CN102335184B - 5,6,7,4’-四羟基黄酮及衍生物在制备jak酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，公开了5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用，尤其涉及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂用于制备治疗JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病的药物的应用。本发明所述5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对JAK酪氨酸蛋白激酶发生强烈抑制作用，其酶学结合特性为竞争性抑制；还可以有效地透过细胞膜对JAK/STAT信号转导通路激活产生阻竭，从而抑制淋巴细胞向周边组织分泌细胞因子如干扰素的能力。药理学研究显示，对血管有明显的舒张作用，表明5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物在临床具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用，尤其涉及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂用于制备防治JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病的药物的应用。
背景技术
5，6，7，4’-四羟基黄酮，通用名称为灯盏花乙素苷元，或称野黄芩苷苷元，是目前广泛用于心脑血管疾病的灯盏花素中的主要成分——灯盏花乙素的无糖部分。5，6，7，4’-四羟基黄酮为药用植物灯盏细辛的黄酮有效成分之一。
灯盏细辛(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz)属菊科短亭飞蓬类植物，具有活血化瘀、散寒解表、舒经活络等功效，临床常用于治疗心脑血管疾病。5，6，7，4’-四羟基黄酮既可通过植物提取方式从灯盏细辛等植物中获得，也可通过人工化学方式合成而得。目前对灯盏花(乙)素已进行了较为广泛的药理研究，研究已涉及清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抗菌等多种功效。研究表明，5，6，7，4’-四羟基黄酮具有增加脑、冠状血管血流量，降低血管阻力，抗血小板聚集、红细胞凝聚，降低血液粘稠度等作用。
车庆明报道，对5，6，7，4’-四羟基黄酮在动物体内的药代及动力学进行了研究，认为动物口服5，6，7，4’-四羟基黄酮后的代谢产物为灯盏花乙素，其药动学行为呈非线性，并认为5，6，7，4’-四羟基黄酮口服易 于吸收，与灯盏花乙素相比，其相对生物利用度为301.8％。中国专利CN 1657042A公开了灯盏花乙素苷元在制备治疗或预防脑卒中、心脑血管疾病药物中的应用，中国专利CN 1657061A公开了灯盏花乙素苷元或其药学上可接受的盐类与中、西药组方在治疗或预防心脑血管疾病药物中的应用。但是这些公开的专利申请和其他文献资料，大部分所涉及药效学研究仅为常见的急性脑缺血试验、纤溶酶的影响、血栓形成的影响，未在更新、更有价值的靶点上进行研究。
迄今为止有关5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的更加高效和确切的作用靶点、机制等尚未被发现，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的准确应用有待研究，以便更好、更精准的治疗疾病，而降低不良反应。
缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion)是机体局部组织或器官循环系统出现暂时性供血障碍时发生的一种应急状态，常常伴发于各种缺血性心脑血管系统疾病的发生和发展过程中。缺血/再灌注(I/R)过程可分成两个阶段。第一阶段为瞬时性缺血(Ischemia)，即局部组织出现低氧状态和营养供给不足，导致组织或器官缺血性损伤。第二阶段为再灌注(Reperfusion)，是指缺血组织中循环系统经短暂停滞后再疏通的过程。在再灌注过程中，受损组织内部由于血液循环重建而触发了一系列局部性应急反应。I/R过程中被激活的组织包括血管内壁细胞、血液补体系统和淋巴细胞。被激活的淋巴细胞不但向周边组织释放各种强氧化自由基(NO、H2O2、NO3)和各种炎性因子(干扰素、白介素、肿瘤坏死因子和巨噬细胞刺激因子)，还引发中性粒细胞向周边组织聚集、浸润等炎性反应。另外、被激活的淋巴细胞同时还向周围组织分泌多种影响细胞生长的因子从而诱导周边细胞进入非正常凋亡和坏死过程(参见Coutts SB et al(2003)：Hyperperfusion syndrome：toward a stricter definition.Neurosurgery.53：1053-1058)。