CN113912704A - 一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113912704A CN113912704A CN202111009174.0A CN202111009174A CN113912704A CN 113912704 A CN113912704 A CN 113912704A CN 202111009174 A CN202111009174 A CN 202111009174A CN 113912704 A CN113912704 A CN 113912704A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fish
- collagen hydrolysate
- derived collagen
- cells
- alcohol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 57
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 12
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 10
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101150086731 ges-1 gene Proteins 0.000 claims abstract 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 9
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims description 3
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 abstract description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 6
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 6
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 206010061459 Gastrointestinal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 2
- 208000018556 stomach disease Diseases 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001008148 Aster indicus Species 0.000 description 1
- JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N Bioquercetin Natural products CC1OC(OCC(O)C2OC(OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061164 Gastric mucosal lesion Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 244000274050 Platycodon grandiflorum Species 0.000 description 1
- 235000006753 Platycodon grandiflorum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol 7-O-rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(O)=C(O3)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=O)=C(O)C=2)O1 IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000008944 intestinal immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N quercetin rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N rutin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N 0.000 description 1
- ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N rutin Natural products CC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5 ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005493 rutin Nutrition 0.000 description 1
- 229960004555 rutoside Drugs 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
- A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
- A61K38/014—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from connective tissue peptides, e.g. gelatin, collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用，由水热法提取，经碱性蛋白酶酶切制备而成。该鱼源胶原蛋白水解物具有明显修复因酒精引起的人胃黏膜细胞（GES‑1细胞）损伤的功能，无细胞毒性，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，用其制备出的相关食品、保健品或药物用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡的食品或药物具有潜在的应用价值以及广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物的制备与应用。
背景技术
近年来,胃病发病率逐年升高，而许多胃病都与胃黏膜损伤有关。大量或长期酗酒是引起胃肠道疾病的主要原因之一。近年来， 随着人们的生活质量与水平逐渐提高，人们的生活习惯与饮食结构发生了很大的变化。我国胃溃疡的发病率呈逐年上升的趋势，如何有效控制及治疗胃溃疡是一个比较热门的课题。
中国专利申请CN202010056918公开了一种用于修复受损胃黏膜的海参肽及其制备方法，将新鲜海参预处理后粉碎制得料液，在蒸煮罐内加热维持料液的温度在38～39℃；将料液从蒸煮罐泵入自溶反应器，反应后返回蒸煮罐；重复该步骤进行循环自溶反应，当料液滴速达到设定值终止反应；收集料液，经过初虑、灭酶、脱色、膜过滤，得到相对分子量为5500-6500Da的滤液，该制备方法得到的海参肽有别于采用酶水解方法制得的海参肽，是通过东海海参自溶液制得的，并且具有高效、快速修复动物受损胃黏膜的功能。
中国专利申请CN202110304423公开了一种具有抗胃肠溃疡功效的鱼肽蛋白粉组合物及其制备方法，以重量份计，包括下述原料制备而成：水解蛋白粉80～100份、马兰6～12份、芦丁6～12份、桔梗6～12份、羧甲基纤维素0.5～2.5份、醋酸酯淀粉0.5～2.5份、花椒1～3份和益生菌1～3份。该组合物营养丰富，具有预防及治疗猪胃肠溃疡的功效，并且该组合物还具有增强肠道免疫力，提高新陈代谢的能力，达到抗病促进生长的目的。
