CN107271600B - 一种4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中异构体杂质含量的检测方法 - Google Patents

一种4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中异构体杂质含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种式Ⅰ所示化合物的产品中异构体杂质含量的检测方法，它是采用HPLC法实现的。本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物的产品中异构体杂质含量的检测方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了终产品甲磺酸沙芬酰胺的产品质量和患者的用药安全。

Description

一种4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中异构体杂质含量的检测方法
技术领域
本发明属于化学中的分析检测领域，具体涉及一种4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中异构体杂质含量的检测方法。
背景技术
本领域公知的，药物中的杂质是影响药物纯度的主要因素，如果药物中所含杂质超过质量标准规定的限量要求，极有可能造成药物的外观性状、理化参数发生改变，甚至影响药物的稳定性，使药物活性降低而毒副作用增加，严重危害药物的产品质量和患者的用药安全；同时，药物中杂质的来源非常广泛，既可能来源于生产过程，也可能来源于贮藏过程，其中，生产过程中的原料不纯是很重要的一个来源(参见：刘文英主编.《药物分析》第6版，第三章：人民卫生出版社，2007年.)。
4-(3-氟苄氧基)苯甲醛(即本发明式Ⅰ所示化合物)，是一种重要的药物中间体，主要用于制备多巴胺激动剂沙芬酰胺甲磺酸盐：沙芬酰胺甲磺酸盐(Sfinamide，商品名：Xadago，化学名为(S)-2-(4-(3-氟苄氧基)苄胺基)丙酰胺甲磺酸盐(分子式：C18H23FN2O5S)，以化合物4-(3-氟苄氧基)苯甲醛为原料制备沙芬酰胺的合成路线如下：
由间氟苄氯制备4-(3-氟苄氧基)苯甲醛的合成路线如下：
目前未见有4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质含量的相关报道。为了进一步保证甲磺酸沙芬酰胺的产品质量和患者的用药安全，有必要对甲磺酸沙芬酰胺起始原料及中间产品的产品质量进行监控，特别是，需要发明一种新方法，对化合物4-(3-氟苄氧基)苯甲醛产品中的位置异构体含量进行检测。
发明内容
发明人在偶然的机会下，发现了4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中存在异构体杂质，如4-(4-氟苄氧基)苯甲醛和4-(2-氟苄氧基)苯甲醛，由于这些杂质的存在，在随后制备甲磺酸沙芬酰胺后，同样会对终产物的纯度、药效、安全性和稳定性等产生影响。基于这一发现，本发明的目的在于提供一种4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质含量的检测方法，以此来控制4-(3-氟苄氧基)苯甲醛这一中间体的杂质含量，尽可能在中间体阶段降低异构体杂质含量，从而提高终产物的纯度。
本发明提供的一种式Ⅰ所示化合物的产品中异构体杂质含量的检测方法，它包括以下步骤：
a、取式Ⅰ所示化合物的异构体，制备对照品溶液；
b、取待检的式Ⅰ所示化合物的产品，制备供试品溶液；
c、采用高效液相色谱法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测，计算异构体杂质含量；所述高效液相色谱方法的检测条件为：
色谱柱：固定相为硅胶表面涂覆或键合直链淀粉类手性固定相；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚，正己烷比甲基叔丁基醚的比例为160：20～250：20，所述的甲基叔丁基醚中含有15％～75％v/v的乙醇；
检测波长：200nm～300nm。
本发明中，对异构体杂质含量的计算，可以采用高效液相色谱法(HPLC)中常规的测定方式，如外标法、内标法、面积归一法等。在实际操作过程中，可以根据具体需求选择不同的方式。在本发明上述条件已经可以将式I化合物与各异构体杂质有效分离的情况下，对外标法、内标法、面积归一法、自身对照法等含量测定方式的选择，可以是任意的。当然，如果采用内标法，还需要找到不干扰各杂质吸收峰的内标物。在流动相、固定相等色谱条件确定的情况下，内标物的选择仅仅需要进行常规的有限次筛选即可获得。
本发明研究发现，采用上述方法，可以在色谱中将式I化合物与其杂质异构体有效分离，从而实现对式I化合物产品中异构体杂质的测定。本发明中所述式I化合物产品，可以包括但不限于购买的式I化合物、按照现有技术自行合成的式I化合物等。
本发明一个具体实施方式中，流动相选自正己烷-甲基叔丁基醚，正己烷比甲基叔丁基醚的比例为160：20～250：20，所述的甲基叔丁基醚中含有15％～75％(ml/ml)的乙醇；例如正己烷比甲基叔丁基醚的比例可以是但不限于160：20、165：20、170：20、175：20、180：20、185：20、190：20、195：20、200：20、210：20、215：20、220：20、225：20、230：20、235：20、240：20、245：20、250：20等；甲基叔丁基醚中含有乙醇的体积百分比可以是但不限于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％等。
其中，如上所述异构体杂质至少包括4-(4-氟苄氧基)苯甲醛或/和4-(2-氟苄氧基)苯甲醛。本发明一个具体实施方式中，所述异构体杂质为4-(4-氟苄氧基)苯甲醛或/和4-(2-氟苄氧基)苯甲醛。使用本发明检测方法，可以单独对其中一种异构体杂质进行测定，当然，也可以同时对多种异构体杂质进行测定。
本发明中所述的色谱柱——硅胶表面涂覆或键合直链淀粉类手性固定相，属于多糖衍生物手性色谱柱之一，目前多糖衍生物手性色谱柱多为纤维素类和直链淀粉类。直链淀粉类中最常见的为硅胶表面涂覆或键合直链淀粉苯基氨甲酸酯或其衍生物的手性固定相。目前经常使用的有直链淀粉一三(苯基氨基甲酸酯)(ATPC)，直链淀粉一三(3，5一二甲基苯基氨基甲酸酯)(ADMPC)，支链淀粉一三(苯基氨基甲酸酯)(APTPC)和支链淀粉一三(苯基甲酸酯)(APTB)四种手性固定相。色谱填料的选择，还需要与流动相匹配，尽可能避免流动相对色谱柱的损害，这种匹配可以通过常规实验以及色谱柱说明书中记载的相关内容进行常规选择。
