CN107384590A - 一种制备高抗衰老作用罗仙子精油的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备高抗衰老作用罗仙子精油的方法及应用。本发明制备罗仙子精油的方法，不仅可以解决烟草废弃物的处理问题，而且显著提高了罗仙子精油的药用价值，使制得的罗仙子精油具有很好的抗皮肤衰老作用，提高皮肤的抗氧化能力，且提高了生产工艺，有利于大量开发应用，对罗仙子的开发利用具有重要的意义。

Description

一种制备高抗衰老作用罗仙子精油的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种制备高抗衰老作用罗仙子精油的方法及应用。

背景技术

烟草作为一种重要的经济作物，是很多国家财政收入的重要来源。作为烟草生产大国，自20世纪90年代后我国烟草的年产量均在2000kt以上，2010年至今我国年产烟草达到5000kt，其中烟草废弃物约占25％。随着国家卷烟工业的发展，优质烟叶及中上等烟叶需求量增大，而烟草废弃物也随之增加。

烟草废弃物是指不适用于卷烟生产的低次等或下等烟叶，以及烟茎、烟花、烟种、烟筋、腋芽、卷烟企业积存的烟末、烟根、根出条。由于缺乏经验及相关配套设施导致烟草废弃物再利用率低，目前多采用直接焚烧和填埋的处理方式。前者会产生大量烟尘，不符合环保的要求。后者在处理过程中通常添加石灰和水及浇水蓄霉，虽能保证废弃烟草的彻底毁形，但是容易污染地下水及周围环境，且所需毁形场地较大、毁形过程繁琐、耗费人力物力。此外，还有一些烟区的烟农将烟草废弃物随意丢弃田间，随灌溉和雨水横流，传播病毒害、污染水土环境。随着烟草年产量的增大，烟草废弃物也逐渐增多，废弃烟草的处理问题日益严峻，充分利用废弃烟草的有效成分为医药、化工等领域提供原料，将其变废为宝、循环利用，已成为我们亟待研究的新课题。

罗仙子所含化学成分复杂，具有多种药理活性，因而近年来国内外学者对其化学成分、药理作用及临床方面的研究也日渐深入。但对罗仙子的研究也存在以下问题：对其化学成分的研究多集中于蛋白质类成分，而对油脂类成分的研究还不够深入，缺乏油脂类成分提取精制工艺的研究。药效物质基础不甚明确，有效成分及作用机理未能揭示。因此，进一步系统而深入地研究罗仙子油脂类活性成分和药理作用，这对指导临床用药和新药开发是非常有必要的。

发明内容

本发明前期研究发现以废弃烟叶为主要饲料饲养的罗仙子生长状态良好，且根据课题组前期实验结果显示油脂成分也具有一定的药理活性。本发明通过对罗仙子油脂的提取精制工艺优化，以及废弃烟叶饲养罗仙子及普通饲料饲养罗仙子油脂的化学成分分析和药理活性对比，揭示罗仙子油脂的药用价值。

本发明的目的在于提供一种制备高抗衰老作用罗仙子精油的方法及应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种制备高药用价值罗仙子精油的方法，包括以下步骤：

1)用烟草饲喂罗仙子，具体饲喂方法为：将孵化出的罗仙子用含烟草的培养料进行培养，培养温度为25～28℃，培养至罗仙子体长13～15mm；

2)罗仙子粗油的制备：将上步所得的罗仙子干燥后，碾碎得罗仙子粉末，罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：(15～25)，超声提取2～4次，每次30～50min，超声功率为400～500W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48～52℃时加入水，用水体积为粗油体积的15％～20％，于48～52℃条件下搅拌10～22min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至50～60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的碱溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％～0.2％的碱溶液，继续于50～60℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80～85℃，加入80～85℃水，水体积为脱酸油的28％～32％，继续加热至80～85℃搅拌28～32min，静置分层，取油层即为高药用价值罗仙子精油。

进一步的，所述含烟草的培养料的配方为废弃的鲜烟叶60～75％，麸皮15～23％，锯末3～6％，鱼粉3～6％，糠粉3～6％，所述百分比均为重量百分比。

上述任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油。

上述任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在护肤品或化妆品中的应用。

进一步的，所述护肤品或化妆品为具有抗衰老作用的护肤品或化妆品。

进一步的，所述抗衰老为皮肤抗衰老作用。

进一步的，所述皮肤抗衰老作用为提升皮肤含水量和/或提升皮肤羟脯氨酸含量和/或提高皮肤抗逆境能力。

进一步的，所述提高皮肤抗逆境能力为提高皮肤抗氧化能力。

进一步的，所述提高皮肤抗氧化能力为提高皮肤超氧化物歧化酶或/和谷胱甘肽-过氧化物酶的活力。

上述任一所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在制备具有抗衰老作用的药物或保健品中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过对罗仙子油脂的提取精制工艺优化，以及与烟草饲喂相结合，不仅可以解决烟草废弃物的处理问题，而且显著提高了罗仙子精油的药用价值，使制得的罗仙子精油具有很好的抗皮肤衰老作用，有利皮肤的抗氧化能力，且提高了生产工艺，有利于大量开发应用，对罗仙子的开发利用具有重要的意义。