因此由再灌注引发的二次损伤的强度远远超过由于缺血导致的损伤，是多种缺血性心脑血管系统创伤疾病发展过程中的主要病理过程，而淋巴细胞的超强活化是再灌注损伤的主要因素之一(参见Hilfiker-Kleiner et al(2006)：MolecularMechanisms in Heart Failure：Focus on Cardiac Hypertrophy，Inflammation，Angiogenesis，and Apoptosis，J.Am.College of Cardiology，48：56-66)。现代医学研究表明，淋巴细胞的活化则主要是通过一组分布细胞膜下的信号转导系统(JAK/STAT)的激活来完成，而通过恰当的药物分子干扰JAK/STAT信号转导系统的激活，可以达到调整或抑制淋巴细胞的过度活化的目的。因此、参与构成JAK/STAT信号转导系统的各种蛋白成为探索新一代治疗各种缺血性心脑血管系统创伤疾病特效药的最新研发靶点(参见Kaminski KA et al(2002)：Oxidativestress and neutrophil activation the two keystones of ischemia/reperfusioninjury.International Journal of Cardiology，86：41-59)。
JAK/STAT是1989年科学家在利用链激酶基因放大技术(PCR)研究真核细胞生长控制机理时偶然发现的(参见Andrew F.W.(1989)：Twoputative protein-tyrosine kinases identified by application ofthe polymerasechain reaction.Proc.Nadl.Acad.Sci.USA，86：1603-1607)。而STAT则是近期在探索细胞介素通过受体干予细胞基因表达机理时发现的一套信号传递系统(参见Kisseleva T.et al，(2002)：Signaling through theJAK/STAT pathway，recent advances and future challenges.Gene.285：1-24.)。整个系统由分布于细胞膜的受体(R)、细胞膜下的酪氨酸蛋白激酶(JAK)和与之紧密结合的信号转递激活蛋白(STAT)组成。JAK酪氨酸蛋白激酶属于非受体型蛋白激酶，分布在细胞膜下。迄今为止，JAK酪氨酸蛋白激酶家族共有四个成员被鉴定出来：JAK1、 JAK2、JAK3和TYK2。与JAK同时被鉴定而出的还有与JAK在结构上密切相连的激酶底物STAT(信号传导和转录活化蛋白，SignalTransducer and Activator of Transcription，STAT)，参见(Murray PJ(2007)：The JAK-STAT Signaling Pathway：Input and Output Integration，Journal of Immunology，178：2623-2629)。在相关的组织和细胞中，受体激活物-受体-激酶信号转递系统共同组成一个精致、有序的信息分析处理中心，使细胞外部的各种刺激信号可以迅速传递至细胞内部，使细胞作出各种积极、准确的应急反应。因此，JAK酪氨酸激酶信号转递系统在维系各种组织、细胞的正常生理功能起到及其重要的作用。然而在异常情况下，由于JAK酪氨酸激酶信号转导通路激活失控也在多种疾病的发生、发展过程中起着关键作用(参见SchindlerCW(2002)：Series Introduction：JAK-STAT signaling in human disease，JClin Invest.109：1133-1137)，如肿瘤、心脑血管疾病、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、白血病、免疫缺陷疾病、移植物抗宿主反应性疾病和过敏反应性疾病的发生发展。
由于天然黄酮类化合物在结构上具有超强抗氧化特点，以及近期关于氧化自由基的形成与诸多疾病发生的内在联系机理被逐一阐明，探讨使用天然黄酮类化合物干预各种与超氧化物过度合成有关的疾症，特别是与I/R密切相关的心脑血管系统疾病治疗理念被重新激活，参见(Akhlaghi and Bandy B(2009)：Mechanisms of flavonoid protectionagainst myocardial ischemia-reperfusion injury，Journal of molecular andcellular cardiology，46：309-317；Larson A.J.et al(2010)：“Quercetin：A Treatment for Hypertension？A Review of Efficacy and Mechanism”，Pharmaceuticals，3：237-250)。作为多种抗心脑血管损伤疾病中药的主要活性成分，天然黄酮类化合物早已成为国内药界研发的重点， 其中最成功的例子是以灯盏花素为核心成分的各种治疗性制剂的开发和临床应用(参见高晨等(2008)：灯盏细辛、灯盏花素注射剂治疗脑梗塞、冠心病、心绞痛的应用情况及影响因素分析中国药房，第19卷(27)：2156-2157)。但是，迄今为止有关灯盏花乙素的更加高效和确切的作用靶点、机制等尚未被发现。
