CN107338283A - 一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 - Google Patents
一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107338283A CN107338283A CN201710561252.5A CN201710561252A CN107338283A CN 107338283 A CN107338283 A CN 107338283A CN 201710561252 A CN201710561252 A CN 201710561252A CN 107338283 A CN107338283 A CN 107338283A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cucumber
- bacterium
- leaf spot
- angular leaf
- inoculation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 title claims abstract description 103
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 title claims abstract description 103
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002347 injection Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 63
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 7
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 3
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 abstract description 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 6
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 5
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021503 ATP-binding cassette sub-family B member 6 Human genes 0.000 description 1
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 101000742140 Foeniculum vulgare Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000924727 Homo sapiens Alternative prion protein Proteins 0.000 description 1
- 101000740685 Homo sapiens C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001090065 Homo sapiens Peroxiredoxin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 101000686934 Mus musculus Prolactin-7D1 Proteins 0.000 description 1
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000521936 Pseudomonas amygdali pv. lachrymans Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000550081 Renata Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101000633277 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Peroxiredoxin TSA1 Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 244000137773 Viola philippica Species 0.000 description 1
- 238000001467 acupuncture Methods 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000000283 familial pityriasis rubra pilaris Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
Abstract
本发明建立了一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，专用于黄瓜抗细菌角斑病材料的鉴定及抗病育种研究。本发明以人工气候室内培养的黄瓜幼苗子叶为接种对象，通过注射一定浓度的强致病力psl菌株的菌液，子叶接种在人工气候室内上述培养条件下培养7天，随后根据接种子叶的褪绿症状来直接判断黄瓜材料对黄瓜的抗性。本发明与喷雾接种法比，保证了黄瓜抗细菌角斑病材料在不同批次的抗病接种鉴定结果的准确性、一致性、可比性和稳定性；能有效避免喷雾接种法引起的接种叶片症状不明显、不稳定和鉴定结果重复性差等问题。本发明方法更为规范、简单、准确、稳定和可控，为黄瓜抗细菌角斑病育种及研究提供了一个快速准确简单的方法。
