CN107345222B - 表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组伪狂犬病毒，该病毒插入有优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明进一步公开了所述重组伪狂犬病毒的构建方法，以及制备动物疫苗中的应用。本发明重组伪狂犬病毒安全性好，免疫后既能产生针对变异株伪狂犬病毒抗体，又能产生针对流行株猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体，具有广阔的市场前景。

Description

表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方 法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用。

背景技术

猪流行性腹泻病是一种流行性疾病。据农业部流行病学中心统计，最近几年猪流行性腹泻(PED)病引起猪的死亡数已占据现有猪病的首位。调查结果表明，发病场的哺乳仔猪的发病率在10～100％，病死率在40～92.58％之间。据不完全统计因该病的死亡率约占总存栏数的3～5％给养猪业带来巨大经济损失。

PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科、冠状病毒属。病原研究的初步结果表明，目前中国从本次流行中腹泻病猪检测到的PEDV大多数为基因2型，与泰国、菲律宾、越南等地2009－2010年所流行的毒株非常相似。S基因序列分析表明，2010年以前PEDV毒株S基因序列与英国标准株CV777(AF353511)同源性很高，达到98％，2010年后，对9个猪场27个S基因序列进行比较分析，结果只有3个猪场8个S基因序列与CV777同源，7个猪场19个S基因序列与PEDV韩国分离株(DQ862099.1)同源，与CV777的同源性仅有85％左右，存在基因的插入和缺失，PEDV基因序列的改变可能导致了其流行规律的变化。

S蛋白位于病毒表面，是PEDV最大的结构蛋白，人为的划分为S1和S2亚基，其中S1亚基主要是识别细胞膜上特异受体并与之结合，是病毒中最早与细胞接触的部分，且S1中含有两个中和抗原表位(COE和S1D)和多个线性表位，S2主要是膜融合区。

因此，针对猪流行性腹泻病毒S1构建一种新的重组病毒，对于猪流行性腹泻病的治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种重组伪狂犬病毒。

本发明的第二个目的在于提供一种重组伪狂犬病毒的构建方法。

本发明的第三个目的在于提供一种重组伪狂犬病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种重组伪狂犬病毒，所述重组伪狂犬病毒的基因组插入有优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，所述优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示。

本发明中所述优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因是在猪流行性腹泻病毒S1基因(PEDV-S1)5’端加入BamHI酶切位点GGATTC和Kozak序列GCCACC，3’端加入EcoRI酶切位点GAATTC和flag标签GATTACAAGGATGACGACGATAAG得到的。

优选的，所述重组伪狂犬病毒的基因组插入有优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA；其中，S1表示优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾。

进一步，所述重组伪狂犬病毒的基因中标记GFP的CMV启动子替换为EF1启动子，且gI和gE基因替换为优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA。

一种构建表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将pPRV-Bac ZJ株中标记GFP的CMV启动子替换成EF1启动子，得到pPRV-EF1；

(2)将pPRV-EF1中的gI和gE基因替换成优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA，得到pPRV-S1-ΔgIE；

(3)将pPRV-S1-ΔgIE转染BHK-21细胞中，拯救得到表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组伪狂犬病毒，命名为rPRV-S1-ΔgIE。

在本发明中，所述标记GFP的CMV启动子替换成EF1启动子的步骤为：

(1)以pEP-EF1-in质粒为模板，利用核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示的引物扩增得到目的片段；

(2)将目的片段转入pPRV电转化感受态细胞，得到pPRV-EF1-Kan；

(3)删除pPRV-EF1-Kan中Kan基因，得到pPRV-EF1。

所述将pPRV-EF1的gI和gE基因替换成优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因表达框Pcmv-S1-BGH-pA的步骤为：

(1)将优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，插入到pEP-BGH-END中，得到pEP-S1-END；

(2)以pEP-S1-END为模板，利用核苷酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物扩增得到目的片段；

