CN107405370A - 含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物 - Google Patents

含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明的含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的组合物在以下方面具有优异的效果：预防或治疗炎性疾病，抑制主要的炎症因子一氧化氮和前列腺素E2的分泌，抑制主要的过敏相关因子β‑己糖胺酶和组胺的分泌，以及显著抑制皮肤疾病相关的细胞因子和趋化因子的生成。这些效果和那些常规皮肤疾病治疗剂(他克莫司)在相同的水平上，甚至可与它们相匹敌，因此，该组合物可用作炎性疾病的预防或治疗剂。此外，本发明的组合物显示出对抗引起特应性皮炎的继发感染等的金黄色葡萄球菌的抗菌活性，因此可用于预防或治疗细菌感染。

Description

含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于预防 或治疗炎性疾病的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物。具体而言，本发明的组合物抑制巨噬细胞释放一氧化氮和炎性细胞因子，并抑制肥大细胞表达组胺或诱发过敏的细胞因子，从而可用于治疗炎性疾病或过敏性疾病。此外，本发明的组合物表现出对抗引起特应性皮炎的继发感染等的微生物——金黄色葡萄球菌的抗菌活性，因此可用于治疗细菌感染。
背景技术
本申请要求于2015年3月27日提交的韩国专利申请第10-2015-0043602号的优先权，其整体内容通过引用纳入本申请。
传统上，炎症是针对由物理外伤、有害化学物质、微生物感染或体内代谢产物中的刺激物引起的组织损伤而局部显现的正常的保护性体内防御机制的表达。这样的炎症由从损伤组织和迁移细胞中产生的多种化学媒介因子所触发，已知这些化学媒介因子随着炎症过程的类型而变化。正常情况下，机体可通过炎症反应抵消或消除发病因素，并使损伤组织再生以恢复正常的结构和机能，但在非正常情况下，疾病状态如慢性炎症会继续发展。此外，在由自身免疫反应——如无害物质(如花粉)、哮喘或风湿性关节炎——不适当地触发炎症的情况下，防御反应自身反而会损伤组织，因此需要用于预防或治疗炎性疾病的药剂。在几乎所有的临床疾病中可观察到炎症反应。在这些炎性疾病中，虽然一些是可通过抗生素治疗的细菌性疾病，但是大部分是由自身免疫反应引起的组织损伤导致的，因此是没有具体治疗方法的疑难病。
用于治疗这样的炎性疾病的最常见的炎性疾病预防或治疗药剂主要分为甾体类以及非甾体类炎性疾病预防或治疗药剂，其中大部分合成的炎性疾病预防或治疗药剂具有除主要作用外伴随多种副作用的缺点。即，为了治疗炎性疾病，使用适当的用于预防或治疗炎性疾病的非甾体类药物(非甾体类抗炎药，NSAID)来缓解炎症，当炎症严重或非甾体类抗炎药(NSAID)无效时，使用甾体类，在难治疗的情况下，实施免疫抑制或手术疗法。此时使用的非甾体类抗炎药(NSAID)主要通过抑制环氧合酶(COX)来抑制参与炎症反应的前列腺素的生成，从而显现预防或治疗炎性疾病的作用，但其具有引发胃肠障碍、肝障碍、肾脏机能障碍等的副作用而无法长时间使用的问题。
另外，过敏是指宽范围的复杂病理现象的总和且是一种基于免疫反应的机体全身性或局部性障碍。人体中的过敏根据免疫机制分为I、II、III以及IV型，其中属于速发型过敏反应的I型过敏在临床中占据重要部分，并且特应性皮炎、特应性鼻炎、支气管哮喘、枯草热以及花粉症等均属于此。
大约在1953年，已知I型过敏由肥大细胞的活化而引起，而且这种肥大细胞的颗粒中含有大量作为炎症反应媒介物的组胺。在发现发生过敏反应时从肥大细胞释放出组胺这一现象后，在对该机制进行研究时，Ishizaka发现了免疫球蛋白E(IgE)，这成为了证实肥大细胞参与速发型过敏反应的重要契机。也就是说，在肥大细胞的表面上具有IgE高亲和力受体，当IgE与该受体结合之后再与抗原结合从而形成交叉连接，诱导脱颗粒反应，进而同时释放作为颗粒内含物的组胺、血清素、缓激肽等，这些颗粒内含物作为预先形成的媒介物、蛋白酶和蛋白聚糖而被合成并贮存(Ishizaka，Hosp Pract.；12(1)：57-67，1977)。
I型过敏的特征在于存在随着肥大细胞的活化而释放出的作为颗粒内含物的活性胺类和蛋白酶、由细胞膜磷脂生成的脂质媒介物、细胞因子IL-3(肥大细胞生长因子)——其已知为免疫反应的调节因子、IL-4、IL-5(Galli SJ et al.，Curr Opin Immunol.；，3(6)：865-872，1991；Bradding P et al.，J Immunol.，151(7)：3853-3865，1993)。
此外，当皮肤暴露于过敏原时，抗原特异性IgE与存在于朗格汉斯细胞表面上的IgE受体结合，并将抗原呈递至T细胞表面而活化T细胞。在该情况中，不同于正常情况，在过敏性皮肤疾病、特别是在特应性皮炎的情况中，Th2被活化而释放IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10以及IL-13等的细胞因子，其结果是，促进B细胞产生IgE，并通过促进被活化的肥大细胞的脱颗粒而释放细胞因子和组胺。(Baruah C.C.et al.，Pharmacol Res.；38(6)：487-92，1998；Karadag C.H.et al.，Braz J Med Biol Res.；33(3)：327-330，2000；PaoliniR.et al.，Nature.；353(6347)：855-858，1991)
现在，在临床上使用的过敏治疗药物根据作用机制可分为脱颗粒抑制剂、化学递质作用抑制剂、化学递质合成抑制剂等。在这些药物中，化学递质作用抑制剂和化学递质合成抑制剂的药物作用点比较明确，但脱颗粒抑制剂的作用机制不明确，并且，如过长时间给予这些药物会导致多种副作用。因此，通过弄清肥大细胞中的这些生理活性物质的生成和释放，而开发可将长期服用的副作用最小化的药物在I型过敏的治疗中是非常重要的。
发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明的发明人在为了从乳酸菌中找出治疗效果高且副作用少的炎性疾病和过敏性疾病的治疗剂而进行研究时发现，本发明的Lactococcus chungangensis具有以下效果而完成了本发明。Lactococcus chungangensis在以下方面具有显著的效果：抑制炎症或过敏相关的细胞因子和趋化因子的生成，抑制主要的炎症因子一氧化氮和前列腺素E2分泌，抑制主要的过敏因子β-己糖胺酶和组胺的分泌。并且当Lactococcus chungangensis应用于诱发了特应性的动物模型时，它还具有与以往使用的公知治疗剂相同程度的治疗效果。
因此，本发明的目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis(登记号为KCTC12684BP)作为有效成分的用于治疗炎性疾病的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的食品组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的化妆品组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的皮肤外用制剂。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的食品组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的化妆品组合物。
本发明的另一个目的是提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的皮肤外用制剂。
本发明的另一个目的是提供一种治疗炎性疾病的方法，其包括将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
本发明的另一个目的是提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗炎性疾病的药剂中的用途。
本发明的另一个目的是提供一种治疗细菌感染的方法，其包括将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
本发明的另一个目的是提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗细菌感染的药剂中的用途。
