CN104542646B - 安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，安石榴甙浓度为200-1000μg/mL，能有效杀灭松材线虫，在72小时内对松材线虫的半致死浓度为332.88μg/mL，安石榴甙能有效抑制松材线虫的乙酰胆碱酯酶的活性，杀灭松材线虫，其半抑制浓度为654.92μg/mL。安石榴甙由石榴皮中分离得到。本发明操作方法简单，原料来源广泛，成本低廉，高效低毒，安全环保，安石榴甙在控制松材线虫病方面有良好的应用前景，可应用于杀松材线虫的农药制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，属于林业病虫害防治技术领域。
背景技术：
松材线虫病，又称为松萎蔫病(Pinewiltdisease)，是由松褐天牛携带传播的松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的一种毁灭性的林业病虫害，该病不但导致松树的大面积死亡从而带来严重的经济损失，而且该病还对生态环境、旅游景区及对外贸易带来严重的负面影响，国际上很多国家都将松材线虫列为重要的检疫对象。目前，对松材线虫病的防治主要以化学防治为主，但是大量使用化学农药容易使松材线虫产生耐药性，且对环境造成一定的污染，因此寻找高效低毒的杀线虫成分已成为对松材线虫病防治研究的重要内容。
已有的研究表明，从香菜、枫香和缬草中分离得到挥发性精油具有很好的杀线虫活性(KimJ，SeoSM，LeeSG，ShinSC，ParkIK.Nematicidalactivityofplantessentialoilsandcomponentsfromcoriander(Coriandrumsativum)，orientalsweetgum(Liquidambarorientalis)，andvalerian(Valerianawallichii)essentialoilsagainstpinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus).JournalofAgriculturalFoodChemistry，2008，56：7316－7320)，从甘遂中获得的二萜类化合物及其衍生物对于松材线虫也有很好的杀灭作用(ShiJ，LiZ，NitodaT，IzumiM，KanzakiaH，BabaN，KawazuK，NakajimaS.AntinematodalactivitiesofingenanediterpenesfromEuphorbiakansuiandtheirderivativesagainstthepinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus).ZNaturforschC，2008，63：59-65)。中国专利CN201010198655.6，CN201010198681.9，CN201010198673.4，CN201010198691.2公布了油酸乙酯、亚油酸乙酯、反油酸乙酯及棕榈酸乙酯在防治松材线虫病中的应用；赵博光在其专利(CN200510039280.8)中公布了一种植物源化合物α-三噻吩对松材线虫有良好的杀灭作用。郭道森等在其专利(CN200410075754.X)公布了以迷迭香酸为主要成分的紫苏提取物具有杀灭松材线虫的活性，中国专利(CN94111492.9)公布了苦豆草中的苦豆碱对于对松材线虫病有效；中国专利(CN200810055785.7)公布了拟青霉菌产生的CerebrosideA和CerebrosideB两种化合物单独或组合使用具有毒杀松材线虫的作用；中国专利(CN201110301281.0)公布了苏云金芽孢杆菌Bt-06A晶体蛋白具有杀灭松材线虫用途，中国专利(CN200610048614.2)公布了由植物三瓣木兰叶制备得到的和厚朴酚具有对松材线虫较好的毒杀作用。
虽然近些年已陆续公布报道了多种具有杀灭松材线虫活性的天然产物，但多数产物的杀线效果仍不及高毒化学农药。本发明公布了安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，以期为新型松材线虫防治药物的开发打下基础。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，安石榴甙来源于多种植物，具有高效、低毒，在线虫体内的作用位点明确等优点。
为了实现上述发明目的，本发明所提供的具有杀松材线虫活性的安石榴甙，浓度为200-1000μg/mL，能有效杀灭松材线虫。
安石榴甙由石榴皮中分离得到；该成分的结构式为：
该化合物的特征常数为：NegativeESMSm/z:1083.0621[M-H]-；1HNMR(acetone-d6):δ5.06(1H,m,glc-α-H-1),4.72(m,glc-β-H-1),4.82(m,glc-H-2),5.15(dd,glc-H-3),4.75(dd,glc-H-4),3.24(m,glc-H-5),4.15(dd,glc-H-6a),2.12(dd,glc-H-6b),6.47,6.53,6.60,6.92(s,aromaticH,respectively).13CNMR(acetone-d6):δ90.47(glc-C-1),71.37(glc-C-2),76.66(glc-C-3),74.68(glc-C-4),67.17(glc-C-5),64.44(glc-C-6),157.30,157.72(δ-lactone-C,respectively),168.71,168.90,169.55,169.75(CO2-C,respectively)。