因此，JAK酪氨酸激酶信号传递系统在维系各种组织、细胞的正常生理功能起到及其重要的作用。然而在异常情况下，由于JAK酪氨酸激酶信号转导通路激活失控也在多种疾病(如心脑血管疾病、肿瘤等)的发生、发展过程中起着关键作用。因此，这些激酶以及相应的受体成为当今各大药物研发机构竭力推崇的研究靶点，用以探索、研发针对各种相关疾病特效新药。
发明内容
基于前期研究发现，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物具有强烈的阻断上述信号转导系激活的作用。进一步的实验证明，本发明所述5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物可以直接与特定的JAK酪氨酸蛋白激酶发生专一性结合，并对酶分子发生强大的抑制作用。因此，我们推断上述信号转导系中的重要组成之一的JAK酪氨酸蛋白激酶是5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的攻击靶点。
基于这一发现我们进一步成功地组建了一个精确、高效的药物识别酶筛平台，对5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物进行了筛选，筛选出可抑制JAK酪氨酸蛋白激酶活性的5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物，其结果如式Ⅰ所示：
其中，R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3，所述葡萄糖醛酸结构式如下：
当R1为葡萄糖醛酸，R2为H，对应化合物为灯盏花乙素；
当R1与R2均为H，对应化合物为5，6，7，4’-四羟基黄酮；
当R1与R2均为-CH3，对应化合物为5，6，7，4’-四甲氧基黄酮；
当R1与R2均为-COCH3，对应化合物为4’，5，6，7-四乙酰氧基黄酮；
当R1为H，R2为-COCH3，对应化合物为7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮；
当R1为葡萄糖醛酸，R2为-CH3，对应化合物为4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素。
为了简化，在本发明的说明书中，式Ⅰ所示化合物，其中R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3，也称为5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物，或简称式Ⅰ所示化合物，三者含义相同。
本发明所述5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物，具有很强的JAK酶的抑制作用，而且对细胞也有很强的亲和力，可有效调节JAK/STAT信号转导通路异常。5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物可以对JAK酪氨酸蛋白激酶发生强烈抑制作用，其酶学结合特性为竞争性抑制。5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物还可以有效地透过细胞膜对JAK/STAT信号转 导通路激活产生阻竭，从而抑制淋巴细胞向周边组织分泌细胞因子如干扰素的能力。药理学研究显示，对血管有明显的舒张作用。由此，表明5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物在JAK/STAT信号转导通路异常上具有重大的应用价值。
本发明提供式Ⅰ所示化合物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用；
式Ⅰ中，R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3。所述葡萄糖醛酸结构式如下：
本领域技术人员可根据目的将其灵活应用，如用作实验室研究工具或制备药物。具体的，本发明还提供式Ⅰ所示化合物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂在制备治疗或预防JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病的药物中的用途。根据现有资料，JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病有多种，如肿瘤、自身免疫疾病、心脑血管疾病等。
作为优选，所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为缺血性心脑血管疾病。