解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明提供一种含有Lactococcus chungangensis(登记号为KCTC 12684BP)作为有效成分的用于治疗炎性疾病的药物组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的食品组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的化妆品组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的皮肤外用制剂。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的药物组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的食品组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的化妆品组合物。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种含有Lactococcuschungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的皮肤外用制剂。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种治疗炎性疾病的方法，其包括将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗炎性疾病的药剂中的用途。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供一种治疗细菌感染的方法，其包括将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
为了实现本发明的另一个目的，本发明提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗细菌感染的药剂中的用途。
以下对本发明进行详细说明。
本发明提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的药物组合物。
并且，本发明提供一种组合物，其中所述Lactococcus chungangensis的保藏登记号为KCTC 12684BP。
本发明的菌株——Lactococcus chungangensis——是一种从污水处理厂的污水中分离出的菌株，在分类学上属于革兰氏阳性球菌。本发明的菌株是本发明的发明人新发现的新菌株，根据其细胞形态学和生化试验结果，将其鉴定为属于乳球菌属(Lactococcus)的菌株，并于2008年保藏在韩国典型培养物保藏中心(登记号为KCTC 12684BP)。此外，Lactococcus chungangensis作为革兰氏阳性球菌的特征在于不形成孢子和菌丝体并以短链形态或不规则聚簇(cluster)形态而单生或成对发育，对本菌株的更具体的说明在“International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2008)，58，1844-1849”中给出。
本发明的组合物以含有所述Lactococcus chungangensis菌株的组合物为主，由于菌株的培养液或培养上清液也显示出对抗炎性疾病的效果，因此将含有所述菌株、其培养液或培养上清液的用于治疗炎性疾病的药物组合物纳入权利要求的范围之内。可从所述培养液去除Lactococcus chungangensis，并优选所述培养液为离心分离之后的上清液。所述培养液可包含培养液的浓缩液以及所述培养液的干燥物。此外，本发明的组合物可含有Lactococcus chungangensis活菌体、破碎的细胞壁碎片、死菌体或干燥的菌体作为有效成分，并还可包含赋形剂或载体。
本发明的培养Lactococcus chungangensis的方法不受特别限制，可以以常规方法进行。例如，在微生物能够增殖的培养基中进行培养，并通过离心分离等方法进行回收。
根据本发明的实施例，采用Lactococcus chungangensis处理巨噬细胞RAW264.724小时，结果显示在LPS刺激的RAW264.7细胞中所产生的一氧化氮的量显著减少，前列腺素E2(PGE2)的量也呈现相同状态，因此可知Lactococcus chungangensis具有抑制炎症反应的效果(实施例2-2)。
此外，根据本发明的另一个实施例，在通过DNCB处理而诱发了特应性的动物模型中，将Lactococcus chungangensis以109细胞/小鼠的量，每周2次，总共4周经口给予或皮肤涂布的结果，确认了炎症反应相关的细胞因子——IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α和TARC的血清浓度显著降低，因此可知Lactococcus chungangensis可用作炎性疾病的预防或治疗剂(实施例4-5)。
本发明的组合物可进一步包含药学上可接受的添加剂，作为药学上可接受的添加剂可使用：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶态二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯树胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇以及滑石等。本发明的药学上可接受的添加剂优选相对于所述组合物的量为0.1-90重量份，但不限于此。
此外，本发明的组合物在临床给药时，可以以口服以及肠胃外的多种临床剂型给药。在制备制剂时可使用通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂可通过将Lactococcus chungangensis与至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖以及明胶等)混合而制备。此外，除了简单的赋形剂以外，还可使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石。用于口服的液状制剂的实例包括悬浮剂、溶液剂、乳剂和糖浆剂，其除了通常使用的简单的稀释剂如水和液体石蜡以外还可包含多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。
用于肠胃外给药的制剂可包括无菌水溶液、非水性溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射用的酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基剂可使用Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸酯和甘油明胶等。
另外，注射剂中可包含常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂等。
此外，本发明的治疗组合物还可包含任何生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th Edition，Alfonso，R.，ed，Mack Publishing Co.(Easton，PA：1995))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受试者无毒性，它们包括：缓冲溶液，例如磷酸、柠檬酸以及其他有机酸；抗氧化剂，以抗坏血酸为首选；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类、以及葡萄糖、甘露糖或糊精以及其他糖类；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子性表面活性剂，例如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物对人体的给药量根据患者的年龄、体重、性别、给药形式、健康状态以及疾病严重程度而变化，通常可为0.014-100mg/kg/天，优选可为0.1-20mg/kg/天，更有选可为5-10mg/kg/天。此外，可根据医生或药剂师的判断以固定间隔分次给药。