(3)将目的片段转入pPRV-EF1/GS1783电转化感受态细胞，得到pPRV-S1-ΔgIE-Kan；

(4)删除pPRV-S1-ΔgIE-Kan中Kan基因，得到pPRV-S1-ΔgIE。

本发明还提供了所述重组伪狂犬病毒在制备动物疫苗中的应用。

将本发明重组病毒免疫小鼠，能够检测出抗PEDV和抗PRV的抗体，为研制PEDV-PRV重组活载体疫苗奠定了基础。

本发明的有益效果如下：

本发明重组伪狂犬病毒中伪狂犬病毒是目前广泛流行的变异株伪狂犬病毒，表达的S1蛋白也是以猪流行性腹泻病毒流行株S1基因进行优化的。因此免疫重组伪狂犬病毒后既能产生针对变异株伪狂犬病毒抗体，又能产生针对流行株猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体，为猪伪狂犬病毒-猪流行性腹泻病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出真核表达质粒pEP-BGH-end的图谱。

图2示出PRV-Bac ZJ BamH Ⅰ酶切鉴定结果；M、Marker，1：PRV-Bac ZJ BamH Ⅰ酶切结果。

图3重组质粒pEP-S1-END的PCR验证；M、2000bp Marker，1-3：重组质粒样品PCR产物，4：阴性对照。

图4示出细胞免疫荧光鉴定结果；A、pEP-S1-END转染Vero细胞免疫荧光结果，B、阴性对照pEP-END空质粒转染Vero细胞免疫荧光结果。

图5示出质粒pEP-EF1-in的图谱。

图6示出pPRV-S1-ΔgIE BamH Ⅰ酶切鉴定结果；其中，1-5pPRV-S1-ΔgIE BamH

切结果，6对照，M:Marker。

图7示出Western blot检测PEDV S蛋白的表达；1-3:rPRV-S1-ΔgIE表达的蛋白，M:Marker。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

1、试验材料和试剂来源

PEDV流行株(ZJ131016)分离自浙江省某猪场；新型PRV(浙江株)细菌人工染色体感染性克隆(PRV-Bac ZJ)由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所构建并保存；工程菌GS1783、真核表达质粒pEP-BGH-end(质粒图谱如图1所示)、Vero细胞和BHK-21细胞均由本实验室保存。

其中，新型PRV(浙江株)细菌人工染色体感染性克隆(PRV-Bac ZJ)的构建方法：将PRV浙江分离株PRV-ZJ的UL22和UL24基因片段作为同源臂，先后克隆到pMD18T载体，构建pUL22-24；再将携带BAC元件和绿色荧光(GFP)标记的mini F片段插入到pUL22-24，构建了转移载体pUL22-gfp-24-HA2；将PRV基因组与转移载体共转染Vero细胞，获得携带BAC载体的PRV重组病毒PRV-HA2，提取重组病毒PRV-HA2基因组，电转GS1783感受态细胞，涂含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB琼脂平板，32℃过夜培养，挑单克隆菌落于含50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基，32℃过夜培养，提取BAC质粒，BamHI酶切鉴定如图2所示，出现Ladder状条带即为PRV-Bac ZJ阳性克隆。

磷酸钙转染试剂盒购于Promega公司；L-阿拉伯糖、氯霉素(CAP)、卡那霉素(Kan)购自上海生工生物工程有限公司；DMEM细胞培养基购自Gibco公司(美国)；胰酶购自Difico公司(美国)；胎牛血清购自四季青生物工程公司；3flag购自上海强耀生物科技有限公司；酚：氯仿、异丙醇、RNaseA、各种DNA限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；磷酸钙转染试剂盒购于Promega公司；甲基纤维素购自Gibco公司。

2、引物设计与合成

引物PEDVS1-P1/PEDVS1-P2用于S1与真核表达载体pEP-BGH-end载体连接后的验证；引物S1F/S1R用于验证S1基因与pPRV重组后的S1序列；引物PRV-in-IE-F/PRV-in-IE-R用于S1基因表达框Pcmv-S1-BGH-pA替换gE和gI基因；引物EF1-epF/EF1-epR用于PRV-BacZJ株的Pcmv启动子更换，均由上海生工生物技术服务有限公司合成。