附图说明

图1为V_C对DPPH自由基清除率；

图2为不同方法制备的罗仙子精油对DPPH自由基清除率；

图3为V_C对ABTS自由基清除率；

图4为不同方法制备的罗仙子精油对对ABTS自由基清除率；

图5为各小组实验期间体重变化；

图6为各组小鼠皮肤切片病理组织学观察(HE染色，100倍)。

具体实施方式

一种制备高药用价值罗仙子精油的方法，包括以下步骤：

1)用烟草饲喂罗仙子，具体饲喂方法为：将孵化出的罗仙子用含烟草的培养料进行培养，培养温度为25～28℃，培养至罗仙子体长13～15mm；

2)罗仙子粗油的制备：将上步所得的罗仙子干燥后，碾碎得罗仙子粉末，罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：(15～25)，超声提取2～4次，每次30～50min，超声功率为400～500W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48～52℃时加入水，用水体积为粗油体积的15％～20％，于48～52℃条件下搅拌10～22min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至50～60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的碱溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％～0.2％的碱溶液，继续于50～60℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80～85℃，加入80～85℃水，水体积为脱酸油的28％～32％，继续加热至80～85℃搅拌28～32min，静置分层，取油层即为高药用价值罗仙子精油。

优选的，所述含烟草的培养料的配方为废弃的鲜烟叶60～75％，麸皮15～23％，锯末3～6％，鱼粉3～6％，糠粉3～6％，所述百分比均为重量百分比。

优选的，所述废弃的鲜烟叶为粉碎的粒径为2～3cm的碎片。

优选的，一种制备高药用价值罗仙子精油的方法，包括以下步骤：

1)用烟草饲喂罗仙子，具体饲喂方法为：将孵化出的罗仙子用含烟草的培养料进行培养，培养温度为25～28℃，培养至罗仙子体长13～15mm；

2)罗仙子粗油的制备：将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：25，超声提取3次，每次30min，超声功率为450W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至50℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的20％，于50℃条件下搅拌20min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至50℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的NaOH溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.2％的NaOH溶液，继续于50℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；

所述NaOH溶液浓度为10％w/v；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80℃，加入80～85℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的30％，继续加热至80℃搅拌30min，静置分层，取油层即为高药用价值罗仙子精油。

上述任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油。

上述任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在护肤品或化妆品中的应用。

优选的，所述护肤品或化妆品为具有抗衰老作用的护肤品或化妆品。

优选的，所述抗衰老为皮肤抗衰老作用。

优选的，所述皮肤抗衰老作用为提升皮肤含水量和/或提升皮肤羟脯氨酸含量和/或提高皮肤抗逆境能力。

优选的，所述提高皮肤抗逆境能力为提高皮肤抗氧化能力。

优选的，所述提高皮肤抗氧化能力为提高皮肤超氧化物歧化酶或/和谷胱甘肽-过氧化物酶的活力。

上述任一所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在制备具有抗衰老作用的药物或保健品中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种制备高药用价值的罗仙子精油的方法

1)罗仙子的饲养：将废弃烟叶(不适用鲜烟叶)粉碎为粒径2～3cm的碎片，添加适量辅料，搅拌均匀，配制成含烟草的培养料。含烟草的培养料配方如下(质量百分比，％)：废弃烟叶65％，麸皮20％，锯末5％，鱼粉5％，糠粉5％。将培养料置于容器中，厚度6cm；然后在培养料表面接入新孵出的罗仙子，在25～28℃条件下饲养至罗仙子体长13～15mm时，即可采收。

2)罗仙子粗油的制备：将上步所得罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：25，超声提取3次，每次30min，超声功率为450W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至50℃时加入水，用水体积为粗油体积的20％，于50℃条件下搅拌20min，离心5min，离心转速为4000r/min，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至50℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的10％w/v的NaOH溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.2％的碱溶液，继续于50℃加热搅拌30min，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80℃，加入80℃水，水体积为脱酸油的30％，继续加热至80℃搅拌30min，静置分层，取油层即为高药用价值的罗仙子精油。