作为优选，所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为损伤性心脑血管疾病。
作为优选，所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为肿瘤。
作为优选，所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为白血病。
作为优选，所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为免疫系统疾病。
所述免疫系统疾病为类风湿关节炎、免疫缺陷疾病、移植物抗宿主反应性疾病或过敏反应性疾病。
基于人们目前对JAK/STAT信号转导通路过度激活与I/R损伤的内在联系的认知，我们使用两个最新组建的药选平台酶选模型和细胞模型对5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物进行了系统筛选和研究。我们意外发现5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物具有很强的抑制JAK/STAT信号转导通路中JAK酪氨酸蛋白激酶的活化。
进一步酶模型分析表明5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物可以对JAK酪氨酸蛋白激酶发生强烈抑制作用，其酶学结合特性为竞争性抑制。
使用细胞模型探讨5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对淋巴细胞的功能影响的研究表明，5，6，7，4’-四羟基黄酮也可以有效地透过细胞膜对JAK/STAT信号转导通路激活产生阻竭，从而抑制淋巴细胞向周边组织分泌细胞因子如干扰素的能力。但是带配糖体结构的灯盏花乙素对淋巴细胞向周边组织分泌干扰素的能力的竭制作用很弱，预示5，6，7，4’-四羟基黄酮可能是体内真正起治疗作用的活性分子。
本发明还提供一种防治JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病的药物制剂，由式Ⅰ所示化合物和药学上可接受的辅料组成，在具体实施例中，本发明提供颗粒、软胶囊、冻干粉针、口服液、滴丸、口腔速崩片，经过初步稳定性考察，产品质量基本稳定，可达一年以上。
从目前的研究数据判断，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的临床适应症将包含缺血性心脑血管疾病、损伤性心脑血管疾病、肿 瘤等适应症，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物很有希望成为一种全新的、治疗各种与心脑血管损伤关联的疾病的特效药。
附图说明：
图1示5，6，7，4’-四羟基黄酮及衍生物对酪氨酸激酶JAK3的抑制活性；
图2示剂量范围为0-0.3mM的灯盏花乙素(DZHS-1)和5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)对酪氨酸激酶JAK3抑制率；
图3示灯盏花乙素(DZHS-1)和5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)对酪氨酸激酶JAK2的半数抑制率；
图4示100μM浓度的灯盏花乙素(DZHS-1)和5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)对T-淋巴细胞分泌干扰素能力的抑制；
图5示5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)刺激外周血T-淋巴细胞分泌干扰素的半数抑制率测定；
图6示5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对U46619诱导SD大鼠离体血管BA收缩的舒张作用比较。
具体实施方式：
本发明公开了5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
按照本发明，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物具有强大的激酶抑 制活性。进一步的酶动力学研究表明5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物这一特定的JAK酪氨酸蛋白激酶抑制强度和专一性均高。使用人体外周血T-细胞刺激模型初步证实5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物有调节免疫系统活性的能力，并对T-细胞分泌各种炎性因子有强烈抑制作用。
从目前的研究数据判断，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的临床适应症将包含缺血性心脑血管疾病、损伤性心脑血管疾病、肿瘤等适应症，通过本技术方案的实施，5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物很有希望成为一种全新的、治疗各种与心脑血管损伤关联的疾病的特效药等。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对JAK酶的抑制作用