本发明一个具体实施方式中，所述直链淀粉苯基氨甲酸酯衍生物选自直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)中的一种；可以优先选自直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)。
本发明中，色谱柱的长度为100～250mm，内径为3.0～4.6mm，填料的粒径为2～5μm。进一步可以选自：色谱柱的长度为100～250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为3～5μm。
本发明具体实施方式中使用的色谱柱商品名为 IF-3、 IF、等中的一种，但是，只要满足上述描述的色谱柱均可运用于本发明的检测方法，不限于上述商品。
本发明一个具体实施方式中，色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
本发明一个具体实施方式中，步骤a、b中，制备对照品溶液或者供试品溶液的溶剂分别独立选自步骤c中的流动相、正己烷、乙醇、正己烷与乙醇混合溶液、正己烷与异丙醇混合溶液、正己烷与乙醇和异丙醇的混合溶液中的一种。以流动相作为溶剂，可以更好地避免检测过程中的其他溶剂干扰。
本发明所称“混合溶液”中，可以按照任意比例混合。
本发明步骤c中，色谱柱的柱温选自20℃～40℃。一般使用的柱温通常为室温，可以是20～30℃，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃。
本发明步骤c中，流动相流速按照常规HPLC操作即可，流速可以根据色谱柱尺寸型号、色谱峰保留时间来进行适当的调整，但通常这些调整都在常规流速范围内，如本发明所述流动相的流速就可以选自0.6ml/min～1.0ml/min；本发明一个具体实施方式中所述流动相的流速为0.8ml/min。若色谱柱固定相填料粒径较小时，应相应调整流动相流速，例如降低流速。
本发明检测波长按照HPLC常用规则选取即可，即一般是在待检样品的最大吸收波长或临近波长进行检测，当然，如果发现了溶剂或其他原因的干扰，可以适当选取其他吸收波长。而检测波长的选取，可以通过将待检样品单独采用紫外分光光度法测定获得，也可以直接通过二极管阵列(DAD)或类似的检测器在HPLC检测过程中查找获取，目前大多数检测器均可实现全波段扫描，检测人员可以通过扫描所得图谱轻松地找到相应的检测波长。本发明中，所述的检测波长在200nm～300nm范围内，在该波长范围内有吸收部分均可实现检测，当然，作为本领域的一个常识，考虑到吸收稳定性，即细微的波长变化对峰面积影响，可以优先选择吸收变化较平滑的波长，从而避免外标法中仪器波长变化导致按峰面积计算误差较大的问题。
本发明一个具体实施方式中，检测波段可以进一步在210～220nm或265～275nm中选择。具体地，所述的检测波长可以是210nm、216nm、268nm。
本发明中，供试品溶液或对照品溶液的进样体积大小，可以按照常规HPLC设备规定进行操作，本发明具体实施方式中，进样体积为10μl～50μl，例如进样体积为20μl。
本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物的产品中异构体杂质含量的检测方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了终产品甲磺酸沙芬酰胺的产品质量和患者的用药安全。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明检测条件下实施例1杂质A对照品溶液的HPLC图。
图2为本发明检测条件下实施例1杂质B对照品溶液的HPLC图。
图3为本发明检测条件下实施例14-(3-氟苄氧基)苯甲醛溶液的HPLC图。
图4为本发明检测条件下实施例14-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图5为实施例2色谱条件下216nm波长下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图6为实施例2色谱条件下210nm波长下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图7为实施例2色谱条件下268nm波长下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图8为实施例3色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图9为实施例4色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图10为对比试验1色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。
图11为对比试验1色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。
图12为对比试验1色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛溶液的HPLC图。
图13为对比试验2色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。
图14为对比试验2色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。
图15为对比试验2色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛溶液的HPLC图
图16为对比试验2色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图。
图17为对比试验3色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。
图18为对比试验3色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛溶液的HPLC图。
图19为对比试验4色谱条件下杂质A的混合溶液。
图20为对比试验4色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛溶液的HPLC图。
图21为对比试验4色谱条件下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B的混合溶液。
图22为试验例1第1项下4-(3-氟苄氧基)苯甲醛的紫外光谱图。
图23为试验例1第1项下杂质A的紫外光谱图。
图24为试验例1第1项下杂质B的紫外光谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得；
