CN107406448B - 呈柠檬酸盐形式的化合物的颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及N‑(5‑氰基‑4‑((2‑甲氧乙基)氨基)吡啶‑2‑基)‑7‑甲酰基‑6‑((4‑甲基‑2‑氧代哌嗪‑1‑基)甲基)‑3,4‑二氢‑1,8‑萘啶‑1(2H)‑甲酰胺的颗粒；制备所述颗粒的方法；包含所述颗粒的药物组合物；及使用所述药物组合物治疗癌症的方法。

Description

呈柠檬酸盐形式的化合物的颗粒
技术领域
本发明涉及N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒；制备所述颗粒的方法；及所述颗粒在药物组合物中的用途。
背景技术
N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺为专利申请PCT/IB2014/065585中所描述的选择性且强效的FGFR4抑制剂。其潜在地适用于治疗由FGFR4介导的疾病，诸如癌症，特别是诸如肝癌。PCT/IB2014/065585描述了制备呈游离形式及呈药学上可接受的盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的方法。
在药物开发中，持续需要开发旨在改良原料药的特性和/或特征的新方法。例如，原料药应呈易于处理且易于制成药品的形式。原料药的所述理想特性应该通过可放大规模且可重复的方法实现。
发明内容
本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒；及制备所述颗粒的方法。所述颗粒可用于制备药物组合物且可用于治疗、预防或改善癌症的方法。在此所描述的方法允许制备N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，所述颗粒就可加工性的简易性而言具有有益的特性。如在此所提供的详细说明、实验部分及附图中更详细显示的，与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒相比，所述颗粒具有改良的流动特性。
在此描述本发明的各种实施方式。
在此提供用于制备呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒的方法。该方法包含以下步骤：
a.将N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺溶解于丙酸中；
b.添加柠檬酸至步骤a)中所获得的溶液中，以获得包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的悬浮液；及
c.自步骤b中所获得的悬浮液分离呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒。
在一实施方式中，本发明提供可通过在此所描述的方法获得的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒。
在此也提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其中值粒度(x50)在200与300微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其粒度分布x10在5与10微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其粒度分布x90在400与500微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒，其粒度分布x50在10与20微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒，其粒度分布x10在1与5微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒，其粒度分布x90在50与70微米之间。
在另一实施方式中，本发明提供呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的结晶初始颗粒，其具有柱状晶体形状。
在另一实施方式中，本发明提供包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒的凝聚物，该凝聚物的中值尺寸(x50)在300与400微米之间。
在另一实施方式中，本发明涉及如在此所描述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺及任选的一或多种药学上可接受的载体。
在另一实施方式中，本发明涉及包含如在此所描述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒及任选的一或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一实施方式中，在此所描述的药物组合物用作药物。在一特定实施方式中，其用于治疗癌症。更具体地，其用于治疗选自以下的适应症：肝癌、乳腺癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌。甚至更具体地，其用于治疗肝癌。
在一实施方式中，本发明涉及治疗癌症的方法，其包含向个体施用治疗有效量的如在此所描述的药物组合物。
在一实施方式中，本发明涉及如在此所描述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物的用途。更具体地，其用于治疗选自以下的适应症：肝癌、乳腺癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌。甚至更具体地，其用于治疗肝癌。
附图简要说明
图1为使用本发明方法获得的颗粒的扫描电子显微镜(SEM)影像 (标度20微米)。影像使用来自Zeiss的配备有Supra 40显微镜的SEM设备拍摄。其显示具有柱状晶体形状的初始颗粒。
图2为使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒的扫描电子显微照片(SEM) (标度20微米)。影像使用来自Zeiss的配备有Supra 40显微镜的SEM设备拍摄。其显示针状初始颗粒的簇群。
图3为使用本发明的方法获得的颗粒的扫描电子显微照片(SEM) (标度100微米)。影像使用来自Zeiss的配备有Supra 40显微镜的SEM设备拍摄。该图显示初始颗粒的凝聚物。在凝聚物中，可见具有柱状晶体形状的初始颗粒。
图4为使用本发明的方法获得的颗粒的扫描电子显微照片(SEM) (标度500微米)。影像使用来自Zeiss的配备有Supra 40显微镜的SEM设备拍摄。该图显示初始颗粒的凝聚物。
图5显示使用本发明的方法获得的颗粒的XRPD及使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒的XRPD的重叠图。重叠图显示，本发明的颗粒及使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒两者具有相同标识。
图6显示使用本发明的方法获得的颗粒的粒度分布。该图显示随粒度而变化的分布密度及累积分布曲线。其显示颗粒含有粒度在0.5至150微米范围内的初始颗粒与粒度在150至875微米范围内的凝聚物的混合物。
图7显示使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒的粒度分布。该图显示随粒度而变化的分布密度及累积分布曲线。其显示颗粒具有在约0.5至30微米范围内的粒度。
图8为通过本发明的方法步骤a)及b)(即分离步骤之前)获得的颗粒的SEM (200微米)。影像用配备有相机DP25 (序号SN8K08782)的Olympus BX51显微镜(序号SN8G30637)拍摄。用于成像的软件为StreamStart。影像显示具有柱状晶体惯态的结晶颗粒。
