX) 배지 및 음이온 교환 (AEX) 배지로 구성되는 군으로부터 선택된 크로마토그래피 배지와 접촉시키는 단계, (d) 배지로부터 관심의 단백질을 수집하는 단계, 및 (e) 관심의 단백질을 지방산 에스테르, 및 선택적으로 완충제 및 열 안정화제와 조합시키는 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 에스테라제 활성을 감소시키는 방법.
제16 항에 있어서, 숙주 세포를 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) 단백질의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 변형시키는 단계는 PLBD2 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 엑손 1 내에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 삽입 또는 결실시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제17 항에 있어서, PLBD2 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:32에 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
변경된 PLBD2 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제19 항에 있어서, PLBD2 유전자는 코딩 영역의 붕괴에 의해 변경되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
제18 항 또는 제19 항에 있어서, PLBD2 유전자 변경은 이중대립유전자 변경을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
제19 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, PLBD2 유전자 변경은 PLBD2 유전자의 1 이상의 염기쌍, 2 이상의 염기쌍, 3 이상의 염기쌍, 4 이상의 염기쌍, 5 이상의 염기쌍, 6 이상의 염기쌍, 7 이상의 염기쌍, 8 이상의 염기쌍, 9 이상의 염기쌍, 10 이상의 염기쌍, 11 이상의 염기쌍, 12 이상의 염기쌍, 13 이상의 염기쌍, 14 이상의 염기쌍, 15 이상의 염기쌍, 16 이상의 염기쌍, 17 이상의 염기쌍, 18 이상의 염기쌍, 19 이상의 염기쌍 또는 20 이상의 염기쌍의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.