酶选模型
测定原理：酶选方法是根据Abukhalaf等在1993年报导的经典方法经适当修改而设立(参见Abukhalaf IK，et al(1993)：Protein phosphataseassay using a modification of the P81paper protein kinase assayprocedure.J Biochem Biophys Methods.26：95-104)。实验测定原理为：当在反应体系中有ATP存在时，JAK可以将ATP上的γ磷转移至多肽底物上特定的酪氨酸上。由于反应中使用的ATP的部分γ磷为标记同位素33，能释放出β射线。而参入多肽的γ磷的强度可以通过液闪烁仪精确测定，从而得以确定底物多肽分子磷酸化程度以及酪氨酸蛋白激酶活性。催化实验所用的两种酪氨酸蛋白激酶JAK2、JAK3为杆状病毒(Baculovirus)传染昆虫细胞并表达合成的融合蛋白，表达蛋白经过亲和层析得以纯化，纯度达90％以上。融合蛋白只包含激酶的催化活 性中心部位(JAK2：a.a.828-1132；JAK3：a.a781-1124)，在融合蛋白的氨基端为六个相连的组氨酸残。激酶反应中的底物为一段由十三个氨基酸构成的人工合成多肽，其序列如下：
NH2-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-Leu-Glu-Phe-Tyr-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-COOH。本实验所用JAK2和JAK3均为millipore公司购买，商品名为KinaseProfilerTM的酪氨酸激酶。
5，6，7，4′-四羟基黄酮及其衍生物编号说明：
式Ⅰ中，R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3。
其中，当R1＝葡萄糖醛酸Gluconic acid，R2＝H，对应化合物为灯盏花乙素，编号为DZHS-1；
当R1＝R2＝H，对应化合物为5，6，7，4’-四羟基黄酮，编号为DZHS-2；
当R1＝R2＝-CH3，对应化合物为5，6，7，4’-四甲氧基黄酮，编号为DZHS-4；
当R1＝R2＝-COCH3，对应化合物为4’，5，6，7-四乙酰氧基黄酮，编号为DZHS-6；
当R1＝H，R2＝-COCH3，对应化合物为7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮，编号为DZHS-7；
当R1＝葡萄糖醛酸Gluconic acid，R2＝-CH3，对应化合物为4’，5，6- 三甲氧基灯盏花乙素，编号为DZHS-8。
实验操作：
1、试剂及溶液配置：本专利中所有使用到的化学试剂和5，6，7，4′-四羟基黄酮及其衍生物均为纯度超过99％的纯品。5，6，7，4′-四羟基黄酮及其衍生物用二甲基亚砜(简称DMSO)溶解，配置成20毫摩尔的储液，之后用50％的DMSO将5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物储液稀释至所要的浓度。底物和ATP则用去离子水分别配置成0.25毫摩尔和0.05毫摩尔(33P-ATP比活性：225μCi/μmol)的储液。
2、标准酶反应的终体积为50微升，并包含以下各种反应成分：14ng酪氨酸蛋白激酶，10μM ATP，40μM底物多肽，20mM Hepes，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.02％Brij35，0.02mg/ml BSA，0.1mM Na3VO4，2mM DTT，0.5％DMSO。若进行IC50测定，则反应中还应包含以及0至0.2毫摩尔的待测5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物。
3、待以上各种成分加入到1.5毫升的反应管后，在室温预反应5分钟，最后加入ATP储液以启动磷酸化酶学反应。让该反应在室温进行120分钟。
4、于反应管中加入25微升的2％磷酸，并立即混匀，以终止酶反应。取10微升反应样品点至P81号磷酸纤维虑膜(P81，Disc，Waterman)上，空气干燥5分钟。
5、将P81磷酸纤维虑膜移至多孔抽虑器(Millipore)，用两毫升的150mM磷酸溶液抽虑洗涤虑膜四次，以再用两毫升甲醇抽虑洗涤虑膜一次。将经洗涤的滤膜在室温空气干燥5分钟，之后移至液闪烁管，再加入两毫升的闪烁液。
6、使用液闪烁仪(Wallac 1411Liquid Scintillation Counter)测定残留在滤膜上同位素强度，用CPM值(Count Per Minuter，放射性同位素强度单位)表示。