本发明还提供一种组合物，其用于治疗选自以下的炎性疾病中的任何一种：炎性皮肤疾病、过敏性疾病、炎性肠病如克罗恩病和溃疡性结肠炎、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝组织炎、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、囊性纤维化、中风、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、赖特综合征、银屑病性关节病、肠病性关节炎、青少年关节炎、青少年强直性脊柱炎、反应性关节炎、感染性关节炎、后-感染性关节炎、淋菌性关节炎、结核性关节炎、病毒性关节炎、真菌性关节炎、梅毒性关节炎、莱姆病、“血管炎综合症”相关的关节炎、结节性多动脉炎、过敏性血管炎、卢伽雷氏肉芽肿症、风湿性多肌痛、关节细胞动脉炎、钙晶体沉积关节病、假性痛风、非-关节性风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、神经性关节病(charco andjoint)、出血性关节病(hemarthrosic)、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、肥大性骨关节病、多中心性网状组织细胞瘤、肉状瘤病(surcoilosis)、血色素沉着症、镰状细胞病以及其他血红蛋白病、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、家族性地中海热、贝赫切特综合征、全身性红斑、回归热、银屑病、多发性硬化症、败血症、败血性休克、多器官功能障碍综合征、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤以及支气管肺发育不良，但不限于所述炎性疾病。
本发明还提供一种组合物，其用于治疗选自以下的过敏性疾病中的任何一种：过敏性皮肤病、特应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性中耳炎、荨麻疹、哮喘以及过敏性休克，但不限于所述过敏性疾病。
在本发明中使用的术语“过敏”是指与某种外来物质接触的机体对该物质产生的不同于正常的反应的现象。过敏是指宽范围的复杂病理现象的总和且是一种基于免疫反应的机体全身性或局部性障碍。人体中过敏根据免疫机制分为I、II、III以及IV型，其中I型过敏属于速发型过敏反应，在临床中占据重要部分，此外特应性皮炎、特应性鼻炎、支气管哮喘、枯草热以及花粉症等也属于速发型过敏反应。
此外，所述过敏疾病可为以肥大细胞作为媒介的过敏疾病，具体而言，Lactococcus chungangensis通过抑制肥大细胞中的脱颗粒而对过敏疾病起效。
根据本发明的实施例，在采用Lactococcus chungangensis处理之后，采用诱导脱颗粒的化合物48/80处理肥大细胞HMC-1细胞，结果表明表征肥大细胞的活化和脱颗粒的主要因子β-己糖胺酶的分泌被抑制，作为诱发过敏性疾病的最重要因子之一的组胺的分泌也被抑制(实施例3)。
此外，根据本发明的另一个实施例，从经口给予了Lactococcus chungangensis的BALB/c小鼠或NC/Nga小鼠的血清中测量作为介导过敏性疾病的细胞因子的IgE表达量，结果表明与作为阳性对照的他克莫司(tacrolimus)相比，Lactococcus chungangensis显示出同等水平的抑制IgE表达的效果(实施例4-4)，因此可知Lactococcus chungangensis可有效地用于预防和治疗过敏性疾病。
特别地，本发明的Lactococcus chungangensis几乎没有毒性，显示出由于抗炎症和抗过敏效果而引起的对过敏性皮肤疾病的预防和治疗效果，并抑制过敏性炎症反应以及炎性细胞因子的表达，因此对过敏性皮肤疾病包括特应性皮炎具有显著效果。因此，含有Lactococcus chungangensis的药物组合物可有效地用于预防和治疗过敏性疾病。
特应性皮炎一般始于称为胎热的婴儿期湿疹，在急性期表现出皮肤瘙痒、红斑或水肿或米粒状突起、小水泡或变得潮湿并结瘢等症状，在慢性期表现出瘙痒、皮肤变硬或变厚或结线状或米粉状鳞或变黑或脱色而变白等症状。
如参考特应性皮炎患者的血液检查和皮肤组织检查结果，在大部分患者的血液中，观察到IgE、单核细胞上IgE受体I表达以及嗜酸性粒细胞的增加，在皮肤组织检查中，观察到表达IgE受体的抗原提呈细胞的增加以及活化的T细胞、IL-5、IL-10、IL-13和嗜酸性粒细胞的增加。特应性皮炎的患者们表现出免疫性异常反应，即对环境性抗原的速发型过敏反应增加、IgE和IgE受体表达增加、抗原特异性T细胞和Th2细胞增加，当所述疾病成为慢性时，表现出Th1细胞增加的双相细胞因子谱。此外，表皮朗格汉斯细胞和记忆T细胞被活化，并且树突状细胞和嗜酸性粒细胞以及肥大细胞被活化。
根据本发明的另一个实施例，在通过DNCB诱发了特应性皮炎的BALB/c小鼠或NC/Nga小鼠动物模型中，观察Lactococcus chungangensis口服给药组、Lactococcuschungangensis皮肤涂布组以及作为阳性对照的他克莫司皮肤涂布组的治疗效果，结果表明在Lactococcus chungangensis口服给药组以及他克莫司皮肤涂布组中，肉眼可观察到的皮肤病理症状如角质、红斑、渗出性结瘢的形成和出血、水肿等显著改善，并且在Lactococcus chungangensis皮肤涂布组中皮肤状况也逐渐改善。此外，小鼠的抓挠次数评价也表明Lactococcus chungangensis口服给药组与他克莫司皮肤涂布组以相同的程度显著地改善抓挠现象(实施例4-2)。
此外，在本发明的另一个实施例中，在特应性皮炎动物模型的皮肤组织中评价Lactococcus chungangensis对特应性皮炎相关的趋化因子和细胞因子基因表达的影响，结果表明Lactococcus chungangensis口服给药组和作为阳性对照的他克莫司皮肤涂布组的皮肤组织内IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α和TARC的mRNA表达量减少(实施例4-5)，并表明从心脏采取的血液样品中所述趋化因子和细胞因子的蛋白表达量显著减少(实施例4-5)。由于本发明的Lactococcus chungangensis能够提供与特应性皮炎治疗剂他克莫司相同程度的治疗效果，因此表明其可用作过敏性皮肤疾病包括特应性皮炎的预防或治疗剂。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的食品组合物。
所述炎性疾病如上所述。
本发明的食品组合物可直接使用Lactococcus chungangensis或与其他食品或食品成分共同使用，并可通过常规方法适当地使用。
本发明中使用的术语“食品”是指肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、小吃类、饼干类、比萨饼、拉面、其他面类、口香糖类、乳制品包括冰淇淋、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料以及复合维生素剂等，并包含常规意义上的所有食品。
本发明的食品组合物中可包含健康功能食品。本发明中使用的术语“健康功能食品”是指通过使用对人体有益的功能性原料或成分制备并加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液状以及丸等形式的食品。在此，“功能性”是指对人体的结构以及功能具有有益健康的效果，如调节养分或生理学作用。本发明的健康功能食品可通过该领域中通常使用的方法来制备，在制备时可添加该领域中通常使用的原料和成分。
此外，所述健康功能食品的剂型只要是认证为健康功能食品的剂型就可不受限制地制备。本发明的食品用组合物能够制备成多种剂型，与一般药物不同，由于食品被用作长期服用的原料，其具有不发生副作用的优点，并且非常方便，因此本发明的健康功能食品可作为用于增加抗炎剂或抗过敏剂等的效果的辅助剂来摄取。
此外，本发明的食品组合物可包含多种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸剂等。此外可包含用于制备天然水果汁、水果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。这些成分可单独或混合使用。这些添加剂的比例虽然不是特别重要，但通常针对每100重量份的本发明的食品组合物在0.01-0.1重量份的范围内进行选择，但不限于此。
此外，本发明的食品组合物与通常的饮料一样，还可包含多种香料或天然碳水化合物。所述天然碳水化合物为：单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，糖醇如木糖醇、山梨糖醇、糖醇和赤藓醇等。作为甜味剂可使用天然甜味剂如索马甜和甜菊提取物或合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜。所述天然碳水化合物的比例针对100ml本发明的组合物通常为约0.01-0.04g，优选为约0.02-0.03g，但不限于此。
在本发明的食品组合物中，可根据使用目的(预防、健康或治疗处理)而适当地确定Lactococcus chungangensis的混合量。
通常，当将本发明的Lactococcus chungangensis制备成食品或饮料时，在1g(或ml)所述特定食品材料中添加1×107至1×109个(细菌)本发明的菌株，优选以1×108至5×108个的量添加。此外，本发明的含有Lactococcus chungangensis的食品组合物的每日摄取量为1×105至1×1010CFU/kg，优选为1×105至1×107CFU/kg，摄取可为一日摄取一次，也可分成数次摄取，但不限于此。