图9显示如实施例1及1a中所描述的本发明颗粒及使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)的基本流动能。该图显示与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)相比，本发明的颗粒需要更少的能量来流动，表明改良的流动性。
图10显示如实施例1及1a中所描述的本发明颗粒及使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)随所施加的正应力而变化的可压缩性百分比。该图显示本发明颗粒具有更高的可压缩性百分比，表明使用本发明的颗粒可以实现最终药品中的更高的载药量。
图11显示如实施例1及1a中所描述的本发明颗粒及使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)随所施加的正应力而变化的剪应力。这使得能够计算壁摩擦角。该图显示与使用PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)相比，本发明的颗粒具有更低的壁摩擦角，表明本发明的颗粒对金属表面呈现更少的粘着行为且因此改良的可加工性。
发明详细说明
定义
当定义溶液中化合物的浓度时，术语“%”是指w/w%，即，化合物重量相比于溶液(即，化合物+溶剂)重量。
除非另外定义，在此所用的呈复数的术语“颗粒”是指大量颗粒。
除非另外定义，在此所用的呈复数的术语“晶体”是指大量晶体。
术语“颗粒”意欲涵盖初始颗粒及凝聚物。
如在此所用，术语“初始颗粒”是指单个的实体。本发明的初始颗粒可见于例如图1及8中。
如在此所用，术语“凝聚物”是指初始颗粒的簇集。如在此所用，术语“凝聚物”不意欲对初始颗粒之间的连接的性质加以限制，且可例如与术语“聚集体”互换使用。
通过激光衍射所测量的以体积计的累积筛下物(undersize)粒度分布来确定粒度。例如，中值粒度值(x50或d50)表示在样品中存在的50重量%颗粒所小于的尺寸。例如，x50值为10微米表示50重量%颗粒具有小于10微米的尺寸。
类似地，x10或d10的粒度表示在样品中存在的10重量%颗粒所小于的尺寸。
类似地，x90或d90的粒度表示在样品中存在的90重量%颗粒所小于的尺寸。
应理解，根据所使用的设备及方法，在此所给定的粒度会存在变化。技术人员将理解，这些值不是绝对值且可改变约+/- 10%。
在本说明书中，通过激光衍射测量粒度。用于激光衍射的设备为Sympatec Helos设备。所使用设备及测量的细节在实施例3及4中给出。
如在此所用，缩写“微米”对应于微米。
如在此所用，提及本发明颗粒的晶体形状的术语“柱状”描述如例如图1中所显示的晶体形状。“柱状”晶体形状为小平面型三维生长晶体。柱状晶体形状也可定义为板条。其可与晶体生长为单向的针晶体形状(或针状晶体)相区别。
如在此所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收推迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料及其类似物及其组合，如本领域技术人员所已知(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版Mack Printing Company, 1990, 第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不兼容，否则涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
术语本发明的化合物的“治疗有效量”是指将诱发个体的生物学或医学反应(例如酶或蛋白质活性的降低或抑制)或改善症状、缓解病状、减缓或推迟疾病进展或预防疾病等的本发明的化合物的量。 在一个非限制性实施方式中，术语“治疗有效量”是指当向个体施用时有效实现以下效果的本发明的化合物的量：(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善病状或病症或疾病，该病状或病症或疾病(i)由FGFR4介导、或(ii)与FGFR4活性相关、或(iii)以FGFR4的活性(正常或异常)表征；或(2)降低或抑制FGFR4的活性；或(3)减少或抑制FGFR4的表达。在另一非限制性实施方式中，术语“治疗有效量”是指当向细胞、或组织、或非细胞生物材料、或介质施用时有效地至少部分降低或抑制FGFR4的活性的本发明的化合物的量。
如在此所用，术语“个体”是指动物。动物通常为哺乳动物。个体也指例如灵长类动物(例如，人类，男性或女性)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟类及其类似物。在某些实施方式中，个体为灵长类动物。在其他实施方式中，个体为人类。
如在此所用，术语“抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)”是指减少或抑制给定病状、症状、或病症、或疾病，或显著降低生物活性或过程的基线活性。
如在此所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”任何疾病或病症在一个实施方式中是指改善疾病或病症(即，减缓、或停滞、或减少疾病或其至少一个临床症状的发展)。在另一实施方式中，“治疗”是指缓解或改善至少一个生理参数，包括患者可能无法辩别的生理参数。在又一实施方式中，“治疗”是指在身体上(例如，可辩别症状的稳定化)、生理上(例如身体参数的稳定化)或在两方面调节疾病或病症。在又一实施方式中，“治疗”是指预防或推迟疾病或病症的发作、或发展、或进展。
如在此所用，若个体将在生物学、医学或生活质量上受益于治疗，则该个体“需要”该治疗。
如在此所用，除非在此另外表示或与上下文明显矛盾，否则本发明的上下文中(尤其在申请专利范围的上下文中)所用的术语“一(a/an)”、“该(the)”及类似术语应解释为涵盖单数及复数两者。
本发明涉及用于制备呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒的方法。呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺具有以下结构：
Figure 634335DEST_PATH_IMAGE001
步骤1：2-(二甲氧甲基)-1,8-萘啶
使用J. Org. Chem., 2004, 69(6), 第1959-1966页中所描述的程序。将2-氨基吡啶-3-甲醛(1000 g，8.19mol)、1,1-二甲氧基丙-2-酮(1257 g，10.64 mol)、乙醇(10 L)及水(2 L)置入20 L 4颈圆底烧瓶中。随后在0-15℃下在搅拌下逐滴添加氢氧化钠(409.8g，10.24 mol) 的水(1000 mL)溶液。将溶液在0-20℃下搅拌3小时，且随后在真空下浓缩。用3 × 1200 mL乙酸乙酯萃取所得溶液且合并有机层。将混合物经硫酸钠干燥且在真空下浓缩。用3 × 300 mL己烷洗涤残余物且通过过滤来收集固体。此产生呈黄色固体状的标题化合物。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.11 (dd, 1H), 8.53 (d, 1H), 8.50 (dd, 1H),7.73 (d, 1H), 7.67 (dd, 1H), 5.44 (s, 1H), 3.41 (s, 6H)。
步骤2：7-(二甲氧甲基)-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶
使用J. Org. Chem., 2004, 69(6), 第1959-1966页中所描述的流程。将2-(二甲氧甲基)-1,8-萘啶(200 g，979 mmol)、乙醇(3 L)、PtO2 (12 g)置入5 L压力槽反应器(5atm)中。将反应器抽空，且用氮气冲洗三次、随后用氢气冲洗。在23℃下在氢气氛围下搅拌混合物过夜。将此反应重复四次。将固体过滤出且在真空下浓缩所得混合物以得到呈黄色固体状的标题化合物。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.14 (d, 1H), 6.51 (d, 1H),6.47 - 6.41 (m, 1H), 4.98 (s, 1H), 3.28 - 3.19 (m, 2H), 3.23 (s, 6H), 2.64(t, 2H), 1.73 - 1.79 (m, 2H)。
