CN107375376A - 一种孔雀草总黄酮提取物制备方法及在抗抑郁药物中应用 - Google Patents

一种孔雀草总黄酮提取物制备方法及在抗抑郁药物中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种孔雀草总黄酮提取物在抗抑郁药物制备中的应用。所述制备方法包括：(1)用水溶液对孔雀草进行提取至少一次得提取液，所述提取液经浓缩得到浓缩液；(2)所述浓缩液加95％乙醇(乙醇/水体积比)调成乙醇浓度为70％(乙醇/水体积比)，冷藏4℃放置12‑24小时，离心，取上清液；(3)上清液经水饱和正丁醇萃取，合并正丁醇提取液，浓缩，干燥即得所述孔雀草总黄酮提取物。本发明提供的孔雀草总黄酮提取物，按照比色法测定的总黄酮的重量含量高于40％。药理试验证明，该孔雀草总黄酮提取物具有较强的抗抑郁作用，且纯度高，且制备方法简便实用，适合工业化生产，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗抑郁药物的制剂中。

Description

一种孔雀草总黄酮提取物制备方法及在抗抑郁药物中应用
技术领域
本发明涉及一种植物药及其应用，具体是以孔雀草总黄酮为活性成分的提取物及其在制备抗抑郁药物中的用途。
背景技术
孔雀草(Tagetes patula L.)又名红黄草、藤菊、小万寿菊，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本，花期为7月～9月。我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，花叶可以入药，有清热化痰、补血通经的功效。能治疗百日咳、气管炎、感冒等。
从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素(patuletin)，槲皮万寿菊素(quercetagetin)，槲皮万寿菊甙(quercetagitrin)等黄酮类化合物(国家中医药管理局《中华本草》编委会；中华本草[M]；上海科学技术出版社，1999年版)。目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。
前期我们采用大孔树脂法和聚酰胺法制备孔雀草总黄酮，并探索其抗前列腺炎和帕金森作用(中国专利：蔡德成，窦德强.一种孔雀草提取物、制备方法及其在制备抗癌药物中应用，申请号：201511022916.8；蔡德成，窦德强.孔雀草总黄酮提取物、制备方法及应用，申请号：201511022920.4.)。但这两个制备工艺成本较高，所制备的总黄酮纯度低，于是我们改进了工艺，并探索其抗抑郁作用，发现这个总黄酮提取物抗抑郁作用较强，可适合开发成为抗抑郁症的药物，于是形成本专利。孔雀草中总黄酮含量约40％以上，测定方法参见文献：迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮含量测定.中国现代中药，2008年第10卷第11期。
由于工作和社会生活压力等原因，抑郁症发病率在我国较高，但目前尚无抗抑郁症的药物生产，其新药开发具有重要意义。本专利制备的孔雀草总黄酮提取物可用于抗抑郁的保健食品和药品中。
发明内容
本发明的目的是提供一种孔雀草总黄酮提取物用于制备抗抑郁药物中的新用途。
为实现上述目的而采用的技术方案如下：
1.建立制备孔雀草总黄酮提取物的方法
(1)对孔雀草全草(包括根及地上部分，粉碎成1-10目粉末)进行温浸水提取(60-80℃)，每次溶剂用量为药材质量的8倍量，每次1小时，浸提2次。合并提取液后经浓缩得到浓缩液(约为药材质量的1.5倍量)；
(2)上述浓缩液加95％乙醇(乙醇/水体积比)调成乙醇浓度为70％(乙醇/水体积比)，冷藏4℃放置12-24小时，离心，取上清液；
(3)所得上清液经水饱和正丁醇萃取3-4次，每次用量为浓缩液1/2体积，合并正丁醇提取液，浓缩成浸膏，减压干燥即得所述孔雀草总黄酮提取物。
2.孔雀草总黄酮提取物在抗抑郁的药物制备中应用
上述孔雀草总黄酮提取物用于抗抑郁药物的药理试验研究。
具体实施方式
