一种小分子芯片、其构建方法、其应用及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域,特别涉及一种小分子芯片、其构建方法、其应用及其检测方法。
背景技术
小分子芯片也称小分子微阵列,是生物芯片研究的重要分支之一。自从哈佛大学Schreiber课题组1999年首次报道小分子微阵列以来,小分子芯片得到了广泛的应用。目前小分子芯片的研究主要有两个方向,一是基于小分子芯片载体表面化学修饰及小分子化合物固定化策略为主的基础性研究,二是拓展小分子芯片的应用范围。近年来,小分子芯片已经成功应用于各种蛋白质配体的筛选、蛋白质与小分子之间的相互作用、酶的抑制剂筛选、酶活性图谱研究、高通量药物筛选、食品和临床检测及细胞表面与小分子的相互关系等领域。
侵袭和转移是肿瘤的恶性标志,其往往是肿瘤发生和演进过程中的最终阶段,临床肿瘤患者约80%以上死于侵袭和转移。微转移与肿瘤复发、转移及预后密切相关,微转移的确诊为临床手术方式的选择、淋巴结清扫范围及肿瘤分期提供依据,并能指导综合治疗。因此,如何准确发现肿瘤微转移成为当前的研究热点之一。研究发现,性别决定区Y框蛋白18(SOX18蛋白)与肿瘤的微转移有关,因此,SOX18蛋白的检测对于科研具有重要的意义。
现有技术中,主要是通过Elisa法来检测SOX18蛋白,此方法利用抗原与抗体的特异反应来检测待测样品中的SOX18蛋白,需要用到SOX18蛋白的特异性抗体。此方法灵敏度高、特异性强,但也具有一定的缺点。例如,Elisa试剂盒中所采用的抗体制备过程复杂,生产成本高;且抗体易变性失活,性能不稳定,运输和存储成本也较高。针对以上缺点,研发一种成本低廉,性能稳定的检测SOX18蛋白的产品和方法具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种小分子芯片,可检测待测样品中的SOX18蛋白,此小分子芯片成本低廉,性能稳定,检测结果准确;此外,本发明还提供了此小分子芯片的构建方法和检测方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种小分子芯片,由光交联芯片和小分子化合物组成,小分子化合物与光交联芯片化学键合;
其中,小分子化合物为以下化合物中的一种或多种:
3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯或2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑。
小分子芯片为无标记的小分子芯片,在使用时不需要任何标记试剂,工作效率高。
作为优选,光交联芯片还与空白对照化学键合。
作为优选,空白对照为DMSO;DMSO的用量为1μL~2μL。
作为优选,阳性对照为雷帕霉素。
作为优选,光交联芯片还与阴性对照化学键合。
作为优选,阴性对照为BSA。
光交联芯片为用紫外交联技术即可固定小分子化合物的芯片。
作为优选,光交联芯片为二维光交联芯片或三维光交联芯片。
更优选地,二维光交联芯片包括固体支持物、两端修饰的聚乙二醇和光交联剂;两端修饰的聚乙二醇为一端由铆定基团修饰,另一端由结合基团修饰的聚乙二醇,固体支持物与铆定基团连接,光交联剂与结合基团连接;铆定基团选自-SH、-S-S-或-SiCl3;结合基团选自-COOH、-OH、-NH2或-OCH3。
更优选地,三维光交联芯片包括固体支持物、引发组合物、引发单体和光交联剂;引发单体通过引发组合物与固体支持物连接;光交联剂与引发单体连接,引发组合物包括引发剂和稀释剂,引发剂为双硫醇引发剂。
本发明还提供了一种小分子芯片的构建方法,包括以下步骤:取小分子化合物与光交联芯片混合,干燥,光交联,清洗,干燥,得到芯片,封闭未结合位点,清洗,干燥,即得。
作为优选,取小分子化合物之后,小分子化合物与光交联芯片混合步骤之前还包含溶解小分子化合物的步骤。
作为优选,溶解小分子化合物的溶剂为DMSO。
作为优选,小分子化合物与光交联芯片混合时,每一种小分子化合物的浓度为5mmol/L~10mmol/L。
作为优选,小分子化合物与光交联芯片混合时,每一种小分子化合物的体积为1μL~2μL。
作为优选,小分子化合物与光交联芯片混合之后,光交联之前,干燥的温度为25℃~30℃。
作为优选,小分子化合物与光交联芯片混合之后,光交联之前,干燥的时间为1h~2h。
作为优选,光交联的具体步骤为:取紫外光照射2~4次,每次照射的时间为1min~3min。
作为优选,紫外光的波长为340nm~380nm。
更优选的,紫外光的波长为365nm,紫外光的能量为0~9999uJ/cm2。
作为优选,光交联之后干燥之前的清洗的洗液为分析纯的有机溶剂和去离子水。
作为优选,洗液中的有机溶剂为DMSO、DMF、THF、DCM、MeCN或EtOH中的任意一种或两者以上的溶剂。
作为优选,光交联之后,干燥之前,清洗为超声波清洗。