步骤3：6-溴-7-(二甲氧甲基)-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶
将于乙腈(2 L)中的7-(二甲氧甲基)-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶(114.6 g，550.3mmol)置入3 L 4颈圆底烧瓶中。随后在25℃下在搅拌下逐份添加NBS (103 g，578 mol)。在25℃下搅拌所得溶液30分钟。在真空下浓缩所得混合物且用1000 mL乙醚稀释残余物。用3× 100 mL冰/水洗涤混合物。用2 × 100 mL乙醚萃取水相且合并有机层。将所得混合物用1 × 100 mL盐水洗涤、经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到呈淡黄色固体状的标题化合物。LC-MS：(ES, m/z)：286.03 [M+H]+。1H-NMR：(300MHz, CDCl3) δ 1.86 - 1.94 (2H, m),2.70 - 2.74 (2H, m), 3.9 - 3.43 (2H, m), 3.47 (6H, s), 5.23 (1H, s), 5.58(1H, s), 7.29 (1H, s)。
步骤4：2-(二甲氧甲基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲醛
在-78℃下在氩气下向6-溴-7-(二甲氧甲基)-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶(15.0 g，52.2 mmol)于THF (400 mL)的溶液中添加MeLi (1.6 M于Et2O中，32.6 mL，52.2 mmol)，搅拌溶液5分钟，随后缓慢添加n-BuLi (1.6 M于己烷中，35.9 mL，57.5 mmol)且搅拌溶液20分钟。在-78℃下添加THF (100 mL)至反应物中。随后，添加n-BuLi (1.6 M于己烷中，49.0mL，78 mmol)且搅拌反应混合物20分钟，随后再次添加n-BuLi (1.6 M于己烷中，6.53 mL，10.45 mmol)且在-78℃下搅拌混合物10分钟。添加DMF (2.10 mL，27.2 mmol)且在-78℃下搅拌反应混合物45分钟，随后使其升温至室温，倾入至NH4Cl饱和水溶液中且用DCM萃取两次。将经合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤且蒸发，得到呈橙色油状的标题化合物。(UPLC-MS3) tR 0.63 min；ESI-MS 237.2 [M+H]+。
步骤5：2-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)(甲基)氨基)乙酸乙酯
在0℃下添加溴乙酸乙酯(1.27 mL，11.48 mmol)至(2-(甲氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.0 g，11.48 mmol)、三乙胺(4.81 mL)与THF (24 mL)的混合物中。在室温下搅拌24小时之后，将反应混合物分配于NaHCO3饱和水溶液与DCM之间，用DCM萃取2次，将有机层经Na2SO4干燥且蒸发，得到呈透明浅黄色油状的标题化合物。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ5.20 (s, br, 1H), 4.18 (q, 2H), 3.24 (s, 2H), 3.22 - 3.16 (m, 2H), 2.65 -2.61 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.24 (t, 3H)。
步骤6：2-((2-氨乙基)(甲基)氨基)乙酸乙酯二盐酸盐
在室温下添加浓盐酸(10 mL)至2-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)(甲基)氨基)乙酸乙酯(3.05 g，11.13 mmol)于THF (20 mL)及EtOH (100 mL)中的溶液中。在室温下搅拌1小时后，蒸发反应混合物，添加乙醇(20 mL)，蒸发，添加另外的乙醇(50 mL)，且随后在60℃下搅拌70分钟。随后蒸发经冷却的反应混合物，得到呈浅黄色玻璃状的标题化合物。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (s, br, 3H), 4.19 (q, 2H), 4.26 - 4.15 (m, 2H),3.44 (s, br, 2H), 3.21 (s, br, 2H), 2.88 (s, 3H), 1.21 (t, 3H)。
步骤7：1-((2-(二甲氧甲基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-基)甲基)-4-甲基哌嗪-2-酮
在室温下添加三乙酰氧基硼氢化钠(3.10 g，14.61 mmol)至2-(二甲氧甲基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲醛(在步骤4中获得，2.30 g，9.74 mmol)、2-((2-氨乙基)(甲基)氨基)乙酸乙酯二盐酸盐(在步骤6中获得，2.6 g，14.61 mmol)及三乙胺(6.75 mL，48.7mmol)于1,2-二氯乙烷(20 mL)中的混合物中。在室温下搅拌反应混合物21小时，且添加额外的三乙酰氧基硼氢化钠(2.6 g，9.74 mmol)。在室温下再搅拌4小时后，再次添加额外的三乙酰氧基硼氢化钠(1.3 g，4.87 mmol)，且将反应物维持在4℃下2.5天。随后将反应混合物升温至室温，添加NaHCO3饱和水溶液，用DCM (3次)萃取混合物，将经合并的有机层经Na2SO4干燥且蒸发。将残余物以DCM溶液形式施加于120 g RediSep®二氧化硅柱，且通过正相层析法、用自DCM至含10% MeOH的DCM的梯度洗脱而纯化。将含有产物的洗脱份合并且蒸发，得到呈橙色泡沫状的标题化合物。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.08 (s, 1H), 5.30(s, br, 1H), 5.20 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.44 - 3.34 (m, 2H), 3.40 (s, 6H),3.22 - 3.15 (m, 2H), 3.24 (s, 2H), 2.71 - 2.64 (m, 2H), 2.58 - 2.50 (m, 2H),2.31 (s, 3H), 1.98 - 1.82 (m, 2H)。(UPLC-MS 6) tR 0.33；ESI-MS 335.3 [M+H]+。
步骤8：4-氟-5-碘吡啶-2-胺
用TFA (114 g，1 mol)处理4-氟吡啶-2-胺(336 g，2.5 mol)及NIS (745 g，2.75mol)于MeCN (9 L)中的悬浮液。随后在室温下搅拌反应混合物8小时。将反应混合物用EtOAc (10 L)稀释，用Na2S2O3饱和水溶液(2 × 5 L)、盐水(4 × 5 L)洗涤。将经合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤且浓缩以得到粗产物。通过自EtOAc/戊烷(1/10)重结晶来纯化粗产物，获得呈白色固体状的标题化合物。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.14 (d, 1H), 6.45(s, 2H), 6.33 (d, 1H)。
步骤9：6-氨基-4-氟烟碱腈