本发明中，采用下述文献报道的比色法对总黄酮含量进行测定：迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮的含量测定.中国现代中药2008，10(11)：16-17。该方法的简要操作过程如下：精密称取一定量的总黄酮提取物，制备样品溶液。加Al(NO3)3/NaNO2试液显色，以芦丁为对照品，于505nm处进行比色测定。根据测定的吸光度值，即可计算得到孔雀草中总黄酮的含量。
实施例1孔雀草总黄酮制备
将孔雀草(全草)1kg粉碎，过10目筛子，以水为溶媒，提取2次，每次溶剂用量为药材质量的8倍量(重量比)，每次70℃温浸1小时。合并提取液，浓缩至约为药材质量的1.5倍量(约1.5升)，加95％乙醇(乙醇/水体积比)调成乙醇浓度为70％(乙醇/水体积比)，冷藏4℃放置12小时，离心，取上清液。所得上清液经水饱和正丁醇萃取3次，每次用量为浓缩液1/2体积，合并正丁醇提取液，浓缩成浸膏，减压干燥即得所述孔雀草总黄酮提取物110.7g，测得总黄酮为50.2g，占所述干燥后的总黄酮提取物的重量百分比为45.3％，占孔雀草原料药材总重的百分比即收率为5.02％。
实验例2孔雀草总黄酮的抗抑郁作用研究
1.实验材料与方法
1.1材料与仪器
健康雄性KM小鼠，体重18g～22g，由大连医科大学动物实验中心提供，合格证编号：2008-0002，所用孔雀草总黄酮为采用上述工艺自制。地昔帕明(Desipramine，DMI，批号：123K1364，阳性药)、阿扑吗啡(Apomorphine，APO，批号110K1391)及育亨宾(Yohinbin，批号：124F0516)均系美国Sigma公司产品。)；YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(沈阳佰益科技发展有限公司)。
1.2动物分组
将40只KM雄性小鼠随机分为4组：空白组、阳性药组(地昔帕明)和孔雀草总黄酮(ZHT)低(150mg/kg)和高剂量(300mg/kg)组，每组10只。ZHT及阳性药用时采用生理盐水溶解，空白组给予生理盐水。
1.3小鼠悬尾实验
将小鼠随机分为空白组、阳性药组(地昔帕明20mg/kg)、ZHT低剂量(150mg/kg)和高剂量(300mg/kg)组各组动物每日灌胃给药1次，连续给药7d。末次给药1h后，将小鼠尾部距末端约2cm处用夹子固定，使小鼠倒挂在悬尾箱内，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后，立刻开始观察，观察持续5min，记录5min内小鼠的不动时间。
1.4小鼠强迫游泳实验
小鼠分组及给药方法同上。连续给药9天，末次给药1h后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸一只，缸中水深10cm，水温(25±1)℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续5min，累计此5min内的不动时间。
1.5小鼠自主活动实验
小鼠分组及药物剂量、给药方法同上，连续给药7d。末次给药1h后，将动物放人YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪内，适应2min后，测定5min内的自主活动次数。
1.6育亨宾致死小鼠试验
小鼠分组及药物剂量、给药方法同上，每组10只，连续给药7d，末次给药1h后，皮下注射育亨宾30mg/kg，观察18h后受试组和对照组中小鼠的死亡率。
1.7阿朴吗啡致小鼠刻板运动实验
环境温度保持20℃～22℃，小鼠分组及药物剂量、给药方法同上，每组10只，连续给药7d，末次给药1h后，皮下注射阿朴吗啡16mg/kg，立即单独放入小鼠笼中，笼底部预先铺上揉有皱褶的纸，皱褶向上。根据小鼠刻板运动的评分标准，观察阿朴吗啡1h内动物出现刻板运动的程度。无定型活动反应为0分，不连续地闻并伴有兴奋活动为1分，连续地闻，头稍有活动伴周期性兴奋活动为2分，连续地闻和头部活动伴有不连续地咬、啃、舔的动作并有短暂活动期为3分，连续地咬、啃，无兴奋活动期，有时全身迅速移位为4分。
1.8统计学处理
本实验数据处理采用SPSS统计软件，统计学处理数据以均数±标准差表示，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学处理。
2.结果
2.1对小鼠悬尾不动时间的影响
实验结果表明，与空白组相比，ZHT低剂量和高剂量组均有抑制小鼠悬尾不动时间的作用，其中高剂量组较强(p＜0.01)。实验结果见表1.