中国专利申请CN202010222340公开了一种具有解酒作用的组合物，该组合物包括胶原蛋白及其部分水解产物，为以鱼、牛、猪为原料，通过提取、浓缩、部分水解制得胶原蛋白或其变性胶原蛋白以及它们的混合物及其部分水解产物。该活性成分对各种因素诱发的胃溃疡、十二指肠溃疡具有极显著的预防和治疗效果。
金枪鱼是一种应用较为广泛的商业鱼类产品。加工金枪鱼产品会产生大量的副产品，如骨骼、内脏和皮肤。众所周知，这些副产品中含有大量的蛋白质。另一方面，商业上可用的蛋白质类产品大多来自猪和牛。然而，考虑到宗教和饮食习惯等问题，鱼源胶原蛋白水解物便成为了一个很好的选择。已有研究表明，鱼源胶原蛋白水解物具有多种生物活性，比如抗氧化活性以及抗炎活性。因此鱼源胶原蛋白水解物有可能成为治疗酒精引起的胃溃疡等疾病的食品和药物的潜在来源。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物及其应用。该鱼源胶原蛋白水解物具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的功能，并且无细胞毒性，具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，可用其制备出的相关食品、保健品或药物用于治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病。
为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物，所述鱼源胶原蛋白水解物是从金枪鱼源原料中提取。
本发明还保护所述的的鱼源胶原蛋白水解物的制备方法，通过对蛋白质破坏较小的水热法结合定向蛋白酶酶切技术提取。
作为优选技术方案，所述的制备方法具体步骤如下：
（1）前处理：称取新鲜的金枪鱼源原料，切碎成均匀块状后脱脂；
（2）匀浆：于室温下，前处理后原料加入去离子水进行充分匀浆，制得匀浆液，其中前处理后原料与去离子水的质量比为1:3-1:5；
（3）酶解：调节匀浆液pH值至9，加入添加量1-3%（w/w）的碱性蛋白酶，在温度60-70℃酶解3-5小时；
（4）离心分离：将步骤（5）酶解结束后的酶解液高温煮沸30-60min进行灭酶与杀菌，之后于8000-12000rpm的条件下离心15-20min，微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液；
（5）透析：将微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液放入透析袋中进行透析2-3天；
（6）干燥：对透析后的鱼源胶原蛋白水解物溶液进行冷冻干燥，制得鱼源胶原蛋白水解物。
本发明还保护所述的的鱼源胶原蛋白水解物在制备用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病的产品中的应用。
作为优选技术方案，所述的产品包括食品、保健品和药物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明所述的鱼源胶原蛋白水解物是从金枪鱼中天然提取，具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的功能，无细胞毒性，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，用其制备出的相关食品、保健品或药物用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡的食品或药物具有潜在的应用价值以及广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例用于说明本发明作进一步详细的描述，但不用来限制本发明的范围。
如无特殊说明，本发明所制备的蛋白水解物处理细胞24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100μL含有10% CCK-8的DMEM培养基，在37℃下孵育1-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。细胞存活率（%）=加药孔OD值/对照孔OD值×100%。实验重复3次。
实施例1
一种鱼源胶原蛋白水解物，其选用金枪鱼源原料，通过定向蛋白酶酶切技术提取，具有修复由乙醇造成的人胃黏膜细胞损伤的功效，其制备方法具体步骤如下：
（1）前处理：称取新鲜的金枪鱼源原料，切碎成均匀块状后脱脂；
（2）匀浆：于室温下，前处理后原料的按液料质量比为1：3（kg/kg）加入质量去离子水后进行充分匀浆，制得匀浆液；
（3）酶解：调节匀浆液pH值至9，加入添加量1%（w/w）碱性蛋白酶，温度60℃酶解3-5小时；
（4）离心分离：将步骤（5）酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶与杀菌，之后于10000rpm的条件下离心15min，微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液；
（5）透析：将微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液放入透析袋中进行透析2-3天；
（6）干燥：对透析后的鱼源胶原蛋白水解物溶液进行冷冻干燥，制得鱼源胶原蛋白水解物。
实施例2
本发明鱼源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（GES-1细胞）损伤的影响
1、建立酒精损伤GES-1细胞模型
将GES-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μL，含6×104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释无水乙醇，然后将稀释的无水乙醇加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μL，乙醇终浓度分别为1%, 2%，3%，4%。5%，6%，7%，8%和9%（v/v）。加入不同浓度乙醇后，细胞继续培养24小时。培养完成后，吸出孔中液体。每孔加入100 μL含有10%CCK-8的DMEM培养基，在37℃下孵育2-4h。使用酶标仪测定孔在450nm处的吸光度值。
细胞存活率（%）=加药孔OD值/对照孔OD值×100%。实验重复3次。
不同浓度乙醇损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）24小时后,采用CCK-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。不用浓度的乙醇作用于人胃黏膜细胞（GES-1细胞）后，细胞活性均降低；且呈现剂量梯度依赖性，降低速率增大。当乙醇浓度为3.87% 时，细胞活性抑制率达50%。因此，建立乙醇损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）模型的条件为3.87%乙醇作用GES-1细胞24小时。
2、修复由酒精引起的人胃黏膜细胞（GES-1细胞）损伤
将GES-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μL，含6×104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100 μL浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100 μL DMEM完全培养液。乙醇损伤GES-1细胞24小时后，用DMEM完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μL，鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为100 μg/mL，200 μg/mL，400 μg/mL，600 μg/mL，800 μg/mL和1000 μg/mL。