在氮气下将含4-氟-5-碘吡啶-2-胺(在步骤8中获得，240 g，1 mol)、氰化锌(125g，1.05 mol)、锌(13 g，0.2 mol)、Pd2(dba)3 (25 g，25 mmol)及dppf (55 g，0.1 mol)的DMA (800 mL)脱气且装入圆底烧瓶中。在100℃下搅拌混合物3小时。将反应混合物用5%NaHCO3 (2 L)稀释，用EtOAc (4 × 600 mL)萃取。将经合并的有机层用5% NaOH (1 L)洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩至700 mL。经由硅胶柱使用EtOAc (1.7 L)洗脱所得有机相。用2 MHCl (3 × 800 mL)洗涤经合并的有机滤液。将水相的pH用饱和NaHCO3调节至10。用DCM (3× 500 mL)萃取水相。将经合并的DCM经Na2SO4干燥且浓缩。将残余物通过柱层析(用戊烷:EtOAc 10:1至3:2洗脱)进一步纯化、随后自戊烷/EtOAc 3/1重结晶，得到呈白色固体状的标题化合物。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.40 (d, 1H), 7.40 (s, 2H), 6.34 (d,1H)。
步骤10：(4-氯-5-氰基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
用氮气使2,4-二氯-5-氰基吡啶(10 g，57.8 mmol)、氨基甲酸叔丁酯(8.2 g，70.5mmol)、Pd(OAc)2 (0.26 g，1.1 mmol)、Xantphos (1.34 g，2.3 mmol)及K2CO3 (12 g，87mmol)于THF(150 mL)中的混合物脱气3次。随后将混合物在70℃下加热4-5小时，且通过层析监测，直至完全转化。反应完成后，添加额外THF (100 mL)，且在70℃下将混合物再加热1小时，且随后冷却至室温。随后经由硅藻土垫过滤悬浮液以移除固体。随后将滤液浓缩且与乙酸乙酯共沸蒸馏，之后过滤，得到标题化合物。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.82(s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 1.49 (s, 9H)。
步骤11：N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在65-70℃下将(4-氯-5-氰基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(在步骤10中获得，9.8g，38.6 mmol)、2-甲氧基乙胺(5.8 g，77.3 mmol)及DIPEA (6 g，46.4 mmol)于DMSO (80mL)中的混合物加热24小时，且通过层析监测直至完全转化。随后将溶液冷却至室温，且白色固体逐渐沉淀。随后在1小时内缓慢地添加水(20 mL)。将悬浮液再搅拌1小时，过滤且干燥，得到呈白色固体状的标题化合物。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.87 (s, 1H),8.18 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.86 (s, 9H), 3.51 (t, 2H), 3.36 (t, 2H), 3.28(s, 3H), 1.47 (s, 9H)。
步骤12：6-氨基-4-((2-甲氧乙基)氨基)烟碱腈
将6-氨基-4-氟烟碱腈(在步骤9中获得，1.10 g，8.02 mmol)于DMA(20 mL)中的溶液用2-甲氧基乙胺(2.07 mL，24.1 mmol)及DIPEA (4.20 mL，24.1 mmol)处理，加热至50℃且搅拌15小时。将反应混合物冷却至室温且浓缩。通过正相层析法(24 g硅胶滤筒，庚烷/EtOAc 100:0至0:100)纯化粗物质。将含有产物的洗脱份浓缩，且在真空下干燥，得到呈灰白色固体状的标题化合物。
6-氨基-4-((2-甲氧乙基)氨基)烟碱腈的替代合成概述于下文中：
向N-{5-氰基-4-[(2-甲氧乙基)氨基]吡啶-2-基}氨基甲酸叔丁酯(在步骤11中获得，7 g)中添加30-36% HCl水溶液(40 mL)，在室温下将混合物搅拌30分钟，且通过层析监测直至完全转化。随后用20-30% NaOH溶液将溶液碱化至pH=9-10，且过滤，得到白色固体。将固体添加至乙酸乙酯(15 mL)且加热至50-55℃以形成透明溶液。随后将溶液冷却至3-6℃，搅拌2-3小时且过滤。随后干燥湿滤饼，得到呈白色固体状的标题化合物。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.92 (s, 1H), 6.39 (s, 2H), 6.15 (t, 1H), 5.61 (s, 1H), 3.46(t, 2H), 3.27 (s, 3H), 3.24 (q, 2H)。(UPLC-MS 3) tR 0.62；ESI-MS 193.1 [M+H]+。
步骤13：N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-(二甲氧甲基)-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺
历经10分钟将6-氨基-4-((2-甲氧乙基)氨基)烟碱腈(在步骤12中获得，481 mg，2.50 mmol)于无水DMF (1.5 mL)中的溶液逐滴添加至0℃下冷却的二(1H-1,2,4-三唑-1-基)甲酮(410 mg，2.50 mmol)与DMF (1.5 mL)中的混合物中。在0℃下搅拌45分钟之后，使反应混合物升温至室温，且在室温下再搅拌90分钟之后，添加1-((2-(二甲氧甲基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-基)甲基)-4-甲基哌嗪-2-酮(在步骤7中获得，418 mg，1.00 mmol)于DMF (2 mL)中的溶液。在室温下将反应混合物搅拌17.5小时，通过添加MeOH淬灭且蒸发。将残余物以DCM溶液形式施加于80 g RediSep®二氧化硅柱，且通过正相层析、用自DCM至含2% MeOH的DCM的梯度洗脱而纯化。将含有产物的洗脱份合并且蒸发，得到呈橙色泡沫状的标题化合物。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.50 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.52 (s,1H), 7.39 (s, 1H), 6.93 (t, 1H), 5.45 (s, 1H), 4.65 (s, 2H), 3.94 - 3.89 (m,2H), 3.54 - 3.50 (m, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 3.38 (s, 6H), 3.29 (s, 3H),3.20 - 3.16 (m, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.86 - 2.80 (m, 2H), 2.61 - 2.55 (m, 2H),2.22 (s, 3H), 1.94 - 1.88 (m, 2H)。(UPLC-MS 6) tR 0.72；ESI-MS 553.3 [M+H]+。
步骤14：N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺
在室温下添加浓盐酸(0.40 mL)至N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-(二甲氧甲基)-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(在步骤13中获得，470 mg，0.808 mmol)于THF (3 mL)及水(1 mL)中的溶液中。在室温下搅拌3小时之后，添加NaHCO3饱和水溶液，用DCM (3次)萃取混合物，将有机层经Na2SO4干燥且蒸发。将残余物用EtOAc (6 mL)及戊烷(6 mL)声波处理，且随后过滤。随后将所获得的白色固体溶解于DCM (6 mL)中，添加EtOAc (3 mL)，使溶液升温、密封且使其在室温下静置2小时。过滤且干燥，提供呈白色固体状的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.43 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.24 (s,1H), 7.49 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.96 (t, br, 1H), 4.86 (s, 2H), 3.96 - 3.90(m, 2H), 3.52 - 3.46 (m, 2H), 3.39 - 3.33 (m, 2H), 3.30 - 3.21 (m, 2H), 3.37(s, 3H), 3.02 (s, 2H), 2.93 - 2.86 (m, 2H), 2.61 - 2.56 (m, 2H), 2.21 (s,3H), 1.95 - 1.85 (m, 2H)。(UPLC-MS 6) tR 0.70；ESI-MS 507.2, [M+H]+。
步骤15：呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)
在丙酸(29.3 g，29.60 mL)中在70℃下搅拌N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(在步骤14中获得，4 g，7.896 mmol)，直至完全溶解(20分钟)。将溶液冷却至55℃，且将柠檬酸于丙酮中的溶液(23% w/w)添加至其中。单独地，通过将丙酮(0.2 g，0.252 mL)添加至呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(0.0185 g，0.026 mmol)中来制备晶种悬浮液。在50℃下将晶种悬浮液添加至溶液中，且在50℃下搅拌所得悬浮液40分钟。历经380分钟将另一柠檬酸于丙酮中的溶液(26.6 g，2.51% w/w，33.63 mL)添加至反应物中。将所得悬浮液再搅拌120分钟，且在搅拌下历经4小时冷却至20℃。再搅拌悬浮液12小时，之后在真空下过滤悬浮液，且在室温下用丙酸:丙酮溶液(1:1，7 g，7.96 mL)洗涤所得固体。在室温下用丙酮(7 g，8.85 mL)进一步洗涤固体。在烘箱中在40℃及5毫巴下干燥所得固体，得到呈淡橙色固体状的标题化合物(5.2 g，7.443 mmol)。(mw 698.70)，mp(DSC) 168.8℃ (开始)。
XRPD分析显示与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)相同的图案-参见图5。
实施例1a
如实施例1中所描述进行步骤1至14。
步骤15a：呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)
在丙酸(33.5 g，33.84 mL)中在60℃下搅拌N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(在步骤14中获得，5 g，9.930 mmol)。溶解N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺后，添加无水柠檬酸粉末(0.19 g，0.9889 mmol)。将所得悬浮液加热至70℃，且声波处理5分钟以确保完全溶解。将所得溶液冷却至50℃，且历经20分钟添加柠檬酸在乙酸乙酯中的溶液(3.7 g，1.3%柠檬酸于乙酸乙酯中)。将呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的晶种(0.02 g)添加至溶液中，且使悬浮液老化15分钟。历经11.85小时将柠檬酸的乙酸乙酯溶液的另一等份(128 g，1.3%柠檬酸于乙酸乙酯中)添加至悬浮液中。历经4小时搅拌悬浮液。随后在真空(500毫巴)下过滤悬浮液，且将所得固体首先在室温下用丙酸:乙酸乙酯溶液(1:1，7 g，7.44 mL)洗涤，且随后在室温下用乙酸乙酯(12 g，13.38 mL)洗涤。在烘箱中在40℃及5毫巴下干燥所得固体，得到呈淡橙色固体状的标题化合物(6.3g，9.074 mmol)。
XRPD分析显示与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒(参考实施例1)相同的谱形态-参见图5。
参考实施例1 (描述于PCT/IB2014/065585中)-呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)
如实施例1中所描述进行步骤1至14。
参考步骤15 - 呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)
在室温下制备柠檬酸(96.9 mg)于丙酮(5 ml)中的溶液(0.1 M)。随后将一部分0.1 M柠檬酸于丙酮中的溶液(2 mL)添加至N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(100 mg)于丙酮(4 mL)中的悬浮液中，且将混合物声波处理1分钟，随后在55℃下在搅拌下加热2小时，之后缓慢地冷却至室温。随后将白色固体通过过滤来收集，用丙酮(2 mL)洗涤2次，且在40℃下在真空下干燥18小时，得到标题盐。
或者，将N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(6.5 g，12.83 mmol)置于500ml 4-烧瓶反应器中。添加49 mL冰乙酸，且在23℃下搅拌所得悬浮液，直至获得透明混合物。在单独的烧瓶中，在50℃下将无水2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸(2.59 g，13.47 mmol，1.05当量)溶解于49 mL冰乙酸中，直至获得透明溶液。随后在23℃下将此溶液添加至先前制备的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺溶液中。在23℃下将此混合物搅拌30分钟，且随后历经1小时逐滴添加至192 mL升温至75℃的乙酸乙酯中。添加期间使温度保持恒定。添加结束时，将混合物的温度缓慢地冷却至23℃，且在此温度下在温和搅拌下维持16小时。将悬浮液冷却至5-10℃且过滤。用15 mL乙酸乙酯及15 mL丙酮洗涤滤饼。将湿滤饼(约8.5 g)转移至含有192 mL无水丙酮的500 mL烧瓶中。使所得悬浮液回流24小时。过滤悬浮液且用15 mL无水丙酮洗涤滤饼2次，随后在50℃下在真空下干燥若干小时，得到标题盐。
实施例2 - FGFR4的体外生物化学激酶分析
所有分析均在384孔微量滴定培养盘中进行。各分析培养盘含有40种测试化合物的8点连续稀释液，以及作为参考化合物的星形孢菌素的4个8点连续稀释液，加16个高对照及16个低对照。
液体处置及培育步骤在配备有机械臂(Thermo CatX, Caliper Twister II)及培育箱(Liconic STX40, Thermo Cytomat 2C450)的Innovadyne Nanodrop Express上进行。分析培养盘通过每孔添加50 nl化合物于90% DMSO中的溶液来制备。激酶反应通过逐步添加4.5微升/孔的肽/ATP溶液(50 mM HEPES，pH 7.5，1 mM DTT，0.02% Tween20，0.02% BSA，0.6% DMSO，10 mM β-甘油磷酸酯及10 µM原钒酸钠，16 mM MgCl2，1122 µM ATP，4 µM肽(5-Fluo-Ahx-KKKKEEIYFFFG-NH2，Biosyntan GmbH))及4.5微升/孔的酶溶液(50 mM HEPES，pH7.5，1 mM DTT，0.02% Tween20，0.02% BSA，0.6% DMSO，10 mM β-甘油磷酸酯及10 µM原钒酸钠，16 mM MgCl2，6 nM FGFR4 (GST-FGFR4 (388-802)，通过昆虫细胞中的表达及亲和层析法内部自行制备))来起始。在30℃下培育激酶反应60分钟，且随后通过添加16微升/孔的停止液(100 mM HEPES，pH 7.5，5% DMSO，0.1% Caliper包覆试剂，10 mM EDTA及0.015%Brij35)来终止反应。将激酶反应终止的培养盘转移至Caliper LC3000工作站进行读取。使用Caliper微流体迁移偏移技术分离磷酸化与未磷酸化的肽。简言之，将来自终止的激酶反应的样品施加于芯片。由恒定缓冲液流将分析物运送经过芯片，且通过底物肽的标签的荧光信号监测其迁移。磷酸化肽(产物)及未磷酸化肽(底物)通过其荷/质比在电场中分离。由所形成的磷酸-肽的量计算激酶活性。通过非线性回归分析从不同化合物浓度下的抑制百分比值来确定IC50值。