实施例2一种制备高药用价值的罗仙子精油的方法

1)罗仙子的饲养：将废弃烟叶(不适用鲜烟叶)粉碎为粒径2～3cm的碎片，添加适量辅料，搅拌均匀，配制成含烟草的培养料。含烟草的培养料配方如下(质量百分比，％)：废弃烟叶60％，麸皮23％，锯末6％，鱼粉6％，糠粉5％。将培养料置于容器中，厚度5cm；然后在培养料表面接入新孵出的罗仙子，在27℃条件下饲养至罗仙子体长13～15mm时，即可采收。

2)罗仙子粗油的制备：罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：15，超声提取2次，每次50min，超声功率为400W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的15％，于48℃条件下搅拌22min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的NaOH溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％的NaOH溶液，继续于60℃加热搅拌32min后，产生的絮状物凝结，停止搅拌，4500r/min离心4min，取上清得脱酸油；所述NaOH溶液浓度为12％w/v；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至85℃，加入85℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的32％，继续加热至85℃搅拌28min，静置分层，取油层即为高药用价值的罗仙子精油。

实施例3一种制备高药用价值的罗仙子精油的方法

1)罗仙子的饲养：将废弃烟叶(不适用鲜烟叶)粉碎为粒径2～3cm的碎片，添加适量辅料，搅拌均匀，配制成含烟草的培养料。含烟草的培养料配方如下(质量百分比，％)：废弃烟叶75％，麸皮15％，锯末3％，鱼粉4％，糠粉4％。将培养料置于容器中，厚度7cm；然后在培养料表面接入新孵出的罗仙子，在25℃条件下饲养至罗仙子体长13～15mm时，即可采收。

2)罗仙子粗油的制备：罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：20，超声提取4次，每次30min，超声功率为500W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至52℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的18％，于52℃条件下搅拌10min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至55℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的NaOH溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.18％的NaOH溶液，继续于55℃加热搅拌28min后，产生的絮状物凝结，停止搅拌，3500r/min离心6min，取上清得脱酸油；所述NaOH溶液浓度为8％w/v；取油层即为高药用价值的罗仙子精油。

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80℃，加入80℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的28％，继续加热至80℃搅拌32min，静置分层，

实施例4高药用价值的罗仙子精油的化学组成和相对含量分析

方法：

(1)脂肪酸甲酯的制备

精密称取本发明制备的罗仙子精油0.15g，加入0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液2mL，65℃水浴至油滴完全消失，冷却后加入14％三氟化硼-甲醇溶液2mL，水浴煮沸10min，室温中冷却，加入异辛烷10mL，饱和

氯化钠溶液20mL，取上清液于试管中，加无水硫酸钠，离心分层，取上清液保存备用。

(2)GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；采用程序升温，初温160℃，以5℃/min升温至170℃，以3℃/min升温至176℃，保持2min，以5℃/min升温至190℃，保持10min；进样口温度280℃；检测器温度250℃；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样量1.0μL，分流比40∶1。

质谱条件：电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV，接口温度250℃；质量扫描范围(m/z)35～500u。质谱检索软件NIST02，采用峰面积归一法进行定量分析。

对照组：同时以现有常规普通饲料(除了不含烟草，其他成分与本发明所用的含烟草的培养料的成分相同，下文中所有“普通饲料”均指这种情况)饲养的罗仙子作为对照组，对照组中除了饲养罗仙子的为普通饲料，其他所有条件与本发明方法相同。

结果：

(1)对普通饲料饲养的罗仙子(对照组)与本发明烟草饲养的罗仙子进行精油提取，前者得油率为17.65％；本发明方法得油率为18.45％。

(2)对普通饲料饲养的罗仙子(对照组)与本发明烟草饲养的罗仙子提取的精油进行化学成分组成及相对含量的检测，分析结果如表1所示，两组精油中共有的脂肪酸类成分为13种，然而本发明方法制得的罗仙子精油中还存在少量的5-十六碳烯酸。普通饲料饲养罗仙子精油(对照绿春县)中所含饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比为41.4％/58.5％，本发明方法制得的罗仙子精油为40.58％/59.42％，可看出本发明方法制得的罗仙子精油中不饱和脂肪酸比例高于普通饲料饲养罗仙子。

表1罗仙子精油中脂肪酸的组成及相对含量

实施例5高药用价值的罗仙子精油的理化值测定

对照组：以现有常规普通饲料饲养的罗仙子作为对照组，对照组中除了饲养罗仙子的为普通饲料，其他所有条件与本发明方法相同。

对照组罗仙子粗油与本发明烟草喂养的罗仙子粗油经精制后由浑浊的褐色变为澄清的金黄色，刺激性气味显著减弱；检测精制后普通饲料饲养罗仙子粗油、精油(对照组)与本发明罗仙子粗油、精油的各理化值。

