CN107312079A - 一种甲鱼血糖肽的分离提取方法 - Google Patents

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时春娟
陈旋
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Abstract

本发明公开了一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，其特点是采集的甲鱼血经透析、离心、沉淀以及色谱分离，提取得到两种单一组分的活性多糖肽，对其进行成分鉴定和生物活性测试具有较强的抗肿瘤活性，多糖肽的具体提取和纯化包括：粗多糖缀合物提取、精多糖制取、粗糖肽制取和多糖肽纯化步骤。本发明与现有技术相比具有原料丰富，提取工艺简单，操作方便，产出价值高，产物具有抗肿瘤的活性，是一种很有应用前景的药物或保健品。

Description

一种甲鱼血糖肽的分离提取方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的甲鱼血糖肽的分离提取方法。
背景技术
中华鳖（俗称甲鱼）是我国的一种传统动物中药，也是我国近年来发展起来的一种重要的特种经济动物。由于其丰富的营养价值和较高的药用价值倍受人们的青睐,其生化成分含胶原蛋白、维生素D、脂肪及碘等，具有滋阴清热、平肝益肾、破结软坚及消淤功能。鳖甲、头、肉、血、胆等都可入药。国内外对龟鳖类动物的有效成分所开展的研究报道很少，有文献报道从鳖甲或者甲鱼肉中分离到粗多糖，具有促抗体生成、抗疲劳作用[金妙仁, 王水, 朱海良等. 氨基酸和生物资源. 2005, 27(2):31-32]。还具有抗肿瘤作用，对肿瘤细胞S-180有抑制作用[张娅婕,凌笑梅, 甘振威等. 长春中医学院学报. 2004, 20(2): 38-39]。此外，鳖血提取物在治疗免疫性疾病(如AIDS和肝炎等)中，具有一定的辅助疗效，表明鳖血中的某些成分具有一定的免疫调节作用(王志镛. 甲鱼血的用途: CN, CN 1282586 A[P]. 2001.)。
现有技术只是从鳖甲或甲鱼肉中分离得到具有抗肿瘤作用的粗多糖，通常将甲鱼血作为废弃物处理，针对此现状，申请人对甲鱼血进行系统化研究开发，发现其中活性糖肽是很有应用前景的药物或保健品候选物。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，采用膜分离及生化技术对甲鱼血进行透析、离心、沉淀以及色谱分离提取活性糖肽，对其进行成分鉴定和生物活性测试，所得甲鱼血糖肽具有良好的抗肿瘤活性，原材料价廉易得，提取工艺简单，生产成本低，产出价值高，是一种很有应用前景的药物或保健品。
实现本发明目的的具体技术方案是：一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，其特点是采集的甲鱼血经透析、离心、沉淀以及色谱分离，提取得到两种单一组分的活性多糖肽，对其进行成分鉴定和生物活性测试具有较强的抗肿瘤活性，多糖肽的具体提取和纯化按下述步骤进行：
a、粗多糖缀合物的提取
将采集的甲鱼血在0~4℃温度下透析1~3天，在4000rpm离心速度下得到的上清液与乙醇、丙酮或三氯乙醇按1:1~10体积比进行沉淀分离，分离的沉淀物按1:2~10体积比溶于蒸馏水，在0~4℃温度下透析1~5天，然后经冷冻干燥得絮状的粗多糖缀合物为S-1。
b、精多糖的制取
将上述粗多糖缀合物S-1按1g:1~5ml重量体积比溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用阴离子交换色谱柱分离，分离依次用蒸馏水和0.1～0.5mol/L碳酸氢钠溶液或0.1～1.0mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥得产物为甲鱼血精多糖S-2，所述阴离子交换色谱柱的填料为DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex或DEAE-Saphrose。
c、粗糖肽的制取
将上述甲鱼血精多糖S-2按1g:1~5ml重量体积比溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用阳离子交换色谱柱分离，分离依次用蒸馏水和0.1～0.5mol/LNa2HPO4-NaH2PO4 溶液或0.1～1.0mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥得到两种单一组分的产物为粗糖肽S-3和S-4，所述阳离子交换色谱柱的填料为CM-Sephadex或CM-Sepharose。
d、糖肽的纯化
将上述粗糖肽S-3和S-4按1g:1~5ml重量体积比分别溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用分子排阻色谱柱分离，分离使用0.1～0.5mol/L的碳酸氢钠、氯化钠或Na2HPO4-NaH2PO4 溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥分别得产物为多糖肽S-5和S-6，所述分子排阻色谱柱的填料为Sephadex G-25、G-50、G-75、LH-60或LH-20。
所述透析的分离膜采用截留分子量为500～1500纳滤膜。
所述Na2HPO4-NaH2PO4 溶液的pH=7～9。
本发明与现有技术相比具有提取工艺简单，操作方便，原料丰富，生产成本低，产出价值高，产物具有抗肿瘤的活性，是一种很有应用前景的药物或保健品。
附图说明
图1为糖肽S-5的CE图；
图2为糖肽S-6的CE图。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述：
实施例1
a、粗多糖缀合物的提取
取新鲜甲鱼血500mL于4℃温度下透析2天，透析后的甲鱼血在4000rpm的转速下离心分离，得深棕色的上清液用5倍体积的乙醇进行沉淀分离，分离的沉淀物溶于4倍体积蒸馏水，并在4℃温度下透析2天，然后冷冻干燥得4.6克淡黄色絮状产物为粗多糖缀合物S-1。
上述产物易溶于水，通过紫外吸光度检测，既有糖吸收又有蛋白吸收，说明该产物是粗糖蛋白缀合物，粗多糖缀合物S-1经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法检测，其总糖含量为38.3%，总蛋白含量为53.1%。
b、精多糖的制取
将上述提取的粗多糖缀合物S-1溶于2倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经DEAE-Cellulose DE-52柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L碳酸氢钠溶液作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得产物为甲鱼血精多糖S-2。
上述甲鱼血精多糖S-2经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法检测，其含糖量为12%，蛋白质含量为85%。
c、粗糖肽的制取