表1 试验用引物和编号

实施例1 PEDV S1基因的优化

PEDV S1基因密码子由南京金斯瑞生物科技股份有限公司优化并合成，克隆到pUC57质粒载体中。优化的PEDV-S1(2325bp)基因5’端加入BamHI酶切位点GGATTC和Kozak序列GCCACC，3’端加入EcoRI酶切位点GAATTC和flag标签GATTACAAGGATGACGACGATAAG。优化后的PEDV-S1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

实施例2 验证S1蛋白的表达

1、真核表达质粒pEP-S1-END的构建

1.1重组质粒pUC57-S1和真核表达载体酶切

将重组质粒pUC57-S1和真核表达载体pEP-BGH-end分别用BamHI、EcoRI双酶切，酶切体系如表2所示。

表2 酶切体系

37℃水浴酶切5h，将酶切产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果，然后分别将目的片段用胶回收试剂盒进行纯化回收。

1.2 表达载体与目的基因连接

以T4 DNA Ligase连接酶切纯化后的目的基因和表达载体，构建重组表达质粒pEP-S1-END，连接反应体系如下：

混匀后，16℃连接过夜。

1.3 连接产物的转化

(1)将10μl的连接产物加入到100μlTranse10感受态细胞中，冰上放置25min；

(2)体系在42℃水浴热击90s，迅速冰浴2min；

(3)加入700μl的LB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养1h；

(4)菌液5000rpm离心3min,弃去600μl上清，剩余菌液重悬菌体；

(5)涂布含50μg/ml氨苄的LB平板，37℃培养箱中倒置培养过夜。

1.4重组菌的鉴定

用酒精灯烧过的无菌接种环，随机挑选过夜培养平板上的单个菌落，置于2ml Amp抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜。

将培养的菌液各取0.5μl作为模板，引物PEDVS1-P1/PEDVS1-P2(其核苷酸序列SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示)对S1进行菌液PCR鉴定。体系如下：

扩增条件：95℃预变性4min；94℃变性2min，60℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃总延伸10min。

PCR产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析仪观测结果并拍照记录，结果如图3。将PCR产物大小正确的克隆送到杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，将测序鉴定正确的重组质粒命名为pEP-S1-END。

2、真核质粒的体外瞬时转染

取测序正确的阳性菌液去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒(购自天根公司)，具体操作步骤见说明书。

以脂质体3000作为转染试剂将真核质粒转染至Vero细胞，具体操作步骤为：将Vero细胞传于6孔板，当细胞生长至细胞瓶底面积70％～90％时即可转染，步骤如下：

1)在125μl Opti-MEM培养基中加入4μl

3000试剂，充分混匀；

2)使用125μl Opti-MEM培养基稀释4μg pEP-S1-END和pEP-S2-END质粒，制备DNA预混液，然后加入4μl P3000试剂，充分混匀；

3)将1、2两管混匀，室温静置5min；

4)吸尽6孔板中培养基，每孔加入750μl Opti-MEM培养基；

5)将DNA-脂质体复合物加至细胞中，每孔250μl，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养6h后，每孔加1ml含20％血清的DMEM培养液，继续培养24-48h后检测转染水平。

3、间接免疫荧光法检测转染水平

将质粒转染的细胞弃上清，PBST溶液将细胞板洗两次；用冷甲醇和丙酮按1∶1混合，室温固定15min；再用PBST洗两次，每次5min，随后用PBST透膜15min；用稀释2000倍抗flag标签抗体的一抗，37℃作用1h；PBST洗3次，每次5min；用伊文思蓝稀释100倍的山羊抗鼠FITC异硫氰酸荧光素标记的抗体作为二抗，37℃温育1h后；PBST洗3次，每次5min。结果如图4所示，在荧光显微镜下可以看到pEP-S1-END表达绿色荧光蛋白，说明重组质粒可在Vero细胞中成功瞬时表达S1蛋白。

实施例3 表达PEDV S1的重组PRV的构建

1、PRV-Bac ZJ株的Pcmv启动子更换

1.1 pEP-EF1-in质粒的制备

取PRV-Bac ZJ菌种在Kan抗性的平板上划线，37℃培养18h，以获得其纯培养物。从纯培养物中挑取单菌落，接种于3mL含Kan抗性的LB培养液中，37℃220r/min震荡培养16h后提取pEP-EF1-in质粒(质粒图谱如图5所示)。