可依据所述药物组合物的有效剂量来使用本发明的菌株的有效剂量，但在以健康和卫生为目的或以健康调节为目的进行长时间摄取的情况下，可在所述范围以下使用，由于有效成分在安全性方面没有任何问题，因此可使用所述范围以上的量。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的化妆品组合物。
所述炎性疾病如上所述。
在本发明的所述化妆品组合物中，所述含有Lactococcus chungangensis的化妆品组合物除Lactococcus chungangensis外还可包含：脂质、有机溶剂、增溶剂和胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、助悬剂、稳定剂、发泡剂、香料、表面活性剂、离子或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂以及螯合剂、防腐剂、维生素、隔离剂、增湿剂、精油、染料、颜料、亲水性或疏水性(亲油性)活化剂、脂质囊泡或通常用于化妆品中的任何其他成分以及在相同化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的辅助剂。此外，所述成分的量可以是它们在皮肤科学领域中通常使用的量。
作为化妆品的本发明的组合物的具体剂型包括：润肤乳液、皮肤柔软剂、爽肤水、收敛化妆水、乳液、牛奶润肤乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗发水、洁面泡沫剂、洁面乳液、洁面霜、润肤乳液、沐浴露、乳液、粉饼、散粉、眼影等的剂型，但不限于此。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗炎性疾病的皮肤外用制剂。
所述炎性疾病如上所述。
在将本发明的组合物制成皮肤外用制剂的情况下，本发明的组合物不仅包含Lactococcus chungangensis，还包含通常用于皮肤外用制剂中的成分，并包含例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料以及香料等常规辅助剂和载体。此外，本发明的组合物除了Lactococcus chungangensis以外，在不破坏其作用的前提下，可与常规使用的皮肤保湿剂、皮肤密封剂以及含神经酰胺的保湿剂混合使用。
本发明的皮肤外用制剂可制成在该领域中通常制备的任何剂型，例如可制成溶液剂、悬浮剂、乳剂、膏剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、皂、含表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底以及喷雾，但不限于此。更详细地可制成柔软化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜、喷雾或粉末的剂型。
在本发明的剂型为膏、霜或凝胶的情况下，作为载体成分可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌。
在本发明的剂型为粉末或喷雾的情况下，作为载体成分可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别是在喷雾的情况下，还可包含推进剂如氯氟氢碳化合物(chlorofluorohydrocarbon)、丙烷/丁烷或二甲醚。
在本发明的剂型为溶液剂或乳剂的情况下，作为载体成分可使用溶剂、增溶剂或乳化剂，此外可列举水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨醇脂肪酸酯。
在本发明的剂型为悬浮剂的情况下，作为载体成分可使用液态稀释剂如水、乙醇或丙二醇，助悬剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯失水山梨醇酯，微晶纤维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶。
在本发明的剂型为含表面活性剂的洁面剂的情况下，作为载体成分可使用脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐(Isethionate)、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐(Methyl taurate)、肌氨酸、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的药物组合物。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的食品组合物。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的化妆品组合物。
本发明还提供一种含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的用于治疗细菌感染的皮肤外用制剂。
根据本发明的实施例，由于本发明的含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的组合物显示出对抗金黄色葡萄球菌的抗菌作用，因此可确认其对细菌感染具有预防或治疗作用(实施例5)。
所述细菌具体可为有害微生物如大肠杆菌(<57>E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphyllococcus aureus)、白念珠菌(Candida albican)、黑曲霉(Aspergillus niger)或痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)，优选可为金黄色葡萄球菌，但不限于此。
另外，所述细菌感染可为细菌渗透患有特应性皮炎的患者的皮肤而使患者感染的情况，但不限于此。患有特应性皮炎的患者由于皮肤变得非常干燥且瘙痒，因此会持续进行抓挠，并由此在皮肤上产生伤痕。通过这样的伤痕，有害微生物如细菌和病毒侵入而导致继发感染，并引发炎症，严重时会伴随畏寒、发烧等症状。
诱发这种特应性皮炎引起的继发感染的最常见的细菌为金黄色葡萄球菌。已知金黄色葡萄球菌只在5％的正常人中建群(colonization)，却在90％的特应性皮炎患者中建群(Leyden，JE，Marples，RP and Kligman AM Br.J.Dermatol.90：525-530，1974)。所述细菌通过释放毒素(例如，肠毒素A、B、C以及D；中毒性休克综合征毒素)而使特应性皮肤病患者的症状恶化和慢性化，并且由于大部分毒素在自然界中具有高抗原性，因此导致皮肤中的炎症反应加重(Leung，DYM et al J.Clin.Invest.92 1374-80，1993)。一项对儿童的特定研究表明疾病的严重性和产生毒素的菌株的建群相关联，并确认金黄色葡萄球菌在81％的患者中建群(对照组为4％)(Bunikowski，R et al J.Allergy Clin Immunol.105(4)：814-819，2000)。
因此，对金黄色葡萄球菌显现出抗菌活性的本发明的组合物不仅能够改善特应性皮炎的症状，还可以预防或改善特应性皮炎引起的继发感染，这是尤为重要的。
所述药物组合物、食品组合物、化妆品组合物以及皮肤外用制剂如上所述。
本发明提供一种治疗炎性疾病的方法，其包括将有效量的Lactococcuschungangensis给予需要其的受试者。
本发明提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗炎性疾病的药剂中的用途。
本发明提供一种治疗细菌感染的方法，包括将有效量的Lactococcuschungangensis给予需要其的受试者。
本发明提供Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗细菌感染的药剂中的用途。
本发明的所述“有效量”是指，当给予受试者时，可改善细菌感染或炎性疾病的量，其可包括治疗或实质上预防这样的疾病或改善其病症的量。所述“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类的动物，也可以是来自动物的细胞、组织、器官等。所述受试者可以是需要治疗的患者。
发明的效果
因此，本发明的含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的组合物对于炎性疾病的预防或治疗具有优异的效果，并对主要的炎症因子一氧化氮和前列腺素E2的分泌具有显著的抑制效果，不仅对主要的过敏因子β-己糖胺酶和组胺的分泌具有显著的抑制效果，还显著抑制皮肤疾病相关的细胞因子和趋化因子的生成，因此可作为预防和治疗炎性疾病的药剂使用。此外，由于本发明的组合物显示出对抗诱发特应性皮炎的继发感染的金黄色葡萄球菌的抗菌作用，因此可用于预防或治疗细菌感染。