将上述甲鱼血精多糖S-2溶于2倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经CM-Sephadex C-50柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L氯化钠溶液作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得两种单一组分的产物，该产物经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法检测，为粗糖肽S-3和S-4。
d、糖肽的纯化
将上述粗糖肽S-3和S-4分别溶于4倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经Sephadex G-75柱色谱分离，分离依次用蒸馏水和浓度为0.3mol/L碳酸氢钠溶液为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥分别得两种单一组分的产物为多糖肽S-5和S-6。
实施例2
a、粗多糖缀合物的提取
取新鲜甲鱼血500mL于4℃温度下透析2天，透析后的甲鱼血在4000rpm的转速下离心分离，得深棕色的上清液用3倍体积的乙醇进行沉淀分离，分离的沉淀物溶于5倍体积的蒸馏水后在4℃温度下透析3天，然后冷冻干燥得6.1克淡黄色絮状产物为粗多糖缀合物S-1。
b、精多糖的制取
将上述提取的粗多糖缀合物S-1溶于3倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经DEAE-Sephadex A-50柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L碳酸氢钠溶液作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得产物为甲鱼血精多糖S-2。
c、粗糖肽的制取
将上述甲鱼血精多糖S-2溶于3倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经CM-Sepharose CL-6B柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/LNa2HPO4-NaH2PO4 溶液（pH=8）作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得两种单一组分的产物，该产物经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法检测，为粗糖肽S-3和S-4。
d、糖肽的纯化
将上述粗糖肽S-3和S-4分别溶于4倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经Sephadex G-50柱色谱分离，分离使用浓度为0.10mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥分别得两种单一组分的产物为多糖肽S-5和S-6。
实施例3
a、粗多糖缀合物的提取
取新鲜甲鱼血500mL于0℃温度下透析2天，透析后的甲鱼血在4000rpm的转速下离心分离，得深棕色的上清液用1.5倍体积的三氯乙醇进行沉淀分离，分离的沉淀物溶于2倍体积的蒸馏水后在4℃温度下透析4天，然后冷冻干燥得5.0克淡黄色絮状产物为粗多糖缀合物S-1。
b、精多糖的制取
将上述提取的粗多糖缀合物S-1溶于3倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L碳酸氢钠溶液作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得产物为甲鱼血精多糖S-2。
c、粗糖肽的制取
将上述甲鱼血精多糖S-2溶于3倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经CM-Sepharose CL-6B柱色谱分离，分离依次用水以及浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L氯化钠溶液作为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥得两种单一组分的产物，该产物经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法检测，为粗糖肽S-3和S-4。
d、糖肽的纯化
将上述粗糖肽S-3和S-4分别溶于2倍重量的蒸馏水后以12000rpm转速离心，将上清液经Sephadex LH-60柱色谱分离，分离使用0.15mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，色谱分离得到的组分经冷冻干燥分别得两种单一组分的产物为多糖肽S-5和S-6。
对上述各实施例的S-1～S-6产物分别进行抗肿瘤活性测试，考察其对人鼻咽癌细胞 (CNE-2) 生长抑制作用。测试采用MTT比色法，其检测采用处于对数生长期的CNE-2细胞, 经0.25 %的胰蛋白酶消化，用含小牛血清的DMEM培养液制成细胞105/mL的悬液，以每孔 100mL接种于96孔细胞培养板中，在 37 ℃和 5% CO2 条件下培养 24 h。弃培养板中培养液，加100mL浓度为1mg/mL的各类样品溶液并混匀，每一浓度各 4个复孔，空白对照加人等体积的含 0.1% 吐温-80 DMEM培养液。培养条件同上，作用24 h后, 每孔加入20mL用生理 BPS 新鲜配制的 MTT (0.5 mg/mL )原条件培养 4 h 后，弃 MTT 溶液，每孔加 150mLDMSO，振荡 10 min，在酶标仪上测吸光度( A值)，波长 57Onm，取 4 孔平均值，其生长抑制率按以下式（1）计算，并将测试结果汇总如下表1所示：
(1 一实验组 A 值/对照组 A 值)x 100% （1）
表1 抗肿瘤活性测试结果
编号 剂量(mg/ml) 抑制率%
Normal 0 0
DDP 1 49.5±0.9
S-1 10 15.9±0.4
S-2 10 26.0±0.7
S-3 10 27.3±1.0
S-4 10 36.2±1.3
S-5 10 31.9±2.1
S-6 10 42.1±1.0
从上述表1的抗肿瘤活性测试结果表明：在较低的浓度下，不同分离提取阶段的S-1～S-6产物对鼻咽癌细胞都具有良好的抑制率，而且纯度越高的多糖肽，其抑制率相应就越高，这就充分说明了对甲鱼血中糖肽的分离纯化具有显著的作用和巨大的开发前景。采用高效毛细管点泳(HPCE)对多糖肽S-5和S-6进行纯度的检测，其电泳条件：电压为20kV；检测：紫外280nm；温度：室温；缓冲液：25mmol/L硼砂，pH=9；样品浓度：0.1%(W/V)；进样体积：5μL。
参阅附图1，上述各实施例制取的多糖肽S-5经CE检测均得到单一峰，说明该组分均一性好，纯度高。
参阅附图2，上述各实施例制取的多糖肽S-6经CE检测均得到单一峰，说明该组分均一性好，纯度高。
以上只是对本发明作进一步的说明，并非用以限制本专利，凡为本发明等效实施，均应包含于本专利的权利要求范围之内。