测定及数据处理：所有实验至少重复三次，本申请文件中所述数据为其中一次实验的三个独立测定平均值，误差使用相对标准偏差(％CV)。实验中无抑制剂对照组包含除抑制剂外的所有成份，而测试组含不同浓度的抑制剂。化合物对酪氨酸蛋白激酶抑制活性抗JAK酪氨酸蛋白激酶作用。
结果与讨论：
图1显示的是5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)及其衍生物在100微摩尔浓度时的酶活性抑制百分比，纵坐标为酪氨酸激酶JAK3的抑制百分数。PFE为参照化合物，是美国辉瑞(Pfizer)发明的抗JAK酪氨酸蛋白激酶专一性抑制剂PC-55590的核心骨架结构
(7H-pyrrolo[2，3-d]pyrimidin-4-ol，其结构见式Ⅱ)，参见Kudlacz E，et al(2004)：The novel JAK-3inhibitor CP-690550is a potentimmunosuppressive agent in various murine models.Am J Transplant.4：51-57。
除PFE外、灯盏花乙素编号为DZHS-1和5，6，7，4’-四羟基黄酮DZHS-2均在100微摩尔浓度时显现强大的抑制活性。尽管其它中间体化合物的抑制活性在同一浓度时均在40％以下，但仍然有所差别。按强度大小依次为：4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素DZHS-8(37.9％)、5，6，7，4’-四甲 氧基黄酮DZHS-4(23.4％)、4’，5，6，7-四乙酰氧基黄酮DZHS-6(22.3％)、7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮DZHS-7(14％)。余下的样品如2′，4，4′，5′，6′-五甲氧基查尔酮DZHS-5、C19H20O7化学名称1，3-丙二酮，1-(6-羟基-2，3，4-三甲氧基苯基)-3-(4-甲氧基苯基)DZHS-3、天麻素DZHS-9、抑制活性都低于10％。如果仔细分析化合物结构可以发现，有一定的构效关系：越接近5，6，7，4’-四羟基黄酮的化合物，其JAK3抑制活性越强。辉瑞JAK3抑制剂PFE核心环为嘌呤类，见式Ⅱ所示，而5，6，7，4’-四羟基黄酮为黄酮类，二者性质相差很大。因此、5，6，7，4’-四羟基黄酮结构具抗JAK活性为首次新发现，其阻断JAK酶活性的机制可能有别于辉瑞JAK3抑制剂。
实施例2：5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对JAK3和JAK2半数抑制剂量(IC50)测定
为了精确测定5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物针对JAK3和JAK2酪氨酸蛋白激酶的抑制强度，研究中使用了半数抑制剂量(IC50)酶学测定法，见图2和图3，纵坐标为酪氨酸激酶的抑制百分数。结果显示：灯盏花乙素及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的抗JAK3酪氨酸蛋白激酶的50％抑制剂量分别为6.9微摩尔和3.0微摩尔，而参照物PFE 50％抑制剂量为19微摩尔。灯盏花乙素及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物的抗JAK2酪氨酸蛋白激酶的50％抑制剂量分别为57微摩尔和4.2微摩尔。由于灯盏花乙素及5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物针对JAK2和JAK3均表现出大致相同的抑制活性，因此推测它们可能对酪氨酸蛋白激酶家族其它两个成员(JAK1、TYK2)也具有抑制作用。
实施例3：5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物细胞测定过程和结果 细胞模型
测定原理：实验中使用新鲜制备的人体外周血淋巴细胞作为研究对象。由于外周血淋巴细胞膜分布有密集的细胞介素-2受体(IL2R)，而IL2R的激活主要通过JAK3的激活来转递。当IL2R被细胞介素-2(IL-2)结合，立即激活与之结合的JAK3，而JAK3进一步激活STAT5/STAT6。被激活的进一步激活STAT5/STAT6随即转移至细胞核，启动由其控制的多个目的基因表达。而干扰素γ(IFNγ)就是受控表达蛋白之一，它一经合成便立即分泌到淋巴细胞外。通过测定淋巴细胞培养液中干扰素γ浓度即可精确推算出药物分子对细胞免疫功能的作用强度(参见Changelian PS et al(2008)：The specificity of JAK3kinase inhibitors.Blood，111：2155-2157)。
实验操作：1、首先制备人体外周血淋巴细胞。取150毫升的健康人体新鲜血液于CPT管(每10毫升管含100微升0.3％柠檬酸作为抗凝剂)。