附图说明
图1示出了Lactococcus chungangensis的细胞毒性评价(细胞生存能力检测)的结果。
图2示出了采用Lactococcus chungangensis处理巨噬细胞并测量一氧化氮生成量的结果。
图3示出了采用Lactococcus chungangensis处理巨噬细胞并测量前列腺素E2生成量的结果。
图4A示出了采用Lactococcus chungangensis处理肥大细胞株HMC-1细胞并测量β-己糖胺酶分泌的结果。
图4B示出了采用Lactococcus chungangensis处理肥大细胞株HMC-1细胞并测量组胺分泌的结果。
图5为显示BALB/c小鼠皮肤损伤程度的图(正常：正常BALB/c小鼠，DNCB：诱发了特应性的BALB/c小鼠，皮肤涂布Lactococcus chungangensis：皮肤涂布Lactococcuschungangensis的诱发了特应性的BALB/c小鼠，口服给予L.chungangensis：口服给予Lactococcus chungangensis的诱发了特应性的BALB/c小鼠，他克莫司：皮肤涂布他克莫司的诱发了特应性的BALB/c小鼠，在以下附图中均具有相同的含义)。
图6为显示NC/Nga小鼠皮肤损伤程度的图。
图7A示出了诱发了特应性的BALB/c小鼠在10分钟内抓挠次数的测量值的结果。
图7B示出了诱发了特应性的NC/Nga小鼠在10分钟内抓挠次数的测量值的结果。
图8示出了将各动物组小鼠的背部皮肤组织和在耳朵中将表皮以及真皮进行H&E染色并通过光学显微镜拍照的结果。
图9示出了比较从各动物组小鼠的血液中分离的血清免疫球蛋白IgE生成量的结果。
图10A示出了采用PCR评价在各动物组小鼠的皮肤组织中的过敏相关的趋化因子和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α以及TARC)的mRNA表达量的结果。
图10B示出了采用PCR评价各动物组小鼠的皮肤组织中的过敏相关的趋化因子和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α以及TARC)的mRNA表达量的结果。
图11A示出了评价从各动物组小鼠的血液中分离的血清IL-4蛋白量的结果。
图11B示出了评价从各动物组小鼠的血液中分离的血清IL-5蛋白量的结果。
图12A示出了从各动物组小鼠的血液中分离的血清IL-12蛋白量的结果。
图12B示出了从各动物组小鼠的血液中分离的血清IFN-γ蛋白量的结果。
图13A示出了从各动物组小鼠的血液中分离的血清TNF-α蛋白量的结果。
图13B示出了从各动物组小鼠的血液中分离的血清TARC蛋白量的结果。
具体实施方式
以下对本发明进行详细地说明。
但是，下述实施例仅例示本发明，本发明并不限于下述实施例。
统计分析
在所有实验结果中，实验组之间的统计分析采用单因素方差分析(one-wayANOVA)在P＜0.05的程度下分析各组之间的平均值的显著性差异。当P值为0.05以下的情况时，在图中标记为＊。在人体角质形成细胞株HaCaT细胞和NC/Nga小鼠的结果中，当P值为0.05以下的情况时，标记为#以示区分。
<实施例1>
Lactococcus chungangensis的培养
Lactococcus chungangensis是在本实验室从活性污泥气泡中分离出的菌株。该菌株保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)。将Lactococcus chungangensis接种到胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB：Tryptic Soy Broth)中，并在振荡培养箱中在30℃下培养24小时。使用全自动定量绘图酶标仪(model Infinite F200，Tecan，Mannedorf，瑞士)测量各细胞密度。
<实施例2>
Lactococcus chungangensis对巨噬细胞和角质形成细胞的效果评价
<2-1>Lactococcus chungangensis对RAW264.7细胞和HaCaT细胞的毒性评价
测定在上述实施例1中培养的Lactococcus chungangensis的细胞毒性。将小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞和人体角质形成细胞株HaCaT细胞用于细胞毒性测定中，进行了细胞生存能力试验以测定细胞毒性。RAW264.7细胞和HaCaT细胞1周进行4-5次传代，培养基是含有20/ml庆大霉素溶液和10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium)，并在37℃、5％CO2的环境中培养。为了测定细胞生存能力，在24孔板中以1×105细胞/孔的浓度培养RAW264.7细胞和HaCaT细胞，培养24小时。将Lactococcuschungangensis以109细胞/ml的浓度在不含FBS的新鲜DMEM培养基中培养24小时。为了测量细胞株的生存率，使用MTT[3-(4，5-二-甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]试剂在全自动定量绘图酶标仪(model Infinite F200，Tecan，M，瑞士)测量590mm处的吸光度。
其结果，如在图1中所示，表明采用Lactococcus chungangensis处理过的RAW264.7细胞和HaCaT细胞的细胞生存能力与无处理组的细胞生存能力相当。
<2-2>Lactococcus chungangensis在RAW264.7细胞中的抗炎症活性测量
测定上述实施例1中培养的Lactococcus chungangensis的抗炎症活性。和<实施例2-1>相同，将RAW264.7细胞用于抗炎症活性测定实验中。将所培养的细胞以1×105细胞/孔的浓度置于24-孔板中，并培养24小时。为了诱发炎症，向不含FBS的新鲜DMEM培养基中添加LPS至浓度为0.1μg/ml。采用Lactococcus chungangensis以109细胞/ml的浓度处理细胞株之后培养24小时。24小时之后，为了从细胞培养上清液中测量细胞株的NO生成程度，以1∶1的比例混合格里斯(Griess)试剂并反应10分钟。在全自动定量绘图酶标仪(modelInfinite F200，Tecan，M，瑞士)中测量540mm处的吸光度。此外，为了在细胞培养上清液中测量细胞株的PGE2生成程度，使用前列腺素E2参数TM免疫测定试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)并根据手册进行实验。PGE2的蛋白量通过在全自动定量绘图酶标仪测量450mm处的吸光度而确定。
其结果，如在图2和图3中所示，表明在以LPS刺激的RAW264.7细胞中，添加了Lactococcus chungangensis的细胞的NO生成量显著减少(图2)，PGE2生成量也显示出相同的情况(图3)。因此证实了Lactococcus chungangensis抑制炎症反应并具有抗炎症效果。本研究的结果表明Lactococcus chungangensis具有高的炎症治愈效能，Lactococcuschungangensis可用于抗炎症组合物中，并且更广泛地，可用于治疗炎症的药物组合物中。
<实施例3>
Lactococcus chungangensis的体外抗过敏效能评价
<3-1>由Lactococcus chungangensis引起的肥大细胞(HMC-1)的β-己糖胺酶分泌的比较
β-己糖胺酶的分泌作为表示肥大细胞的活化和脱颗粒的主要因素而被广泛使用。因此，在本研究中，利用人体肥大细胞株HMC-1细胞来测量β-己糖胺酶的分泌。HMC-1细胞1周进行4-5次传代，培养基是含有20μg/ml庆大霉素溶液和10％胎牛血清的IMDM(Iscove′smodified Dulbecco′s Medium)培养基，并在37℃、5％CO2的环境中培养。将所述细胞以1×106细胞/孔的浓度在24-孔板中培养，并将Lactococcus chungangensis以1×109细胞/ml的浓度添加到台氏液(tyrode′s buffer)(137mM NaCl，2.7mM KCl，1.8mM CaCl2，1.1mMMgCl2，11.9mM NaHCO3，0.4mM NaH2PO4，5.6mM葡萄糖，pH 7.2)中，并在37℃下培养30分钟。此后，以6μg/ml的浓度添加化合物48/80并再次在37℃下培养30分钟。在采用冰终止反应10分钟后通过离心分离细胞，仅回收上清液，并将30μl上清液转移到96孔板中，并添加30μl1mM的4-p-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷作为基质，并在37℃下反应1小时。最后，采用120μl停止液(碳酸氢钠，pH 10.2)终止反应，然后在全自动定量绘图酶标仪中测量405mm处的吸光度。
采用Lactococcus chungangensis处理HMC-1细胞之后，将采用化合物48/80诱导脱颗粒而分泌的β-己糖胺酶的结果示于图4A中。如图4中所示，表明Lactococcuschungangensis对β-己糖胺酶的抑制效果显著，并抑制了65％的β-己糖胺酶分泌。
<3-2>由Lactococcus chungangensis引起的肥大细胞(HMC-1)的组胺分泌的比较
为了测定人体肥大细胞株HMC-1细胞分泌的组胺的浓度，培养HMC-1细胞，并以1×106细胞/孔的浓度在24-孔板中培养24小时。培养后，通过与上述实施例3-1相同的方式采用Lactococcus chungangensis以1×109细胞/ml的浓度处理所述细胞并培养1小时。将细胞采用化合物48/80(10μg/ml)处理20分钟，并回收细胞培养液。通过使用组胺测定ELISA试剂盒(Cayman Chemical Company；Ann Arbor，IL，USA)在全自动定量绘图酶标仪中测量450mm处的吸光度而确定细胞培养液中的组胺浓度。
采用Lactococcus chungangensis处理之后，将采用化合物48/80诱导HMC-1细胞分泌组胺并将组胺分泌量的结果示于图4B。如图4B中所示，Lactococcus chungangensis显示出81％的高的组胺分泌抑制效果。所以，可知Lactococcus chungangensis对过敏显示出高的治愈效能。因此，本研究的结果是Lactococcus chungangensis显示出对过敏的高的治愈效能，Lactococcus chungangensis可用于抗过敏组合物，并且更广泛地，可用于治疗过敏的药物组合物中。
<实施例4>
Lactococcus chungangensis对诱发了特应性的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠模型的 体内效能评价
<4-1>特应性的诱发以及药物处理
将小鼠分成未处理组(正常)、DNCB组、他克莫司皮肤涂布组、Lactococcuschungangensis皮肤涂布组、Lactococcus chungangensis口腔给药组总共5个组，每组各利用10只BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠进行评价。在BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的背部和颈部涂布0.1g脱毛膏，并以柔软的绵纸以不会产生伤口的方式进行脱毛。放置5天，使微小伤愈合之后，以每周3次持续2周将1％的DNCB 200(丙酮∶橄榄油＝3∶1)涂布在背部和耳部来诱发特应性。诱发特应性之后每周2次持续4周将Lactococcus chungangensis以109细胞/小鼠的量涂布在患部，并每周2次持续4周将Lactococcus chungangensis以109细胞/小鼠的量经口给药小鼠。为了比较效能，使用他克莫司作为特应性的治疗剂。以100mg/kg的量每周2次持续4周将他克莫司涂布在特应性患部。
<4-2>诱发了特应性的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的肉眼评价
为了评价他克莫司皮肤涂布组、Lactococcus chungangensis皮肤涂布组、Lactococcus chungangensis口腔给药组的治疗效果，进行了肉眼评价。肉眼评价将红斑/出血、干燥/结瘢结瘢、水肿、糜烂/抓痕程度作为评价指标而将皮肤状况分为4个等级(0＝不存在，1＝轻度，2＝中度，3＝严重)来评价，12分以上判断为特应性症状达到最高。将其结果示于下表中，BALB/c小鼠的情况示于下表1至表5中，NC/Nga小鼠的情况示于下表5至表6中。
此外，测量BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的抓挠次数，并示于图7A和图7B中。
【表1】
正常BALB/c小鼠的肉眼评价结果
【表2】
DNCB诱发了特应性的BALB/c小鼠的肉眼评价结果
【表3】
DNCB诱发了特应性之后采用特应性治疗剂(他克莫司)皮肤涂布处理的BALB/c小鼠的肉眼评价结果
【表4】
DNCB诱发了特应性之后采用Lactococcus chungangensis皮肤涂布处理的BALB/c小鼠的肉眼评价结果
【表5】
DNCB诱发了特应性之后采用Lactococcus chungangensis口服给药处理的BALB/c小鼠的肉眼评价结果
【表6】
正常NC/Nga小鼠的肉眼评价结果
【表7】
DNCB诱发了特应性的NC/Nga小鼠的肉眼评价结果
【表8】
DNCB诱发了特应性之后采用特应性治疗剂(他克莫司)皮肤涂布处理的NC/Nga小鼠的肉眼评价结果
【表9】
DNCB诱发了特应性之后采用Lactococcus chungangensis皮肤涂布处理的NC/Nga小鼠的肉眼评价结果
【表10】
DNCB诱发了特应性之后采用Lactococcus chungangensis口服给药处理的NC/Nga小鼠的肉眼评价结果
通过采用DNCB处理2周(图3的0-2周)对BALB/c小鼠诱发了特应性之后，对采用100mg/kg特应性治疗剂他克莫司涂布患部的组、采用109细胞/小鼠的Lactococcuschungangensis涂布患部的组、采用109细胞/小鼠的Lactococcus chungangensis口服.给药的组，肉眼观察皮肤损伤状况的结果示于图5以及上述表1-表5中。诱发了特应性皮炎的皮肤出现皮肤干燥引起的角质、整体性的红斑、渗出性痂形成和出血、水肿等各种症状，从他克莫司皮肤涂布组和Lactococcus chungangensis口服给药组观察到皮肤状况明显变好。相反，Lactococcus chungangensis皮肤涂布组虽然相对于Lactococcuschungangensis口服给药组较缓慢，但还是在肉眼观察时观察到皮肤状况慢慢变好的情况。这样的现象在BALB/c小鼠抓挠次数评价中也显示出类似的倾向，特别地，Lactococcuschungangensis口服给药组与他克莫司处理组以相同的程度显著地减少抓挠。NC/Nga小鼠也同样，通过DNCB处理2周(图3的0-2周)诱发特应性之后，以相同方式对采用100mg/kg特应性治疗剂他克莫司涂布患部的组、采用109细胞/小鼠的Lactococcus chungangensis涂布患部的组、采用109细胞/小鼠的Lactococcus chungangensis口服给药的组，肉眼观察皮肤损伤状况的结果示于图6以及上述表6-表10中。在NC/Nga小鼠上也同样观察到皮肤角质和红斑、渗出性痂形成和出血、水肿等多种症状，采用实验物质处理后显示出比BALB/c小鼠更迅速的治愈能力。总之，可知BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的Lactococcus chungangensis口服给药组对DNCB处理引起的皮肤损伤，显示出高的治愈效能。
<4-3>组织病理学检查
实验物质处理之后，摘取实验组以及对照组BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的背部组织(1.5×1.5cm)和耳朵，并在10％多聚甲醛中固定24小时之后，将上述组织充分固定在石蜡上，之后切成5片而制备玻璃载片。采用苏木精&伊红(H&E)以公知的方法进行染色，并利用光学显微镜观察表皮和真皮的厚度，并将其结果示于图8中。
如图8中所示，在DNCB诱发了特应性的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的表皮上观察到角质脱落、表皮肥厚、角化过度症。相反，在特应性治疗剂他克莫司皮肤涂布组和Lactococcus chungangensis口服给药组的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠中观察到经过处理后，角质脱落、表皮肥厚和角化过度症均减轻，并且同样在Lactococcus chungangensis皮肤涂布组中观察到，相对于DNCB诱发了特应性的小鼠，经过处理后角质脱落、表皮肥厚、角化过度症稍微减轻。
<4-4>免疫球蛋白IgE的测量
实验物质处理之后，处死五个组的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠并从心脏中采集血液，从中分离血清并测量IgE。具体而言，使用IgE ELISA试剂盒(BD Biosciences，SanDiego，CA)，将抗体在缓冲溶液中稀释并使之附着在96孔板上，在4℃下静置过夜，并根据手册进行试验。通过在全自动定量绘图酶标仪中测量450nm处的吸光度而测定IgE的蛋白量。