Claims (3)

1.一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，其特征在于采集的甲鱼血经透析、离心、沉淀以及色谱分离，提取得到两种单一组分的活性多糖肽，对其进行成分鉴定和生物活性测试具有较强的抗肿瘤活性，多糖肽的具体提取和纯化按下述步骤进行：
a、粗多糖缀合物的提取
将采集的甲鱼血在0~4℃温度下透析1~3天，在4000rpm离心速度下得到的上清液与乙醇、丙酮或三氯乙醇按1:1~10体积比进行沉淀分离，分离的沉淀物按1:2~10体积比溶于蒸馏水，在0~4℃温度下透析1~5天，然后经冷冻干燥得絮状的粗多糖缀合物为S-1；
b、精多糖的制取
将上述粗多糖缀合物S-1按1g:1~5ml重量体积比溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用阴离子交换色谱柱分离，分离依次用蒸馏水和0.1～0.5mol/L碳酸氢钠溶液或0.1～1.0mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥得产物为甲鱼血精多糖S-2，所述阴离子交换色谱柱的填料为DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex或DEAE-Saphrose；
c、粗糖肽的制取
将上述甲鱼血精多糖S-2按1g:1~5ml重量体积比溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用阳离子交换色谱柱分离，分离依次用蒸馏水和0.1～0.5mol/LNa2HPO4-NaH2PO4 溶液或0.1～1.0mol/L氯化钠溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥得到两种单一组分的产物为粗糖肽S-3和S-4，所述阳离子交换色谱柱的填料为CM-Sephadex或CM-Sepharose；
d、糖肽的纯化
将上述粗糖肽S-3和S-4按1g:1~5ml重量体积比分别溶于蒸馏水，在12000rpm离心速度下得到的上清液采用分子排阻色谱柱分离，分离使用0.1～0.5mol/L的碳酸氢钠、氯化钠或Na2HPO4-NaH2PO4 溶液为洗脱剂进行淋洗，分离后的组分经冷冻干燥分别得产物为多糖肽S-5和S-6，所述分子排阻色谱柱的填料为Sephadex G-25、G-50、G-75、LH-60或LH-20。
2.根据权利要求1所述一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，其特征在于所述透析的分离膜采用截留分子量为500～1500纳滤膜。
3.根据权利要求1所述一种甲鱼血糖肽的分离提取方法，其特征在于所述Na2HPO4-NaH2PO4 溶液的pH=7～9。
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