例如，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛(化合物M1，如式Ⅰ所示)的批号为20150901；杂质A对照品的批号为20150526，含量：97.4％；杂质B对照品的批号为20150527，含量：99.1％；均来源于成都百裕制药股份有限公司。
杂质A为甲磺酸沙芬酰胺中间体(化合物M1，如式Ⅰ所示)的位置异构体，其名称为4-(4-氟苄氧基)苯甲醛。
杂质B为甲磺酸沙芬酰胺中间体(化合物M1，如式Ⅰ所示)的位置异构体，其名称为4-(2-氟苄氧基)苯甲醛。
AUW220D型精密电子天平可购自岛津公司；安捷伦7890B气相色谱仪，LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，SPD-M20A DAD检测器可购自岛津公司，SIL IF(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱， AD-H(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱可购自大赛璐公司；Waters symmetryC18(250mm×4.6mm,5μm)可购自沃特世公司；CYCLOSIL-B毛细管柱(30mm×0.32mm×3μm)可购自安捷伦有限公司。
实施例1、本发明检测4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质的高效液相色谱方法
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚(190:20)(甲基叔丁基醚中含25％的乙醇)
溶剂：流动相
柱温：25℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长216nm)。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL含1μg的杂质A对照品溶液。
取杂质B对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL含1μg的杂质B对照品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加溶剂稀释，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加入杂质A、B对照品溶液，用溶剂稀释，配制成混合溶液。
测定法：取上述溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1～图4。
图1为杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为19.217min。
图2为杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为16.072min。
图3为4-(3-氟苄氧基)苯甲醛样品溶液的HPLC图，样品主峰的保留时间21.494min。
图4为样品和杂质A、杂质B混合溶液的HPLC图，样品的保留时间为21.449min，杂质A的保留时间为19.220min，杂质B的保留时间为16.184min，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为6.231，3.754。
结果表明，本发明的色谱条件下，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛与杂质之间的分离度高，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中无其他杂质干扰杂质A、杂质B的检测。
实施例2、检测4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质的高效液相色谱方法
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚(230:20)(甲基叔丁基醚中含25％的乙醇)
溶剂：流动相
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长216nm、210nm、268nm)。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加入杂质A、B对照品溶液，用溶剂稀释，配制成混合溶液。取溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图并分别在210nm、216nm、268nm波长下分析图谱，结果如图5～7。
图5为样品和杂质A、杂质B混合溶液的在216nm波长下HPLC图，样品的保留时间为18.303min，杂质A的保留时间为16.601min，杂质B的保留时间为14.172min，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为5.52，2.61。杂质A、杂质B峰高为40536、36623。
图6为样品和杂质A、杂质B混合溶液的在210nm波长下HPLC图，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为5.43，2.76。杂质A、杂质B峰高为37650、400823。
图7为样品和杂质A、杂质B混合溶液的在268nm波长下HPLC图，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为5.57，2.84。杂质A、杂质B峰高为47023、47802。
结果表明，本发明的色谱条件下，210nm、216nm、268nm波长下，2，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛与杂质之间的分离度高，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中无其他杂质干扰杂质A、杂质B的检测。
实施例3、检测4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质的高效液相色谱方法
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚(180:20)(甲基叔丁基醚中含25％的乙醇)
溶剂：流动相
柱温：20℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长216nm)。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加入杂质A、B对照品溶液，用溶剂稀释，配制成混合溶液。取溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图并分别在210nm、216nm、268nm波长下分析图谱，结果如图8。
