CN107219291B - 快速检测酪氨酸浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测酪氨酸浓度的方法，包括以下步骤：步骤一、以玻碳电极为工作电极搭建三电极体系，用差分脉冲伏安法分别测量并记录多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，并记录对应的电压强度峰值；步骤二、以每份含酪氨酸的缓冲PBS冲溶液的电压强度峰值与不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值的差值为纵坐标，以每份酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算线性方程；步骤三、采用步骤一的方法得到待测溶液的电压强度峰值，代入线性方程得待测溶液的酪氨酸浓度。本发明具有操作简单、检测快速且灵敏度高的优点，能进行混合样品溶液中酪氨酸的高灵敏识别。

Description

快速检测酪氨酸浓度的方法
技术领域
本发明涉及酪氨酸浓度检测领域。更具体地说，本发明涉及一种快速检测酪氨酸浓度的方法。
背景技术
酪氨酸(Tyrosine，Tyr)属于芳香族氧基酸，在体内可由苯丙氨酸经化而来，是人体重要的半必需氨基酸。酪氨酸的代谢斎乱可导致多种遗传性疾病的发生，如酪氨酸血症、尿黑酸症等，而且与肝肾疾病、神经系统变性性疾病、恶性肿瘤等有一定的相关性。酪氨酸是人体不可缺少的一种氨基酸，它是合成神经递质儿茶酚胺的前体，缺乏酪氨酸人体就会出现生长异常，智能低下等现象，因此国内外已普遍开始重视食品中酪氨酸含量的添加。研究发现，酪氨酸及其代谢产物的含量在健康人和遗传性疾病、肝肾疾病以及恶性肿瘤等疾病患者体液中有明显差异。因此，探索酪氨酸及其代谢产物含量的分析新技术并应用于实际样品测定，对某些疾病的诊断、治疗和监测具有十分重要的临床意义。测定酪氨酸的方法主要有氨基酸自动分析仪、分光光度法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振波谱法和毛细管电泳法等,这些技术虽然应用比较广泛，但使用的仪器昂贵、前处理复杂费时、试剂消耗量大且分析时间较长，混合样品检测不灵敏的缺陷，检测限高，不能满足现场快速检测的需求。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中酪氨酸的高灵敏识别。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种快速检测酪氨酸浓度的方法，包括以下步骤：
步骤一、采用玻碳电极作为工作电极搭建三电极体系，利用差分脉冲伏安法，分别测量并记录多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，在此过程中记录每份含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值；
步骤二、以步骤一得到的每份含酪氨酸的缓冲PBS冲溶液的电压强度峰值与不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值的差值作为纵坐标，以每份酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算线性方程；
步骤三、以玻碳电极作为工作电极，使用三电极体系差分脉冲伏安法测量并记录待测溶液的差分脉冲伏安曲线，得到待测溶液的电压强度峰值，代入所述线性方程得到待测溶液的酪氨酸浓度。
优选的是，步骤一中配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的pH均为7.4，其浓度均为0.1mol/L，酪氨酸浓度依次为5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、4.5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10- 4mol/L、3×10-4mol/L。
优选的是，所述玻碳电极经过打磨处理，具体为：将玻碳电极先用紫薯粉水溶液浸泡20～30min，取出玻碳电极用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡20～30min，再依次用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5～10min，然后依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨，再用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5～10min，最后用氮气吹干即可；
其中，紫薯粉水溶液的制备具体为：紫薯粉与去离子水以质量体积比为1g:10～20ml混合，并置于40～60℃水浴条件下搅拌20～30min；
大豆磷脂与四氯化碳的质量体积比为1g:20～50ml。
优选的是，打磨处理后的玻碳电极进行修饰，具体为：以质量体积比为1g:10ml往研钵内加入碳纳米管和质量分数为95％的乙醇，研磨10～15min后，再加入去离子水并进行超声处理，超声温度为40～60℃，超声频率为400kHz，超声时间为20～30min，形成碳纳米管悬浮液，取5ml碳纳米管悬浮液滴加在打磨处理后的玻碳电极上，经红外干燥即可。
优选的是，对碳纳米管进行预处理，具体为：
S1、将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精置于离子水中超声处理，超声时间为20～30min，再加入碳纳米管，继续超声处理2～3h，得混合液A，超声频率均为400kHz，其中，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-环糊精、碳纳米管、以及去离子水的质量体积比为1g:0.2～0.5g:2～3g:100～120ml；