作为优选,光交联之后,干燥之前,清洗时,每种洗液清洗的次数为3次~4次,每次清洗的时间为5min~10min。
作为优选,每次清洗的时间为5min。
作为优选,清洗之后,得到芯片之前,干燥为氮气吹干。
作为优选,封闭未结合位点具体为:取芯片与浓度为1mol/L、pH值为8.5的乙醇胺溶液混合。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的小分子芯片的构建方法中,封闭未结合位点所用的乙醇胺溶液的溶剂为DMF。
作为优选,乙醇胺溶液的用量为0.5mL~2mL。
作为优选,混合的温度为25℃~30℃,混合的时间为30min~60min。
作为优选,混合的时间为30min。
作为优选,封闭未结合位点之后,干燥之前,清洗的洗液为乙醇和去离子水。
作为优选,清洗之后,得到小分子芯片之前,干燥为氮气吹干。
本发明还提供了该小分子芯片在制备检测性别决定区Y框蛋白18产品中的应用,
该小分子芯片由光交联芯片和小分子化合物组成,小分子化合物与光交联芯片化学键合,;
其中,小分子化合物为以下化合物中的一种或多种:
3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯或2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑。
本发明还提供了一种采用本发明小分子芯片非诊断目的的检测性别决定区Y框蛋白18的方法,包括以下步骤:
取小分子芯片与待测样品混合,孵育,清洗,得到小分子化合物孵育后产物和空白对照孵育后产物,再经表面等离子体共振成像技术检测,若小分子化合物孵育后产物和空白对照孵育后产物相比有显著(P<0.05)的SPR信号,表明待测样品中含有相应的蛋白。
从实施例8中可知,通过小分子芯片对已知成分的样品a~样品f的检测,所得检测结果和实际情况一致,准确率达到100%,由此说明,本发明的小分子芯片可用来检测SOX18蛋白,检测结果准确。
从实施例9中可知,相比于现有的ELISA试剂盒,本发明提供的小分子芯片检测性能稳定,便于储藏和运输。此外,本发明小分子芯片和ELISA试剂盒相比,还具有成本低廉的优点。
作为优选,孵育的时间为300s~600s,孵育的温度为25℃~30℃。
作为优选,孵育的时间为300s。
作为优选,清洗的溶剂为甘氨酸、盐酸和水的混合溶液,混合溶液的pH值为2.0。
本发明提供了一种小分子芯片,由光交联芯片和小分子化合物组成,小分子化合物与光交联芯片化学键合;其中,小分子化合物为3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯或2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑中的任意一种或多种。
由实施例7可知,3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯或2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑可与SOX18蛋白结合,包含有以上小分子化合物的小分子芯片可用来检测SOX18蛋白。
本发明还提供了小分子芯片的构建方法,由实施例6可知,运用本发明方法构建的小分子芯片,光交联芯片与小分子化合物之间的固定效率高,固定效果好。本发明还提供了一种采用该小分子芯片检测SOX18蛋白的方法及应用,由实施例8可知,本发明的小分子芯片可用来检测SOX18蛋白,检测方法简单,检测结果准确,准确率达到为100%。由实施例9可知,相比于ELISA试剂盒,本发明提供的小分子芯片检测性能稳定,便于储藏和运输。本发明提供的小分子芯片采用与SOX18蛋白结合的小分子化合物来检测SOX18蛋白,避免了抗体的使用,由于抗体属于蛋白质,易变性,生产成本高,小分子化合物具有性质稳定、成本低廉的优点,因此,本发明提供的小分子芯片成本低廉,性能稳定。
附图说明
图1为实施例6中10mmol/L的雷帕霉素与FKBP12蛋白的SPR信号图。
具体实施方式
本发明提供了一种小分子芯片、其构建方法、其应用及其检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的实施例中所用到的试剂及原料均可由市场购得。在本发明实施例中,原料来源具体如下:
GSK3β蛋白:生产厂家为SELLECK中国。
SOX18蛋白:生产厂家为SELLECK中国。
SOX18ELISA试剂盒:生产厂家为Elabscience。
其他原料及试剂均由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 小分子芯片的构建
