CN107400691A - 一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，包括以下步骤，取大目金枪鱼红肉匀浆、加水混匀、稀碱液调pH值、碱性蛋白酶酶解、离心得上清液即为大目金枪鱼红肉定向酶解制备的活性多肽液，本发明通过定向酶解制备大目金枪鱼红肉活性多肽的方法具有简单、稳定、得率高、成本低的特点，可用作工业化生产，通过大目金枪鱼红肉定向酶解制备具有抗疲劳、抗氧化功能的活性多肽，可作为医药中间体或者保健品原料，充分、高值化地利用大目金枪鱼红肉中的蛋白质，提高大目金枪鱼红肉的附加值，充分利用资源。

Description

一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法
技术领域
本发明涉及食品科学和生物工程技术领域，尤其涉及一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法。
背景技术
金枪鱼类是硬骨鱼纲鲈形目鲭科鱼类中具有胸甲的几个属鱼类的总称，又称鲔鱼、吞拿鱼，是一种生活在海洋中上层水域的高度洄游性鱼类，主要分布在太平洋、大西洋、印度洋的热带、亚热带以及温带广阔水域，常见的金枪鱼类有5个属，17个种，主要包括长鳍金枪鱼、大西洋金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、蓝鳍金枪鱼、鲣鱼等。其中，大目金枪鱼，拉丁名为Thunnusobesus，是一种洄游性的红肉鱼，其红肉又称暗色肉，分布于体测线附近，由于血管丛生，肉色暗红，腥味较重而不易被消费者接受，通常作为下脚料处理，附加值较低。而实际上，暗色肉跟普通肉一样，具有高蛋白低脂肪的特点，营养价值高，其蛋白质含量可达23％左右，氨基酸含量丰富，包含人体所需的8种必需氨基酸和2种半必需氨基酸(组氨酸和精氨酸)，因此，提高大目金枪鱼红肉的附加值，充分、高值化地利用其优质蛋白质是目前非常值得研究并解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术的现状，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，通过大目金枪鱼红肉定向酶解制备具有抗疲劳、抗氧化功能的活性多肽，充分、高值化地利用大目金枪鱼红肉中的蛋白质，提高大目金枪鱼红肉的附加值。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，包括以下步骤：
(1)将大目金枪鱼红肉在冰水浴中用高速匀浆机以100-200r/min的速度匀浆1-3min；
(2)匀浆完毕，按照料液比1:3加水充分混匀；
(3)在经过步骤(2)处理的匀浆液中缓慢滴入稀碱液，搅拌均匀，直至pH值为9-11；
(4)在经过步骤(3)处理的匀浆液中加入占红肉质量0.5-1.5％的碱性蛋白酶，在40-50℃的恒温水浴中酶解3-6h，酶解结束后，在100℃下灭酶10-15min，然后冷却至室温，用高速冷冻离心机以6000-8000r/min的转速离心10-15min，得到的上清液即为活性多肽液。
进一步地，所述步骤(1)中高速匀浆机的速度为100r/min，匀浆时间为2min，在该条件下匀浆，一方面能够保证红肉被充分捣碎，另一方面保证多肽的活性。
进一步地，所述步骤(3)中的稀碱液为氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液可以有效准确快速地调节pH值。
进一步地，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浓度过低，需加入较大体积的氢氧化钠溶液才能将pH值调节至所需范围，且速度较慢；浓度过高，对蛋白质、多肽的活性会有负面影响。
进一步地，所述步骤(4)中的碱性蛋白酶占红肉质量1％，该1％的量是通过响应面优化后得出的，一方面使水解度达到最高或接近最高，另一方面也考虑了酶解的成本。
进一步地，所述步骤(4)中的恒温水浴的温度为45℃，酶解时间为4h，灭酶时间为10min，上述参数是通过响应面优化后得出的，在此参数下蛋白的水解度达到最高。
进一步地，所述步骤(4)中高速冷冻离心机的转速为8000r/min，离心时间为10min，该条件下可以有效去除残渣。