1.2 PCR扩增带有I-Sce I-Kan和EF1的同源重组序列

以提取的pEP-EF1-in质粒为模板，用引物对EF1-epF/EF1-epR(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示)扩增含有I-Sce I-Kan和EF1的DNA片段I-Sce I-Kan-EF1。

PCR的反应体系(总体积25μL)为：5×PrimeSTAR Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)2μL，质粒DNA 0.1μL，EF1-epF(10uM)1μL，EF1-epR(10uM)1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.25μL，dd H2O 15.65μL，PCR的反应条件如下：95℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃2min30ms，30个循环；72℃10min。

将PCR产物按照试剂盒回收说明书操作步骤回收。

1.3 pPRV电转化感受态细胞的制备

取保存的菌种PRV-Bac ZJ，在含有氯霉素抗性(CAP)的LB平板上划线，32℃培养20h后，从平板上挑取生长良好的单菌落接种于2mL含CAP抗性的LB液体培养基中，32℃震荡培养20h。取2mL培养好的菌液接种于100mL在32℃预热的含CAP抗性的LB液体培养基中，32℃振荡培养，当至培养物的OD600nm值达到0.6时，将其转移到42℃水浴摇床中以220r/min振荡培养15min，震荡完毕后立刻将培养物置于冰上冰浴20min。然后将菌液分装到4个灭菌预冷的50mL离心管中，以4℃4500r/min离心5min，弃上清，用灭菌预冷的10％的甘油重悬沉淀，12,000r/min 4℃离心5min，弃上清，洗涤3次，最后1％菌液体积的预冷的10％的甘油将沉淀重悬，混匀后分装至1.5mL的灭菌的EP管中，50μL/管，用于电转化。

1.4 I-Sce I-Kan-EF1替换Pcmv序列

取100ng纯化的I-Sce I-Kan-EF1 DNA片段，加入新鲜制备的pPRV电转化感受态细胞中，充分混匀后，将此混合物立即转移到预冷的电转杯(内部间隔为0.1cm)中，冰上静置30min后，在1.7KV、25μF，200Ω的条件下电击3.7ms，电击完成后在无菌条件下向电转杯中加入1mL无抗LB培养基重悬菌体，将电转后菌液转至1.5mL灭菌的EP管中，32℃振荡培养90min后，取150μL菌液涂布于含Kan和CAP双抗性的LB平板上，剩余的菌液低速离心后用100μL无抗LB液体培养基重悬后，也涂布于含Kan和CAP双抗性的LB平板上，在32℃温箱中培养24h。待菌落长出后，随机挑取多个单菌落分别接种于3mL含Kan、CAP双抗性的LB液体培养基中，提取质粒，用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切鉴定，最终获得pPRV-EF1-Kan突变体。

酶切体系(25μL)为：10×K buffer 3μL，Bac DNA 10μL，BamH Ⅰ1μL，dd H₂O 16μL，30℃水浴中作用3h，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切结果，便于下一步分析。将该菌保存，并纯培养。

1.5 pPRV-EF1-Kan突变体Kan基因的删除

挑取pPRV-EF1-kan突变体单菌落，置于含34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，培养过夜后，取100μL新鲜的菌液接入1mL预热的含有氯霉素的LB液体培养基中，32℃振荡培养3h后加入1mL预热的含有34μg/mL氯霉素和1％阿拉伯糖的LB液体培养基，32℃振荡培养1h后转入42℃水浴摇床以220r/min继续培养20min，最后将其移至32℃再振荡培养4h。将菌液稀释10⁴倍后分别取150μL稀释的菌液涂布于含有34μg/mL氯霉素和1％阿拉伯糖的LB平板上，32℃培养36-48h。待菌落长出后，挑取单菌落同时点种于含氯霉素的LB平板上和含氯霉素和卡那霉素双抗性的LB平板上，32℃温箱中培养24h-48h。挑取在氯霉素抗性LB平板上生长而在含氯霉素和卡那霉素双抗性的LB平板上不生长的单菌落，接种于3mL含氯霉素的液体LB培养基中，震荡培养16h后提取质粒，用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ进行单酶切鉴定，筛选获得pPRV-EF1突变体。