取石榴皮干粉，用乙醇于室温浸提48小时，石榴皮干粉与乙醇的料液比为100：1g/L，重复提取1次，浸提液减压浓缩得糊状物，糊状物用水稀释10倍后再用乙酸乙酯萃取，水相冷冻干燥后得冻干粉，冻干粉用20％甲醇溶解，滤纸过滤，上SephadexLH-20层析柱，20％甲醇洗脱，得I-V五个洗脱组分，组分V经制备高效液相色谱，60％甲醇为洗脱剂，进一步分离得安石榴甙。
将50μl的松材线虫悬液加入1mL置于24孔板中，使其中的松材线虫浓度为1000条/mL，每孔加入为安石榴甙溶液50μl，使安石榴甙终浓度为200-1000μg/mL，混匀，以加入等体积的蒸馏水组为阴性对照，28℃避光培养一段时间后，体式显微镜下观察，计算线虫的存活及死亡条数，重复以上实验。视野下松材线虫呈僵直状不动为死亡，否则为存活。分别计算不同梯度下24小时，48小时和72小时下的松材线虫校正死亡率，结果用SPSS17.0进行统计分析。计算公式如下所示：
结果显示，安石榴甙在72小时内对松材线虫的半致死浓度为332.88μg/mL，95％的可信区间为312.91-352.07μg/mL。
本发明提供的一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，能有效抑制松材线虫的乙酰胆碱酯酶的活性，杀灭松材线虫，其半抑制浓度(IC50)为654.92μg/mL。
本发明操作方法简单，原料来源广泛，成本低廉，高效低毒，安全环保，安石榴甙在控制松材线虫病方面有良好的应用前景，可应用于杀松材线虫的农药制剂。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1、安石榴甙的制备
石榴皮干粉100g，用1升乙醇于室温浸提48h，重复提取1次，浸提液减压浓缩得7.4g糊状物，糊状物用水稀释10倍后再用乙酸乙酯萃取，水相冷冻干燥后得3.7g冻干粉，冻干粉用10mL20％甲醇溶解，滤纸过滤，上SephadexLH-20层析柱，20％甲醇洗脱，得I-V五个洗脱组分，组分V经制备高效液相色谱(60％甲醇为洗脱剂)进一步分离得51.4mg安石榴甙。
实施例2、安石榴甙的杀松材线虫活性测定
将50μl的松材线虫悬液加入1mL置于24孔板中，使其中的松材线虫浓度为1000条/mL，每孔加入为安石榴甙溶液50μl，使安石榴甙终浓度为200-1000μg/mL，混匀，以加入等体积的蒸馏水组为阴性对照，28℃避光培养一段时间后，体式显微镜下观察，计算线虫的存活及死亡条数，实验重复4次。视野下松材线虫呈僵直状不动为死亡，否则为存活。分别计算不同梯度下24h，48h和72h时的松材线虫校正死亡率，结果用SPSS17.0进行统计分析。计算公式如下所示：
结果显示，安石榴甙在72h内对松材线虫的半致死浓度为332.88μg/mL，95％的可信区间为312.91-352.07μg/mL。
实施例3、安石榴甙对松材线虫乙酰胆碱酯酶的抑制作用
健康的松材线虫按照1：5(w/v)的比例与生理盐水混合，于冰浴中快速研磨，提取液于4℃,12000转/分钟离心30min，取上清，即为乙酰胆碱酯酶待测溶液，乙酰胆碱酯酶的活性按照乙酰胆碱酯酶测试盒(南京建成生物工程研究所)提供的方法进行测定，其原理是乙酰胆碱被乙酰胆碱酯酶水解后生成胆碱与乙酸，而胆碱与巯基显色剂反应生成黄色化合物，412nm处比色分析，根据生成胆碱的量计算乙酰胆碱酯酶的活性，一个单位的乙酰胆碱酯酶的量定义为在测定条件下，6分钟内水解1.0μmol乙酰胆碱的酶量。测定时向反应体系中添加终浓度为200-1000μg/mL安石榴甙，以添加等体积蒸馏水的反应体系为阴性对照。
分析结果表明，安石榴甙能明显抑制松材线虫乙酰胆碱酯酶的活性，其半抑制浓度(IC50)为654.92μg/mL，其95％的可信区间为639.01-671.79μg/mL。
Claims (4)
1.一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于安石榴甙结构式为：
在其浓度为200-1000μg/mL时，能有效杀灭松材线虫。
2.根据权利要求1所述的一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于安石榴甙在72小时内对松材线虫的半致死浓度为332.88μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于安石榴甙由石榴皮中分离得到，取石榴皮干粉，用乙醇于室温浸提48小时，石榴皮干粉与乙醇的料液比为100：1g/L，重复提取1次，浸提液减压浓缩得糊状物，糊状物用水稀释10倍后再用乙酸乙酯萃取，水相冷冻干燥后得冻干粉，冻干粉用20％甲醇溶解，滤纸过滤，上SephadexLH-20层析柱，20％甲醇洗脱，得I-V五个洗脱组分，组分V经制备高效液相色谱，60％甲醇为洗脱剂，进一步分离得安石榴甙。
4.根据权利要求1所述的一种安石榴甙在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于安石榴甙能有效抑制松材线虫的乙酰胆碱酯酶的活性，杀灭松材线虫，其半抑制浓度为654.92μg/mL。
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