进一步地，所述步骤(4)中的上清液经过冷冻干燥处理后即为活性多肽干粉。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过定向酶解制备大目金枪鱼红肉活性多肽的方法具有简单、稳定、得率高、成本低的特点，可用作工业化生产，通过大目金枪鱼红肉定向酶解制备具有抗疲劳、抗氧化功能的活性多肽，可作为医药中间体或者保健品原料，充分、高值化地利用大目金枪鱼红肉中的蛋白质，提高大目金枪鱼红肉的附加值，充分利用资源。
附图说明
图1为本发明活性多肽液的一级质谱图；
图2为本发明活性多肽液的二级质谱图；
图3为本发明活性多肽液与PLRLP多肽对DPPH的清除率的对比图。
具体实施方式
实施例1
一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，包括以下步骤：
(1)将冷冻状态下的大目金枪鱼红肉，在室温条件下流水解冻，解冻后，大目金枪鱼红肉在冰水浴中用高速匀浆机以150r/min的速度匀浆1min；
(2)匀浆完毕，按照料液比1:3加水充分混匀；
(3)在经过步骤(2)处理的匀浆液中缓慢滴入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，同时用玻璃棒不断搅拌，并用pH试纸检测pH值，直至pH值为9-11；
(4)在经过步骤(3)处理的匀浆液中加入占红肉质量0.5％的碱性蛋白酶，在40℃的恒温水浴中酶解3h，酶解结束后，在100℃下灭酶12min，然后冷却至室温，用高速冷冻离心机以6000r/min的转速离心13min，得到的上清液即为活性多肽液；
(5)将上清液冷冻干燥处理，即为活性多肽干粉。
实施例2
一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，包括以下步骤：
(1)将冷冻状态下的大目金枪鱼红肉，在室温条件下流水解冻，解冻后，大目金枪鱼红肉在冰水浴中用高速匀浆机以200r/min的速度匀浆3min；
(2)匀浆完毕，按照料液比1:3加水充分混匀；
(3)在经过步骤(2)处理的匀浆液中缓慢滴入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，同时用玻璃棒不断搅拌，并用pH试纸检测pH值，直至pH值为9-11；
(4)在经过步骤(3)处理的匀浆液中加入占红肉质量1.5％的碱性蛋白酶，在50℃的恒温水浴中酶解6h，酶解结束后，在100℃下灭酶15min，然后冷却至室温，用高速冷冻离心机以7000r/min的转速离心15min，得到的上清液即为活性多肽液；
(5)将上清液冷冻干燥处理，即为活性多肽干粉。
实施例3
一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，包括以下步骤：
(1)将冷冻状态下的大目金枪鱼红肉，在室温条件下流水解冻，解冻后，大目金枪鱼红肉在冰水浴中用高速匀浆机以100r/min的速度匀浆2min；
(2)匀浆完毕，按照料液比1:3加水充分混匀；
(3)在经过步骤(2)处理的匀浆液中缓慢滴入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，同时用玻璃棒不断搅拌，并用pH试纸检测pH值，直至pH值为9-11；
(4)在经过步骤(3)处理的匀浆液中加入占红肉质量1％的碱性蛋白酶，在45℃的恒温水浴中酶解4h，酶解结束后，在100℃下灭酶10min，然后冷却至室温，用高速冷冻离心机以8000r/min的转速离心10min，得到的上清液即为活性多肽液；
(5)将上清液冷冻干燥处理，即为活性多肽干粉。
本发明通过大目金枪鱼红肉定向酶解制备的活性多肽液具有抗疲劳、抗氧化的功能，可作为医药中间体或者保健品原料，充分、高值化地利用大目金枪鱼红肉中的蛋白质，提高大目金枪鱼红肉的附加值，充分利用资源。为验证本发明大目金枪鱼红肉定向酶解制备的为具有抗疲劳、抗氧化功能的活性多肽，通过动物实验验证，取同龄小鼠20只，雌雄各半，分为两组，实验组和对照组，实验组每日灌胃红肉酶解制备的活性多肽液50mg/ml，对照组灌胃生理盐水，连续灌胃28天后，小鼠眼球取血，检测小鼠血清中的CK、LDH、BUN反映疲劳程度的指标，结果如表1所示，CK为肌酸激酶，是骨骼肌能量代谢的关键酶之一，LDH为乳酸脱氢酶，其活性的变化反映了机体对运动产生的乳酸的处理能力，BUN为血清尿素氮，尿素氮的增高说明机体得不到充分能量即为疲劳，CK、LDH、BUN是常用的表征疲劳的指标，灌胃红肉酶解制备的活性多肽液的小鼠血清中的CK值较低，表明红肉酶解制备的活性多肽液对于小鼠运动所致的损伤及疲劳具有一定的修复功能；灌胃红肉酶解制备的活性多肽液的小鼠血清中LDH活性较对照组偏高，表明红肉酶解制备的活性多肽液有助于缓解乳酸积累造成的疲劳；灌胃红肉酶解制备的活性多肽液的小鼠血清中BUN的减少，也表明了红肉酶解制备的活性多肽液对于缓解疲劳的积极作用。