表1 孔雀草总黄酮对小鼠悬尾不动时间的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2对小鼠强迫游泳不动时间的影响
与空白组相比，ZHT高、低剂量组对小鼠游泳不动时间均有抑制作用，具有显著意义。实验结果见表2。
表2 孔雀草总黄酮对小鼠游泳不动时间的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3对小鼠自主活动的影响
实验结果表明阳性药组具有显著的抑制小鼠自主活动次数的作用，与空白组比较具有显著性差异，而孔雀草总黄酮组对自主活动次数影响差异不显著，表明在所给药剂量下孔雀草总黄酮对小鼠自主活动次数影响不显著。实验结果见表3。
表3 孔雀草总黄酮对小鼠自主活动的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.4育亨宾致小鼠死亡影响
结果显示，给予ZHT各剂量组及阳性药组均能增加皮下注射育亨宾30mg/kg小鼠的死亡率，表明ZHT可能是通过影响NE能神经传递，产生抗抑郁作用。实验结果见表4。
表4 孔雀草总黄酮对对育亨宾致死小鼠的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2.5对阿朴吗啡致小鼠刻板运动的影响
阿朴吗啡(APO)是一种非选择性多巴胺受体激动剂，阳性药和孔雀草总黄酮可协同阿朴吗啡致小鼠刻板运动的程度，与空白对照比较，差异具有显著意义(P＜0.05)，提示其作用可能与增强脑内多巴胺的作用有关。实验结果见表5。
表5 孔雀草总黄酮对阿朴吗啡致小鼠刻板运动的影响
注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
上述结果表明，孔雀草总黄酮具有显著的抗抑郁作用，在一些指标上与阳性药无显著差异，可单独或与其它药物联合应用于制备抗抑郁药物。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (5)

1.一种具有抗抑郁作用的孔雀草总黄酮提取物的制备方法及其在抗抑郁药物中应用，孔雀草提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)用水对孔雀草粗粉进行提取至少一次得提取液，所述提取液经浓缩得到浓缩液；
(2)上述浓缩液加95％乙醇(乙醇/水体积比)调成乙醇浓度为70％(乙醇/水体积比)，冷藏4℃放置12-24小时，离心，取上清液；
(3)所得上清液经水饱和正丁醇萃取，合并正丁醇提取液，浓缩，干燥即得所述孔雀草总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孔雀草为全草包括根及地上部分及花；所述孔雀草粗粉粒度为1目-10目；步骤(1)中所述水为生活用水或市售纯净水；所述提取为60-80℃温浸；所述提取的次数为1～3次；所述水溶液的用量为所述药材的质量的6～10倍(重量比)；每次所述提取的时间为0.5～3小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述浓缩液与所述孔雀草的重量份数比为(2～1)：1；步骤(3)所用正丁醇为水预先饱和的正丁醇，用量为浓缩液1/2体积，萃取3-4次；所述的干燥方法可以为冷冻干燥和50℃下减压干燥。
4.权利要求1-3中任一所述方法制备的孔雀草总黄酮提取物，总黄酮的含量为40％(重量比)以上。
5.根据权利要求1和4的要求，其特征在于：权利要求4所制备的孔雀草总黄酮提取物可以单独或与其它药物组合应用于抗抑郁药物制剂中。
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