S2、在搅拌作用下向混合液A中加入质量分数为80％的水合肼，并置于80～90℃水浴中反应4～5h，冷却后，离心处理得沉淀，并用去离子水对沉淀进行洗涤，用红外干燥即可，其中，混合液A与质量分数为80％的水合肼的体积比为1:0.2～0.4。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明的检测方法具有电子传递速率快、稳定性好、制备简单、操作方便的优点，检测过程简单方便、灵敏度高、检测限低，可实现实际样品中酪氨酸的快速检测；
第二、从差分脉冲伏安曲线中可得知待检测溶液对应的电压强度随酪氨酸的浓度的增加而增强，且电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，因此，玻碳电极可以作为检测酪氨酸的电极，快速并定量检测溶液中酪氨酸的含量，对酪氨酸的检测限可达到6×10- 7mol/L；
第三、玻碳电极经紫薯粉水溶液、大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡后，再打磨，可以缓和利用氧化铝粉末打磨时与玻碳电极的摩擦作用，以使玻碳电极的表面达到更细致的纹路，减小因纹路的差异而引起的电化学信号误差，从而提高准确性；
第四、碳纳米管由碳原子形成的无缝纳米碳材料，中空的管体，具有良好的表面与界面特性和电化学性，玻碳电极利用碳纳米管进行修饰后，可以大大提高电极的电化学信号强度，使电子定向传输，消除了其它电子干扰因素，大大提升了灵敏度，检测限可达6×10-8mol/L；
第五、采用经邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精超声处理，及与水合肼反应后的碳纳米管，用此碳纳米管修饰后的玻碳电极的电化学信号更加稳定，使得在5～45℃温度范围内检测酪氨酸，其检测限和检测准确性仍然很好，且重复测量多次，电化学信能仍然稳定。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的差分脉冲伏安曲线图；
图2为本发明酪氨酸的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
一种快速检测酪氨酸浓度的方法，包括以下步骤：
步骤一、配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的pH均为7.4，其浓度均为0.1mol/L，酪氨酸浓度依次为5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、2.5×10- 5mol/L、4.5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L、3×10-4mol/L。采用玻碳电极作为工作电极搭建三电极体系，设定初始电位为0.4V，终止电位为1.0V，然后设置如下脉冲参数：电位增量为0.004V，方波频率为50Hz，方波幅度为0.05V，等待时间为2s。利用差分脉冲伏安法，分别测量并记录多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，在此过程中记录每份含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值；
步骤二、以步骤一得到的每份含酪氨酸的缓冲PBS冲溶液的电压强度峰值与不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值的差值作为纵坐标，以每份酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算线性方程；
如图1为差分脉冲伏安曲线，其中曲线a、b、c、d、e、f、g、h、i和j分别为酪氨酸的标准液浓度为0mol/L、5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、4.5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L和3×10-4mol/L的标准溶液的差分脉冲伏安曲线。用5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、4.5×10-5mol/L、7×10- 5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L和3×10-4mol/L的标准溶液的电压强度峰值分别减去0mol/L标准溶液的电压强度峰值，得到九个电压强度峰值差值。从图1可知待测溶液对应的电压强度峰值随酪氨酸的浓度的增加而增强。
图2为酪氨酸的标准曲线图，图中Y为电压强度峰值差值，单位为mV，X为酪氨酸的标准液浓度，单位为μM，电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，R2＝0.9961，检测限为6×10-7mol/L。
步骤三、按照步骤一测量并记录待检测溶液的差分脉冲伏安曲线，得到待测溶液的电压强度峰值，该差分脉冲伏安曲线的电压强度峰值与不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值的差值代入到所述线性方程中，从差分脉冲伏安曲线读出电压强度峰值减去0mol/L标准溶液的电压强度峰值，即得到Y值，将Y值代入线性方程即可解出X，即可得到待检测溶液中酪氨酸的浓度。
<实施例2>
一种快速检测酪氨酸浓度的方法，测定步骤同实施例1，其中，