通过使用IgE ELISA试剂盒在从各BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的心脏采集的血液分离出的血清中测量的介导特应性疾病的IgE的量的结果示于图9中。实验物质处理过的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的IgE量的结果表明，在他克莫司皮肤涂布组和Lactococcuschungangensis口服给药组中以高水准抑制了IgE的生成。在BALB/c小鼠中，与DNCB诱发组相比，他克莫司皮肤涂布组抑制了48％，Lactococcus chungangensis口服给药组抑制了49％。此外，在Lactococcus chungangensis皮肤涂布组中也显示了25％左右的低水准的抑制。此外，在NC/Nga小鼠中，与DNCB诱发组相比，他克莫司皮肤涂布组抑制了62％，Lactococcus chungangensis口服给药组抑制了58％，Lactococcus chungangensis皮肤涂布组抑制了30％。上述结果显示，Lactococcus chungangensis对于特应性疾病是有效的。
<4-5>趋化因子和细胞因子的测量
在实验物质处理之后，处死BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠，从DNCB诱发了特应性的对照组小鼠、他克莫司皮肤涂布组、Lactococcus chungangensis口服给药组、Lactococcuschungangensis皮肤涂布组的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠中摘取皮肤组织，然后加入裂解液(Trizol)，并用匀浆器进行粉碎直至溶解，并从粉碎的组织中提取RNA。具体而言，向从上述各对照组和实验组的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠中摘取的皮肤组织中加入裂解液，并加入氯仿(CHCl3)，混合之后，放置10分钟，之后进行离心分离。回收离心分离的上清液并与等量的2-丙醇混合之后放置10分钟。再次对其进行离心分离，并采用80％的乙醇洗涤，干燥后获得RNA。通过逆转录PCR使用AMV逆转录酶、dNTP(Promega，Madison，WI)和EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzou，日本东京)获得cDNA，分析所得cDNA以确认特应性相关趋化因子和细胞因子的mRNA表达量。具体而言，利用下表5中对各IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-a、TARC细胞因子和趋化因子以及作为对照的GAPDH所描述的引物对进行PCR。所述PCR反应在94℃下1分钟、95℃下30秒、55-65℃下30秒以及70℃下3分钟的条件下反复30个循环。在如上所述的PCR反应之后，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳法分析反应物，并利用GelDocTMXR+(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行成像，其结果示于图10A和10B中。在所述PCR中所使用的引物由Macrogen公司制备并使用。下表11是用于逆转录PCR中的引物的碱基序列。
此外，从各BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的心脏采集的血液中分离出的血清中的IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-a和TARC蛋白质变化分别通过使用IL-4 Quantikine免疫测定试剂盒、IL-5 Quantikine免疫测定试剂盒、IL-12 Quantikine免疫测定试剂盒、TNF-αQuantikine免疫测定试剂盒、CCL17/TARC Quantikine免疫测定试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)在全自动定量绘图酶标仪中测量450nm处的吸光度而确定。
【表11】
在PCR中所使用的引物的碱基序列
将DNCB诱发了特应性的对照组、他克莫司皮肤涂布组、Lactococcuschungangensis皮肤涂布组、Lactococcus chungangensis口服给药组的BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠处死，摘取组织，从中提取RNA以证实各趋化因子和细胞因子特异性引物。结果发现，相对于DNCB诱发了特应性的小鼠，他克莫司皮肤涂布组小鼠、Lactococcuschungangensis口服给药组小鼠的IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α和TARC的mRNA表达量均减少(图10)。
此外，通过ELISA试剂盒测量从BALB/c小鼠和NC/Nga小鼠的心脏采集的血液中分离出的血清中介导特应性疾病的趋化因子和细胞因子的量，结果在蛋白质水平上证实了，相对于DNCB诱发了特应性的小鼠，他克莫司皮肤涂布组小鼠、Lactococcus chungangensis口服给药组小鼠的IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α和TARC的mRNA表达量显著减少(图11至图13)。还在蛋白质水平上证实了Lactococcus chungangensis皮肤涂布组小鼠的IL-4、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α和TARC的mRNA表达量稍微减少。因此，本发明的Lactococcuschungangensis能够以与他克莫司相同的程度治疗特应性，并且更广泛地，提示Lactococcus chungangensis可用于治疗特应性的药物组合物中。
<实施例5>
Lactococcus chungangensis对抗诱发特应性继发感染的微生物金黄色葡萄球菌 的抗菌活性
<5-1>实验微生物的制备
将Lactococcus chungangensis使用胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)在30℃培养箱中培养24小时，然后用于抗菌活性检测。实验中使用了从作为公知保藏机构的国家病原体培养物保藏中心(National Culture Collection for Pathogens，NCCP)获取的金黄色葡萄球菌NCCP 14780(Staphylococcus aureus NCCP 14780)。
<5-2>Lactococcus chungangensis对抗诱发特应性继发感染的微生物金黄色葡萄球菌的抗菌活性测量
将Lactococcus chungangensis在30℃培养箱中培养24小时以测量其抗菌活性。将金黄色葡萄球菌在脑心浸液(BHI)培养基中在37℃培养箱中培养24小时。将所培养的Lactococcus chungangensis转移到另一个胰蛋白酶大豆液体培养基之后，将所培养的葡萄球菌属细菌调节至每个培养皿的菌数为5×107，并加入7ml、60℃的未凝固的脑心浸液琼脂培养基，凝固后，在30℃培养箱中培养24小时。培养后，确认所生成的细菌的低生长区，即无菌区(Clear zone)，并使用游标卡尺测量直径，其结果示于表12中。
【表12】
Lactococcus chungangensis的抗菌活性测量
如表12中所示，证实了Lactococcus chungangensis对葡萄球菌属细菌显示出抗菌性。因此，由于Lactococcus chungangensis可保护机体避免葡萄球菌属细菌引起的特应性继发感染，并且其比抗菌剂更安全，因此，其可用于治疗特应性的药物组合物中。
<制备例1>
皮肤外用制剂的制备
<1-1>软膏的制备
根据本领域中通常使用的方法通过混合下述制剂材料而制备软膏。
<1-2>乳液的制备
根据本领域中通常使用的方法通过混合下述制剂材料而制备乳液。
<制备例2>
食品组合物的制备
<2-1>发酵乳的制备
利用本发明的Lactococcus chungangensis制备发酵乳。
通过将生乳(74.41％)和脱脂乳(6.45％)混合并向其中加入培养种菌和Lactococcus chungangensis进行培养而制备培养液(Lactococcus chungangensis：1×109CFU/ml)。将在相同混合液组分中只加入培养种菌并进行培养所得的培养液作为对比实施例。制备糖液并与之前所制备的各培养液混合而制备发酵乳制品。
<2-2>饮料的制备
使用以上述组分及含量通过常规方法制备饮料。
<2-3>健康功能食品(粉剂)的制备
