CN105076233B

CN105076233B - 一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂其制备工艺

Info

Publication number: CN105076233B
Application number: CN201510510932.5A
Authority: CN
Inventors: 刘权; 彭爱风; 李晓蓓
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN105076233A

Abstract

本发明公开了一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物。本发明提供的红三叶植物源农药，不仅对蚜虫和螨虫有明显的触杀作用，不易产生抗药性，且对环境友好，对人畜等非靶标生物安全。本发明还对主要功能成分进行了分离鉴定，确定为黄酮类化合物，为进一步开发利用提供了前提。该植物资源丰富，制备工艺简单，在农业生产中具有良好的开发应用前景和经济价值。

Description

一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂其制备工艺，属于生物农药技术领域。

背景技术

蚜虫(aphid)，又称腻虫、蜜虫，是一类植食性昆虫。目前已经发现的蚜虫总共有10个科约4400种，其中多数属于蚜科。蚜虫是地球上最具破坏性的害虫之一。其中大约有250种是对于农林业和园艺业危害严重的害虫。蚜虫在世界范围内的分布十分广泛，但主要集中于温带地区。蚜虫的繁殖力很强，一年能繁殖10～30个世代，世代重叠现象突出。雌性蚜虫一生下来就能够生育，而且不需要雄性就可以繁殖(即孤雌繁殖)。

螨类(mites)隶属于蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，种类繁多，全球约有30-50 万种，是动物界中仅次于昆虫纲的第二大生物类群。以植食性为主的农业螨类在世界各地的农作物上都有发现，危害日益严重。农业害螨是不断侵占暂时性生境的种类，对短暂的生活环境具有高度的适应性；个体小、繁殖能力强，寿命及每个世代的周期短，是典型的R类害虫。它们破坏植物的正常生理机能，引起落叶、落蕾、落果，轻则造成减产，削弱树势，重则整株死亡，不少螨类还能传播植物病害，是公认的最难防治的农业害虫之一。

蚜虫和螨虫在农业生产中危害非常严重且难于防治，常常造成巨大的经济损失。在控制害蚜和害螨方面，自20世纪50年代以来，化学农药就起到不可替代的重要作用。目前农业上防治害蚜害螨，化学杀蚜和杀螨剂仍占现行品种的绝大部分；仅有的植物源、矿物油剂均还属于第一代、二代杀蚜和杀螨剂，杀虫效果低，且易产生药害。然而，正因为现行使用的杀虫剂均为化学品，害蚜和害螨虽得到了不同程度的遏制，但同时也带来了诸多的负面影响，尤其是其对非靶标生物的杀伤以及导致的环境问题引起了全世界的广泛关注，“3R”问题(残留(residue)、抗性(resistance)和害虫的再猖獗(resurgence))也日益严重。面对这种情况，使用高效、低毒、低残留、对环境安全的生物农药，已成为农药开发研究的新方向。

植物源杀虫剂具有取材容易，加工使用方便，能有效地防治害虫,害虫不易产生抗药性, 不杀伤天敌，使用安全的特点，对环境不会造成污染,对人、畜毒性低。此外，寻找有效的植物源杀虫剂对于害蚜害螨的防治具有重要意义。然而，因为植物资源不够丰富，或者活性不是很理想，很多研究未能取得进一步的成果，而且大多均未确定其中的活性化学成分。

发明内容

本发明提供了一种杀虫效果好的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂；

本发明的另一个目的是提供上述防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

一种防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物。

优选的，防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物的乙酸乙酯部位萃取物、石油醚部位萃取物或水相部位萃取物中的一种或两种以上的组合。

最佳的，防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，其主要成分为红三叶提取物的乙酸乙酯部位萃取物。经实验验证，采用红三叶提取物的乙酸乙酯部位萃取物为主要成分作为防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，较其它部分萃取物的效果更好。

防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的主要活性成分为芒柄花素、染料木素和鹰嘴豆芽素A。

上述防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的制备工艺，所述红三叶提取物的制备方法如下：

采集新鲜红三叶植物地上部位，阴干粉碎后，加入乙醇水溶液，超声或加热回流提取，提取液减压浓缩得浸膏，然后在通风避光处晾干，制得红三叶提取物。

优选的，所述乙醇水溶液，加入量是干粉体积的10-50倍，乙醇水溶液浓度为20-100wt％；超声或加热回流提取10-90分钟。

上述以红三叶提取物的萃取物为主要成分的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂的制备工艺，包括如下步骤：

1)红三叶提取物的制备；

2)红三叶不同活性部位的制备

a.红三叶石油醚部位萃取物(以下简称石油醚部位)的制备：将红三叶提取物用水溶解，再加入石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复萃取2-5 次，合并石油醚层，减压浓缩，制得红三叶石油醚部位萃取物；

b.红三叶乙酸乙酯部位萃取物(以下简称乙酸乙酯部位)的制备：石油醚萃取后的水溶液中加入乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸乙酯重复萃取2-5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得红三叶乙酸乙酯部位萃取物；

c.红三叶水相部位萃取物(以下简称水相部位)的制备：将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得红三叶水相部位萃取物。

优选的，所述步骤2)的步骤a中，红三叶提取物用其2-20倍体积的蒸馏水溶解。

优选的，所述步骤2)的步骤a中，加入红三叶提取物2-10倍体积的石油醚。

优选的，所述步骤2)的步骤b中，石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10倍体积的乙酸乙酯。

本发明提供的防治蚜虫和螨虫的植物源杀虫剂，采用的植物材料为红三叶，其为豆科多功能优良牧草，在全世界有广泛种植。其中含有的异黄酮成分，具有雌激素样作用，对于治疗糖尿病、癌症，特别是妇女期综合症，具有明显效果。利用该植物制备的乙酸乙酯部位在 1mg/mL的浓度下，对蚜虫的触杀活性就能达到80％以上，对螨虫的活性高达98％，具有很好的开发应用前景。

同时本发明也明确其主要活性成分为芒柄花素、染料木素和鹰嘴豆芽素A。经实验验证，红三叶乙酸乙酯部位具有非常好的杀虫活性。利用柱层析色谱、重结晶等分离手段，从乙酸乙酯部位中分离得到3种化合物。通过现代波谱技术测定，鉴定这些化合物为异黄酮类化合物，分别为芒柄花素(formononetin，以下简称FOR)、染料木素(genistein，以下简称GEN) 和鹰嘴豆芽素A(biochanin A，以下简称BIO)。活性检测结果表明，这3个化合物对蚜虫和螨虫具有明显的触杀活性，处理桃蚜48小时后，LC₅₀分别为0.192，0.190和0.244mg/mL；处理甘蓝蚜48小时后，LC₅₀分别为0.180，0.239和0.155mg/mL；处理朱砂叶螨48小时后， LC₅₀分别为0.158，0.273和0.180mg/mL。

本发明提供的红三叶植物源农药，对害蚜和害螨有明显的触杀作用，不易产生抗药性，且对环境友好，有益于人类健康。此外，该植物资源丰富，制备工艺简单，在保护农业生产方面具有很好的开发应用前景。

具体实施方式

首先需要指出，本发明的实施例仅仅公开几个优选的实施方式，不应该理解成对本发明实施的限制，本发明的保护范围仍以权利要求书所公开的内容为准。

实施例1红三叶不同活性部位的制备

1、红三叶提取物的制备：采集新鲜的红三叶植物的地上部位，阴干，粉碎。加入20倍体积乙醇，超声提取30分钟，重复提取3次。将提取溶剂减压浓缩，得浸膏，在通风避光处，晾干，得红三叶提取物。

2、红三叶不同活性部位的制备：取制得的红三叶提取物20g，用5倍体积的蒸馏水100mL 溶解，在水溶液中加入3倍于水溶液体积的石油醚300mL，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层；重复萃取3次，合并石油醚层，减压浓缩，制得红三叶石油醚部位。将石油醚萃取后剩余水溶液中加入3倍体积的乙酸乙酯300mL，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得红三叶乙酸乙酯部位。将萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得红三叶水相部位。

实施例2不同活性部位对桃蚜的杀虫活性

参照已报道权威经典测试方法—点滴法(Zhao Q.Q.,Li Y.Q.,Xiong L.X.,etal.J. Agric.Food Chem.2010,58,4992-4998.)。

杀虫剂称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯和水相不同活性部位物质1-2mg，分别加入含 10％蒸馏水的丙酮液配制成1.00mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液依次稀释成0.50、 0.25、0.10和0.05mg/mL的溶液，加入药液体积1％的表面活性剂JFC(C7～C9烷醇聚氧乙烯醚)，混合均匀即得杀虫剂。配置药液浓度分别为。然后用微量点滴器将药液点滴在桃蚜腹部背部，点滴完毕后，各处理分别放入培养皿中(每个培养皿中30只)，24h后检查死亡数。以含10％蒸馏水的丙酮液稀释同样的倍数+表面活性剂JFC点滴处理作为溶剂对照。计算死亡率和校正死亡率。平行重复3次。不同组分杀虫剂对桃蚜的触杀效果见表1。

从表1，我们可知红三叶乙酸乙酯的活性高于石油醚部位和水相部位。其中，在1mg/mL 浓度下，处理24h后，石油醚部位和乙酸乙酯部位对桃蚜的触杀活性在50％以上；处理48h 后，乙酸乙酯部位对桃蚜的触杀活性达到80％，石油醚部位和水相的活性为60％左右。从表 2可知，虽然乙酸乙酯部位最强，但是石油醚和水相也具有明显的活性，这些将为在进一步开发和应用红三叶杀虫剂过程中精简工艺路线提供可能，有利于降低生产和使用成本，且更为安全环保。

表1红三叶不同活性部位对桃蚜的触杀活性

表2红三叶不同活性部位对桃蚜的LC₅₀值

实施例3不同活性部位对甘蓝蚜的杀虫活性

活性测试方法与对桃蚜活性方法相同。红三叶不同部位对甘蓝蚜的活性测试结果见表3。其中，在1mg/mL浓度下，处理24h后，乙酸乙酯部位对甘蓝蚜的触杀活性就在60％以上；处理48h后，乙酸乙酯部位对甘蓝蚜的触杀活性达到80％以上，石油醚部位和水相的活性均大于60％。从表4，我们可知红三叶乙酸乙酯的活性高于石油醚部位和水相部位。这些结果与对桃蚜测试结果基本相符。

表3红三叶不同活性部位对甘蓝蚜的触杀活性

表4红三叶不同活性部位对甘蓝蚜的LC₅₀值

实施例4不同活性部位对朱砂叶螨的杀虫活性

参照FAO(联合国粮农组织)推荐的测定螨类的标准方法—玻片浸渍法并加以改进(Wang Y.J.,et al.Agrochemical Research Application.2006,10,20–23.)。将双面胶带剪成2～3 cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的螨虫，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每片粘3行，每行粘10头。然后用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。

杀虫剂称取上述制备的石油醚、乙酸乙酯和水相不同活性部位物质1-2mg，分别加入含 10％蒸馏水的丙酮液配制成1.00mg/mL浓度的母液，再用蒸馏水将母液依次稀释成0.50、 0.25、0.10和0.05mg/mL的溶液，加入药液体积1％的表面活性剂JFC(C7～C9烷醇聚氧乙烯醚)，混合均匀即得杀虫剂。配好后将带螨虫玻片的一端浸入溶液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用滤纸吸干螨体及其周围多余的药液。24h后用双目镜检查死亡数(用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡)，以含10％蒸馏水的丙酮液稀释同样的倍数+JFC浸渍处理作为溶剂对照。计算死亡率和校正死亡率。

从表5可知，处理24小时后，石油醚部位和乙酸乙酯部位在1mg/mL均对朱砂叶螨的触杀活性在80％以上，水相部位活性在70％以上；处理48小时后，石油醚部位、乙酸乙酯部位和水相部位在1mg/mL均对朱砂叶螨的触杀活性在80％以上，尤其是乙酸乙酯部位触杀活性高达98％。乙酸乙酯部位活性最强，但是石油醚部位和水相部位也有非常明显的活性(见表6)。

表5红三叶不同部位对朱砂叶螨的触杀活性

表6红三叶不同活性部位对朱砂叶螨的LC₅₀值

实施例5杀虫活性化合物的跟踪分离

活性结果表明，红三叶乙酸乙酯部位活性最强。因此，对乙酸乙酯部位进行了进一步分离纯化。取乙酸乙酯部位10g，用硅胶10g拌样，上100g硅胶柱，依次用石油醚300mL，石油醚：丙酮(100：1)溶液300mL，石油醚：丙酮(50：1)溶液300mL，石油醚：丙酮(10： 1)溶液500mL，石油醚：丙酮(2：1)溶液300mL，石油醚：丙酮(1：1)溶液300mL，丙酮100mL洗脱，通过薄层色谱分析比较，合并相似组分，得A-H 8个组分。对其中组分D 进行多次连续的硅胶柱层析分离，利用葡聚糖凝胶进行纯化，重结晶得到化合物FOR。对其中组分E进行多次连续的硅胶柱层析分离，利用葡聚糖凝胶进行纯化，得到化合物GEN和化合物BIO。

利用核磁共振技术和质谱，鉴定这两个活性成分分别为芒柄花素(Formononetin)、染料木素(Genistein)和鹰嘴豆芽素A(Biochannin A)，化学结构式为：

。

其结构数据如下：

FOR：无色针状晶体。ESI-MS给出[M+H]⁺m/z 269.0805。¹H-NMR(400M，DMSO-d₆) δ：8.34(1H,s,H-2),7.97(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),7.51(2H,d,J＝8.0Hz,H-2’,H-6’),6.98(2H,d, J＝8.0Hz,H-3’,H-5’),6.93(1H,dd,J＝8.0,4.0Hz,H-6),6.87(1H,d,J＝4.0Hz,H-8),3.79(3H,s, 4’-OCH₃)。

GEN：无色针状晶体。ESI-MS给出[M+H]⁺m/z 271.0440。¹H-NMR(400M，DMSO-d₆) δ：12.96(1H,s,5-OH),10.88(1H,s,7-OH),9.58(1H,s,4’-OH),8.32(1H,s,H-2),7.38(2H,d,J＝12.0Hz,H-2’,H-6’),6.82(2H,d,J＝12.0Hz,H-3’,H-5’),6.39(1H,brs,H-8),6.23(1H,brs, H-6)。

BIO：淡黄色粉末。ESI-MS给出[M+H]⁺m/z 285.0722。¹H-NMR(400M，CDCl₃)δ：12.88(1H,s,5-OH),7.85(1H,s,H-2),7.46(2H,d,J＝8.0Hz,H-2’,H-6’),6.98(2H,d,J＝8.0Hz,H-3’, H-5’),6.41(1H,brs,H-8),6.36(1H,brs,H-6),3.84(3H,s,4’-OCH₃)。

活性测试结果表明(表7-表12)，3个化合物均对蚜虫和螨虫有明显的触杀活性，处理桃蚜48小时后，LC₅₀分别为0.192，0.190和0.244mg/mL；处理甘蓝蚜48小时后，LC₅₀分别为0.180，0.239和0.155mg/mL；处理朱砂叶螨48小时后，LC₅₀分别为0.158，0.273和0.180mg/mL。化合物FOR杀蚜杀螨活性都很强，化合物BIO对甘蓝蚜和朱砂叶螨具有很强的活性。这3个化合物为红三叶杀蚜杀螨的活性成分。

表7红三叶活性化合物对桃蚜的触杀活性

表8红三叶活性化合物对桃蚜的LC₅₀值

表9红三叶活性化合物对甘蓝蚜的触杀活性

表10红三叶活性化合物对甘蓝蚜的LC₅₀值

表11红三叶活性化合物对朱砂叶螨的触杀活性

表12红三叶活性化合物对朱砂叶螨的LC₅₀值

从以上实例可知，利用红三叶制备的杀虫剂对蚜虫和螨虫有非常明显的触杀活性，尤其是乙酸乙酯部位，而且制备工艺简单，成本便宜。红三叶作为多功能优良牧草，且为畅销的对人体有益的植物源保健药，在食品安全上具有得天独厚的优势。同时，本发明对其中的活性成分进行了确认，为深入开发和利用提供了理论支持。本发明所制备的的红三叶杀虫剂将在农业生产中具有重要的应用前景。

最后还应指出，任何单位和个人使用或实施本发明的技术方案都是对本发明的侵犯，任何单位和个人未经过本申请人的允许，都不能单独实施本专利。而任何单位和个人受到本发明的启发或经过简单调整而实施，也应认为是本专利的保护范围。

Claims

1.一种植物源杀虫剂在防治蚜虫和螨虫中的应用，其特征在于：所述植物源杀虫剂的主要成分为红三叶提取物的萃取物，主要活性成分为芒柄花素、染料木素和鹰嘴豆芽素A；

所述红三叶提取物的萃取物的制备方法如下：

1）红三叶提取物的制备

采集新鲜红三叶植物地上部位，阴干粉碎后，加入乙醇水溶液，超声或加热回流提取，提取液减压浓缩得浸膏，然后在通风避光处晾干，制得红三叶提取物；

所述乙醇水溶液，加入量是干粉体积的10-50 倍，乙醇水溶液浓度为20-100wt% ；超声或加热回流提取10-90 分钟；

2）红三叶不同活性部位的制备

a. 红三叶石油醚部位萃取物的制备：将红三叶提取物用水溶解，再加入石油醚，剧烈振荡，静置分层，上清液为石油醚层，下层水溶液用石油醚重复萃取2-5 次，合并石油醚层，减压浓缩，制得红三叶石油醚部位萃取物；

b. 红三叶乙酸乙酯部位萃取物的制备：石油醚萃取后的水溶液中加入乙酸乙酯，剧烈振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层水溶液用乙酸乙酯重复萃取2-5 次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，制得红三叶乙酸乙酯部位萃取物；

c. 红三叶水相部位萃取物的制备：将乙酸乙酯萃取后剩余水溶液，减压浓缩，制得红三叶水相部位萃取物；

所述植物源杀虫剂的主要成分为红三叶提取物的乙酸乙酯部位萃取物、石油醚部位萃取物或水相部位萃取物中的一种或两种以上的组合。

2.根据权利要求1所述的植物源杀虫剂在防治蚜虫和螨虫中的应用，其特征在于：所述步骤2）的步骤a 中，红三叶提取物用其2-20 倍体积的蒸馏水溶解。

3.根据权利要求1所述的植物源杀虫剂在防治蚜虫和螨虫中的应用，其特征在于：所述步骤2）的步骤a中，加入红三叶提取物2-10 倍体积的石油醚。

4.根据权利要求1 所述的植物源杀虫剂在防治蚜虫和螨虫中的应用，其特征在于：所述步骤2）的步骤b中，石油醚萃取后的水溶液中加入水溶液2-10 倍体积的乙酸乙酯。