制备化合物稀释液
将测试化合物溶解于DMSO (10 mM)中，且转移至带有独特2D基质的1.4 mL平底或V形基质管中。若不立即使用，则将储备液储存在+2℃下。用于测试流程时，将小瓶解冻且通过扫描仪来鉴别，由此产生引导后续工作步骤的工作表。
在96孔培养盘中制得化合物稀释液。此形式最大限度地实现在8种浓度(单点)下的40种个别测试化合物(包括4种参考化合物)的分析。稀释方案包括制备“预稀释培养盘”、“主培养盘”及“分析培养盘”。
预稀释培养盘：使用96孔聚丙烯培养盘作为预稀释培养盘。制备总共4个预稀释培养盘，包括10种测试化合物分别置于在培养盘A1-A10处，在A11处为一种标准化合物，且在A12处为一个DMSO对照。所有稀释步骤在HamiltonSTAR机器人上进行。
主培养盘：将4个“预稀释培养盘”的30 µL单个化合物稀释液(包括标准化合物及对照)转移至384“主培养盘”中，包括以下浓度1'810、362、72.5、54.6、14.5、2.9、0.58及0.12 µM，分别于90% DMSO中。
分析培养盘：随后借由HummingBird 384通道分配器将50 nL的各“母培养盘”的化合物稀释液吸至384孔“分析培养盘”中来制备相同的“分析培养盘”。这些培养盘被直接用于分析，该分析以9.05 µL的总体积进行。这在分析中产生10、2.0、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064及0.000128 µM的最终化合物浓度及0.5%的最终DMSO浓度。
FGFR4的体外细胞激酶分析
开发测量FGFR4上的酪氨酸磷酸化含量的分析作为细胞FGFR4激酶活性的读数。就此而言，生成BaF3-Tel-FGFR4细胞株：使用编码由融合至FGFR4的胞质域(包括近膜域)的TEL (aa1-337)的氨基末端部分组成的融合蛋白的反转录病毒稳定地转导BaF3细胞。TEL域的存在通过低聚合介导融合FGFR4激酶的组成性活化，以及因此酪氨酸位点上的自体磷酸化。
开发基于MSD (Meso Scale Discovery)的捕获ELISA且如下使用：
-细胞处理：于96孔组织培养盘(Corning目录号3359)中于40 μL生长培养基(补充有10%胎牛血清、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、2 mM稳定谷氨酸及1×青霉素-链霉素的RPMI-1640 (Amimed目录号1-41F01-I))中接种250000个BaF3-Tel-FGFR4细胞/孔。使用液体处理装置(Velocity 11 Bravo，Agilent)于DMSO中制备化合物的连续3倍稀释液，将其预稀释于生长培养基中，随后转移10微升/孔至细胞培养盘。在37℃/5% CO2下培育1小时之后，添加50 μL裂解缓冲液(150 mM NaCl，20 mM Tris (pH 7.5)，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1%Triton X-100，10 mM NaF，补充有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，Roche目录号11836153001)及磷酸酶抑制剂(根据供货商说明书，Phosphatase Inhib I，SIGMA目录号P2850；Phosphatase Inhib II，SIGMA目录号P5726))，且于冰上在300 rpm下震荡培育30分钟。随后将样品培养盘冷冻且在-70℃下储存。于冰上融化之后，使样品培养盘在6℃下以1200 rpm离心15分钟。
-ELISA分析：在室温下以25微升/孔的于PBS/O中1:400稀释的小鼠抗H-TEL抗体(Santa Cruz，目录号sc-166835)涂布多阵列96孔培养盘(MSD，目录号L15XB-3) 1小时。添加150 μL含3% MSD阻断剂A (目录号R93BA-1)的TBS-T (50 mM Tris，150 mM NaCl，0.02%Tweeen-20)之后，在室温下在震荡下培育培养盘1小时。随后用200微升/孔TBS-T洗涤培养盘3次。随后将50 μL细胞裂解物转移至经涂布的培养盘且在4℃下培育15小时，随后用200µl TBS-T/孔洗涤3次且添加25微升/孔于TBS-T + 1% MSD阻断剂A中1:250稀释的MSDSULFOTAGGED PY20抗体(MSD目录号R32AP-5)。在室温下在震荡下培育1小时之后，用200 μLTBS-T/孔洗涤孔3次。添加150 µL用纳米水1:4稀释的MSD读取缓冲液(MSD，目录号R92TC-2)储备液之后，立即于SectorImager 6000 (MSD)上定量所生成的电化学发光信号。IC50计算：对于数据分析而言，由含有培养基及裂解缓冲液但无细胞的孔确定分析背景，且自所有数据点减去对应值。特定测试化合物浓度对FGFR4磷酸化的效应表示为相对于仅用运载体(DMSO，0.2% f.c.)处理的细胞所获得的经背景校正的电化学发光读数(其被设定为100)的百分比。通过标准四参数曲线拟合(XLfit 5.4，IDBS)来确定产生半最大信号抑制的化合物浓度(IC50)。
细胞增殖分析
亚甲基蓝染色增殖分析(MBS)：使用HuH-7肝细胞癌细胞评估化合物对细胞增殖的效应，所述HuH-7肝细胞癌细胞获自Japanese Collection of Research BioresourcesCell Bank (目录号JCRB0403)，且在供货商推荐的培养基(DMEM高葡萄糖(Amimed目录号1-26F01-I)、10%胎牛血清(Invitrogen目录号16140-071)、1 mM丙酮酸钠(Amimed目录号5-60F00-H)、1×青霉素/链霉素(Amimed目录号4-01F00-H))中在含湿气5% CO2培育箱中在37℃下培养。具体而言，于96孔组织培养盘(TPP目录号92696)中以100微升/孔的总培养基体积接种5000个细胞/孔，且其后24小时，一式三份地添加增加的化合物稀释液或DMSO。添加化合物后72小时，通过添加25微升/孔的20%戊二醛(Sigma Aldrich目录号G400-4)固定细胞，且在室温下将其培育10分钟。将细胞用200微升/孔H2O洗涤三次，且在室温下用100微升/孔0.05%亚甲基蓝(ABCR GmbH目录号AB117904)染色10分钟。将细胞用200微升/孔H2O洗涤3次，且随后通过在室温下在震荡下添加200微升/孔的3% HCl (Fluka目录号84422)来溶解30分钟。在A650 nm下测量光学密度。使用XLFit软件确定相对于经DMSO处理细胞提供50%增殖抑制的化合物的浓度(IC50)。