检测结果如表2所示，其中，酸值表示油脂中游离脂肪酸的含量，为评价油脂质量的重要指标，中华人民共和国国家标准GBT 26516-2011按摩精油及GBT 29990-2013润肤油中均对精油酸值作了规定，分别要求低于≤7mg/g及≤5mg/g，对照组精油与本发明方法制得的精油均符合以上标准规定。说明除了烟草饲喂罗仙子这一技术特征外，本发明方法中的其他技术特征对获得具有高药用价值的罗仙子精油的作用也是至关重要的。

表2罗仙子精油和罗仙子粗油的理化值测定结果(n＝3)

实施例6高药用价值的罗仙子精油清除DPPH自由基能力的测定

DPPH自由基是一种稳定的紫色有机自由基，在517nm处有强吸收。分别吸取2mL不同质量浓度的样品溶液与2mL DPPH+工作液混合，涡流振荡30s后暗处静置10min，于517nm处测定其吸光度，每个浓度平行测三次，计算清除率和IC₅₀值(清除率为50％时样品的质量浓度)。按上述方法分别对本发明方法制得的高药用价值的罗仙子精油、对照组罗仙子精油(除了饲养罗仙子的为普通饲料，其他所有条件与本发明方法相同)、阳性对照组(Vc)进行清除DPPH⁺能力的检测。

由图1、2和表3可知，两种罗仙子精油均有一定清除DPPH自由基的能力，在所选浓度范围内随着样品浓度的增大，自由基清除率呈现正向线性关系。由线性方程计算本发明精油与对照组精油抑制DPPH的IC₅₀值分别为45.73mg/mL、48.86mg/mL。由此可看出，本发明烟草饲养的罗仙子精油较普通饲料饲养罗仙子精油抗DPPH自由基活性更强。

表3不同方法制备的罗仙子精油对DPPH自由基清除作用测定结果

实施例7高药用价值的罗仙子精油清除ABTS自由基能力的测定

ABTS自由基溶液呈蓝绿色在734nm处有最大吸收，在其与抗氧化物结合形成络合物后，反应溶液褪色，溶液吸光度降低。分别对本发明方法制得的高药用价值的罗仙子精油、对照组罗仙子精油(除了饲养罗仙子的为普通饲料，其他所有条件与本发明方法相同)、阳性对照组(Vc)进行清除ABTS自由基能力的测定。

测定结果如图3、4和表4所示，两种罗仙子精油均对ABTS自由基有一定的清除能力，且呈良好的浓度依赖关系，普通饲料饲养罗仙子精油与本发明烟草饲养的罗仙子精油清除ABTS自由基的IC₅₀值分别为34.73mg/mL、25.95mg/mL。由此可知，后者对ABTS的清除作用稍强于前者。

表4不同方法制备的罗仙子精油对对ABTS自由基清除能力测定结果

实施例8高药用价值的罗仙子精油抗衰老能力的测定

1实验材料

1.1药物与试剂

1号油为普通饲料饲养的罗仙子提取得到的罗仙子精油(对照组罗仙子精油)；2号油为本发明废弃烟草饲料喂养罗仙子后提取得到的罗仙子精油；1号油(对照组罗仙子精油)中除了饲养罗仙子的食物为普通饲料，其他所有条件均与本发明方法相同。屈臣氏橄榄多效护理油(以下简称橄榄油)，批号FH11，佛山市梦莎美容化妆品有限公司生产，卫生许可证号：XK16-1089328；维力康维生素E软胶囊，广州白云山制药总厂生产，产品批号，2150005；屈臣氏丝滑柔和脱毛膏，广州市华安堂生物科技有限公司生产，卫生许可证：GD-FDA(2011)。

羟脯氨酸(HYP)试剂盒，生产批号为20160105；超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒(WST-1法)，生产批号为20151230；丙二醛(MDA)测试盒，生产批号为20151230；谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)测试盒，生产批号为20160105；蛋白定量测试盒，生产批号为20160105；均购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物

雌性小鼠120只，体重18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。饲养于鼠笼中，每笼15只，每两天更换一次垫料，正常饲养给予饲料和饮用水。

1.3仪器

TDL80-2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；

PK-S23电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；

AUY120分析天平，日本岛津；

UV-2450紫外可见分光光度计，日本岛津。

鼠笼，小鼠注射器，剃毛器等均由广东药科大学中药学院中药方剂与药理系提供。

2方法

2.1动物分组、造模及给药

取昆明种雌性小鼠120只，按体重随机分为正常对照组(空白组)、衰老模型组、橄榄油组、维生素E(Vit E)组、1号油高、低剂量组、2号油高、低剂量组，每组15只。空白对照组正常饲养，其余每组每日给予3％D-半乳糖溶液颈背部皮下注射一次，造成亚急性衰老模型，连续注射42天。从造模后第11天起每日在皮下注射D-半乳糖1h后，各给药组每天予以相应油涂抹于背部。观察并记录、比较各组小鼠体重和皮肤老化情况。