Lactococcus chungangensis冷冻干燥粉末(1×109CFU/g)20mg
乳糖 100mg
滑石 10mg。
将上述成分混合并填充到气密布中来制备粉剂。
<2-4>健康功能食品(片剂)的制备
将上述成分混合并通过片剂的常规制备方法进行制备。
<2-5>健康功能食品(胶囊剂)的制备
根据胶囊剂的常规制备方法将上述成分混合并填充到明胶胶囊中而制备胶囊剂。
<2-6>健康功能食品(混合粉剂)的制备(1)
<2-7>健康功能食品(混合粉剂)的制备(2)
尽管上述维生素和矿物质混合物的配比相对地适合作为健康功能食品的优选实施例，但是可任意地改变所述配比，并可根据健康功能食品组合物的常规制备方法将所述成分混合之后制成颗粒。
综上所述，本发明所属技术领域的技术人员可知晓本发明在不改变其精神或必要技术特征的前提下，可体现为其他具体实施形式。对此，上述实施例仅为例示性的，并不限制本发明。本发明的范围和上述详细说明应该由后面所附的权利要求书来定义。此外应理解，从其相同概念中导出的所有改变或变形的形式皆属于本发明的范围内。
【工业适用性】
本发明的含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的组合物对炎性疾病具有优异的预防或治疗效果，并对主要的炎症因子一氧化氮和前列腺素E2的分泌具有显著的抑制效果，不仅对主要的过敏因子的β-己糖胺酶和组胺的分泌具有显著的抑制效果，还显著地抑制皮肤疾病相关的细胞因子和趋化因子的生成，这些效果与公知的皮肤疾病治疗剂(他克莫司)的效果处于相同的水平。此外，本发明的组合物对诱发特应性皮炎的继发感染的金黄色葡萄球菌具有抗菌作用，因此具有高的工业适用性。
序列表
<110> 中央大学校产学协力团
<120> 含有Lactococcus chungangensis作为有效成分的药物组合物
<130> OP17-0050
<150> 10-2015-0043602
<151> 2015-03-27
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaaccccca gctagttgtc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catcgaaaag cccgaaagag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcacagtgg tgaaagagac ctt 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccaatgcat agctggtgat tt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacacgcctg aagaagatga c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgccattcca catgtcactg c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacgctacac actgcatct 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagctcattg aatgcttgg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggcggtgc ctatgtctc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgatcacccc gaagttcagt ag 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggaagttg gtgagctggt ata 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgtgttcgc ctgtagtgca ta 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagctgtggc gtgatggccg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgggccctca gatgcctgct 20

Claims (15)

1.一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于：
所述Lactococcus chungangensis的登记号为KCTC 12684BP。
3.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于：
所述炎性疾病选自以下中的任何一种：炎性皮肤疾病、过敏性疾病、炎性肠病如克罗恩病和溃疡性结肠炎、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝组织炎、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、囊性纤维化、中风、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、赖特综合征、银屑病性关节病、肠病性关节炎、青少年关节炎、青少年强直性脊柱炎、反应性关节炎、感染性关节炎、后-感染性关节炎、淋菌性关节炎、结核性关节炎、病毒性关节炎、真菌性关节炎、梅毒性关节炎、莱姆病、“血管炎综合症”相关的关节炎、结节性多动脉炎、过敏性血管炎、卢伽雷氏肉芽肿症、风湿性多肌痛、关节细胞动脉炎、钙晶体沉积关节病、假性痛风、非-关节性风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、神经性关节病、出血性关节病、过敏性紫癜、肥大性骨关节病、多中心性网状组织细胞瘤、肉状瘤病、血色素沉着症、镰状细胞病以及其他血红蛋白病、高脂蛋白血症、低丙种球蛋白血症、家族性地中海热、贝赫切特综合征、全身性红斑、回归热、银屑病、多发性硬化症、败血症、败血性休克、多器官功能障碍综合征、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤以及支气管肺发育不良。
4.根据权利要求3的组合物，其特征在于：
所述过敏性疾病为选自以下中的任何一种：过敏性皮肤病、特应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性中耳炎、荨麻疹、哮喘以及过敏性休克。
5.一种用于治疗炎性疾病的食品组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
6.一种用于治疗炎性疾病的化妆品组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
7.一种用于治疗炎性疾病的皮肤外用制剂，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
8.一种用于治疗细菌感染的药物组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
9.一种用于治疗细菌感染的食品组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
10.一种用于治疗细菌感染的化妆品组合物，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
11.一种用于治疗细菌感染的皮肤外用制剂，其特征在于：
含有Lactococcus chungangensis作为有效成分。
12.一种治疗炎性疾病的方法，其特征在于：
将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
13.Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗炎性疾病的药剂中的用途。
14.一种治疗细菌感染的方法，其特征在于：
将有效量的Lactococcus chungangensis给予需要其的受试者。
15.Lactococcus chungangensis作为有效成分在制备用于治疗细菌感染的药剂中的用途。
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CHO SUNG-LIM等: "Lactococcus Chungangensis Sp.Nov.,A Lactic Acid Bacterium Isolated from Activated Sludge Foam", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY》 *

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