图8为样品和杂质A、杂质B混合溶液的在216nm波长下HPLC图，样品的保留时间为16.261min，杂质A的保留时间为14.830min，杂质B的保留时间为12.796min，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为5.22，2.53。结果表明，本发明的色谱条件下，2，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛与杂质之间的分离度高，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中无其他杂质干扰杂质A、杂质B的检测。
实施例4、检测4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中位置异构体杂质的高效液相色谱方法
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚(190:20)(甲基叔丁基醚中含50％的乙醇)
溶剂：流动相
柱温：25℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长216nm)。
进样体积：20μL。
检测步骤：
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加入杂质A、B对照品溶液，用溶剂稀释，配制成混合溶液。取溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图并分别在210nm、216nm、268nm波长下分析图谱，结果如图9。
图9为样品和杂质A、杂质B混合溶液的在216nm波长下HPLC图，样品的保留时间为14.340min，杂质A的保留时间为13.195min，杂质B的保留时间为11.496min，样品与杂质A、杂质B，以及杂质之间的分离度分别为4.91，2.21。结果表明，本发明的色谱条件下，2，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛与杂质之间的分离度高，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中无其他杂质干扰杂质A、杂质B的检测。
对比试验1：
色谱柱：Water Symmetry C18 4.6mm×250mm，5μm；
流动相A：磷酸盐缓冲液①〔取6.8g磷酸二氢钾，加水溶解并稀释1000ml，用磷酸调节pH至3.0〕；
流动相B：甲醇-乙腈(50:50)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长226nm)。
梯度洗脱条件如下：
取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的杂质A对照品溶液。
取杂质B对照品适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的杂质B对照品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图10～12所示。
图10为对比试验1色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A保留时间为36.563min。
图11为对比试验1色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间36.505min。
图12为对比试验1色谱条件下供试品溶液的HPLC图，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛的保留时间36.218min。
结果表明，杂质A、杂质B和样品主峰几乎完全重合，该方法完全不能进行杂质A、杂质B分离检测。
对比试验2：
色谱柱： AD-H，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-乙醇(85:15)
溶剂：流动相
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长254nm)。
进样体积：20μL。
取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5μg的杂质A对照品溶液。
取杂质B对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5μg的杂质B对照品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质A、杂质B对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各杂质0.5μg，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛0.5mg的混合溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图13～16所示。
图13为对比试验2色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为7.144min。
图14为对比试验2色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为8.423min。
图15为对比试验2色谱条件下样品的HPLC图，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰保留时间为7.595min。
图16为对比试验2色谱条件下混合溶液的HPLC图，杂质A保留时间为7.125min，杂质B被4-(3-氟苄氧基)苯甲醛主峰拖尾处掩盖，且杂质峰处有其他峰干扰。因此，对比试验2的方法不能准确检测杂质A和杂质B。
对比试验3：
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲基叔丁基醚-乙醇(75:25)
溶剂：流动相
柱温：35℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：20μL。
取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5μg的杂质A对照品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图17～18所示。
图17为对比试验4色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为4.481min。
图18为对比试验4色谱条件下样品的HPLC图，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰保留时间为4.504min。杂质A和样品4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰几乎完全重合，且与溶剂峰不能分离，因此，对比试验4的方法不能用于4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中杂质A的检测。
对比试验4：
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-乙醇(95:5)
溶剂：流动相
柱温：30℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：20μL。
取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5μg的杂质A对照品溶液。
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图19～21所示。
图19为对比试验5色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为4.481min。
图20为对比试验5色谱条件下样品的HPLC图，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰保留时间为4.504min。
图21为对比试验5色谱条件下混合溶液的HPLC图，杂质B与4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰分离度良好，但杂质A被完全包裹在4-(3-氟苄氧基)苯甲醛峰内。
上述对比实验4和对比实验5与本发明流动相近似，能分离4-(3-氟苄氧基)苯甲醛和杂质B，但均无将杂质A与4-(3-氟苄氧基)苯甲醛分开的趋势，不能通过简单调整比例和流速将其分开的可能性。对比实验3能将杂质A、杂质B与4-(3-氟苄氧基)苯甲醛分离，但分离度并不理想，且受色谱柱柱效影响较大。因此，本发明对杂质A、杂质B与4-(3-氟苄氧基)苯甲醛的分离有明显优势。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1、本发明检测方法的方法学研究
本试验例中各种试验均采用如下条件：
色谱柱： IF，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚(190:20)(甲基叔丁基醚中含25％的乙醇)
溶剂：流动相
柱温：25℃；流速：0.8ml/min；UV检测器(检测波长216nm)。
进样体积：20μL。
1、检测波长
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛及杂质A、杂质B适量，用甲醇溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图22～24所示。
结果显示，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛、杂质A、杂质B在200～300nm均有吸收，紫外光谱图略有区别，因此选择在200～300nm范围内选择测定波长。而在216nm波长附近，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛、杂质A、杂质B均有较大吸收，且吸收峰较平缓，此处波长的细微变化，对杂质峰面积影响较小，因此对最终选择检测波长216nm作为4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中异构体检测的检测波长。
2、专属性试验
取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛适量，用乙醇溶解后，加流动相稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取杂质A、杂质B适量，加流动相溶解并稀释，配制杂质对照品溶液。分别精密取上述杂质对照品溶液、供试品溶液及溶剂各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图1～4所示。
结果表明，在本发明检测方法的条件下，4-(3-氟苄氧基)苯甲醛样品及溶剂对杂质A、杂质B的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。
3、标准曲线和线性范围
精密量取杂质A、杂质B对照品溶液适量，用流动相稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果见表1。
表1、线性关系
以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算杂质的线性回归方程及相关系数r。
结果表明，本发明检测方法中杂质A的浓度在0.0257μg/mL～1.0285μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝121375.8676X-140.1120，r＝1；杂质B的浓度在0.0280μg/mL～1.1206g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝118832.9531X+38.2545，r＝1；证明本发明方法线性范围广，准确度高。
此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法，同时，不仅仅限于外标法，由于本品与杂质结构相似，紫外吸收图谱相似，仍可以采用面积归一法和自身对照法进行计算。
4、精密度试验
取试验例1第3项下的混合杂质对照品溶液3#，精密取20μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表2。
表2、精密度试验结果
计算得到杂质A峰面积的RSD为：0.96％，杂质B峰面积的RSD为1.43％，证明本发明的检测方法精密度优异。
5、定量限
量取试验例第3项下混合杂质对照品溶液5#，精密量取20μl，注入液相色谱仪，按照本发明的检测方法测定峰面积及基线噪音，结果见表3。
表3、定量限试验结果
杂质名称 浓度(μg/mL) 定量限(ng)
杂质A 0.0061 0.1210
杂质B 0.0068 0.1358