所述玻碳电极经过打磨处理，具体为：将玻碳电极先用紫薯粉水溶液浸泡20min，取出玻碳电极用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡20min，再依次用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5min，然后依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨，再用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5min，最后用氮气吹干即可；
其中，紫薯粉水溶液的制备具体为：紫薯粉与去离子水以质量体积比为1g:10ml混合，并置于40℃水浴条件下搅拌20min；
大豆磷脂与四氯化碳的质量体积比为1g:20ml。
打磨处理后的玻碳电极进行修饰，具体为：以质量体积比为1g:10ml往研钵内加入碳纳米管和质量分数为95％的乙醇，研磨10min后，再加入去离子水并进行超声处理，超声温度为40℃，超声频率为400kHz，超声时间为20min，形成碳纳米管悬浮液，取5ml碳纳米管悬浮液滴加在打磨处理后的玻碳电极上，经红外干燥即可。
碳纳米管进行预处理，具体为：
S1、将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精置于离子水中超声处理，超声时间为20min，再加入碳纳米管，继续超声处理2h，得混合液A，超声频率均为400kHz，其中，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-环糊精、碳纳米管、以及去离子水的质量体积比为1g:0.2g:2g:100ml；
S2、在搅拌作用下向混合液A中加入质量分数为80％的水合肼，并置于80℃水浴中反应4h，冷却后，离心处理得沉淀，并用去离子水对沉淀进行洗涤，用红外干燥即可，其中，混合液A与质量分数为80％的水合肼的体积比为1:0.2。
电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，R2＝0.9995。
<实施例3>
一种快速检测酪氨酸浓度的方法，测定步骤同实施例1，其中，
所述玻碳电极经过打磨处理，具体为：将玻碳电极先用紫薯粉水溶液浸泡30min，取出玻碳电极用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡30min，再依次用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗10min，然后依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨，再用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗10min，最后用氮气吹干即可；
其中，紫薯粉水溶液的制备具体为：紫薯粉与去离子水以质量体积比为1g:20ml混合，并置于60℃水浴条件下搅拌30min；
大豆磷脂与四氯化碳的质量体积比为1g:50ml。
打磨处理后的玻碳电极进行修饰，具体为：以质量体积比为1g:10ml往研钵内加入碳纳米管和质量分数为95％的乙醇，研磨15min后，再加入去离子水并进行超声处理，超声温度为60℃，超声频率为400kHz，超声时间为30min，形成碳纳米管悬浮液，取5ml碳纳米管悬浮液滴加在打磨处理后的玻碳电极上，经红外干燥即可。
碳纳米管进行预处理，具体为：
S1、将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精置于离子水中超声处理，超声时间为30min，再加入碳纳米管，继续超声处理3h，得混合液A，超声频率均为400kHz，其中，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-环糊精、碳纳米管、以及去离子水的质量体积比为1g:0.5g:3g:120ml；
S2、在搅拌作用下向混合液A中加入质量分数为80％的水合肼，并置于90℃水浴中反应5h，冷却后，离心处理得沉淀，并用去离子水对沉淀进行洗涤，用红外干燥即可，其中，混合液A与质量分数为80％的水合肼的体积比为1:0.4。
电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，R2＝0.9995。
<实施例4>
一种快速检测酪氨酸浓度的方法，测定步骤同实施例1，其中，
所述玻碳电极经过打磨处理，具体为：将玻碳电极先用紫薯粉水溶液浸泡25min，取出玻碳电极用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡25min，再依次用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗8min，然后依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨，再用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗8min，最后用氮气吹干即可；
其中，紫薯粉水溶液的制备具体为：紫薯粉与去离子水以质量体积比为1g:15ml混合，并置于50℃水浴条件下搅拌25min；
大豆磷脂与四氯化碳的质量体积比为1g:30ml。
打磨处理后的玻碳电极进行修饰，具体为：以质量体积比为1g:10ml往研钵内加入碳纳米管和质量分数为95％的乙醇，研磨12min后，再加入去离子水并进行超声处理，超声温度为50℃，超声频率为400kHz，超声时间为25min，形成碳纳米管悬浮液，取5ml碳纳米管悬浮液滴加在打磨处理后的玻碳电极上，经红外干燥即可。
碳纳米管进行预处理，具体为：
S1、将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精置于离子水中超声处理，超声时间为25min，再加入碳纳米管，继续超声处理2.5h，得混合液A，超声频率均为400kHz，其中，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-环糊精、碳纳米管、以及去离子水的质量体积比为1g:0.3g:2.5g:110ml；