CellTiter Glo (CTG)分析：使用HuH-7肝细胞癌细胞评估化合物对细胞增殖的功能性效应，所述HuH-7肝细胞癌细胞获自Japanese Collection of ResearchBioresources Cell Bank (目录号JCRB0403)，且在供货商推荐的培养基(DMEM高葡萄糖(Amimed目录号1-26F01-I)、10%胎牛血清(Invitrogen目录号16140-071)、1 mM丙酮酸钠(Amimed目录号5-60F00-H)、1×青霉素/链霉素(Amimed目录号4-01F00-H))中在含湿气5%CO2培育箱中在37℃下培养。化合物介导的细胞增殖/活力的抑制通过使用CellTiter-Glo(CTG)试剂(Promega，目录号G7573)定量细胞ATP水平来评估。简言之，以3'000个细胞/孔/80 µl新鲜培养基将细胞接种于经组织培养物处理的96孔培养盘(Costar目录号3904)中，随后添加20 µl含有为其最终预期浓度的5倍的化合物稀释液的培养基。剂量反应效应通过测试化合物的3倍连续稀释液(以10 µM开始)来评估。在37℃及5% CO2下培育细胞3天后，在按照供货商手册添加50 µl CTG及荧光测量物(整合时间：500 ms)后，使用相应配备的多模式培养盘读取器(M200Pro, TECAN, 瑞士)对抑制剂对细胞活力的效应进行定量。对于数据分析，自所有数据点减去在含有培养基但无细胞的孔中确定的分析背景值。为使得能够区别细胞毒性与细胞静止化合物，相对于使用单独细胞培养盘在化合物添加时观测到的活细胞数(第0天)来评估活细胞数。特定测试化合物浓度对细胞增殖/活力的效应表示为针对仅用运载体(DMSO，0.1% f.c.)处理的细胞所获得的经背景及第0天校正的荧光读数的百分比，将其设定为100%，而将仅含有培养基但无细胞的孔的荧光读数设定为-100%。使用标准四参数曲线拟合(XLfit 5.2.，IDBS，UK)确定产生半最大生长抑制的化合物浓度(GI50)。
Figure 879371DEST_PATH_IMAGE003
比较数据
使用激酶域的所表示部分，以与上文所描述的FGFR4的体外生物化学分析类似的方式进行针对FGFR1 (407-822)、FGFR2 (406-821)及FGFR3 (411-806)的体外生物化学分析。在生物化学FGFR1、FGFR2及FGFR3分析中，实施例1产生的IC50值> 10000 nM。
实施例3 - 实施例1中所获得的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒的激光衍射测量
根据欧洲药典(European Pharmacopoeia)第2.9.31章“通过激光衍射的粒度分析”(Particle size analysis by laser light diffraction)中所描述的方法，分析实施例1中所获得的呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)的粒度分布。
对于测量，使用配备有湿式分散装置比色管(Cuvette) (来自Sympatec GmbH, 德国)的来自Sympatec GmbH, 德国、焦距为500 mm的Sympatec HELOS装置。使用分散助剂(例如，StatsafeTM 6000，INNOSPEC Limited，约1%于白色石油脑中)，将测试物质分散于白色石油脑，Brenntag Schweizerhall AG, 瑞士 (目录号12200-150)中。
步骤：在手动混合下将数滴分散助剂添加至实施例1中所获得的呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)的粉末样品中。在例如涡旋混合器上剧烈混合颗粒，以使物质彻底湿润且形成光滑且均匀的糊状物。用白色石油脑将糊状物稀释至几毫升的最终体积，且再次混合储备分散液。
测量：通过用白色石油脑稀释储备分散液获得适当光学浓度来制备测试分散液，且根据说明书手册使用激光衍射仪器确定累积体积分布。在10秒、20秒、30秒声波处理之前及之后进行测量。参数设置如下：在来自Bandelin electronic GmbH & Co. KG的超声波处理装置GM70上，30%振幅及80%循环时间，及约20秒的测量持续时间。
在无声波处理情况下自累积体积分布评估10%、50%及90%的筛下物值的粒度(x10、x50、x90)。声波处理对测量的粒度无显著影响。
所得粒度分布显示于图6中。
实施例4 - 参考实施例1(描述于PCT/IB2014/065585中)中所获得的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒的激光衍射测量
根据欧洲药典第2.9.31章“通过激光衍射的粒度分析”中所描述的方法，分析参考实施例1中所获得的呈柠檬酸形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)的粒度分布。
对于测量，使用配备有湿式分散装置比色管(来自Sympatec GmbH, Germany)的来自Sympatec GmbH, Germany的焦距为100 mm的Sympatec HELOS装置。使用分散助剂(例如，StatsafeTM 6000，INNOSPEC Limited，约1%于白色石油脑中)，将测试物质分散于白色石油脑，Brenntag Schweizerhall AG, Switzerland(目录号12200-150)中。
步骤：在手动混合下将数滴分散助剂添加至实施例1中所获得的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺(1:1)的粉末样品中。在例如涡旋混合器上剧烈混合颗粒，以使物质彻底湿润且形成光滑且均匀的糊状物。用白色石油脑将糊状物稀释至几毫升的最终体积，且再次混合储备分散液。
测量：通过用白色石油脑稀释储备分散液获得适当光学浓度来制备测试分散液，且根据说明书手册使用激光衍射仪器确定累积体积分布。在声波处理之前及声波处理多达600秒之后进行测量。参数设置如下：在来自Telsonic AG的超声波处理装置USGD-100上，50%振幅，及约20秒的测量持续时间。测量进行两次。
240秒声波处理后自累积体积分布评估10%、50%及90%的筛下物值的粒度(x10、x50、x90)。此确定为表示初始颗粒尺寸。
所得粒度分布显示于图7中。
实施例5 - 基本流动能测量
基本流动能(BFE)为在调节的精确体积的粉末中确立特定流型所需的能量。此流型为叶片的向下逆时针运动，在粉末中产生压缩的、相对高的应力流动模式。BFE由在使叶片经由粉末自容器顶部移动至底部时(即在向下穿越期间)所做的功计算。
在本发明实施例中，使用来自Freeman Technology的FT4粉末流变仪在以下条件下测量基本流动能：容器尺寸：25 mm；标准程序名称：25mm_1C_Split_1T；起始辅助：23.5mm叶片；容器：25 mm × 25 mL分离容器。结果绘制于图9中。
对于通过实施例1a中所描述的方法获得的颗粒，针对本发明颗粒的2个样品所测量的基本流动能为39.17 mJ；且对于通过实施例1中所描述的方法获得的颗粒，为65.07mJ。
针对通过PCT/IB2014/065585中所描述方法获得的颗粒的样品所测量的基本流动能为185.20 mJ。
这些结果表明本发明的颗粒具有改良的流动特性，优于通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒的流动特性。
实施例6 - 可压缩性测量
可压缩性为密度如何随所施加正应力而变化的量度。通过定义，可压缩性为压缩后体积的变化百分比(%)。使用来自Freeman Technology的FT-4粉末流变仪进行测量。
将通过本发明方法获得的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺颗粒，及通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒置于容器中，且使用排气活塞来压缩颗粒。设计排气活塞，以便自编织不锈钢网格构造压缩面，且使得粉末中的经夹带空气穿过粉末床表面均匀地逸出。在8个以0.5 kPa开始且以15 kPa结束的连续压缩步骤中施加正应力。在各步骤中，使正应力保持恒定60秒，且自动计算体积变化百分比形式的可压缩性。结果绘制于图10中。
对于本发明的颗粒，15 kPa下测量的可压缩性百分比为54.14%及54.63%。对于通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒，15 kPa下测量的可压缩性百分比为49.93%。
