CN107383036A

CN107383036A - 黄皮中喹诺酮生物碱类化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107383036A
Application number: CN201710565306.5A
Authority: CN
Inventors: 谭宁华; 曾广智; 宋卫武; 王佳
Original assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107383036B

Abstract

本发明公开了一种黄皮(Clausena lansium)植物中分离得到的喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)，其用作杀线虫剂，其作为有效成分的杀线虫农药组合物，其制备方法及其在制备杀线虫农药中的应用，属于农药技术领域。本发明的Dictamine(1)为从植物黄皮中分离得到的喹诺酮生物碱类化合物，其在液体浸泡法的抗线虫活性测试中显示出杀线虫活性。本发明能作为制备杀线虫农药制剂和前体物质的应用。本发明具有环境友好、成本低、毒杀线虫效果明显等优点。

Description

黄皮中喹诺酮生物碱类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物源生物农药技术领域，具体涉及一种从黄皮中提取分离得到的喹诺酮生物碱类化合物，及其制备方法与作为杀线虫农药的应用。

技术背景

植物寄生线虫病是农作物重要的病害之一，每年都会给全世界造成上千亿美元的损失，严重制约着世界农业生产。我国是一个农业大国，粮食的生产至关重要。因此，找到能够杀线虫的有效方法，不仅关系到我国的粮食生产与经济安全，也关系到国家的和谐与稳定。但是，在目前众多的防治线虫的方法中，化学防治依然占据着主流的地位。虽然人工合成的杀线虫剂杀虫效果不错，但大多是非特异性的，极易给非靶标生物造成危害，严重威胁人畜以及环境安全。例如，熏蒸型杀线虫剂，如溴甲烷，会严重破坏臭氧层，影响人类的生存，并且有些熏蒸型杀线虫剂还有可能致癌或影响生育；非熏蒸型杀线虫剂虽然毒性没有熏蒸型杀线虫剂大，但是极易诱发线虫产生抗药性。在寻找高效而安全的杀线虫剂过程中，线虫的生防研究逐渐成为人们的研究重点。

目前已有两代生防制剂问世。第一代生防制剂是活菌体，但是由于土壤的抑菌作用，使得其在不同国家不同地区的试用产生了不稳定性和不一致性。第二代生防制剂是菌株代谢产物，它的出现不仅克服了第一代生防产品的缺点，也使得线虫的生物防治成为可能。为了得到环境友好型的生防制剂，科研工作者不断地从菌株中分离具有杀线虫活性的化合物。在近三十年的探索过程中，结构类型多样的具有杀线虫活性的化合物，如醌类、生物碱类、萜类、肽类、吡喃类、脂肪酸类、萘类等，都被人们挖掘了出来。但是，在众多的化合物中，能够被开发成生防制剂的却少之又少。因此，加快对天然产物的筛选，尽可能多地获得具有杀线虫活性的化合物并将其开发成环境友好型杀线虫农药，对于现代农业的生存和发展具有重要的意义。

植物是大自然赋予人类的宝贵财富。在生存进化的过程中，植物能够通过丰富的代谢途径产生次生代谢产物来抵御病原生物的侵袭。与高毒的化学合成类农药相比，这些植物源化合物是病原生物的天然克星。天然产物具有选择性好、低毒、无残留、不易产生抗药性、与环境相容等特点，完全符合现代农业对于绿色农药的要求。因此，从植物中分离并筛选具有杀线虫活性的成分对于开发绿色农药意义重大。现有技术中未见喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)作为杀线虫剂及用于植物线虫防治农药的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取自黄皮可作为新型杀线虫剂的喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)；本发明的另一目的是提供了制备上述化合物的方法；本发明还提供了上述化合物的具体应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种如下结构式所示的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)，

一种以如下结构式所示的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)为有效成分的杀线虫剂，

一种制备如上结构式所示的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的方法，包括以下步骤：取黄皮的根和茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取2-5次，时间为2-4小时，提取液经减压浓缩得总浸膏；将总浸膏经水混悬后，分别用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积萃取2-5次；乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用100:0，90:10，80:20和70:30的氯仿/甲醇梯度洗脱，结合TLC检测分为七个组分Fr.1–Fr.7；Fr.2组分先用MCI柱层析，以10:90，20:80，30:70和40:60的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，除去色素并划分为4个亚组分Fr.2-1–Fr.2-4；Fr.2-2亚组分再反复经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，分离得到化合物Dictamine(1)。