2、pPRV-S1-ΔgIE突变体的构建

2.1 PCR扩增带有I-Sce I-Kan和S1的同源重组序列

以提取的pEP-S1-END质粒为模板，用引物对PRV-in-IE-F、PRV-in-IE-R(其核苷酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)扩增含有I-Sce I-Kan和S1的DNA片段I-SceI-Kan-S1，即PEDV S1表达框(Pcmv-S1-BGH-pA)。

PCR的反应体系(总体积25μL)为：2×Prime STARTM GC Buffer 12.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，质粒DNA 1μL，PRV-in-IE-F(10uM)0.1μL，PRV-in-IE-R(10uM)0.1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.25μL，dd H2O 9.05μL。PCR的反应条件如下：95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃4min30s，30个循环；72℃10min。

用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒对PCR产物进行回收和纯化。

2.2 PCR产物模板质粒的去除

用甲基化酶DpnⅠ选择性降解PCR产物中的质粒模板，反应体系如下：

混匀后，置于37℃反应4h。用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒回收去除质粒的PCR产物，具体步骤见说明书。

2.3 pPRV-EF1/GS1783电转化感受态细胞的制备

1)取pPRV-EF1/GS1783突变体菌液在含有氯霉素的LB平板上划线，32℃震荡培养20h。

2)取培养好的菌种接种于5-200ml预热的含氯霉素抗性的LB培养液，以1:20-1:50的比例，220rpm,32℃培养至OD600为0.5～0.7之间。

3)将其转移到42℃水浴摇床，220rpm培养15min。

4)震荡完毕后立即将培养物置于冰上20min。

5)将菌液分装到4个灭菌预冷的50ml管中，以4℃，4500rpm离心5min。

6)用灭菌预冷的10％甘油重悬沉淀,12000r/min,4℃离心5min弃上清，洗涤3次。

7)最后用1％菌液体积的10％甘油悬浮沉淀，混合后分装至1.5mlEP管中，50μl/管，用于电转化。

2.4 pPRV-S1-ΔgIE-Kan突变体的构建

通过Red E/T两步重组用PEDV S1表达框(Pcmv-S1-BGH-pA)替换pPRV-EF1的gI和gE基因。具体操作步骤为：将100ng PCR产物加入到50μl pPRV-EF1/GS1783电转化感受态细胞中，混合后，将此混合物立即转移到预冷的电转杯中，在1.5KV，25μF，200兆的条件下电击3.7ms，电击完成后，在无菌条件下向电转杯中加入1ml SOC培养液重悬菌体，然后将电转液转移到1.5mlEP管中，32℃摇菌培养1h，取150μl菌液涂布于含有Kan、CAP双抗性的LB培养基上，32℃倒置培养24h。待菌落长出后，随机挑取多个单菌落分别接种于3mL含Kan、CAP双抗性的LB液体培养基中，提取质粒，用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切鉴定，最终获得pPRV-S1-ΔgIE-Kan突变体。

2.5 pPRV-S1-ΔgIE突变体的构建

按照1.5的方法将pPRV-S1-ΔgIE-Kan突变体中的Kan基因删除，得到pPRV-S1-ΔgIE突变体。

实施例4 拯救pPRV-S1-ΔgIE重组病毒

1、提取pPRV-S1-ΔgIE质粒及酶切鉴定

转化的平板挑取20个单菌落，用1:1000的卡那霉素和氯霉素抗性的LB培养液摇菌，菌液用PRV gE基因的引物扩增验证，没有条带证明缺失成功。同时用S1F/S1R引物(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)扩增验证，有相应的条带证明目的基因已经连接BAC载体，引物扩增验证后，挑取疑似阳性菌3ml提取pPRV-S1-ΔgIE质粒，具体操作步骤如下：

1)1.5ml菌液加入1.5mlEP管中，8000rpm离心2min。

2)弃上清，加入1.5ml菌液再次离心，8000rpm离心2min。

3)弃上清，加入300μl不含RNA酶的P1悬浮沉淀，震荡混匀。

4)加入300μl P2裂解，轻轻摇匀，室温放置5min。

5)加300μl P3终止液，混匀，轻轻的置于冰上10min，每管加20μl RNase酶，14000rpm，离心10min。

6)将上清液移入另一个离心管中，加入900μl酚氯仿，轻轻的颠倒数次，13000rpm离心10min。

7)将800μl上层液体(包含DNA),移入另一离心管中。

8)加入等量的800μl异丙醇，和盒子一起摇匀，置于冰上10min，15000rpm离心15min。

9)弃上清，勿打扰到沉淀，70％预冷的无水乙醇500μl洗DNA，15000rpm离心5min。

10)弃上清，不能打扰到沉淀，常温干燥15min左右。

11)含有RNase的30μl水溶解DNA，1：50加入RNase(RNase保存浓度为10mg/ml)。

提取的pPRV-S1-ΔgIE质粒用BamH Ⅰ单酶切验证，以筛选重组的阳性克隆，验证体系如下，30℃酶切4h，结果如图6所示。

酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，挑选阳性质粒送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序正确的pPRV-S1-ΔgIE突变体，可通过磷酸钙转染的方法转染BHK-21细胞进行该重组病毒的拯救。

2、rPRV-S1-ΔgIE重组病毒的拯救

将提取的pPRV-S1-ΔgIE质粒纯化并测定浓度后根据磷酸钙转染方法在BHK-21细胞中进行该重组病毒的拯救。具体操作步骤为：取2μg pPRV-S1-ΔgIEBac DNA用4℃保存灭菌的50μl10mMTris-HCL(pH为7.5)稀释，然后加入388μl的灭菌水，室温放置4h，期间轻轻摇匀，使BAC DNA充分伸展，然后将62μl的2M CaCl₂逐滴加入，温柔混匀后置于4℃过夜，在上述DNA CaCl₂混合液中，逐滴加入500μl 2×HBS，室温下15min，此时，弃掉六孔板中刚长满单层BHK-21细胞的培养液，加入500μl含10％胎牛血清的新鲜培养基，然后将500Μl BACDNA混合物缓慢加入六孔板中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4h。弃掉上清，用2mL1×PBS洗涤一次，每孔加入1.5mL高渗缓冲液(1×HBS，15％甘油)室温作用2.5min，弃上清后用1×PBS洗两次，每孔加入2mL含10％胎牛血清的新鲜的培养基，继续培养，每天观察细胞状态及病毒噬斑形成情况，获得的病毒命名为rPRV-S1-ΔgIE。

实施例5 Western blot检测PEDV S1蛋白的表达

扩繁rPRV-S1-ΔgIE病毒液，收集后，7000rpm离心5min，收集上清，100℃煮样品10min后，用胶浓度为12％的SDS-PAGE电泳后将其电转印至硝酸纤维素膜上，用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入鼠的flag标签抗体，稀释2000倍，37℃作用1h，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗，稀释2000倍，37℃作用1h，加入底物显色液，放置于暗箱中5min后，终止反应，显色后，在94kDa处有特异性条带与预期蛋白大小一致为PEDV S1蛋白，结果如图7所示，说明PEDV S1外源蛋白获得表达。

实施例6 重组病毒免疫小鼠试验

将20只Balb/c小白鼠随机分为二组，每组10只，第一组免疫重组病毒rPRV-S1-ΔgIE，第二组注射生理盐水作为空白对照，通过肌肉注射分别进行免疫，首免后14d进行二免，共免疫两次，于首次免疫后的28d，小鼠采血通过ELISA测定抗体。具体方法：用S663蛋白包被酶标板，包被浓度为1μg/ml，用PBST分别将不同组的小鼠血清倍比稀释，100μl/孔，37℃作用1h；PBST洗涤液洗涤3次，每次5min；加入1:5000稀释的HRP标记额山羊抗鼠的IgG,100μl/孔，37℃作用1h；PBST洗涤液洗涤3次，每次5min；加入底物100μl/孔显色，37℃温育20min，最后加入2MH₂SO₄，50μl/孔，终止反应。在酶联免疫检测仪上测定OD490值，结果如表3。可明显看出，rPRV-S1-ΔgIE检测出的抗体浓度较高，说明重组病毒rPRV-S1-ΔgIE的免疫原性较好，可以作为研究PEDV-PRV活载体疫苗。

表3 倍比稀释后得到的OD490值

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用

<130> JLC17I0205E

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 人工合成优化后的PEDV-S1基因序列

<400> 1

ggatccgcca ccatggccaa caccaacttc cgccggttct tctccaagtt caacgtgcag 60

gctccagctg tggtggtgct gggaggctac ctgccaatcg gcgagaacca gggcgtgaac 120

agcacctggt actgcgctgg acagcaccca accgcttccg gagtgcacgg catcttcgtg 180

agccacatca ggggcggcca cggcttcgag atcggcatct cccaggagcc cttcgaccca 240

agcggctacc agctgtacct gcacaaggcc accaacggca acaccaacgc caccgccagg 300

ctgagaatct gccagttccc ctccatcaag accctgggcc caaccgccaa caacgacgtg 360

accaccggca gaaactgcct gttcaacaag gccatccccg cccacatgtc cgagcacagc 420

gtggtgggca tcacctggga caacgacagg gtgaccgtgt tctccgacaa gatctactac 480

ttctacttca agaacgactg gagcagagtg gccaccaagt gctactccag cggcggctgc 540

gccatgcagt acgtgtacga gcccacctac tacatgctga acgtgacctc cgccggagag 600

gacggaatca gctaccagcc atgcaccgcc aactgcatcg gctacgccgc caacgtgttc 660

gccaccgagc ccaacggcca catcccagag ggcttctcct tcaacaactg gttcctgctg 720

tccaacgaca gcaccctggt gcacggcaag gtggtgagca accagcccct gctggtgaac 780

tgcctgctgg ccatcccaaa gatctacggc ctgggccagt tcttctcctt caaccagacc 840

atcgacggcg tgtgcaacgg agctgctgtg cagagggctc cagaggccct gcggttcaac 900

atcaacgaca cctccgtgat cctggctgag ggcagcatcg tgctgcacac cgccctgggc 960

accaacctgt ccttcgtgtg cagcaactcc agcgacccac acctggccac cttcgccatc 1020

ccactgggag ctacccaggt gccatactac tgcttcctga aggtggacac ctacaacagc 1080

accgtgtaca agttcctggc cgtgctgcca ccaatcgtgc gcgagatcgt gatcaccaag 1140

tacggcgacg tgtacgtgga cggcttcgga tacctgcacc tgggactgct ggacgctgtg 1200

accatcaact tcaccggaca cggaaccgac gacgacgtgt ccggcttctg gaccatcgcc 1260

agcaccaact tcgtggacgc tctgatcgag gtgcagggaa ccgccatcca gcgcatcctg 1320

tactgcgacg accccgtgtc ccagctgaag tgcagccagg tggccttcga cctggacgac 1380

ggcttctacc caatctccag ccggaacctg ctgtcccacg agcagcccat cagcttcgtg 1440

accctgccat ccttcaacga ccacagcttc gtgaacatca ccgtgtccgc cagcttcggc 1500

ggacactccg gagctaacct gatcgccagc gacaccacca tcaacggctt ctccagcttc 1560

tgcgtggaca cccgccagtt caccatccgg ctgttctaca acgtgacctc cagctacggc 1620

tacgtgtcca acagccagga ctccaactgc cccttcaccc tgcagagcgt gaacgactac 1680

ctgtccttca gcaagttctg cgtgtccacc agcctgctgg cttccgcctg caccatcgac 1740

ctgttcggct acccagactt cggcggcgcc gtgaagttca ccagcctgta cttccagttc 1800

accaagggag agctgatcac cggaacccca aagccactgg agggagtgac cgacgtgtcc 1860

ttcatgaccc tgtacgtgtg caccaagtac accatctacg gcttcaaggg cgagggcgtg 1920

atcaccccca ccaactccag cttcctggcc ggcatctact acacctccga cagcggccag 1980

ctgctggcct tcaagaacgt gacctccgga gccgtgtaca gcgtgacccc atgctccttc 2040

agcgagcagg ccgcctacgt ggacgacgac atcgtgggcg tgatctccag cctgtccaac 2100

agcaccttca acaacaccag ggagctgccc ggcttcttct accactccaa cgacggcagc 2160

aactgcaccg agccagtgct ggtgtactcc aacatcggcg tgtgcaagtc cggcagcatc 2220

ggatacgtgc catcccagag cggacaggtg aagatcgccc ccaccgtgac cggcaacatc 2280

agcatcccaa ccaacttctc catgagcatc cgcaccgagg attacaagga tgacgacgat 2340

aagtgagaat tc 2352

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成引物PEDVS1-P1

<400> 2

ttggatccgc caccatggcc aacaccaac 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成引物PEDVS1-P2

<400> 3

gggaattctc acttatcgtc gtcatccttg 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成引物S1F

<400> 4

accgtgttct ccgacaagat ctac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成引物S1R

<400> 5

aggatcacgg aggtgtcgtt gatg 24

<210> 6

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工合成引物PRV-in-IE-F

<400> 6

ggtccgtagc ctccgcagta ccggcgtcga tgatgatggt ggcttaaata ccgggagaac 60

cgggcgatgt acgggccaga ta 82

<210> 7

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工合成引物PRV-in-IE-R

<400> 7

ggcatgtcgg aatgcgggcg gaccggttct cccggtattt aagccaccat catcatcgac 60

gccggcccat agagcccacc gcatcccc 88

<210> 8

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工合成引物EF1-epF

<400> 8

ttttgcgcac ggttatgtgg acaaaatacc tggttaccca ggccgtgccg gcacgttaac 60

cgggctcgtg aggctccggt gcccgtca 88

<210> 9

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工合成引物EF1-epR

<400> 9

tggtggcgac cggtagcgct agcggatctg acggttcact aaaccagctc tgcttatata 60

gacctctcac gacacctgaa atggaaga 88

Claims (7)

1.一种重组伪狂犬病毒，其特征在于：所述重组伪狂犬病毒的基因组插入有优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，所述优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病毒，其特征在于：所述重组伪狂犬病毒的基因组插入有优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA；

其中，S1表示优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾。

3.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病毒，其特征在于：所述重组伪狂犬病毒的基因组中标记GFP的CMV启动子替换为EF1启动子，且gI和gE基因替换为优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA。

4.一种构建权利要求1-3任一所述重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将pPRV-Bac ZJ株中标记GFP的CMV启动子替换成EF1启动子，得到pPRV-EF1；

(2)将pPRV-EF1中的gI和gE基因替换成优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA，得到pPRV-S1-ΔgIE；

(3)将pPRV-S1-ΔgIE转染BHK-21细胞中，拯救，即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CMV启动子替换成EF1启动子的步骤为：

(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物扩增得到目的片段；

(2)将目的片段转入pPRV电转化感受态细胞，得到pPRV-EF1-Kan；

(3)删除pPRV-EF1-Kan中Kan基因，得到pPRV-EF1。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将pPRV-EF1的gI和gE基因替换成优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因的表达框Pcmv-S1-BGH-pA的步骤为：

(1)将优化后的猪流行性腹泻病毒S1基因，插入到pEP-BGH-END中，得到pEP-S1-END；

(2)以pEP-S1-END为模板，利用核苷酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物扩增得到目的片段；

(3)将目的片段转入pPRV-EF1/GS1783电转化感受态细胞，得到pPRV-S1-ΔgIE-Kan；

(4)删除pPRV-S1-ΔgIE-Kan中Kan基因，得到pPRV-S1-ΔgIE。

7.如权利要求1-3任一所述重组伪狂犬病毒在制备伪狂犬病病毒-猪流行性腹泻病毒二联疫苗中的应用。

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