另外，GSH-px、SOD和MDA为检测抗氧化的指标，GSH-px即谷胱甘肽过氧化物酶，SOD即超氧化物歧化酶，GSH-px和SOD是生物体内清除自由基的重要抗氧化酶，而MDA即丙二醛，是脂质过氧化的终产物，从表2可知，灌胃红肉酶解制备的活性多肽液的小鼠血清中GSH-px和SOD的活性高于对照组，而MDA的量显著低于对照组，说明大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液具有良好的抗氧化活性。
表1大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液对小鼠血清中抗疲劳指标的影响
表2大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液对小鼠血清中抗氧化指标的影响
然后，通过质谱测序，解析大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液中的优势多肽，通过MALDI-TOF/TOF 5800(AB SCIEX)质谱仪进行分析，结果如图1、图2所示，图1表明大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液中的优势多肽是分子量为595.25的多肽，图2进一步对上述优势多肽进行了分析，确定该优势多肽的氨基酸组成为PLRLP(脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-脯氨酸)。
最后，进一步研究了大目金枪鱼红肉酶解制备的活性多肽液与PLRLP多肽分子对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的清除率，以此衡量它们的体外抗氧化能力，取DPPH的浓度为0.1mM，结果发现两者均具有良好的清除DPPH的能力，如图3所示。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。

Claims (8)

1.一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大目金枪鱼红肉在冰水浴中用高速匀浆机以100-200r/min的速度匀浆1-3min；
(2)匀浆完毕，按照料液比1:3加水充分混匀；
(3)在经过步骤(2)处理的匀浆液中缓慢滴入稀碱液，搅拌均匀，直至pH值为9-11；
(4)在经过步骤(3)处理的匀浆液中加入占红肉质量0.5-1.5％的碱性蛋白酶，在40-50℃的恒温水浴中酶解3-6h，酶解结束后，在100℃下灭酶10-15min，然后冷却至室温，用高速冷冻离心机以6000-8000r/min的转速离心10-15min，得到的上清液即为活性多肽液。
2.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中高速匀浆机的速度为100r/min，匀浆时间为2min。
3.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的稀碱液为氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求3所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的碱性蛋白酶占红肉质量1％。
6.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的恒温水浴的温度为45℃，酶解时间为4h，灭酶时间为10min。
7.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中高速冷冻离心机的转速为8000r/min，离心时间为10min。
8.根据权利要求1所述的一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的上清液经过冷冻干燥处理后即为活性多肽干粉。
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