鱼源胶原蛋白水解物处理由乙醇引起的人胃黏膜细胞（GES-1）损伤24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。鱼源胶原蛋白水解物对乙醇损伤的人胃黏膜细胞（GES-1）具有明显修复作用。活细胞数目随鱼源胶原蛋白水解物的增大而增加。与不加药的对照组相比，鱼源胶原蛋白水解物能明显修复乙醇对人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的损伤。随着鱼源胶原蛋白水解物浓度的增加，细胞存活率逐渐增大。
实施例3
本发明鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的细胞活力影响
将GES-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μL，含6×104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μL，鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为200 μg/mL，400 μg/mL，600 μg/mL，800 μg/mL和1000 μg/mL。
鱼源胶原蛋白水解物药物处理人胃黏膜细胞（GES-1细胞）24小时后，采用CCK-8法检测细胞生长情况。以未加药的对照组细胞数为100，对各组数据作统计学分析。鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（GES-1细胞）生长的无细胞毒性。活细胞数目随鱼源胶原蛋白水解物的增大而增加。此结果说明本发明鱼源胶原蛋白水解物对人胃黏膜细胞（GES-1细胞）生长的无细胞毒性。
对比例1
胰蛋白酶酶解制得的鱼源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（GES-1细胞）损伤的影响。
将实施例1中碱性蛋白酶换为胰蛋白酶，采用与实例1中相同的酶解条件制得鱼源蛋白水解物。
将GES-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μL，含6×104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100 μL浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100 μL DMEM完全培养液。乙醇损伤GES-1细胞24小时后，用DMEM完全培养液稀释鱼源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔 ，对照孔只加100 μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μL，胰蛋白酶酶解制得的鱼源胶原蛋白水解物药物终浓度分别为100 μg/mL, 200 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL, 800 μg/mL 和 1000 μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
对比例2
碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物对修复乙醇造成的人胃黏膜细胞（GES-1细胞）损伤的影响。
采用与实例1中相同的酶解条件制得鸡源胶原蛋白水解物。
将GES-1细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100 μL，含6×104个细胞，使细胞贴壁。孵育培养24h后，加入100 μL浓度为3.87%乙醇，对照孔只加100 μL DMEM完全培养液。乙醇损伤GES-1细胞24小时后，用DMEM完全培养液稀释鸡源胶原蛋白水解物，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，每个浓度设三个复孔，对照孔只加100 μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100 μL，碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物终浓度分别为100 μg/mL, 200 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL, 800 μg/mL 和 1000 μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
表1 实施例与对比例对GES-1细胞的细胞存活率比较（鱼源胶原蛋白水解物浓度1000μg/mL）
对鱼源胶原蛋白水解物影响人胃黏膜细胞GES-1细胞增殖的数据进行分析，实验数据表1明，在浓度为3.87%乙醇损伤50%GES-1细胞的细胞数目的基础上，鱼源胶原蛋白水解物能对乙醇损伤的GES-1细胞具有明显修复作用。而用胰蛋白酶处理鱼源胶原蛋白得到的鱼源胶原蛋白水解物以及碱性蛋白酶酶解制得的鸡源胶原蛋白水解物对乙醇损伤的人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的修复效果均不如本发明鱼源胶原蛋白水解物。
以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
Claims (6)
1.一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞（GES-1细胞）的鱼源胶原蛋白水解物，其特征在于，所述鱼源胶原蛋白水解物是从金枪鱼源原料中提取。
2.根据权利要求1所述的鱼源胶原蛋白水解物的制备方法，其特征在于，通过对蛋白质破坏较小的水热法结合定向蛋白酶酶切技术提取。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）前处理：称取新鲜的金枪鱼源原料，切碎成均匀块状后脱脂；
（2）匀浆：于室温下，前处理后原料加入去离子水进行充分匀浆，制得匀浆液，其中前处理后原料与去离子水的质量比为1:3-1:5；
（3）酶解：调节匀浆液pH值至9，加入添加量1-3%（w/w）的碱性蛋白酶，在温度60-70℃酶解3-5小时；
（4）离心分离：将步骤（5）酶解结束后的酶解液高温煮沸30-60min进行灭酶与杀菌，之后于8000-12000rpm的条件下离心15-20min，微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液；
（5）透析：将微滤后得到鱼源胶原蛋白水解物溶液放入透析袋中进行透析2-3天；
（6）干燥：对透析后的鱼源胶原蛋白水解物溶液进行冷冻干燥，制得鱼源胶原蛋白水解物。
4.根据权利要求1所述的的鱼源胶原蛋白水解物在制备用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病的产品中的应用。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法制备得到的鱼源胶原蛋白水解物在制备用于预防和治疗由于酒精引起的胃溃疡有关的疾病的产品中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的产品包括食品、保健品和药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111009174.0A CN113912704B (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111009174.0A CN113912704B (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113912704A true CN113912704A (zh) | 2022-01-11 |