Description
技术领域
本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法。
技术背景
黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=14）是世界范围内种植的一种重要的蔬菜作物，在我国蔬菜供应和国民经济中占有极其重要的地位，但是近年来随着黄瓜保护地栽培面积的不断扩大，黄瓜病害越来越成为制约黄瓜生产的一个重要因素，严重影响黄瓜的产量和品质。据报道2014-2016年，中国河北、山东、河南和辽宁省等地黄瓜细菌角斑病（Angularleaf spot, ALS）危害十分严重，严重减产的达到30-50%（Meng et al., 2017）。
黄瓜角斑病是由丁香假单胞杆菌黄瓜细菌角斑病致病变种(Pseudomonas syringae pv. Lachrymans，psl ) 引起的叶部病害，病菌在种子和病残体幸存，初侵染来源为带菌的种子、昆虫、雨水、劳动者、病残体及污染病残体的土壤等，带菌土壤通过大风或者灌溉迅速远距离传播。病菌通过种子萌发时定植到子叶上增殖发病，子叶侵染首先在子叶边缘开始黄化，叶片侵染发病时首先在叶背面出现水浸状的褪绿斑，病斑的外围扩大呈褪绿晕环，因受叶脉限制而呈多角形，逐渐成黄褐色、褐色、灰白色、白色，易破裂形成穿孔，有时可危害瓜条，腐烂有臭味（Young et al. 1996）。
黄瓜角斑病菌psl与寄主植物互作的报道甚少，ps小种存在分化现象，Renata等收集了侵染瓜类作物的22个psl小种，利用感病黄瓜LineB鉴定了不同小种的致病性和毒力，并通过分子进化方法对小种进行了划分。根据psl小种的致病性及其分子进化分析结果，将psl菌株划分为两种类型，强致病力类型和弱致病力类型(Renataet al., 2015）。 当病菌侵染寄主植物后，寄主植物一般产生两种反应，其一是过敏性坏死反应，当病菌侵染寄主细胞后，病菌在寄主植物中繁殖很少，一般在12-24h内达到高峰，然后迅速衰减；另一种反应为非过敏性坏死反应，细菌感染寄主后，在寄主的接种部位不断增殖，一般3至4d内达到高峰产生坏死斑。黄瓜对psl抗病反应为延迟了病菌在寄主细胞的增殖，表现为耐病， 接种psl后侵染位点可检测到高浓度的游离氨基酸，psl的生理小种的致病性与其产生的蛋白裂解酶成正相关（Keen et al. , 1967a and b)。而寄主在psl侵染位点诱导产生病程相关蛋白（Pathogenesis-related proteins, PRPs）来抑制psl分泌的蛋白酶功能，从而减缓病害的发展（Kryczynski et al., 2002)。这种互作方式符合亲和互作的特征，这为我们指导开展黄瓜抗ALS抗病性鉴定奠定了理论基础。
利用化学农药防治ALS不仅污染环境，而且容易产生抗药性（Lamichhane et al.,2015）。利用黄瓜种质资源进行抗病品种的选育是一项最经济和有效的措施，而快速、可靠、准确的接种鉴定是实现这一目标的关键。目前黄瓜ALS抗病鉴定主要是通过喷雾接种病菌的方法，虽然操作简单，但是病害发病不稳定，受环境影响大，每次喷雾接种后的材料的发病率及病情指数不稳定，给抗病鉴定带来困难。目前缺乏一种快速准确评价不同黄瓜种质资源对ALS抗病鉴定表现型的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，该方法首先在黄瓜幼苗两片子叶完全展开时，以一定浓度的强致病力的黄瓜细菌角斑病psl病菌液轻轻注射黄瓜幼苗的子叶背面，然后保温保湿7天后根据子叶的表现的症状来判定黄瓜对细菌角斑病的抗病性。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种黄瓜子叶接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，该方法使用黄瓜细菌角斑病菌psl强致病力菌株进行子叶注射接种，从而根据接种子叶的症状快速鉴定黄瓜种质资源对细菌角斑病的抗病性，该方法包括以下步骤：
（1）鉴定黄瓜细菌角斑病病菌psl强致病力菌株用于黄瓜幼苗子叶接种，且接种浓度在1×106cfu/ml至5×106cfu/ml之间；
（2）黄瓜幼苗子叶为受体注射接种：将黄瓜种子消毒后播种到营养土中，在人工气候室内培养，培养条件为24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时、湿度100%，当子叶完全展开时，将psl菌液轻轻注射入黄瓜幼苗子叶背面的细胞间隙中。接种完后扣透明的塑料盖密封，在人工气候室内继续培养7天，然后统计接种后的子叶的发病症状，根据子叶的症状来判断黄瓜对细菌角斑病的抗病性。
（3）黄瓜对细菌角斑病病菌的抗病性鉴定：当psl菌液接种黄瓜幼苗子叶7天后，在抗病材料上症状表现为无明显褪绿晕环、子叶浓绿色，而感病材料表现为有明显的褪绿晕环、子叶黄化。通过上述方法，即可快速鉴定出黄瓜抗细菌角斑病的材料。
进一步地，步骤（1）中分离黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株的方法为：① 田间采集具有黄瓜细菌角斑病典型症状的病叶，放入离心管中，室内无菌条件下用10%次氯酸钠消毒3 min，用无菌的蒸馏水冲洗三次。② 在离心管里用无菌的玻璃棒将病叶捣碎，加无菌水0.5ml，取无菌的接种针沾取捣碎的病菌汁液，在KB培养基上划线，24 ℃暗培养2天直至菌落长出。③ 选取单菌落KB划板培养，然后培养的划线菌用无菌水在平板上冲洗，收集黄瓜细菌角斑病菌液后，用无菌水调节菌液浓度在1×106cfu/ml。④ 用注射器轻轻在黄瓜子叶叶背面注射接种，直至菌液浸透整个子叶叶背面。⑤ 以24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时、湿度100%的条件培养3至7天。⑥ 根据接种后子叶褪绿黄化的程度来判断黄瓜细菌角斑病菌株的致病力水平，选取强致病力的黄瓜细菌角斑病菌株用于随后的抗病鉴定研究。