从造模后第11天起各给药组每天涂抹相应药物于背部(100μL)，直至实验结束。

1号油-高剂量组：100μL 1号油(对照组罗仙子精油)；

1号油-低剂量组：50μL 1号油(对照组罗仙子精油)+50μL橄榄油；

2号油-高剂量组：100μL 2号油(本发明罗仙子精油)；

2号油-低剂量组：50μL 2号油(本发明罗仙子精油)+50μL橄榄油；

橄榄油组：100μL橄榄油；

维生素E(Vit E)组：100μL维生素E(含α-生育酚28mg)。

2.2指标检测

实验第42天，禁食12h，末次涂药1h后，处死小鼠，切取1cm²皮肤，精密称其湿重，随即将其放入烘箱中，于80℃烘干12h，精密称其干重，并记录，求出小鼠皮肤含水量。另取背部皮肤1cm²取下后迅速冰冻保存,拟作皮肤组织匀浆之用。制备10％组织匀浆液，3000r/min离心10min，取上清液备用，用做检测小鼠皮肤组织的组织蛋白浓度、HYP含量、SOD活性、MDA含量、GSH-PX活力，具体操作方法参考试剂盒使用说明书。取皮肤一块0.5×0.5(单位：cm)的皮肤置10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，HE染色，做成病理切片，光学显微镜下观察并记录小鼠皮肤病理形态变化。另取各小鼠的脾脏和胸腺，记录下每只小鼠的脾脏重量和胸腺重量，再计算脏器系数。

计算公式为：脏器系数＝脏器重量(单位：g)/体重(单位：g)。

3结果

3.1小鼠体重变化

将定期记录的各组小鼠体重整理成图表，如图5、表5所示，图中纵坐标表示各组小鼠体重平均值，横坐标表示小鼠组别(系列1-8分别为空白对照组，衰老模型组，橄榄油组，维生素E组，1号油高浓度组，1号油低浓度，2号油高浓度组和2号油低浓度组)如下列各图所示每周记录各组小鼠的体重均值。

对实验期间记录的小鼠体重数据进行f检验和t检验，整理得到下表。

表5实验期间各组小鼠体重变化

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

根据小鼠体重数据t检验结果显示(表5)，在实验开始前各组体重比较无显著差异(P均大于0.05)。实验期间小鼠体重虽有波动，但至第6周实验结束时，橄榄油组、Vit E组、1号精油高/低组、2号精油高/低组均对小鼠体重无显著性影响。

3.2小鼠脾脏与胸腺脏器系数

表6小鼠脏器系数

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

根据小鼠脏器系数数据t检验结果，显示各组之间相互比较无显著性差异，如表6所示，即：空白组与衰老模型组比较，P＞0.05，提示在此造模时间内，D-半乳糖对衰老模型组的小鼠的免疫器官可能无显著影响；橄榄油组，Vit E组，1号精油高、低组，2号精油高、低组均对小鼠免疫器官无显著性影响。

3.3小鼠皮肤HYP含量

表7小鼠皮肤HYP(羟脯氨酸)含量

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

如表7所示，与空白对照组相比，模型组小鼠皮肤匀浆中HYP含量有极显著下降(P＜0.01)，结合小鼠皮肤老化情况图片，说明造模成功。与衰老模型组相比，各组别中小鼠皮肤中HYP含量数值均比其要高。其中橄榄油组和1号精油高剂量组的小鼠皮肤HYP含量与衰老模型组相比，提高的程度无显著性差异(P＞0.05)；而维生素E组、1号精油低剂量组、2号精油高剂量组和低剂量组的小鼠皮肤HYP含量与衰老模型组相比有较为显著的提高(P＜0.05)，其中2号精油高、低剂量组中HYP含量与维生素E组中HYP的含量接近，高于1号精油低剂量组；上述结果说明1号精油低剂量组、2号精油高剂量组和低剂量组均具有抗衰老作用，其中2号精油(本发明方法制备的罗仙子精油)抗衰老效果更佳。

3.4小鼠皮肤病理形态学观察

对各组小鼠皮肤组织切片，HE染色后在光学显微镜下观察并拍照(见图6)，结果表明：

1)空白对照组：光镜下可见小鼠皮肤形态正常，表皮的基底层、棘细胞层、颗粒层及角质层界限清楚，真皮位于表皮下面，此层内有血管、汗腺、毛囊和皮脂腺等，小鼠皮肤真皮胶原纤维束细长，排列成束状，紧密(见图6A)。