2、使用甩平头离心机(BECKAMN)3000RPM离心30分钟。仔细将淋巴细胞层移至一新管中，2500RPM离心10分钟。沉淀细胞重新悬混于PBS中，使用1200RPM离心10分钟。如此重复对细胞进行PBS混悬、离心三次。之后将细胞混悬于淋巴细胞完全培养液中(RPMI1640-为基础细胞培养液的一个品牌，10％人血清，100单位/毫升氨卞青霉素)。
3、使用流细胞分光光度计测定细胞浓度，将细胞浓度调整至1-2X106细胞/毫升。
4、使用所制备的淋巴细胞进行细胞刺激实验。将细胞(1毫升)种至十二孔细胞培养板中，之后定量加入待测化合物，与细胞混匀。于37℃细胞培养箱中(5％的CO2)同温30分钟，之后加入CD3/CD28抗体 和IL2刺激细胞。
5、测定干扰素表达水平。等细胞在37℃细胞培养箱(5％的CO2)培养40小时后，取100升细胞培养上清液测定干扰素含量。测定方法使用标准酶联免疫试剂盒(R&D的ELSA产品)进行。
6、测定及数据处理：所有实验至少重复三次，所述数据为其中一次实验的三个独立测定平均值，误差使用相对标准偏差(％CV)。实验中无抑制剂对照组包含除抑制剂外的所有成份，而测试组含不同浓度的抑制剂。化合物对干扰素表达抑制作用强度使用干扰素相对合成百分率(％Production of Initial)表示：
干扰素相对合成百分率＝[测试组干扰素含量/无抑制剂对照组干扰素含量×100]
IC50值计算利用SIGMAPLOT作图法，用化合物浓度对相应的干扰素相对合成百分率作非线性回归求得。
结果与讨论：
为了进一步确认在酶筛模型中发现的几种对JAK有强烈抑制活性的5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物也能有效的作用于细胞，并干扰细胞的功能，实验中选择了外周血T-淋巴细胞作为模型。图4所示为灯盏花乙素(DZHS-1)及5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)在浓度为100微摩尔时对T-淋巴细胞分泌干扰素能力的抑制作用档案分析(ProfileAssay)。5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)在100微摩尔时对T-淋巴细胞产生干扰素有明显抑制作用，与对照组PFE(CTL)相比在该浓度下淋巴细胞合成干扰素能力降低至原来的36％。而灯盏花乙素(DZHS-1)在同一浓度下对淋巴细胞分泌干扰素的能力只降低约10％左右，提示带配糖体结构的灯盏花乙素(DZHS-1)透过细胞膜的能力较差，其对淋巴细胞的功能影响低于5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)。
实施例4：
为了进一步评估5，6，7，4’-四羟基黄酮(DZHS-2)对在细胞水平上的作用强度，我们使用外周血rT-淋巴细胞模型对该化合物的半数抑制剂量(IC50)进行了测定，结果见图5。5，6，7，4’-四羟基黄酮50％抑制剂量为57微摩尔。根据这一结果我们推测5，6，7，4’-四羟基黄酮可能是灯盏花乙素在体内的真正起作用的药物活性分子。
实施例5：5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物对大鼠离体脑基底动脉的影响
1、材料
1.1动物SD大鼠，体重250～300g，雄性，许可证号：SYXK(陕)2007-003，购自西安交通大学医学院实验动物中心。
1.2药品及试剂受试样品，昆明制药集团药物研究院提供，用PSS营养液配制成不同浓度待用。U46619购自Cayman公司。
1.3器材Wire Myograph System DMT，Danish Myo Technology Co，PowerLab数据记录和分析系统，澳大利亚Adinstruments公司。
2、方法
2.1营养液配置
PSS营养液含(mM)：NaCl，140.0；KCl，4.7；CaCl2，1.6；MgSO4，1.2；1.2；Na2HPO4，1.4；EDTA，0.02；D-glucose：5.6。37℃调pH至7.4。
2.2BA血管环张力测定
SD大鼠麻醉处死，迅速取出脑组织和心脏，分离出脑基底动脉和 冠状动脉，剥离血管周围粘附组织。将血管剪成约1mm长的动脉环段备用。将血管环挂置在DMT的8个浴槽中，浴槽含有PSS液，恒温37℃，持续通含95％O2和5％CO2的混合气体，pH保持7.4。按照仪器测定程序及累积剂量法加入受试样品，进行测定。受试样品为：DZHS4(5，6，7，4’-四甲氧基黄酮)，BK23(DZHS-8，4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素)、RG-2-1(DZHS-2、5，6，7，4’-四羟基黄酮)、SCU(灯盏花乙素，DZHS-1)。
2.4统计分析
动脉环的张力用其相对最大收缩值的百分数表示，用Sigma Plot绘图软件进行作图，全部数据表示为均数±标准误。
3.结果：见表1和图6
表1.受试药对离体BA收缩的舒张作用比较(％，Mean±SE)
从表1及图6可见，在1μM U46619建立的收缩平台，除DZHS4外，BK23(即DZHS-8)及RG-2-1(即DZHS-2)明显舒张BA，其中BK23(即DZHS-8)舒张作用与SCU(灯盏花乙素)相当。