进一步地，分离的强致病力黄瓜细菌角斑病菌株用无菌的1%脱脂奶粉保存，并加甘油至终浓度为30%，分装在1.5ml离心管后于-80℃下长期保存。
进一步地，步骤（2）中黄瓜种子要用10%的次氯酸钠消毒后，用水冲洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盘上，然后置于人工气候室中培养。
一种上述方法在黄瓜抗细菌角斑病育种中的应用，也是本发明的保护范围。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：
（1）规范了黄瓜细菌角斑病的快速接种鉴定技术，以黄瓜幼苗子叶为接种对象，通过注射接种psl强致病力病菌，在接种过程中psl病菌接种浓度可控，保证黄瓜材料在不同批次的接种鉴定中结果的规范性、准确性、可比性、一致性和稳定性，与传统的黄瓜幼苗叶片喷雾接种方法相比，该方法更为简单、准确、稳定、可控，从而规范了黄瓜抗细菌角斑病菌的接种鉴定技术。
（2）采用注射快速接种子叶，接种后根据接种子叶的褪绿症状来直接判断黄瓜材料对黄瓜的抗性，这种判断方法简单、可靠，可以有效避免黄瓜喷雾接种后叶片调查时发病症状不明显、不稳定和鉴定结果差等问题。
（3）本发明创造性的选择在幼苗的子叶叶背面采用微注射接种，黄瓜的子叶叶片较厚，使用无注射器针头的注射器和子叶叶片紧密吻合，在一定的压力作用下，可以轻轻地将菌液注射进去子叶的细胞间隙中，而且在注射过程中注意避免注射的位置产生伤口，这样在叶片无创口情况下，接种后7天就可以根据子叶的症状来鉴定抗病性。
附图说明
图1表示强致病力psl菌株的浓度；分别以1×108cfu/ml 、1×107cfu/ml、 1×106cfu/ml 和1×105cfu/ml为浓度梯度接种黄瓜幼苗子叶。
图2表示子叶注射法的流程；
子叶背面被去掉针头的注射器轻轻注射到子叶细胞间隙里，避免注射的部位产生伤口。
图3表示在不同浓度下材料的抗病表现，其中在psl病菌>= 1 × 107：的接种浓度下，，PS76 和 Str8 都产生黄化褪绿斑； 在psl病菌<= 1 × 105的接种浓度下， PS76 和Str 8 子叶的都不产出黄化褪绿斑，两者无差异；在psl病菌为 1 × 106接种浓度下，PS76和 Str 8症状差异明显，其中PS76表现为无褪绿斑，而Str 8的表现为黄化褪绿，该浓度合适用于区分抗感材料。
图4 黄瓜材料Gy14和9930子叶注射接种psl的抗病性表现。Gy14和9930在接种后7天的症状表现，其中Gy14的子叶无明显褪绿黄化症状，而感病的9930子叶表现为明显的褪绿黄化症状。
具体实施方式
1. 黄瓜细菌角斑病病菌psl强致病力菌株的分离鉴定
采用平板分离法分离黄瓜细菌角斑病的致病力菌株psl：① 田间采集具有黄瓜细菌角斑病典型症状的病叶，放入离心管中，室内无菌条件下用10%次氯酸钠消毒3 min，用无菌的蒸馏水冲洗三次。② 在离心管里用无菌的玻璃棒将病叶捣碎，加无菌水0.5ml，取无菌的接种针沾取捣碎的病菌汁液，在KB培养基上划线，24 ℃暗培养2天直至菌落长出。③ 选取单菌落KB划板培养，然后培养的划线菌用无菌水在平板上冲洗，收集黄瓜细菌角斑病菌液后，用无菌水调节菌液浓度在1×106cfu/ml。④ 用注射器轻轻在黄瓜子叶叶背面注射接种，直至菌液浸透整个子叶叶背面。⑤ 以24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时、湿度100%的条件培养3至7天。⑥ 根据接种后子叶褪绿黄化的程度来判断黄瓜细菌角斑病菌株的致病力水平，选取强致病力的黄瓜细菌角斑病菌株用于随后的抗病鉴定研究。分离的强毒力psl菌株可以用无菌的1%脱脂奶粉保存，并加甘油至终浓度为30%，分装在1.5ml离心管后于-80℃下长期保存。
2. pls强毒力菌株的接种浓度的确定
以抗病的黄瓜自交系Ps76和感病自交系Str8为材料，种子用10%的次氯酸钠消毒后，用水冲洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盘上，每个材料种8株，置于人工气候室中培养，培养条件：24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时，直至黄瓜的两片子叶完全展开时，于接种前2天将苗盘用透明的塑料盖密封保持湿度100%，随后子叶可方便用于接种。根据步骤（1）选取的强致病力的psl菌株，从冻存的-80℃冰箱里取出迅速在没有融化的情况下用针刺菌然后在KB固体培养基中划线，随后在24℃下暗培养1 d，然后活化的菌株再转接到KB固体培养基上，暗培养2d，用分光光度计测定菌液的浓度，并用无菌的蒸馏水将调整菌液浓度分别为1×108cfu/ml 、1×107cfu/ml、 1×106cfu/ml 和1×105cfu/ml，每个育苗盘接种不同浓度梯度，并设置无菌水对照。随后将psl菌液轻轻注射入黄瓜幼苗的一个子叶背面的细胞间隙中，另一个子叶不进行接种（图2）。接种完后扣透明的塑料盖密封，在人工气候室内保持24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时，湿度在100%，保持7天，然后统计接种后的子叶的发病症状，当某一浓度的psl菌液接种后在抗病材料上症状表现为无明显褪绿晕环、子叶浓绿色，而感病材料表现为有明显的褪绿晕环、子叶黄化时，此时的psl菌液浓度为最适接种浓度，在psl病菌>= 1 × 107：的接种浓度下，，PS76 和 Str8 都产生黄化褪绿斑； 在psl病菌<= 1 × 105:的接种浓度下，Ps76 和 Str 8 子叶的都不产出黄化褪绿斑，两者无差异；在psl病菌为 1 × 106:接种浓度下，Ps76和 Str 8症状差异明显，其中Ps76表现为无褪绿斑，而Str 8的表现为黄化褪绿，该浓度合适用于区分抗感材料。表明psl强致病力菌株的最适宜接种浓度为1×106cfu/ml（图1、图3）。
1.子叶注射接种psl快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病技术建立
对黄瓜的种质资源育苗并进行抗病鉴定。具体方法同（2），黄瓜种质资源在人工气候室进行育苗，每个种质资源种8株，待到子叶完全展开时用于接种，采用psl的最适接种浓度（1×106cfu/ml）接种黄瓜的子叶背面，用手托起子叶，用无菌的注射器将菌液轻轻注入子叶背面的细胞间隙，注意在注入的时候避免接种部位产生伤口。子叶接种完后在人工气候室内保持100%的湿度7天，然后统计不同黄瓜种质资源接种子叶的症状。接种的子叶表现为黄化褪绿的为感病，而子叶叶片浓绿、无褪绿斑的为抗病。通过上述方法，我们筛选了10个抗细菌角斑病的材料，4个感病材料，其中4个抗病材料配制成2个杂交组合，建立了一种黄瓜子叶注射快速准确鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，为应用该方法开展黄瓜抗细菌角斑病病育种奠定了技术基础（图4）。表1为不同的黄瓜材料对psl抗病性表现。筛选出10份抗病材料（R），4份感病材料（S）。
表1不同的黄瓜材料对psl抗病性表现
。
Claims (7)
1.一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）采用平板分离法分离黄瓜细菌角斑病病菌，并从分离的单菌落中选取黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株用于黄瓜幼苗子叶接种；
（2）以黄瓜幼苗子叶为受体注射接种：将黄瓜种子消毒后播种到营养土中，在人工气候室内培养，当子叶完全展开时，将黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株的菌液注射入黄瓜幼苗子叶背面的细胞间隙中，接种完后扣透明的塑料盖密封，在人工气候室内继续培养7天，然后统计接种后的子叶的发病症状，根据子叶的症状来判断黄瓜对细菌角斑病的抗病性；
（3）黄瓜对细菌角斑病病菌的抗病性鉴定：当黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株的菌液接种黄瓜幼苗子叶7天后，在抗病材料上症状表现为无褪绿晕环、子叶浓绿色，而感病材料表现为有褪绿晕环、子叶黄化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用的黄瓜细菌角斑病的强致病力菌株的接种浓度为1×106cfu/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中分离黄瓜细菌角斑病病菌强致病力菌株的方法为：① 田间采集具有黄瓜细菌角斑病典型症状的病叶，放入离心管中，室内无菌条件下用10%次氯酸钠消毒3 min，用无菌的蒸馏水冲洗三次；
② 在离心管里用无菌的玻璃棒将病叶捣碎，加无菌水0.5ml，取无菌的接种针沾取捣碎的病菌汁液，在KB培养基上划线，24 ℃暗培养2天直至菌落长出；
③ 选取单菌落KB划板培养，然后培养的划线菌用无菌水在平板上冲洗，收集黄瓜细菌角斑病菌液后，用无菌水调节菌液浓度在1×106cfu/ml；
④ 用注射器轻轻在黄瓜子叶叶背面注射接种，直至菌液浸透整个子叶叶背面；
⑤ 以24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时、湿度100%的条件培养3至7天；
⑥ 根据接种后子叶褪绿黄化的程度来判断黄瓜细菌角斑病菌株的致病力水平，选取强致病力的黄瓜细菌角斑病菌株用于随后的抗病鉴定研究。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分离的强致病力黄瓜细菌角斑病菌株用无菌的1%脱脂奶粉保存，并加甘油至终浓度为30%，分装在1.5ml离心管后于-80℃下长期保存。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中人工气候室的培养条件为24 ℃光照培养16小时、20℃黑暗培养 8小时、湿度100%。
6.附件权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中黄瓜种子要用10%的次氯酸钠消毒后，用水冲洗3遍，催芽后定植于48孔育苗盘上，然后置于人工气候室中培养。
7.一种权利要求1-6任一项所述方法在黄瓜抗细菌角斑病育种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710561252.5A CN107338283A (zh) | 2017-07-11 | 2017-07-11 | 一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710561252.5A CN107338283A (zh) | 2017-07-11 | 2017-07-11 | 一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107338283A true CN107338283A (zh) | 2017-11-10 |
Family
ID=60218639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710561252.5A Pending CN107338283A (zh) | 2017-07-11 | 2017-07-11 | 一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107338283A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114223426A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种单子叶植物叶片液体注射方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106818455A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-06-13 | 浙江省农业科学院 | 一种定量评价瓠瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒能力的方法 |
-
2017
- 2017-07-11 CN CN201710561252.5A patent/CN107338283A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106818455A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-06-13 | 浙江省农业科学院 | 一种定量评价瓠瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒能力的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 傅淑云 等: "黄瓜霜霉病人工接种技术研究", 《沈阳农学院学报》 * |
| 王爱英 等: "新疆哈密瓜细菌性斑点病离体叶片种子带菌检测及致病力分化", 《西北农业学报》 * |
| 邓德天: "黄瓜角斑病与霜霉病的识别与防治", 《农家科技》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114223426A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种单子叶植物叶片液体注射方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103756975B (zh) | 一种感染烟草的大豆花叶病毒的获得方法及其应用 | |
| CN109182176A (zh) | 一株暹罗芽孢杆菌及其在防治番茄根结线虫病上的应用 | |
| CN103103152B (zh) | 一种珊瑚球菌及其应用 | |
| CN109077067A (zh) | 一种生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用 | |
| Anahosur | Mundkur Memorial Award Lecture-Integrated management of potato Sclerotium wilt caused by Sclerotium rolfsii | |
| CN105420115A (zh) | 一种用于蜜环菌孢子分离、培养的培养基及方法和应用 | |
| WO2015003547A1 (zh) | 人工繁育虫草菌种的种性复壮培养方法 | |
| CN109355208A (zh) | 一种高致病力生防菌爪哇虫草及其应用 | |
| Keeling | Research on Phytophthora root and stem rot: Isolation, testing procedures, and seven new physiologic races | |
| CN102154193B (zh) | 一种诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的方法 | |
| CN103493685A (zh) | 一种利用野生活树桩栽培桑黄的方法 | |
| CN107896751A (zh) | 一种草莓种苗的防病虫害方法 | |
| CN102329760B (zh) | 杀蛴螬类害虫的苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫蛋白 | |
| CN106222121A (zh) | 一种巨大芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用 | |
| Wilhelm et al. | Pathology of strawberry root rot caused by Ceratobasidium species | |
| CN108913621A (zh) | 一株有效防治樱花根癌病的甲基营养型芽孢杆菌yh-18及其应用 | |
| CN107338283A (zh) | 一种黄瓜子叶注射接种快速鉴定黄瓜抗细菌角斑病的方法 | |
| CN107858300A (zh) | 针对番茄的防病、促生、品质提升以及抗逆的解淀粉芽胞杆菌2yn11及其应用 | |
| CN110317735A (zh) | 生防寡雄腐霉菌及应用 | |
| Kavino et al. | Enhancement of growth and Panama wilt resistance in banana by in vitro co-culturing of banana plantlets with PGPR and endophytes | |
| Vatchev | Fusarium root and stem rot of greenhouse cucumber: aerial dispersal of inoculum | |
| CN109055265A (zh) | 一种生防菌及其在农作物蔓枯病防治方面的应用 | |
| CN104357351A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用 | |
| CN104221648A (zh) | 室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法 | |
| CN104593266A (zh) | 一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171110 |