2)衰老模型组：光镜下可见皮肤组织生长受到障碍，真皮层明显变薄，毛囊与皮脂腺数量锐减，胶原纤维层明显减少，排列疏松，部分纤维明显断裂，排列紊乱(见图6B)。

3)维生素E组：可见小鼠皮肤生长良好，毛囊数较衰老模型组明显增加，胶原纤维束一般，呈波纹状排列还紧密(见图6C)。

4)橄榄油组组：小鼠皮肤生长较好，与衰老模型组比较，真皮厚度略有增加，毛囊数增加不明显(见图6D)。

5)1号油高、低剂量组：小鼠皮肤生长较好，表皮与真皮界线可分，表皮较规则，真皮厚度较平均，染色较均匀，细胞层数较模型组有所增加(见图6E)。1号油低剂量组小鼠真皮厚度和毛囊数较衰老模型组均有增加，胶原纤维束排列成束状，(见图6F)。

6)2号油高、低剂量组：小鼠皮肤结构完整，生长良好，皮肤增厚，表皮与真皮界线清晰，表皮规则，真皮层较厚，染色均匀致密，细胞层数增多，皮下脂肪丰富。毛囊、皮脂腺结构完整，毛囊数与衰老模型组相比明显增加，胶原纤维排列较紧密，与维生素E组相似(见图6G和H)。

上述结果说明1号精油高/低剂量组、2号精油高/低剂量组均可改善、恢复衰老皮肤外观和组织构造，具有抗衰老作用，且2号精油(本发明方法制备的罗仙子精油)抗衰老效果更佳。

3.5各组小鼠皮肤含水量

由表8可得，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠皮肤含水量较低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明小鼠亚急性衰老模型造模成功。与衰老模型组相比，维生素E组，橄榄油组及罗仙子脂肪油组的小鼠皮肤含水量均增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)，且给予2号精油(本发明方法制备的罗仙子精油)的小鼠皮肤含水量略高于1号精油组。

表8各组小鼠皮肤含水量比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.6各组小鼠SOD活力比较

由表9可得，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠皮肤SOD(超氧化物歧化酶)活力明显较低，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)，说明小鼠亚急性衰老模型造模成功。与衰老模型组相比，2号油(本发明方法制备的罗仙子精油)高、低浓度组小鼠皮肤SOD活力明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表9各组小鼠皮肤SOD活力比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.7各组小鼠皮肤MDA含量比较

MDA(丙二醛)是反映细胞膜脂过氧化作用的一个指标，膜脂过氧化作用是对细胞有害的，会慢慢将细胞膜系统瓦解，并最终导致机体死亡。在正常情况下，MDA含量很低。而一般在逆境情况下，都会随着时间的推移和逆境的积累，MDA含量显著增高。

由表10可得，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠皮肤MDA(丙二醛)含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明小鼠亚急性衰老模型造模成功。与衰老模型组相比，维生素E组、1号油低浓度组、2号油高、低浓度组小鼠皮肤的MDA含量均明显降低，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)，橄榄油组、1号油高浓度组小鼠皮肤的MDA含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表10各组小鼠MDA含量比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.8各组小鼠皮肤GSH-PX活力比较

由表11可得，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠皮肤GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)活力较低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明小鼠亚急性衰老模型造模成功。维生素E组、1号高浓度组、2号油高、低浓度组小鼠皮肤组织中的GSH-PX活力明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表11各组小鼠GSH-PX活力比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

综上所述，本发明方法制备的罗仙子精油能提高皮肤的抗氧化能力，具有改善、恢复衰老皮肤外观和组织结构的作用，抗皮肤衰老效果确切。

在本发明研究过程中，发明人还发现大量其他制备罗仙子精油的方法的提取效果均不及本发明方法，具体情况如下所述(以下所述所有的罗仙子粉末均为未经烟草饲喂所得的罗仙子粉末)。

一、不同提取方式对罗仙子粗油得率的对比分析

(1)冷浸法提取法

精密称取罗仙子粉末20g，置于具塞的锥形瓶中，加入正己烷500mL，室温浸提3次，每次8h，过滤，合并提取液，减压回收溶剂至恒重，测定得油率。

(2)索氏提取法

精密称取罗仙子粉末20g，置于索氏提取器中，以500mL正己烷为溶剂提取3次，每次8h，合并提取液，减压回收溶剂至恒重，测定得油率。

(3)超临界流体萃取法

精密称取罗仙子粉末100g装入CO₂超临界萃取釜中，设定萃取压力为30MPa，萃取温度58℃，CO₂流量25L/h，萃取时间90min，升温升压至设定值萃取，分离釜分离得到罗仙子粗油，测定得油率。