实施例6：5，6，7，4’-四羟基黄酮颗粒
配方：
5，6，7，4’-四羟基黄酮 500g
蔗糖 600g
淀粉 3000g
糊精 100g
乙醇 适量
按普通制粒法制粒，分装成1000袋(每袋约4.2g)，每袋含5，6，7，4’-四羟基黄酮500mg。
实施例7：5，6，7，4’-四甲氧基黄酮软胶囊
配方：
5，6，7，4’-四甲氧基黄酮 125g
亚麻油 400g
按普通胶丸(软胶囊)剂制备方法制备，每粒内容物重约525mg，可得1000粒，每粒含5，6，7，4’-四甲氧基黄酮(四甲氧基灯盏花乙素苷元)125mg。
实施例8：5，6，7，4’-四羟基黄酮冻干粉针
配方：
5，6，7，4’-四羟基黄酮 50g
HP-β-环糊精 50g
甘露醇 100g
先将5，6，7，4’-四羟基黄酮与HP-β-环糊精形成包合物，再按普通冻干法制备成冻干制剂，可制得1000支50mg之规格的5，6，7，4’-四羟基黄酮冻干粉针。
实施例9：5，6，7，4’-四羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸冻干粉针
配方：
5，6，7，4’-四羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸 200g
氯化钠 5g
甘露醇 90g
将5，6，7，4’-四羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸，按普通冻干法制备成冻干制剂，可制得1000支200mg之规格的5，6，7，4’-四羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸(灯盏花乙素)冻干粉针。
实施例10：复方5，6，7，4’-四乙酰氧基黄酮口服液
配方：
5，6，7，4’-四乙酰氧基黄酮 410g
三七总皂苷 79g
蜂蜜 1000g
蒸馏水 加至10kg
按普通口服液制备方法制备，可得1000支(每支约重11g)的口服液。
实施例11：4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素滴丸
配方：
4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素 50g
PEG-6000 200g
按普通滴丸剂制备方法制备，每丸重约25mg，可得约10000粒，每丸含4’，5，6-三甲氧基灯盏花乙素约5mg。
实施例12：7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮口腔速崩片
配方(1000片)：
7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮(粒径＜35μm)38g
微晶纤维(100目) 150g
乳糖(120目) 59g
羧甲纤维素钠(80目) 10g
聚乙二醇-10000(60目) 6g
山梨醇(120目) 44g
苹果香精 0.1g
制备工艺：将7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮和上述各种原料进行超细化，按配方充分混匀后直接压片，即得每片含7-羟基-4’，5，6-三乙酰氧基黄酮(规格)38mg的口腔速崩片。
实施例13：本发明所述产品的稳定性研究
用实施例6、7、8、9、10、11、12的样品在室温下避光保存，分别放置1、2、3、6、12个月，按时检查，外观基本不变，有效成分经检验也未发生变化。因此，该5，6，7，4’-四羟基黄酮及其衍生物制剂各种处方制得的产品均可达到1年的保质期。
稳定性试验结果：质量标准中含量测定和鉴别等参照现行标准。结果如下：
结果表明本发明提供的样品，经过初步稳定性考察，产品质量基本稳定，可达一年以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.式Ⅰ所示化合物在制备JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂的应用；
其中，R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3。
2.式Ⅰ所示化合物作为JAK酪氨酸蛋白激酶抑制剂在制备治疗或预防JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病的药物中的用途；
其中，R1为-H、-CH3、-COCH3或葡萄糖醛酸；R2为-H、-CH3或-COCH3；且R1与R2不同时为氢；
所述JAK/STAT信号转导通路异常相关疾病为免疫系统疾病。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述免疫系统疾病为类风湿关节炎、移植物抗宿主反应性疾病、过敏反应性疾病或免疫缺陷疾病。
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