这些结果表明，与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒相比，本发明的颗粒具有更好的可压缩性，其将提供以下优势：最终药品中的较高的载药量可通过使用本发明的颗粒实现。
实施例7 - 壁摩擦角测量
已开发壁摩擦测试方法以评估原料药与不锈钢之间的相互作用。所使用设备为来自Freeman Technology的FT-4粉末流变仪。
将通过本发明方法获得的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺颗粒，及通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒置于含有样品及壁摩擦头的容器中，以诱导垂直及旋转应力两者。通过调节且随后使用标准FT4叶片及排气活塞预固结来制备粉末样品。
配备有1.2微米平均粗糙度的316个不锈钢圆盘的壁摩擦头向下移动至样品表面，且在圆盘接触样品顶部时诱导正应力。该头继续向下移动，直至形成所需的正应力。随后壁摩擦头开始缓慢旋转，诱导剪应力。在圆盘与样品表面之间确立剪切平面。在粉末床阻止壁摩擦头的旋转时，扭矩增加直至最终克服阻力。此时，观测到最大扭矩。壁摩擦头继续以18度/分钟旋转，持续5分钟。测量维持此旋转所需的扭矩，其使得能够计算“稳态”剪应力。对于整个所述步骤中的各步骤，正应力在标靶施加应力下维持恒定。测量一系列标靶施加应力的一系列剪应力值。由于样品性质及确切恒定旋转扭矩不大可能实现的事实，软件测定10%的剪切时间期间的平均值。随后通过经图上的数据点绘制最佳拟合线来计算壁摩擦角，且测量在此最佳拟合线与水平面之间对向的角度。结果绘制于图11中。
对于本发明的颗粒，所测量的壁摩擦角为34.58°及35.85°。对于通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒，壁摩擦角为43.18°。
这些结果表明，与通过PCT/IB2014/065585中所描述的方法获得的颗粒相比，本发明的颗粒展现对金属表面更少的粘着行为，且因此具有改良的可加工性。

Claims (22)

1.一种用于制备呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒的方法，其包含以下步骤：
a. 将N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺溶解于丙酸中；
b. 添加柠檬酸至步骤a)中所获得的该溶液中，以获得包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的悬浮液；及
c. 自步骤b中所获得的该悬浮液分离呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的所述颗粒；
其中，所述方法在步骤b之后，包含以下步骤：用呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒接种步骤b中所获得的该溶液，以获得包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的悬浮液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b中所添加的所述柠檬酸以等份形式添加。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b中所添加的所述柠檬酸以溶液形式和/或以固体形式添加。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b中所添加的所述柠檬酸以溶液形式和/或以固体形式添加。
5.根据权利要求3或4的方法，其中该柠檬酸是以柠檬酸于选自以下的溶剂中的溶液形式添加：庚烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、丙酮、乙腈、甲苯、水或其混合物。
6.一种呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其通过权利要求1至5中任一项的方法获得，其中通过激光衍射测量，所述颗粒具有在200与300微米之间的中值粒度x50。
7.根据权利要求6所述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其中通过激光衍射测量，所述颗粒具有在5与10微米之间的粒度x10。
8.根据权利要求6所述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其中通过激光衍射测量，所述颗粒具有在400与500微米之间的粒度x90。
9.一种呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其中通过激光衍射测量，其具有在200与300微米之间的中值粒度x50。
10.根据权利要求9所述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其具有在400与500微米之间的粒度x90。
11.根据权利要求9所述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其具有在5与10微米之间的粒度x10。
12.根据权利要求6或9所述的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，其包含初始颗粒，所述初始颗粒具有在10与20微米之间的中值粒度x50。
13.一种呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的结晶初始颗粒，其具有柱状晶体形状，其中通过激光衍射测量，所述初始颗粒具有在10与20微米之间的中值粒度x50。
14.一种凝聚物，其包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒，其中呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的所述初始颗粒为权利要求13所述。
15.一种凝聚物，其包含呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的初始颗粒，其中通过激光衍射测量，该凝聚物具有在300与400微米之间的中值尺寸x50。
16.根据权利要求6至12中任一项的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物包含治疗有效量的所述呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，及任选的一或多种药学上可接受的载体。
17.一种药物组合物，其包含如权利要求6至12中任一项的呈柠檬酸盐形式的N-(5-氰基-4-((2-甲氧乙基)氨基)吡啶-2-基)-7-甲酰基-6-((4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)甲基)-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酰胺的颗粒，及任选的一或多种药学上可接受的载体。
18.根据权利要求17的药物组合物，其用作药物。
19.根据权利要求17或18的药物组合物，其用于治疗癌症。
20.根据权利要求19的药物组合物，其中该癌症为肝癌、乳腺癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌。
21.权利要求17的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
22.根据权利要求21的用途，其中该癌症为肝癌、乳腺癌、神经胶母细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、胃癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌。
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