(4)本发明超声波提取法

精密称取罗仙子粉末20g，置于锥形瓶中，加入500mL正己烷，超声提取3次(功率400W)，每次30min，过滤，减压回收溶剂，得到罗仙子粗油。

结果：

不同粗油提取方法的得油率如表12所示，从中可以看出，不同提取方法的得油率排序为：超声提取>索氏提取>冷浸>超临界提取，其他粗油提取方法的效果均不及本发明的超声法提取效果。

表12不同提取方法条件下罗仙子粗油的得率(n＝3)

二、不同提取溶剂进行提取的效果对比分析

精密称取4份罗仙子干粉，每份20g，分别以500mL的石油醚-丙酮、正己烷-丙酮、石油醚和本发明用的正己烷作为提取溶剂，超声提取3次(功率400W)，每次30min。

由表13可知，正己烷-丙酮、石油醚-丙酮两种溶剂的得油率稍高，但所得粗油色深浑浊，否说明杂质含量过多。正己烷提取所得油脂颜色浅淡，澄明度好、流动性较好、油脂纯度高，经综合分析对比，其他3种溶剂提取的效果均不及正己烷提取的效果。

表13不同提取溶剂的得油率(n＝3)

三、不同料液比进行罗仙子粗油提取的效果比较

精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，分别按照料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25和1：30加入正己烷溶液，超声提取3次(功率400W)，每次30min。

由表14可知，综合考虑提取效率和溶剂消耗量，料液比为1:15～1:25，最优选为1：25。

表14不同料液比的得油率(n＝3)

四、不同超声次数对罗仙子粗油提取效果的影响

精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，按料液比1:25加入正己烷，分别超声提取1、2、3、4、5次(功率400W)，每次30min。综合考虑提取效率和时间成本，

由表15可知，超声提取2～4次效果较好，最优选为4次。

表15不同超声次数的得油率(n＝3)

五、不同超声提取时间对罗仙子粗油提取效果的影响

精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，按料液比1:25加入正己烷，超声提取3次(功率400W)，每次30、40、50、60、70min。

由表16可知，综合考虑提取效率和时间成本，提取时间为30～50min时效果较好。

表16不同超声时间的得油率(n＝3)

六、不同超声频率对罗仙子粗油提取效果的影响

精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，按料液比1:25加入正己烷，超声提取3次(功率400W)，每次30min，超声频率分别是300、350、400、450、500W。

由表17可知，超声频率为400～500W时效果较好。

表17不同超声频率的得油率(n＝3)

七、粗油提取因素分析

将料液比、超声次数、超声时间三因素进行主体间效应的检验，检验结果如表18所示。

表18主体间效应的检验

a.R²＝0.986(调整R²＝0.945)

由表18可知，各因素对得油率的影响：超声次数(B)＞料液比(A)＞超声时间(C)。其中因素A和B的影响较为显著；最佳条件为A3B3C1。故最佳的罗仙子粗油提取条件为：料液比1:25、超声次数3次、提取时间30min。

八、不同加水量对脱胶效率、精油得率的影响

取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加热到50℃，考察蒸馏水的添加量分别为粗油体积的5％、10％、15％、20％、30％时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组用水量不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

当加水量为15％～20％时，脱胶彻底，所得油颜色由浑浊黄褐色转为澄清金黄色，且精油得率较好(达88.75％以上)，其中当加水量为20％时效果最佳；而当加水量为其他情况时，要么脱胶不彻底，要么精油得率太低，要么易滋生微生物引起腐败，不利于精油的保存。

九、加酸量对脱胶效率、精油得率的影响

取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加热到50℃，加水量为20％的条件下，考察磷酸添加量分别为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组加酸量不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

结果显示，酸的加入对罗仙子粗油脱胶效果不明显，对精油性状改善不明显，且引起了精油的腐败，影响精油得率(表19)。故在本发明罗仙子精油的制备过程中不适合加酸进行脱胶。

表19加酸量对脱胶后精油得率的影响(n＝3)

十、加热温度对脱胶效率、精油得率的影响

取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加水量为20％的条件下，考察加热温度分别为30、40、50、60、70℃时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组加热温度不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

由表20可知，当加热温度为30℃、40℃、60℃、70℃时的精油得率均不及温度为50℃时的精油得率。

表20加热温度对脱胶后精油得率的影响(n＝3)

十一、加热时间对脱胶效率、精油得率的影响

取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加热到50℃，加水量为20％的条件下，考察加热时间分别为10、20、30、40、50min时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组加热时间不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