S2、在搅拌作用下向混合液A中加入质量分数为80％的水合肼，并置于85℃水浴中反应4.5h，冷却后，离心处理得沉淀，并用去离子水对沉淀进行洗涤，用红外干燥即可，其中，混合液A与质量分数为80％的水合肼的体积比为1:0.3。
电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，R2＝0.9995。
抗温度干扰检测方法
一种快速检测酪氨酸浓度的方法，测定步骤同实施例4，其中，
在三种不同的温度下进行检测实验，第一组检测时配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液和不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的温度为5℃，玻碳电极的温度为5℃，待检测溶液的温度为5℃；第二组检测时配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液和不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的温度为25℃，玻碳电极的温度为25℃，待检测溶液的温度为25℃，第三组检测时配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液和不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的温度为45℃，玻碳电极的温度为45℃，待检测溶液的温度为45℃。上述三组检测实验的待检测溶液的酪氨酸浓度为已知浓度且均相同，通过上述实验可知在5～45℃范围内，电压强度与酪氨酸浓度有良好的线性关系，R2在0.9990～0.9996之间，检测限为6×10- 8mol/L。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.一种快速检测酪氨酸浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用玻碳电极作为工作电极搭建三电极体系，利用差分脉冲伏安法，分别测量并记录多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液的差分脉冲伏安曲线，在此过程中记录每份含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值；
步骤二、以步骤一得到的每份含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值与不含酪氨酸的PBS缓冲溶液的电压强度峰值的差值作为纵坐标，以每份酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算线性方程；
步骤三、以玻碳电极作为工作电极，使用三电极体系差分脉冲伏安法测量并记录待测溶液的差分脉冲伏安曲线，得到待测溶液的电压强度峰值，代入所述线性方程得到待测溶液的酪氨酸浓度；
所述玻碳电极经过打磨处理，具体为：将玻碳电极先用紫薯粉水溶液浸泡20～30min，取出玻碳电极用大豆磷脂的四氯化碳溶液浸泡20～30min，再依次用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5～10min，然后依次用粒径为0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨，再用质量分数为95％的乙醇水溶液、二次蒸馏水分别超声清洗5～10min，最后用氮气吹干即可；
其中，紫薯粉水溶液的制备具体为：紫薯粉与去离子水以质量体积比为1g:10～20ml混合，并置于40～60℃水浴条件下搅拌20～30min；
大豆磷脂与四氯化碳的质量体积比为1g:20～50ml。
2.如权利要求1所述的快速检测酪氨酸浓度的方法，其特征在于，步骤一中配制的多份含有不同浓度的酪氨酸的PBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的pH均为7.4，其浓度均为0.1mol/L，酪氨酸浓度依次为5.0×10-6mol/L、1×10-5mol/L、2.5×10-5mol/L、4.5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L、3×10-4mol/L。
3.如权利要求1所述的快速检测酪氨酸浓度的方法，其特征在于，打磨处理后的玻碳电极进行修饰，具体为：以质量体积比为1g:10ml往研钵内加入碳纳米管和质量分数为95％的乙醇，研磨10～15min后，再加入去离子水并进行超声处理，超声温度为40～60℃，超声频率为400kHz，超声时间为20～30min，形成碳纳米管悬浮液，取5ml碳纳米管悬浮液滴加在打磨处理后的玻碳电极上，经红外干燥即可。
4.如权利要求3所述的快速检测酪氨酸浓度的方法，其特征在于，对碳纳米管进行预处理，具体为：
S1、将邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯和β-环糊精置于去离子水中超声处理，超声时间为20～30min，再加入碳纳米管，继续超声处理2～3h，得混合液A，超声频率均为400kHz，其中，邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯、β-环糊精、碳纳米管、以及去离子水的质量体积比为1g:0.2～0.5g:2～3g:100～120ml；
S2、在搅拌作用下向混合液A中加入质量分数为80％的水合肼，并置于80～90℃水浴中反应4～5h，冷却后，离心处理得沉淀，并用去离子水对沉淀进行洗涤，用红外干燥即可，其中，混合液A与质量分数为80％的水合肼的体积比为1:0.2～0.4。
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