杂质A、杂质B的峰高均约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质A的定量限为0.1210ng，杂质B的定量限为0.1358ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足杂质定量测定的要求。
6、重复性试验
精密称取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛样品6份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各20μL，按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算杂质A和杂质B的含量，结果见表4。
表4、重复性试验结果
样品编号 1 2 3 4 5 6 平均
杂质A 0.060％ 0.058％ 0.060％ 0.060％ 0.061％ 0.061％ 0.060％
杂质B 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％
6份样品中检出杂质A含量的RSD值为1.90％。结果说明，本发明检测方法的重复性良好。
7、溶液稳定性试验
精密称取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛约10mg，置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h进样20μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中杂质A、杂质B和杂质C的稳定性情况，结果见表5。
表5、供试品溶液稳定性试验结果表
放置时间 0h 4h 6h 8h 10h 12h
杂质A 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％ 0.000％
杂质B 0.060％ 0.059％ 0.060％ 0.061％ 0.061％ 0.062％
由上述结果可知，在配制后12小时内供试品溶液中杂质A未检出、杂质B检出平均值为0.061％，检出量RSD为1.78％，证明本发明检查方法供试品溶液稳定。
8、回收率试验
精密称取4-(3-氟苄氧基)苯甲醛样品9份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加入试验例第3项下各杂质浓度约为20μg/mL的对照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及试验例第4项下的对照品溶液各20μL进样测定，记录色谱图，计算杂质A和杂质B杂质C的测得量、对照品加入量及回收率，结果见表6～7。
计算公式：
式中：a为供试品中所含异构体杂质的量(μg)；
b为异构体杂质对照品加入量(μg)；
c为异构体杂质的测得量(μg)。
表6、杂质A回收率试验结果
结果表明，本发明检测方法测定4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中的异构体杂质A，回收率在101.5％～105.4％之间，相对标准偏差为1.22％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
表7、杂质B回收率试验结果
结果表明，本发明检测方法测定4-(3-氟苄氧基)苯甲醛中的异构体杂质B，回收率在97.1％～100.9％之间，相对标准偏差为1.08％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
综上所述，本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物的产品中位置异构体杂质含量的检测方法，式Ⅰ所示化合物色谱峰与位置异构体色谱峰之间的分离度高；而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性好、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率准确度高，方法重现性好，检测结果准确、可靠，为监控式Ⅰ所示化合物的产品质量提供了一种行之有效的检测方法，并进一步保证了终产物甲磺酸沙芬酰胺的产品质量和患者的用药安全。

Claims (8)

1.式Ⅰ所示化合物产品中异构体杂质的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
a、取式Ⅰ所示化合物的异构体杂质，制备对照品溶液；
b、取待检的式Ⅰ所示化合物产品，制备供试品溶液；
c、采用高效液相色谱法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测，计算异构体杂质含量；所述高效液相色谱方法的检测条件为：
色谱柱：固定相为硅胶表面涂覆或键合直链淀粉类手性固定相；
流动相：正己烷-甲基叔丁基醚，正己烷比甲基叔丁基醚的比例为160：20～250：20，所述的甲基叔丁基醚中含有15％～75％v/v的乙醇；
检测波长：200nm～300nm；
所述异构体杂质为4-(4-氟苄氧基)苯 甲醛或/和4-(2-氟苄氧基)苯甲醛。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述硅胶表面涂覆或键合直链淀粉类手性固定相选自硅胶表面涂覆或键合直链淀粉苯基氨甲酸酯或其衍生物的手性固定相。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述直链淀粉苯基氨甲酸酯衍生物选自直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)中的一种。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：制备对照品溶液或供试品溶液的溶剂，分别独立选自步骤c中流动相、正己烷、乙醇、正己烷与乙醇混合溶液、正己烷与异丙醇混合溶液、正己烷与乙醇和异丙醇的混合溶液中的一种。
5.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱的长度为100～250mm，内径为3.0～4.6mm，填料的粒径为2～5μm。
6.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱的柱温为20℃～40℃。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：色谱柱的柱温为20～30℃。
8.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的检测波长选自210～220nm或265～275nm。
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