由表21可知，加热时间为10～20min的精油得率显著高于其他加加热时间的精油得率。

表21加热时间对脱胶后精油得率的影响(n＝3)

十二、脱酸过程碱浓度与碱量对脱酸效率、精油得率影响

精密称取适量上述实施例中的脱胶油，按照国家标准GB/T 5009.37-2003规定方法测定酸价，根据酸值计算总加碱量。将脱胶油加热至50℃，快速加入适量NaOH溶液，磁力搅拌使碱液和油完全混合，渐渐出现细小皂粒，待絮状物充分凝结后停止搅拌，离心分离。把上清液放置烧杯中加热至80℃，加入80-85℃蒸馏水，水量为油量体积的30％，继续搅拌30min后，静置于分液漏斗中分离，分出的废水滴加几滴酚酞指示液，水洗至废水中滴加酚酞后不变色即可停止水洗。

M1＝7.13×VA×G₀/10000C；M2＝G₀×w；

式中：M1-理论加碱量(g)；M2-超碱量(g)；VA-罗仙子脱胶油的酸值(mg/g)；G₀-罗仙子脱胶油的质量(g)；C-NaOH溶液的质量分数(％)；w-超碱量占罗仙子脱胶油量的百分比(％)。

(1)碱浓度对脱酸效率的影响

除了脱酸过程中各组NaOH碱溶液浓度w/v不同(2％、6％、10％、14％、18％)，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

以罗仙子精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表22可知当碱浓度为10％w/v时精油得率和精油酸值的综合评价最高，当碱浓度为2％、6％、14％或18％时，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。

表22碱浓度对脱酸效率影响(n＝3)

(2)超碱量对脱酸效率的影响

除了脱酸过程中超碱量不同，即各组中10％w/v NaOH溶液用量在能够中和酸的基础上再分别加入体积为脱胶油体积0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％的量，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

以精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表23可知当超碱量为脱胶油体积0.15％～0.2％时，精油得率和精油酸值的综合评价最高，当超碱量为其他情况时，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。

表23超碱量对脱酸效率影响(n＝3)

十三、脱酸过程加热温度对脱酸效率、精油得率影响

除了脱酸过程中各组加热温度不同(分别设置为40、50、60、70、80℃)，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

以精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表24可知当加热温度为50～60℃时，精油得率和精油酸值的综合评价最高，在其温度情况下，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。

表24加热温度对脱酸效率的影响(n＝3)

十三、脱酸过程加热时间对脱酸效率、精油得率影响

除了脱酸过程中各组加热时间不同(分别设置为15、20、25、30、35min)，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。

以精油的酸价和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表25可知加热时间为30min时，精油得率和精油酸值的综合评价最高，加热时间为15、20、25、35min时，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。

表25加热时间对脱酸效率的影响(n＝3)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备高药用价值罗仙子精油的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用烟草饲喂罗仙子，具体饲喂方法为：将孵化出的罗仙子用含烟草的培养料进行培养，培养温度为25～28℃，培养至罗仙子体长13～15mm；

2)罗仙子粗油的制备：将上步所得的罗仙子干燥后，碾碎得罗仙子粉末，罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：(15～25)，超声提取2～4次，每次30～50min，超声功率为400～500W；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；

3)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48～52℃时加入水，用水体积为粗油体积的15％～20％，于48～52℃条件下搅拌10～22min，离心，取上清液，得脱胶油；

4)脱酸：将脱胶油加热至50～60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的碱溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％～0.2％的碱溶液，继续于50～60℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；

5)水洗：将上步所得脱酸油加热至80～85℃，加入80～85℃水，水体积为脱酸油的28％～32％，继续加热至80～85℃搅拌28～32min，静置分层，取油层即为高药用价值罗仙子精油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含烟草的培养料的配方为废弃的鲜烟叶60～75％，麸皮15～23％，锯末3～6％，鱼粉3～6％，糠粉3～6％，所述百分比均为重量百分比。

3.权利要求1～2任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油。

4.权利要求1～2任一项所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在护肤品或化妆品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述护肤品或化妆品为具有抗衰老作用的护肤品或化妆品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为皮肤抗衰老作用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述皮肤抗衰老作用为提升皮肤含水量和/或提升皮肤羟脯氨酸含量和/或提高皮肤抗逆境能力。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述提高皮肤抗逆境能力为提高皮肤抗氧化能力。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述提高皮肤抗氧化能力为提高皮肤超氧化物歧化酶或/和谷胱甘肽-过氧化物酶的活力。

10.权利要求1～2任一所述方法制备的罗仙子粗油或/和罗仙子精油在制备具有抗衰老作用的药物、护肤品或保健品中的应用。