一种如下结构式所示的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)用作杀线虫剂的应用，以及在制备杀线虫剂中的应用。

本发明以芸香科黄皮属植物黄皮中分离得到的小分子化合物喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)分别处理秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和南方根结线虫(Meloidogyne incognita)48小时后，计数线虫死亡与存活数量，检测化合物的杀线虫活性。结果表明，黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)具有较强的杀线虫活性，具体见实施例部分。

本发明所述含有所述有效成分的药液中，有效成分喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的质量浓度为0.1％～5.0％，优选0.5％～2.0％。其施用量可根据用药方式、所杀线虫类型和严重程度等变化，进行1:1000～1:10000稀释使用，一次或多次施用。

有益效果：本发明具有以下优势：(1)提供的喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)提取分离自黄皮，属于天然产物，具有选择性好、低毒、无残留、不易产生抗药性、与环境相容等特点；(2)所述喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)具有杀线虫作用，属于绿色农药；(3)所述化合物的制备方法可快速分离纯化目标化合物，效率高，目的性强，分离步骤少，操作方便，可控性和重现性好，溶剂可以反复回收利用，成本低，适用于工业生产。

附图说明

图1为黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的制备方法流程图；

图2为黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)杀秀丽线虫活性；

图3为黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)杀南方根结线虫活性。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的任何改进都属于本发明的范围。

实施例1

黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的制备方法(流程见图1)，包括以下步骤：

取黄皮(Clausena lansium)的根和茎(27kg)，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，时间为2-4小时，提取液经减压浓缩得总浸膏(800g)；将总浸膏经水混悬后，分别用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积萃取三次；乙酸乙酯萃取物(406g)经硅胶柱层析，用100:0，90:10，80:20和70:30的氯仿/甲醇梯度洗脱，结合TLC检测分为七个组分Fr.1–Fr.7；Fr.2(38g)组分先用MCI柱层析，以10:90，20:80，30:70和40:60的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，除去色素并划分为4个亚组分Fr.2-1–Fr.2-4；Fr.2-2(12g)亚组分再反复经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，分离得到化合物Dictamine(1)(24mg)。

制备所得黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的结构如下所示：

制备所得化合物Dictamine(1)的结构鉴定数据为：

Dictamine(1):white solid,C₁₂H₉NO₂.ESI-MS(positive)m/z 200[M+H]⁺,222[M+Na]⁺,421[2M+Na]⁺.¹H NMR(400MHz,acetone-d₆)δ_H 8.24(d,J＝8.0Hz,1H,H-5),7.91(d,J＝8.0Hz,1H,H-8),7.87(br.s,1H,H-2′),7.70(t,J＝8.0Hz,1H,H-7),7.46(t,J＝8.0Hz,1H,H-6),7.38(br.s,1H,H-3′),4.50(s,3H,H-OCH₃).¹³C NMR(100MHz,acetone-d₆)δ_C 164.7(s,C-2),157.5(s,C-4),146.6(s,C-9),144.9(d,C-2′),130.2(d,C-7),128.6(d,C-8),124.5(d,C-6),123.2(d,C-5),119.4(s,C-10),106.1(d,C-3′),104.4(s,C-3),59.9(q,C-OCH₃).

实施例2

本发明的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)在混龄的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)上进行初筛、复筛，然后在L4龄的秀丽隐杆线虫上进行评估，发现黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)具有杀线虫的活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：将化合物与秀丽隐杆线虫共同培养48小时后，显微镜下观察线虫生存状况，分别计数死亡线虫与存活线虫的数量，评价样品是否具有杀线虫活性。

实验方法：

1.将Escherichia coli OP50接种于LB固体培养基(Tryptone 10g、NaCl 10g、Yeast extract 5g、Agar 20g，1000mL H₂O)，之后将菌液涂布于NGM培养基(NaCl 3g、Agar17g、Tryptone 2.5g、Cholesterol(5mg/mL in ethanol)1mL，1M磷酸缓冲液(每1L缓冲液含KH₂PO₄ 119g、K₂HPO₄ 21.5g、pH 6.0)25mL、1M CaCl₂1mL、1M MgSO₄ 1mL，973mL H₂O)；