| CN113912704B CN113912704B (zh) | 2023-09-26 |
Family
ID=79233551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111009174.0A Active CN113912704B (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113912704B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007108554A1 (ja) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Nippon Meat Packers, Inc. | 血圧上昇抑制作用を有するペプチド |
| CN102808010A (zh) * | 2011-05-30 | 2012-12-05 | 浙江海洋学院 | 一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法 |
| CN102871121A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-16 | 中国食品发酵工业研究院 | 一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法 |
| CN107400691A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-28 | 宁波大学 | 一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法 |
| CN110592170A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-20 | 浙江黛君生物医药科技有限公司 | 鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用 |
| CN110724178A (zh) * | 2019-10-14 | 2020-01-24 | 浙江海洋大学 | 一种金枪鱼白肉ace抑制肽及其制备方法 |
-
2021
- 2021-08-31 CN CN202111009174.0A patent/CN113912704B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007108554A1 (ja) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Nippon Meat Packers, Inc. | 血圧上昇抑制作用を有するペプチド |
| CN102808010A (zh) * | 2011-05-30 | 2012-12-05 | 浙江海洋学院 | 一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法 |
| CN102871121A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-16 | 中国食品发酵工业研究院 | 一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法 |
| CN107400691A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-28 | 宁波大学 | 一种大目金枪鱼红肉定向酶解制备活性多肽的方法 |
| CN110724178A (zh) * | 2019-10-14 | 2020-01-24 | 浙江海洋大学 | 一种金枪鱼白肉ace抑制肽及其制备方法 |
| CN110592170A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-20 | 浙江黛君生物医药科技有限公司 | 鱼皮胶原蛋白多肽的提取方法及其提取物和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113912704B (zh) | 2023-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9394513B2 (en) | Method for fermentation and cultivation, fermented plant extract, fermented plant extract powder, and composition containing the extract of fermented plant | |
| CN108796017B (zh) | 牛骨肽及其酶解提取方法 | |
| CN109207544B (zh) | 一种小球藻抗氧化多肽的制备方法 | |
| CN109251954B (zh) | 一种海参多肽的生产方法 | |
| CN101240313B (zh) | 一种鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法 | |
| CN107488598B (zh) | 一种牛蒡基蛹虫草菌丝体及其制备方法 | |
| CN103549112B (zh) | 一种桃仁蛋白粉的制备方法 | |
| CN106213523A (zh) | 一种海芦笋膳食纤维的提取方法 | |
| CN107772076B (zh) | 一种虫草基饲用免疫增强剂及其制备方法 | |
| CN102250997A (zh) | 一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法 | |
| CN110656151A (zh) | 一种提高海参补肾壮阳功效的方法 | |
| CN104544141B (zh) | 一种用甘薯淀粉生产废弃物制备膳食纤维粉的方法 | |
| CN111657501A (zh) | 一种具有增强免疫力功能的牡蛎肽虫草菌丝体组合物及其应用 | |
| CN108588053B (zh) | 动物蛋白水解专用酶及其制备方法 | |
| CN103478784B (zh) | 纳豆菌发酵制备核桃仁多肽的方法 | |
| WO2019100540A1 (zh) | 一种南美白对虾饲料添加剂的制备方法 | |
| CN113912704B (zh) | 一种具有修复酒精损伤人胃黏膜细胞的鱼源胶原蛋白水解物及其制备方法和应用 | |
| CN111109413A (zh) | 一种用桑黄菌生产苦荞菌茶的制作方法 | |
| CN107348274B (zh) | 利用海蜇胶原蛋白肽发酵制备功能饮料的方法 | |
| KR20190061527A (ko) | 버섯을 이용한 발효물을 함유하는 항비만용 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN109722462B (zh) | 一种海蜇降血脂肽及其制备方法 | |
| CN108486201B (zh) | 一种白果生物活性多肽的提取方法 | |
| CN112375799A (zh) | 一种提高鲍鱼生物制品抗氧化能力的方法 | |
| CN111304269A (zh) | 一种制备抗性淀粉的方法 | |
| CN110547446A (zh) | 一种蜂王浆抗氧化肽水果酵素及其制作方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |