CN107362179A - 一种猴头菌‑地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包衣丸 - Google Patents

一种猴头菌‑地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包衣丸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猴头菌‑地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包衣丸，该制备方法包括以下步骤：将猴头菌‑地龙生物转化物药材粉碎成粉末，加水超声提取，得到超声提取物；将超声提取物过滤，滤液减压浓缩，得到浓缩液；浓缩液中加入乙醇进行醇沉，静置过滤得到沉淀物；将沉淀物进行减压浓缩后，进行喷雾干燥，得到猴头菌‑地龙生物转化物提取物的干浸膏。该制备方法工艺独特，能最大限度地发挥抗凝血药效。同时本发明的猴头菌‑地龙生物转化物提取物体内外抗凝血效果优于地龙、优于逐瘀通脉胶囊、优于脑血栓片、优于脑心通胶囊、优于猴头菌、优于阿司匹林片。而且以该提取物为丸芯制备的结肠定位包衣丸具有较优的释放度。

Description

一种猴头菌-地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包 衣丸
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别是指一种猴头菌-地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包衣丸。
背景技术
猴头菌-地龙生物转化物缩写为HD生物转化物，是在猴头菌的常规培养基中添加一定比例的中药材地龙，在无菌环境下接种猴头菌栽培种，在适宜的温度湿度光照条件下培养，得到猴头菌-地龙生物转化物。血栓性疾病大都是由于血管损伤、血液性质改变和血流淤堵而使不溶性纤维蛋白、血小板等沉积而成，导致血流在血管内壁腔狭窄闭塞或修补处形成血液凝块，使身体内主要脏器或微循环发生梗死，产生缺血缺氧进而引发机能衰竭。动脉血栓可引起心肌梗塞、脑中风等，静脉血栓可能引发肺栓塞，这两种血栓都是导致患者死亡的主要原因。中国心血管病患病率处于持续上升阶段，据目前统计，全国估计有心血管病患者2.9亿，每5个成年人中就有1名心血管病患者，每5例死亡者中就有2例死于心血管疾病，世界卫生组织调查和分析发现：70％的老人最终是死于心脑血栓病，即死于中风和心梗，从中药或天然药物的生物转化物中寻找抗凝血活性有效部位，再进一步研制成新药，系当今新药研发的发展趋势，具有良好的开发应用前景。
HD生物转化物提取物在家兔体外抗凝血试验中，凝血时间较阳性药物肝素(模型下浓度)以及地龙药材水提物凝血时间都要长，并且在SPSS 16.0统计分析软件分析下具有统计意义，表明HD生物转化物提取物具有较强的抗凝活性，提示将猴头菌地龙转化物开发成抗凝血的中药新药具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种猴头菌-地龙生物转化物提取物、制备方法及结肠定位包衣丸，本发明猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法能最大限度地发挥抗凝血药效，以该猴头菌-地龙生物转化物提取物作 为原料制备了结肠定位丸，该结肠定位丸使活性药物实现结肠定位释放的目的，并具有较优的释放度。
基于上述目的，本发明提供的一种猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将猴头菌-地龙生物转化物药材粉碎成粉末，加水超声提取，得到超声提取物；
(2)将超声提取物过滤，滤液减压浓缩，得到浓缩液；
(3)浓缩液中加入乙醇进行醇沉，静置过滤得到沉淀物；
(4)将沉淀物进行减压浓缩后，进行喷雾干燥，得到猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述猴头菌-地龙生物转化物是将猴头菌接种至培养基中，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物转化菌丝体，烘干，即得；所述培养基包括如下重量份的组分：麦麸65～75份，玉米面15～25份，谷糠7～11份，白糖0.8～1.2份，地龙25～150份，水68.75～150份。
在本发明中，优选的，步骤(1)中将猴头菌-地龙生物转化物药材粉碎成10～80目粉末；所述超声提取的次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将猴头菌-地龙生物转化物药材粉末加入水中浸泡12～24小时后，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物，其中，水的重量为猴头菌-地龙生物转化物药材重量的20～30倍；第二次超声提取的步骤为：将第一超声提取物加入水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物，其中，水的重量为第一超声提取物重量的15～25倍。
在本发明中，优选的，步骤(2)中将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液；其中，所述浓缩液与猴头菌-地龙生物转化物药材的重量为1:1；步骤(3)中所述浓缩液中加入乙醇为边加乙醇边搅拌，并使乙醇在浓缩液中的最终含量为60％～75％，所述静置的时间为24小时。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述减压浓缩为在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩至药液密度为1.06～1.13g/ml；所述喷雾干燥的进风温度为120℃～160℃，所述喷雾干燥的泵药浓度为2.00～4.00r/min。
在本发明中，优选的，步骤(4)中所述药液密度为1.06g/ml；所述喷雾 干燥的进风温度为160℃，所述喷雾干燥的泵药浓度为2.00r/min。
进一步，本发明还提供了所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法制备得到的猴头菌-地龙生物转化物提取物。
更进一步的，本发明还提供了一种结肠定位包衣丸，包括丸芯、隔离层、肠溶层和缓释层，所述丸芯包括所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏。
在本发明中，优选的，所述丸芯为猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏和辅料的混合物，所述隔离层为羟丙基甲基纤维素、二氧化钛和第一增塑剂的混合物，所述肠溶层为丙烯酸树脂Ⅱ号、丙烯酸树脂Ⅲ号、第一增塑剂和滑石粉的混合物，所述缓释层为聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ、聚丙烯酸树脂和第二增塑剂的混合物。
在本发明中，优选的，所述辅料为乳糖，所述第一增塑剂为邻苯二甲酸二乙酯，所述第二增塑剂为聚乙二醇6000。
在本发明中，优选的，所述猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏与所述乳糖的质量比为6:1；隔离层中羟丙基甲基纤维素、二氧化钛和邻苯二甲酸二乙酯的质量比为1:2:3，隔离层包衣增重0.5％；肠溶层中丙烯酸树脂Ⅱ号、丙烯酸树脂Ⅲ号、邻苯二甲酸二乙酯和滑石粉的质量比为1:3:2:1.3～1.4，肠溶层包衣增重2％；缓释层中聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ、聚丙烯酸树脂和聚乙二醇6000的质量比为1:2:1，缓释层包衣增重4％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明HD生物转化物提取物的制备方法工艺独特，采用现代化提取技术-超声波提取，可有效的防止抗凝血活性成分提取过程中损失；采用现代化喷雾干燥技术，可有效的防止抗凝血活性成分干燥过程中失去活性；本发明的制备方法能最大限度地发挥抗凝血药效，方便使用，便于推广或工业化(大规模)生产，应用前景良好。
(2)本发明抗凝血活性的HD生物转化物提取物体内外抗凝血效果优于地龙、优于逐瘀通脉胶囊、优于脑血栓片、优于脑心通胶囊、优于猴头菌、优于阿司匹林片。
(3)本发明采用多层包衣使结肠定位包衣丸达到结肠定位的目的，使HD生物转化物提取物主要在结肠段释放，多层包衣既保证了活性成分在胃液中不溶解，又使其不影响药物在结肠液中的释放，提高结肠病变部位的 药物浓度，发挥药物最佳疗效，为HD生物转化物剂型选择及成型工艺研究奠定基础，为药学、药效学、毒理和临床研究提供依据。
附图说明
图1为药液密度(A)和进风温度(B)对APTT值的曲面和等高线图；
图2为药液密度(A)和泵药速度(C)对APTT值的曲面和等高线图；
图3为进风温度(B)和泵药速度(C)对APTT值的曲面和等高线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
以下实施例中涉及到的猴头菌-地龙生物转化物(缩写为HD生物转化物，湖南新汇制药股份有限公司生产，批号：20151203)，采用以下方法制备得到：取农副产品麦麸650～750g、玉米面150～250g、谷糠70～110g、白糖8～12g，以及中药材地龙粗粉(地龙)250～1500g，混匀，加入687.5～1500g水拌匀，既得菌丝体培养基，再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20～27℃条件下菌丝体转化培养30～40天，取出生物转化菌丝体，烘干，即得HD生物转化物。
实施例1体外抗凝血试验操作方法及体外抗凝血量效关系试验
1.1仪器与试剂
(1)试剂：APTT试剂(批号：201256)；PT试剂(批号：201256)；柠檬酸钠(AR)；(2)仪器：AYW8002半自动凝血分析仪(南京瑞麦科技开发有限公司)
1.2试液的配制
(1)PT溶液配制：按说明书要求每一小瓶冻干粉加入2mL PT缓冲溶液(购买时配带的，已经配制好的)，摇匀。(2)APTT溶液：购买时配带的，已经配制好的。(3)氯化钙试液：购买时配带的，已经配制好的。
1.3血浆的制备
人血浆的制备：用含3.8％柠檬酸钠的采血真空管收集人全血(全血：3.8％柠檬酸钠＝9:1)，摇匀，2500r/min离心10min，用滴管收集上层黄色液体，即血浆，分装成数管，密封，放入-20℃冰箱冷冻保存，用时解冻。
1.4测试液的制备
1.4.1样品液的制备
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液；
(3)在浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％～75％，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物；
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度达设定值后，进行喷雾干燥，得到HD生物转化物提取物的干浸膏。
将HD生物转化物提取物的干浸膏溶于生理盐水中，分别得到浓度为0.5007g/mL的样品一、浓度为0.4g/mL的样品二、浓度为0.3g/mL的样品三、浓度为0.2g/mL的样品四、浓度为0.1g/mL的样品五、浓度为0.05g/mL的样品六、浓度为0.03g/mL的样品七。
1.4.2空白血浆的制备
用含3.8％柠檬酸钠的采血真空管收集人全血(全血：3.8％柠檬酸钠＝9:1)，摇匀，2500r/min离心10min，用滴管收集上层黄色液体，即血浆，分装成数管，密封，放入-20℃冰箱冷冻保存，用时解冻。取生理盐水5μL置于245μL血浆中，摇匀，即得。
1.5血浆与样品液的混合
取1mL样品液，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取5μL样品液，加入245μL血浆，用涡流混匀器振荡混合30秒，备用。
1.6体外抗凝血试验仪器操作(测PT、APTT检测步骤)
1.6.1体外抗凝血试验仪器操作方法
(1)开机后仪器先自检(两个通道同时测)
(2)选择界面：
按“1”进入检测定标，A通道即打开，再按“1”选择PT，进入PT界面；然后按“开始”键，打开B通道，再按“4”选择APTT，进入APTT界面。
(3)选择试剂：
①吸取200μL PT试剂置入一支比色杯中，放入预温孔，预温3min～5min；
②吸取100μL APTT试剂和100μL待测含药或含生理盐水的血浆，置入另一支比色杯中，混匀5秒钟。放入预温孔，预温3min～5min。
(4)测定过程
预温时间到①将装有PT试剂的比色杯插入“检测孔A”，②将装有APTT试剂及血浆混合液的比色杯插入“检测孔B”，按“确认”键，等待屏幕出现“等待测量”显示字样，当对应A孔灯闪烁时，在A比色杯中(含PT试剂)加入100μL已预温的待测含药血浆，当对应B孔灯闪烁时，加入100μL已预温的氯化钙试液，等待结果。
(5)打印结果：测试完毕，按“开始”键，打印结果(不带波形图)。
1.6.2体外抗凝血试验PT及APTT测定结果
按上述方法测定各样品液PT和APTT，结果见表1。
表1HD转化物水提浸膏体外抗凝血量效关系试验结果
对表1中APTT结果进行线性回归，得HD生物转化物提取物体外抗凝血量效关系为：Y＝29.80+252.2X,R2＝0.9971,F＝1374,P＝0.0001。
结果可知，HD生物转化物提取物浓度在0.03g/mL～0.3g/mL(相当于生药量0.15g/mL～1.5g/mL)有良好的体外抗凝血量效关系，呈线性相关，浓度越高，体外抗凝血活性越强。而PT进行线性回归，无相关性，即体外抗凝血活性无量效关系。同时考察了仪器精密度、测定方法的重复性、稳定性，结果发现仪器精密度RSD％＝3.62％(n＝6)，测定方法重复性RSD％＝4.55％(n＝6)，供试样品液在104min内检测完毕。考虑研究成本，可选最常用最典型最稳定最价廉的APTT作为抗凝血活性评价指标。
实施例2抗凝血活性的HD生物转化物提取物制备工艺优选试验
1.1HD生物转化物不同提取溶剂体外抗凝血效果比较试验
在本部分中，采用不同的提取溶剂(水及不同体积分数的乙醇)进行超声提取，然后过滤，滤液减压浓缩得到浓缩液，考察不同的浓缩液体外抗凝血效果。
1.1.1HD生物转化物不同提取溶剂样品液的制备
1.1.1.1HD生物转化物水提取样品液的制备
HD生物转化物水提取样品液的制备方法包括以下步骤：
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液。
1.1.1.2HD生物转化物30％乙醇提取样品液的制备
HD生物转化物30％乙醇提取样品液的制备方法包括以下步骤：
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的30％(体积分数)乙醇中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的30％(体积分数)乙醇中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液。
1.1.1.3HD生物转化物50％乙醇提取样品液的制备
HD生物转化物50％乙醇提取样品液的制备方法与HD生物转化物30％乙醇提取样品液的制备基本相同，区别步骤在于：将HD生物转化物药材粉末用50％乙醇超声提取两次。
1.1.2不同提取溶剂样品液体外抗凝血试验测定结果
将上述各样品液(1.0g/mL)取5μL，加入245μL血浆(血浆的制备方法参照实施例1)，用涡流混匀器振荡混合30秒，备用。空白对照的制备：取生理盐水5μL置于245μL血浆中，摇匀，即得。按照实施例1的方法测定各样品液PT和APTT，结果见表2。
表2人血浆HD转化物不同提取溶剂体外抗凝血试验测定结果(n＝3)
对表2结果采用完全随机t检验LSD法，结果见表3。
表3人血浆HD转化物不同提取溶剂体外抗凝血试验APTT和PT方差分析表
由表3结果可知，各组HD转化物不同提取溶剂PT无统计意义，而APTT有统计意义，再进一步进行两两比较的LSD检验，结果见表4。
表4APTT用LSD法多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)
由表4结果可知，以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：30％醇提≈水提；水提＞50％醇提＞空白对照；30％醇提＞50％醇提＞空白对照；因水提比30％醇提成本更低，故选取水作为超声提取溶剂。
1.2HD生物转化物水提醇沉体外抗凝血效果比较试验
根据步骤1.1的试验结果，选取水作为超声提取试剂。在本部分中，采用不同的体积分数的乙醇溶液进行醇沉，然后过滤，分别取沉淀物和上清液，考察不同的沉淀物和上清液体外抗凝血效果。
1.2.1HD生物转化物水提醇沉分离样品的制备
1.2.1.1水提浓缩液的制备
水提浓缩液的制备包括以下步骤：
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的50％(体积分数)乙醇中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的50％(体积分数)乙醇中在40～50℃下 进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，将浓缩液均分成6份。
1.2.1.2水提浓缩液醇沉上清液样品的制备
(1)30％醇沉沉淀物和30％醇沉上清液的制备
在第一份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达30％(体积分数)，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物和醇沉上清液，沉淀物由于量较少，附在滤纸上一并保存，将滤纸剪碎，加入生理盐水超声溶解5min，倾斜过滤，洗涤滤纸，合并滤液和洗液定容至10mL，取1mL过0.45μm微孔滤膜，浓度为2.5g/mL，即得30％醇沉沉淀物；
醇沉上清液45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，相当于生药量1g/mL，取1mL醇沉上清液浓缩液，过0.45μm微孔滤膜，即得30％醇沉上清液。
(2)40％醇沉沉淀物和40％醇沉上清液的制备
40％醇沉沉淀物的制备方法与30％醇沉沉淀物的制备方法基本相同，区别在于，在第二份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达40％(体积分数)，其余步骤相同。40％醇沉上清液的制备方法与30％醇沉上清液的制备方法相同。
(3)50％醇沉沉淀物和50％醇沉上清液的制备
50％醇沉沉淀物的制备方法与30％醇沉沉淀物的制备方法基本相同，区别在于，在第三份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达50％(体积分数)，其余步骤相同。50％醇沉上清液的制备方法与30％醇沉上清液的制备方法相同。
(4)60％醇沉沉淀物和60％醇沉上清液的制备
60％醇沉沉淀物的制备方法与30％醇沉沉淀物的制备方法基本相同，区别在于，在第四份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％(体积分数)，其余步骤相同。60％醇沉上清液的制备方法与30％醇沉上清液的制备方法相同。
(5)70％醇沉沉淀物和70％醇沉上清液的制备
70％醇沉沉淀物的制备方法与30％醇沉沉淀物的制备方法基本相同，区别在于，在第五份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达70％(体积分数)，其余步骤相同。70％醇沉上清液的制备方法与30％醇沉上清液的制备方法相同。
(6)75％醇沉沉淀物和75％醇沉上清液的制备
75％醇沉沉淀物的制备方法与40％醇沉沉淀物的制备方法基本相同，区别在于，在第六份水提浓缩液中加95％乙醇使含醇量达75％(体积分数)，其余步骤相同。75％醇沉上清液的制备方法与30％醇沉上清液的制备方法相同。
1.2.2体外抗凝血试验PT及APTT测定结果
精密吸取5μL上述样品液，置于245μL血浆中，振动摇匀，用涡流混匀器振荡混合30秒，立即测定。空白对照的制备：取生理盐水5μL置于245μL血浆(血浆的制备方法参照实施例1)中，摇匀，即得。按照实施例1的方法测定各样品液APTT，结果见表5。
表5HD转化物水提醇沉分离样品体外抗凝血试验测定结果(n＝3)
对表5结果采用完全随机t检验LSD法，结果见表6。
表6HD转化物水提醇沉分离样品体外抗凝血试验APTT和PT方差分析表
由表6结果可知，以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱沉淀物为：70％醇沉淀物＞75％醇沉淀物＞60％醇沉淀物＞50％醇沉淀物＞60％醇沉淀物＞40％醇沉淀物≈30％醇沉淀物＞生理盐水。
滤液为：30％醇沉上清液≈40％醇沉上清液≈50％醇沉上清液＞75％醇沉上清液≈70％醇沉上清液≈生理盐水≈60％醇沉上清液，此结果表明，醇沉浓度达70％时，醇沉淀物抗凝血活性最强，醇沉浓度超过50％，醇沉上清液抗凝血活性与生理盐水相当。说明抗凝血活性成分集中在60％～75％醇沉淀物中，可判断HD抗凝血活性成分系不溶于60％～75％乙醇的水溶性大分子成分。
1.3HD生物转化物不同干燥方法体外抗凝血效果比较试验
根据步骤1.2和步骤1.3的试验结果，选取水作为超声提取试剂，并选取 60％～75％的醇沉淀物，本部分以体外抗凝血活性(APTT)为评价指标，采用响应面设计试验优化喷雾干燥工艺参数，探讨了喷雾干燥、常压干燥、减压干燥三种干燥方法对HD生物转化物水提浓缩液抗凝血活性的影响，优选其最佳干燥方法。
1.3.1HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺响应面设计试验研究
1.3.1.2HD生物转化物药材提取浓缩液的制备
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液；
(3)在浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％～75％，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物；
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度达设定值后，进行喷雾干燥，得到HD生物转化物提取物的干浸膏。
1.3.1.3HD药材提取液喷雾干燥工艺响应面设计试验法因素水平表
预试验对HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺进行单因素考察，在此基础上优化关键工艺参数，即药液密度、进风温度、泵药速度，采用三因素三水平Box-Bebnken设计的响应面设计试验法筛选最优喷雾干燥工艺参数，以APTT值为评价指标，各因素水平见表7。
表7HD药材提取液喷雾干燥响应面设计试验因素水平表
按表8安排实验，表8中共有13个试验点，其中包括12个析因点，1个零点，析因点取值于药液密度(A)、进风温度(B)和泵药速度(C)为自变量构成的顶点，零点为曲面的中心点，其中零点试验重复1次，用以计算试验误差。
表8HD药材提取液喷雾干燥响应曲面试验设计及APTT测定结果
1.3.1.4模型的建立及显著性分析
利用Design Expert 8.0软件对表8试验数据进行二次回归拟合，得APTT值对药液密度(A)g/mL、进风温度(B)℃、泵药速度(C)r/min的二次多项回归模型方程为：APTT＝+2050.54-3920.92×药液密度+1.991×进风温度+11.78×泵药速度-1.046×药液密度×进风温度-24.57×药液密度×泵药速度-0.0575×进风温度×泵药速度+1876.53×药液密度2-2.328E-003×进风温度 2+3.331×泵药速度2
对该模型进行显著性检验，结果见表9。“模型F值”为0.83意味着模型相对于噪音是不显著的。存在63.59％的可能性：这种大的“模型F值”可以因噪音而出现。
表9回归模型方差分析
总之，该模型对分析和预测HD药材提取液喷雾干燥工艺参数有一定意义。
1.3.1.5HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺各因素对加强指数影响的曲面分析结果
利用Design-Expert 8.0软件对数据进行处理得到曲面分析结果见图1-图3。从回归方程各项方差的进一步检验也可以看出，在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：泵药速度＞药液密度＞进风温度。
1.3.1.6HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺条件优化结果
采用程序Design-Expert 8.0软件对方程APTT求解，得到HD药材提取浓缩液喷雾干燥最优工艺参数为：药液密度1.06g/mL，进风温度159.99℃，泵药速度2.00r/min，理论APTT值为50.73。
1.3.1.7验证试验结果
对工艺所得到的优化条件进行微调：药液密度1.06g/mL，进风温度160℃，泵药速度2.00r/min，采用上述优化喷雾干燥条件进行HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺验证试验，重复三次，见表10。
表10HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺优化参数响应面设计验证试验
采用DPS 9.5版数据处理系统统计分析可知，重复三次相互间无统计学意义(P＝0.5392)，两两间比较亦无统计学意义(第一次与第二次P＝0.4604、第一次与第三次P＝0.2896、第二次与第三次P＝0.7314)，说明喷雾干燥工艺成熟、稳定、重复性好。三次试验实际测得APTT总平均值为49.34±4.3529，与理论值接近，所以基于响应曲面法所得的优化喷雾干燥工艺参数可供参考。
HD提取浓缩液喷雾干燥工艺研究除了以APTT为评价指标外，还同时以干浸膏粉重量为评价指标，响应曲面设计试验结果表明：以APTT为评价指标得药液密度1.06g/mL，以干浸膏粉重量为评价指标得药液密度1.13g/mL，进风温度皆为160℃，泵药速度皆为2.00r/min，最终取药液密度1.06g/mL进行验证试验，是因为：药液密度达1.13g/mL时，需要浓缩很长时间，导致HD抗凝血活性损失，另一方面，药液密度达1.13g/mL时，黏度大，易堵喷嘴(因药液中含有大量多糖等黏性成分)，故药液密度不宜高，只要能顺利喷雾干燥即可。实际生产上HD药材提取浓缩液喷雾干燥工艺条件可确定为：药液密度1.06g/mL，进风温度160℃，泵药速度2.00r/min。
1.3.2HD药材提取浓缩液常压干燥、减压干燥和喷雾干燥抗凝血活性比 较
1.3.2.1HD药材提取液常压干燥样品的制备
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液；
(3)在浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％～75％，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物；
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度1.35，置干燥箱中50℃常压干燥至含水量5％，保存于干燥器内。
1.3.2.2HD药材提取液减压干燥样品的制备
HD药材提取液减压干燥样品的制备方法中步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)与HD药材提取液常压干燥样品的制备方法中步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)相同，只有步骤(4)不同，具体为：
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度达1.06后，0.1MPa减压干燥至含水量5％，保存于干燥器内。
1.3.2.3HD药材提取液喷雾干燥样品的制备
HD药材提取液喷雾干燥样品的制备方法中步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)与HD药材提取液常压干燥样品的制备方法中步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)相同，只有步骤(4)不同，具体为：
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度达1.06后，调节进风温度160℃，泵药速度2.00r/min，喷雾干燥成干浸膏粉(含水量约5％)，保存于干燥器内。
1.3.2.4抗凝血供试品溶液的制备
分别取常压干燥、减压干燥和喷雾干燥各样品的干浸膏粉(因三种样品置同一干燥器内，故含水量一致)约1.0克，精密称定，加一次蒸馏水溶解并定 容至10mL，即得0.1g(干浸膏粉)/mL的抗凝血供试品溶液。
1.3.2.5HD药材提取浓缩液三种干燥方法抗凝血试验(APTT)结果
将常压干燥、减压干燥和喷雾干燥供试品溶液进行抗凝血试验结果见表11、方差分析见表12、LSD法多重比较(两两比较)见表13。
表11HD药材提取浓缩液三种干燥方法抗凝血试验(APTT)结果
表12HD药材提取浓缩液三种干燥方法抗凝血试验(APTT)方差分析表
表13HD药材提取浓缩液三种干燥方法抗凝血试验(APTT)两两比较表
注：LSD法多重比较(下三角为均值差,上三角为显著水平)，LSD05＝5.737，LSD01＝7.881
由表11、表12、表13可知，HD药材提取浓缩液三种干燥方法抗凝血活性(APTT)有显著的统计学意义(P＝0.013)，喷雾干燥与减压干燥有显著的统计学意义(P＝0.0085)，喷雾干燥与常压干燥有统计学意义(P＝0.0367)，而减压干燥与常压干燥无统计学意义(P＝0.5708)，喷雾干燥＞常压干燥≈减压干燥。故在工业化生产中，HD药材提取液采用喷雾干燥法制备HD生物转化物药材干浸膏粉为佳。
HD生物转化物对热极为敏感，前期单因素考察和响应曲面设计试验结果皆表明，提取、浓缩、常压干燥、减压干燥的温度若超过50℃，抗凝血活性明显下降，故目前生产上采用冷冻干燥，但不论是常压干燥(144小时左右)、减压干燥(96小时左右)，还是冷冻干燥皆需干燥很长时间(72小时左右)，生产效率极低，本实施例对HD提取浓缩液采用喷雾干燥，不但抗凝血活性优于常压干燥和减压干燥，而且生产效率大大提高，因喷雾干燥系瞬间干燥，只需几秒钟即可完成干燥过程，喷雾干燥粉的抗凝血活性等同于HD提取浓缩液的抗凝血活性(P＝0.837)，即从HD提取浓缩液到喷雾干燥粉抗凝血活性几乎没有多少损失。
实施例3HD生物转化物提取物药效对比验证试验
1.1HD生物转化物与地龙和猴头菌等药品体内抗凝血效果比较试验
1.1.1实验对象
健康家兔28只(体重2.5±0.5kg，雌雄各半)，由湖南中医药大学实验动物中心提供，饲养条件规范，空调恒温，有级别、有动物合格证号。
1.1.2试验样品组设计及样品液的制备
(1)样品液制备方法
①猴头菌地龙转化物水提液的制备
将猴头菌地龙转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将药材粉末加入20～30倍药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩至相当于生药材量0.1g/mL药液。
②猴头菌地龙转化物水提醇沉淀水溶液的制备
将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1；在浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％～75％，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物，加蒸馏水溶解，制成相当于生药材量0.1g/mL的药液。
③地龙药材水提液的制备
地龙药材水提液的制备方法与猴头菌地龙转化物水提液的制备方法基于相同，区别在于，将地龙药材粉碎成10～80目的粉末，其余步骤均相同。
④猴头菌药材水提液的制备
猴头菌药材水提液的制备方法与猴头菌地龙转化物水提液的制备方法基于相同，区别在于，将猴头菌药材粉碎成10～80目的粉末，其余步骤均相同。
⑤中成药对照品—逐瘀通脉胶囊混悬液的制备
取16粒逐瘀通脉胶囊内容物，约3.2克，研成约100目细粉，加20倍量含0.5％羧甲基纤维素钠的蒸馏水溶液(64mL)，研磨分散，混匀制成50mg/mL的逐瘀通脉胶囊混悬液。
⑥化学成药对照品—华法林钠片混悬液的制备
取华法林钠片20片(2.5mg/片×20片＝50mg)，即50mg，研成约100目细粉，加50mL含0.5％羧甲基纤维素钠的蒸馏水溶液，研磨分散，混匀制成1mg/mL的华法林钠片混悬液。
⑦生理盐水对照品的制备
取氯化钠45克，加蒸馏水5000mL，搅拌使溶解，即得0.9％氯化钠溶液。
(2)试验样品组及给药量设计
①猴头菌地龙转化物水提液
按地龙药材《药典》给药量，即人用量5克/日折算成家兔量。
每日每kg人用量折算成家兔量：5/60×3.27＝0.2725g＝272.5mg，3kg家兔日给药量：272.5×3＝817.5mg＝0.8175g≈0.82g(每只家兔灌胃量)，将猴头菌地龙转化物水提液制成浓度为0.1g/mL，每只家兔灌胃8.2mL。
②猴头菌地龙转化物水提70％乙醇沉淀水溶液
将猴头菌地龙转化物水提70％乙醇沉淀水溶液制成浓度为0.1g/mL，每只家兔灌胃8.2mL。
③地龙药材水提液
将猴头菌地龙转化物水提液制成浓度为0.1g/mL，每只家兔灌胃8.2mL。
④猴头菌药材水提液
将猴头菌地龙转化物水提液制成浓度为0.1g/mL，每只家兔灌胃8.2mL。
⑤中成药对照品(逐瘀通脉胶囊)
逐瘀通脉胶囊每粒0.2g，一次2粒，一日3次，一日6粒，一日1.2g，每人每kg用药量：1.2/60＝20mg(即人用量为20mg/kg)，换算成家兔用量：20×3.27＝65.4mg/kg，3kg家兔日给药量：65.4×3＝196.2mg(每只家兔灌胃量)，配制50mg/mL的逐瘀通脉胶囊混悬液，3kg家兔用药量约3.924mL≈4mL。
⑥化学成药对照品(华法林钠片，规格5mg/片，用法用量见说明书)
每片含华法林钠约2.5mg，按每人每日4mg计算，每人每日单位体重给药量：4mg/60kg＝0.067mg，换算成家兔用量：3.27×0.067mg＝0.218mg/kg/日，3kg家兔日给药量：0.218×3＝0.654mg(每只家兔灌胃量)，配制1mg/mL的华法林钠片混悬液，3kg家兔每日用药量约0.654mL≈0.65mL。
⑦生理盐水对照品(0.9％氯化钠溶液)
3kg家兔每日用药量约8.2mL。
1.1.3家兔体内抗凝血活性实验方案
取家兔28只，体重2.5±0.5kg，雌雄各半，随机分为生理盐水组(对照组)4只、猴头菌地龙转化物水提70％乙醇沉淀水溶液组6只、猴头菌地龙转化物水提液组6只、地龙药材水提液组6只、猴头菌药材水提液组4只、中成药对照品—逐瘀通脉胶囊混悬液组4只、化学成药对照品—华法林钠片混悬液组4只，共7组，每组4只～6只，灌胃给药5天，每组剂量按临床人用量折算成家兔量。在给药的第3、5天的灌胃给药后30min～40min时间内静脉取血(或兔耳中央动脉取血)，以3.8％的枸橼酸钠1:9抗凝血后，3000r/min离心15min～20min，取上层血浆分别测定血浆凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。
1.1.4各组家兔体内抗凝血活性实验结果及统计处理
(1)各组家兔体内抗凝血活性实验结果
将各组家兔体内抗凝血活性实验结果汇总，见表14。
表14体内抗凝血活性数据统计学处理结果表(n＝6)
注：PT、APTT数据方差分析显示：P＝0.0001，有高度统计学意义。
由LSD法多重比较体内APTT结果可知，华法林钠和HD转化物与各组差异显著(P＝0.0001)，地龙组与逐瘀通脉组(P＝0.0018)有显著差异，生理盐水组和每组(除猴头菌组外)都有显著差异(P＜0.001)，各组家兔体内抗凝血活性APTT由强到弱顺序大致为：
华法林钠片＞HD生物转化物＞地龙≈逐瘀通脉胶囊＞生理盐水≈猴头菌。
由LSD法多重比较体内PT结果可知，华法林钠和HD转化物与各组差异显著(P＝0.0001)各组家兔体内抗凝血活性PT由强到弱顺序大致为：
华法林钠片＞HD生物转化物＞地龙≈逐瘀通脉胶囊≈猴头菌≈生理盐水。
综上所述APTT和PT抗凝血活性结果，HD生物转化物体内抗凝血活性大致为：
华法林钠片＞HD生物转化物＞地龙≈逐瘀通脉胶囊＞生理盐水≈猴头菌。
1.2HD生物转化物与地龙和猴头菌等药品体外抗凝血活性试验
(1)样品液的制备
①HD水提、HD水提醇沉、地龙、猴头菌样品液的制备
制备方法同1.1部分的体内实验，但药液浓度皆为0.5g/mL。
②中成药对照品—逐瘀通脉胶囊混悬液的制备
制备方法同1.1部分的体内实验，药液浓度同体内实验，即50mg/mL。
③化学成药对照品—华法林钠片混悬液的制备
制备方法同1.1部分的体内实验，药液浓度同体内实验，即1mg/mL。
(2)样品液与血浆的混合
取5μL样品液，加入245μL血浆，用涡流混匀器振荡混合10秒，备用。
(3)体外抗凝血血试验测定结果
按实施例1的方法测定各样品液PT和APTT，结果见表15。
表15体外抗凝血活性数据统计学处理结果表(n＝5)
注：PT、APTT数据方差分析显示：P＝0.0001，有高度统计学意义。
由LSD法多重比较体外APTT结果可知，HD生物转化物组及地龙组和各组都有显著差异(P＜0.05)，各组体外APTT抗凝血活性由强到弱顺序大致为：
HD生物转化物＞地龙＞猴头菌≈华法林钠片≈生理盐水≈逐瘀通脉胶囊。
由LSD法多重比较体外PT结果可知，HD转化物与各组差异显著(P＜ 0.05)，猴头菌与生理盐水(P＝0.0453)及逐瘀通脉组(P＝0.0033)差异显著，地龙和逐瘀通脉组差异显著(P＝0.0119)，HD各组体外PT抗凝血活性由强到弱顺序大致为：
HD生物转化物＞地龙≈猴头菌≈华法林钠片≈生理盐水≈逐瘀通脉胶囊。
综上所述APTT和PT抗凝血活性结果，HD生物转化物体外抗凝血活性大致为：
HD生物转化物＞地龙＞猴头菌≈华法林钠片≈生理盐水≈逐瘀通脉胶囊。
实施例4结肠包衣丸制备工艺研究
1.1HD生物转化物提取物的制备及吸湿性考察
(1)将HD生物转化物药材粉碎成10～80目的粉末，加水超声提取两次，第一次超声提取：将HD生物转化物药材粉末加入20～30倍HD生物转化物药材重量的水中先浸泡12～24小时，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物；第二次超声提取：将第一超声提取物加入15～25倍第一超声提取物重量的水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物；
(2)将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液，浓缩液与HD生物转化物药材的重量为1:1，即得1.0g/mL的样品液；
(3)在浓缩液中加95％乙醇使含醇量达60％～75％，边加乙醇边搅拌使分散均匀，将每份样品置2℃，静置24小时，过滤得到醇沉沉淀物；
(4)将沉淀物在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下进行减压浓缩至药液密度达设定值后，进行喷雾干燥，得到HD生物转化物提取物的干浸膏。
先对干浸膏进行吸湿性考察，即配制不同湿度环境的溶液，测定HD生物转化物干浸膏粉样品在不同湿度环境溶液中的吸湿速度及计算HD干浸膏粉临界相对湿度(CRH)，为成型工艺研究提供环境的相对湿度和操作时间。试验结果表明，HD生物转化物干浸膏粉制剂环境的相对湿度应控制在50.84％以下，暴露时间不超过9.937h；或相对湿度控制在68.12％以下，暴露时间不超过6.810h，才能保证HD干浸膏粉吸湿率控制在5％以下，不影响制剂贮存及成型。
1.2丸芯处方与工艺研究
HD生物转化物结肠定位包衣丸的丸芯应在到达结肠后能迅速膨胀溶散，在规定时间内释放出药物。丸芯质量直接影响包衣效果，按浓缩丸的质量要求，以丸芯的成型难易、圆整度、水分、重量差异、溶散时限为指标，采用单因素试验筛选赋形剂的种类和用量。对丸芯的制备工艺进行研究，单因素考察辅料种类(乳糖、甘露醇、蔗糖、糊精、淀粉、微晶纤维素)和比例(4:1，6:1，8:1)对于丸芯圆整度、细腻度、软硬度、干燥情况、黏手情况和溶散时限的影响，确定丸芯辅料的种类和比例。
1.2.1人工模拟液(溶散介质)的配制
参照2015版《中国药典》四部(第324页)缓冲液项下：
(1)人工胃液(不加胃蛋白酶)：
用5mL的移液管移取3.8mL浓盐酸，用一次蒸馏水稀释定容至1000mL，摇匀即得人工胃液。用精密pH试纸测得pH＝1.5左右。
(2)人工小肠液：
称取27.22g磷酸二氢钾，用一次蒸馏水溶解定容至1000mL容量瓶中，摇匀，即得0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液。称取4.00g氢氧化钠用一次蒸馏水溶解定容至500mL容量瓶中，摇匀即得0.2mol/L氢氧化钠溶液。移取0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液250mL，加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液118mL，用一次蒸馏水稀释定容至1000mL，摇匀即得人工小肠液。用精密pH试纸测得pH＝6.8左右。
(3)人工结肠液：
称取27.22g磷酸二氢钾，用一次蒸馏水溶解定容之1000mL容量瓶中，摇匀即得0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液。称取4.00g氢氧化钠用一次蒸馏水溶解定容至500mL容量瓶中，摇匀即得0.2mol/L氢氧化钠溶液。取0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液250mL，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液212mL，用一次蒸馏水稀释定容至1000mL，摇匀即得人工结肠液。用精密pH试纸测得pH＝7.6左右。
1.2.2丸芯赋形剂种类的选择
由于HD生物转化物喷雾干燥浸膏粉较黏，制丸时理论上应用高浓度乙醇，但有效成分系多肽类化合物，高浓度乙醇易导致其失活，前期研究表明，乙醇浓度不易超过30％，经预试采用30％乙醇和蒸馏水作为润湿剂皆可行，考虑成本，故采用蒸馏水作为润湿剂，由于浸膏粉水溶性好，因 此不需要加入崩解剂，仅仅用HD生物转化物喷雾干燥浸膏粉制丸不易成型，故需要加入稀释剂使成型即可。
疏水性稀释剂使溶散时间延长，适用于缓释制剂，本原料适合用亲水性稀释剂，故以丸芯的成型难易、圆整度、溶散时限为指标，选用常用的稀释剂，即乳糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉、糊精、蔗糖，先固定干浸膏粉与稀释剂比例，通过单因素考察比较，筛选稀释剂种类，具体方法如下：
称取干浸膏80克，辅料20克(药物：辅料＝4:1)，混匀，加适量蒸馏水制软材，制成软硬度适中的丸块，搓条，分粒，滚圆，每粒0.62克(含干浸膏0.5克)，常压鼓风干燥至含水量≤15％，评价指标溶散时限参照2015版《中国药典》四部，崩解时限检查法，在人工结肠液中进行溶散时限试验；丸芯的成型难易(包含细腻度、黏手情况、软硬度、干燥情况)、圆整度为主观评价指标，采用等级一致性检验，由好至差排列成6～1个等级，结果如表16，溶散时限试验结果见表17～19。
表16稀释剂种类等级一致性检验分析
注：(1)细腻度：指丸芯的光滑度，丸芯越细腻光亮，评分越高，制软材时眼看手摸其均匀细腻度逐级评分，由细腻至不细腻排列成6～1个等级。
(2)黏手情况：制软材时粘连于手中的软材量越少，评分越高，由黏至不黏排列成1～6个等级。
(3)软硬度：制软材时软材越硬，越不易塑形，不利于浸膏与辅料的混合，越软则不易成型，软材的软硬度由适中到不适中排列成6～1个等级。
(4)干燥情况：指丸芯滚圆之后容易吸湿导致丸芯表面潮湿易粘连，不干爽的情况，此现象导致干燥过程长，且在干燥过程中容易软化变形，不利于包衣，评分越高，说明此现象越不容易发生，由干爽到潮湿排列成6～1个等级。
(5)圆整度：丸芯应呈圆球状，干燥后观察其形状进行评分，形状越规整圆滑，评分越高，由圆到不圆排列成6～1个等级。
将表1中的数据代入公式S＝∑Ri 2-(∑Ri)2/n及χ2＝12S/mn(n+1)中，对本实验m＝5，n＝6，得S＝274，χ2＝15.66，因为υ＝5，查卡方检验临界值表χ2 0.05(5)＝11.07，由于χ2＞χ2 0.05(5)，因而P＜0.05，检验结果有统计学意义，可以认为其等级有一致的倾向，由实验结果可知，以乳糖的Ri值最大，优 于其他稀释剂，各方面指标最好。
表17稀释剂种类溶散时限考察表(n＝3)
表18稀释剂种类溶散时限方差分析
表19稀释剂溶散时限LSD法两两比较
由表17～表19可知，本部分所考察的辅料皆符合2015版《中国药典》四部通则0921崩解时限检查法项下规定：浓缩丸应在2h以内溶散，但不同稀释剂之间溶散时限差别有高度统计学意义(P＝0.0001)。由表19可知，除淀粉和糊精(P＝0.073)、淀粉和微晶纤维素(P＝0.416)、乳糖和甘露醇(P＝0.118)之间无统计学意义外，其他两两之间都有高度统计学意义(P＝0.0001)，因此考虑稀释剂为乳糖或者甘露醇，后续的实验中发现以甘露醇为辅料进行包衣时，丸芯在吹风机加热的情况下极易软化粘连成团，估计甘露醇与HD干浸膏有相互作用(配伍禁忌)，因此综合考虑主观评价指标和溶散时限，因此选择乳糖作为稀释剂。
1.2.3丸芯稀释剂比例的考察
以制剂能成型的前提下，辅料越少越好的原则，称取干浸膏：乳糖＝4:1，6:1，8:1(8:1时制丸块已比较粘手，不利于包衣，因此不再考察稀释剂更少的用量)，混匀，加适量蒸馏水至软硬适中的丸块，出条，分粒，滚圆，每粒含干浸膏0.5克，常压鼓风干燥至含水量≤15％，参照2015版《中国药典》四部崩解时限检查法，在人工结肠液中进行溶散时间实验，结果如表20～表22。
表20稀释剂比例考察结果(n＝3)
表21丸芯稀释剂比例溶散时限方差分析
表22丸芯稀释剂溶散时限LSD法两两比较
由表20～表22结果可知，随干浸膏粉比例的增大，溶散时限基本上呈增长的趋势，差异有统计学意义，由表22可知，4:1和8:1有统计学意义(P＝0.0467)，而8:1时制丸块已比较粘手，不利于丸芯成型，因此考虑干浸膏：乳糖＝6:1。
以HD生物转化物提取物干浸膏：乳糖＝6:1(重量比)的比例制备丸芯，将乳糖制成空白丸芯，溶解HD生物转化物提取物干浸膏成分后喷于空白丸芯上。制得的丸芯外观光洁，具有适宜的硬度，复合包衣丸芯的要求。
1.3结肠包衣丸的制备
本实施例采用多层包衣法，由内至外主要分为：隔离层、肠溶层和缓释层。
1.3.1隔离层包衣
先单因素考察隔离层包衣液中增塑剂的种类(分别为吐温20，吐温80，甘油，邻苯二甲酸二乙酯，邻苯二甲酸二丁酯，1,2-丙二醇，聚乙二醇400)，确定一种增塑剂后，再考察该增塑剂的比例(0.5％、1％、3％、6％、10％、15％)，确定隔离层增塑剂的种类和比例，具体方法是：将隔离层包衣液摊涂于玻璃板使其自然干燥后揭下，密闭于相对湿度10％的干燥器内，测定不同时间的失水百分率，比较吸湿速度差别，优选吸湿速度慢的增塑剂的种类和比例。
试验结果表明，质量分数为6％的邻苯二甲酸二乙酯为隔离层最优浓度的增塑剂；隔离层包衣液处方：HPMC(羟丙基甲基纤维素)粉末4g，二氧化钛2g，邻苯二甲酸二乙酯6g，溶于94mL 30％(质量分数)乙醇，隔离层包衣增重0.5％。
1.3.2肠溶层包衣
肠溶层包衣材料需具备耐酸性，即在胃酸环境中不溶解，在小肠环境下能溶解且溶解时间短，不影响缓释层的溶蚀，导致丸芯在升结肠溶散时间延后。丙烯酸类树脂聚合物可以对抗胃酸，丙烯酸树脂Ⅱ号(L型)和丙烯酸树脂Ⅲ号(S型)研究较为成熟，是应用较多的肠溶型材料。丙烯酸树脂Ⅱ号在pH＝6以上的介质中溶解，外观较差，包衣时不易粘连，但是易控制在肠道中的溶解时间；丙烯酸树脂Ⅲ号在pH＝7以上的介质中溶解，光滑细腻，成膜性好，但包衣时易黏腻粘连，因此包衣处方中将两种材料经常混合使用，取两者之长。按照以上设计理念，以不同包衣增重对HD生物转化物水提物(干膏粉)隔离层丸再进行肠溶层包衣，观察肠溶层包衣丸在三种人工模拟液中的溶解情况，经查阅相关文献及反复试验，处方设计如下，实验结果见表23。
基本处方：按丙烯酸树脂Ⅱ号：丙烯酸树脂Ⅲ号＝1:3的比例，称取丙烯酸树脂Ⅱ号0.75g，丙烯酸树脂Ⅲ号2.25g，邻苯二甲酸二乙酯1.5g，滑石粉1g，95％乙醇57mL，研钵中研匀。取包衣隔离层丸(增重0.5％)，再按表23设计的包衣增重进行肠溶层包衣。先将三种人工模拟液37℃恒温保存，取包肠溶衣丸置于人工胃液的溶出杯中，模拟体内转运环境2h，取出再转移至人工小肠液中转运4h，再取出转移至人工结肠液中转运，观察包衣丸的溶蚀和药物释放情况。若在模拟液中包衣丸开始溶解，释放药物，则不必再往后面的模拟液中转移包衣丸。
表23肠溶层包衣丸在三种人工模拟液中的溶解情况
注：开始溶解指肠溶层衣膜破裂，丸芯暴露，开始释放药物。
由表23可知，随着包衣增重的增加，在小肠中的溶蚀时间也延长，包衣增重0.5％时包衣膜较薄，包衣丸在人工胃液中溶解，包衣增重1％时能顺利通过胃，在人工小肠液中5min开始释放药物，考虑到可能会有其他的因素对溶蚀情况造成影响，包肠溶衣宜稍厚些，因此包衣采用增重2％，既不会推迟缓释层的溶蚀，又确保包肠溶衣丸顺畅通过胃。
1.3.3缓释层包衣
缓释层是指能在小肠中溶蚀，待HD生物转化物水提物(干膏粉)包衣丸到达升结肠时缓释层刚好完全溶蚀，暴露出丸芯，缓释层材料目前常用的有丙烯酸树脂类，本实施例选用EudragitRL100(聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ)和EudragitRS100(聚丙烯酸树脂),EudragitRL100制成的包衣膜孔道直径为1μm～5μm，具有高渗透性；EudragitRS100制成的包衣膜孔道直径为0.1μm～0.6μm，具有低渗透性，调节它们之间的比例和包衣增重即可控制衣膜的溶蚀速度和释药速度。按照上述设计理念及查阅相关文献，固定缓释层处方：RL100:RS100＝1：2(RL100 2g，RS100 4g)，增塑剂PEG6000用量为2g，溶解于118mL95％乙醇(95％乙醇密度0.78)中，对HD生物转化物水提物(干膏粉)丸芯进行隔离层、缓释层和肠溶层包衣，观察缓释层不同包衣增重的包衣丸在三种人工模拟液中的溶解情况，处方设计及结果如表24。
表24HD不同增重缓释层包衣丸在三种人工模拟液中的转运情况
由表24可知，增重1％时包衣丸在小肠中已释放药物，包衣增重2％时在结肠中30min即释放药物，考虑到药丸在小肠中转运可能会有延迟的现象，研究表明从口腔到肛门的转运时间为20h～50h(平均35h)，因此选用缓释包衣层增重4％。
1.3.4包衣方法
为防止丸芯粘连，首先包隔离层，再包肠溶层，最外层包缓释层。按照喷雾速度2mL/min～3mL/min，以45℃～50℃温度交替吹冷热风，枪-床距离40cm～50cm，片床温度40℃～45℃，隔离层包衣锅转速30r/min，缓释层和肠溶层包衣锅转速45r/min的包衣工艺参数进行包衣即可。
1.4HD生物转化物水提物(干膏粉)结肠定位包衣丸验证试验
采用表24中的包衣处方对HD生物转化物水提物(干膏粉)丸芯进行结肠定位包衣处方验证试验，重复3批，每批1000克丸芯，见表25。
表25HD生物转化物水提物(干膏粉)丸芯结肠定位包衣验证试验
根据表25的验证试验可知，HD生物转化物水提物(干膏粉)丸芯结肠定位包衣丸基本上能实现体外结肠定位，包衣处方为：隔离层包衣液处方：HPMC粉末4g，二氧化钛2g，邻苯二甲酸二乙酯6g，溶于93mL30％乙醇，包衣增重0.5％；肠溶层包衣处方：按丙烯酸树脂Ⅱ号：丙烯酸树脂Ⅲ号＝1：3的比例，即丙烯酸树脂Ⅱ号0.75g，丙烯酸树脂Ⅲ号2.25g，邻苯二甲酸二乙酯1.5g，滑石粉1g，95％乙醇57mL，包衣增重2％。缓释层包衣处方：EudragitRL100:Eudragit RS100＝1：2(RL100 2g，RS100 4g)，增塑剂PEG6000用量为2g，溶解于118mL 95％乙醇，按照1.3.1项下确定的包衣工艺参数进行包衣，即得结肠定位包衣丸。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将猴头菌-地龙生物转化物药材粉碎成粉末，加水超声提取，得到超声提取物；
(2)将超声提取物过滤，滤液减压浓缩，得到浓缩液；
(3)浓缩液中加入乙醇进行醇沉，静置过滤得到沉淀物；
(4)将沉淀物进行减压浓缩后，进行喷雾干燥，得到猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏。
2.根据权利要求1所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将猴头菌-地龙生物转化物药材粉碎成10～80目粉末；所述超声提取的次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将猴头菌-地龙生物转化物药材粉末加入水中浸泡12～24小时后，在40～50℃下超声提取40～60min，得到第一超声提取物，其中，水的重量为猴头菌-地龙生物转化物药材重量的20～30倍；第二次超声提取的步骤为：将第一超声提取物加入水中在40～50℃下进行超声提取30～50min，得到第二超声提取物，其中，水的重量为第一超声提取物重量的15～25倍。
3.根据权利要求1所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将第一超声提取物和第二超声提取物分别过滤，合并两次滤液，滤液在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩得到浓缩液；其中，所述浓缩液与猴头菌-地龙生物转化物药材的重量为1:1；步骤(3)中所述浓缩液中加入乙醇为边加乙醇边搅拌，并使乙醇在浓缩液中的最终含量为60％～75％，所述静置的时间为24小时。
4.根据权利要求1所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述减压浓缩为在45℃～55℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩至药液密度为1.06～1.13g/ml；所述喷雾干燥的进风温度为120℃～160℃，所述喷雾干燥的泵药浓度为2.00～4.00r/min。
5.根据权利要求4所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述药液密度为1.06g/ml；所述喷雾干燥的进风温度为160℃，所述喷雾干燥的泵药浓度为2.00r/min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的制备方法制备得到的猴头菌-地龙生物转化物提取物。
7.一种结肠定位包衣丸，其特征在于，包括丸芯、隔离层、肠溶层和缓释层，所述丸芯包括权利要求6所述的猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏。
8.根据权利要求7所述的结肠定位包衣丸，其特征在于，所述丸芯为猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏和辅料的混合物，所述隔离层为羟丙基甲基纤维素、二氧化钛和第一增塑剂的混合物，所述肠溶层为丙烯酸树脂Ⅱ号、丙烯酸树脂Ⅲ号、第一增塑剂和滑石粉的混合物，所述缓释层为聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ、聚丙烯酸树脂和第二增塑剂的混合物。
9.根据权利要求8所述的结肠定位包衣丸，其特征在于，所述辅料为乳糖，所述第一增塑剂为邻苯二甲酸二乙酯，所述第二增塑剂为聚乙二醇6000。
10.根据权利要求9所述的结肠定位包衣丸，其特征在于，所述猴头菌-地龙生物转化物提取物的干浸膏与所述乳糖的质量比为6:1；隔离层中羟丙基甲基纤维素、二氧化钛和邻苯二甲酸二乙酯的质量比为1:2:3，隔离层包衣增重0.5％；肠溶层中丙烯酸树脂Ⅱ号、丙烯酸树脂Ⅲ号、邻苯二甲酸二乙酯和滑石粉的质量比为1:3:2:1.3～1.4，肠溶层包衣增重2％；缓释层中聚甲丙烯酸铵酯Ⅰ、聚丙烯酸树脂和聚乙二醇6000的质量比为1:2:1，缓释层包衣增重4％。
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