2.将秀丽隐杆线虫接种于含E.coli OP50的NGM培养基；

3.收集线虫，用含1％次氯酸钠的虫卵提取液裂解线虫，将分离得到的虫卵置于M9缓冲液中孵化；

4.将孵化的虫卵接种于含E.coli OP50的NGM培养基培养约48小时得L4龄线虫；

5.收集L4龄线虫于M9缓冲液(KH₂PO₄ 3g、Na₂HPO₄ 6g、NaCl 5g、1M MgSO₄ 1mL，加H₂O至1L)中，调节虫液浓度为667条/mL；

6.样品溶解于DMSO中，储备液浓度为10mg/mL，用含0.3％Tween-20水稀释成500μg/mL工作液；

7.反应体系：在6孔板中进行，3mL/孔，每孔含约1800条线虫，化合物反应终浓度最高为50μg/mL。

实验结果：

实验结果如图2。结果表明黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)具有杀线虫活性，LC₅₀(半数致死剂量)为31.12μg/mL。阳性对照阿维菌素(abamectin)的LC₅₀为3.45μg/mL。

实施例3

本发明的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)在南方根结线虫(Meloidogyne incognita)上进行评估，发现黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)具有杀线虫的活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：将化合物与南方根结线虫共同培养48小时后，显微镜下观察线虫生存状况，分别计数死亡线虫与存活线虫的数量，评价样品是否具有杀线虫活性。

实验方法：

1.温室条件下，将番茄种子种植于无线虫感染的土壤中，待其萌发生长；

2.将生长至一定程度的番茄苗移栽至含有南方根结线虫的土壤中，让其生长；

3.收集番茄根，用清水将泥土洗去，收集附着与番茄根上的南方根结线虫虫卵，用1％次氯酸钠溶液消毒之后，将虫卵置于水中于28℃条件下孵化；

4.收集孵化的根结线虫于M9缓冲液(KH₂PO₄ 3g、Na₂HPO₄ 6g、NaCl 5g、1M MgSO₄1mL，加H₂O至1L)中，调节虫液浓度为700条/mL；

5.样品溶解于DMSO中，储备液浓度为10mg/mL，用M9溶液稀释成500μg/mL工作液；

6.反应体系：在24孔板中进行，1mL/孔，每孔含约667条线虫，化合物反应终浓度最高为100μg/mL。

实验结果：

实验结果如图3。结果表明黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)对南方根结线虫具有毒杀作用，LC₅₀(半数致死剂量)为98.75μg/mL。阳性对照阿维菌素(abamectin)对南方根结线虫的LC₅₀为0.31μg/mL。

农药制剂实施例1

将可溶于水的乳化剂与去离子水混合，也可以加如部分高级醇助溶，然后将油溶性农药原药(实施例1制得的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1))，在激烈搅拌下加入水中，制成透明的o/w型微乳。

农药制剂实施例2

将乳化剂与农药原药(实施例1制得的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1))混合，形成溶液，可以加入部分溶剂，在高速搅拌中滴入水中，形成透明的o/w型微乳剂，也可以相反将水滴入油中形成w/o微乳剂，至于形成那种主要看水量的大小和亲水亲油性。

农药制剂实施例3

将农药(实施例1制得的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1))、乳化剂、溶剂混合成油相后，在搅拌下慢慢加入去离子水形成w/o型微乳，在经过搅拌加热使之迅速转相变为o/w微乳降温后即可。

Claims

1.一种如下结构式所示的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)，

2.一种杀线虫剂，其特征在于，以权利要求1所述的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)为有效成分。

3.一种制备权利要求1所述的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)的方法，其特征在于，包括以下步骤：取黄皮的根和茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取2-5次，每次2-4小时，提取液经减压浓缩得总浸膏；将总浸膏经水混悬后，分别用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积萃取2-5次；乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，用100:0，90:10，80:20和70:30的氯仿/甲醇梯度洗脱，结合TLC检测分为七个组分Fr.1–Fr.7；Fr.2组分先用MCI柱层析，以10:90，20:80，30:70和40:60的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，除去色素并划分为4个亚组分Fr.2-1–Fr.2-4；Fr.2-2亚组分再反复经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，分离得到化合物Dictamine(1)。

4.一种如权利要求1所述的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)用作杀线虫剂的应用。

5.一种如权利要求1所述的黄皮中喹诺酮生物碱类化合物Dictamine(1)用于制备杀线虫剂的应用。