取小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯和2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑,阳性对照雷帕霉素,将小分子化合物和阳性对照分别溶于DMSO中,浓度均为10mmol/L,纯DMSO作为空白对照,利用高精度自动化点样仪分别取小分子化合物及阳性对照、空白对照2μL点样于三维光交联芯片表面,25℃(干燥室温)下放置1h;待芯片完全干燥后,在紫外光(波长365nm,9999uJ/cm2)下暴露4次,每次时间为3min,光交联固定待测物;将芯片分别浸泡于分析纯的DMSO、DMF、THF、DCM、MeCN和去离子水中,超声波清洗5min,每种溶剂各清洗4次,每次清洗时间为5min,以除去未固定的待测物。充分清洗完毕,氮气吹干后,在25℃下浸泡于1ml乙醇胺(1M,pH=8.5)30min,封闭未结合位点。用乙醇、去离子水分别清洗,氮气吹干,盖上流通池,获得无标记的小分子芯片。
实施例2 小分子芯片的构建
取小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯和2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑,阳性对照雷帕霉素,将小分子化合物和阳性对照分别溶于DMSO中,浓度均为5mmol/L,纯DMSO作为空白对照,利用高精度自动化点样仪分别取小分子化合物及阳性对照、空白对照1μL点样于二维光交联芯片表面,30℃(干燥室温)下放置1.5h;待芯片完全干燥后,在紫外光(波长340nm,0~9999uJ/cm2)下暴露4次,每次时间为1min,光交联固定待测物;将芯片分别浸泡于分析纯的DMSO、DMF和去离子水中,超声波清洗5min,每种溶剂各清洗4次,每次清洗时间为10min,以除去未固定的待测物。充分清洗完毕,氮气吹干后,在30℃下浸泡于2ml乙醇胺(1M,pH=8.5)45min,封闭未结合位点。用乙醇、去离子水分别清洗,氮气吹干,盖上流通池,获得无标记的小分子芯片。
实施例3 小分子芯片的构建
取小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮和1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯,阳性对照雷帕霉素,将小分子化合物和阳性对照分别溶于DMSO中,浓度均为10mmol/L,纯DMSO作为空白对照,利用高精度自动化点样仪分别取小分子化合物及阳性对照、空白对照2μL点样于三维光交联芯片表面,25℃(干燥室温)下放置1h;待芯片完全干燥后,在紫外光(波长365nm,9999uJ/cm2)下暴露4次,每次时间为3min,光交联固定待测物;将芯片分别浸泡于分析纯的DCM、MeCN、EtOH和去离子水中,超声波清洗5min,每种溶剂各清洗3次,每次清洗时间为5min,以除去未固定的待测物。充分清洗完毕,氮气吹干后,在25℃下浸泡于1ml乙醇胺(1M,pH=8.5)30min,封闭未结合位点。用乙醇、去离子水分别清洗,氮气吹干,盖上流通池,获得无标记的小分子芯片。
实施例4 小分子芯片的构建
取小分子化合物2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑,阳性对照雷帕霉素,将小分子化合物和阳性对照分别溶于DMSO中,浓度均为10mmol/L,纯DMSO作为空白对照,利用高精度自动化点样仪分别取小分子化合物及阳性对照、空白对照2μL点样于二维光交联芯片表面,25℃(干燥室温)下放置1h;待芯片完全干燥后,在紫外光(波长365nm,9999uJ/cm2)下暴露2次,每次时间为3min,光交联固定待测物;将芯片分别浸泡于分析纯的MeCN和去离子水中,超声波清洗5min,每种溶剂各清洗3次,每次清洗时间为5min,以除去未固定的待测物。充分清洗完毕,氮气吹干后,在25℃下浸泡于1ml乙醇胺(1M,pH=8.5)30min,封闭未结合位点。用乙醇、去离子水分别清洗,氮气吹干,盖上流通池,获得无标记的小分子芯片。
实施例5 小分子芯片的构建
取小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯和2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑,将小分子化合物溶于DMSO中,浓度均为10mmol/L,纯DMSO作为空白对照,利用高精度自动化点样仪分别取小分子化合物和空白对照2μL点样于三维光交联芯片表面,25℃(干燥室温)下放置2h;待芯片完全干燥后,在紫外光(波长365nm,9999uJ/cm2)下暴露3次,每次时间为3min,光交联固定待测物;将芯片分别浸泡于分析纯的EtOH和去离子水中,超声波清洗5min,每种溶剂各清洗3次,每次清洗时间为10min,以除去未固定的待测物。充分清洗完毕,氮气吹干后,在25℃下浸泡于1ml乙醇胺(1M,pH=8.5)60min,封闭未结合位点。用乙醇、去离子水分别清洗,氮气吹干,盖上流通池,获得无标记的小分子芯片。
实施例6 小分子芯片固定效率的检测
实施例1制备的小分子芯片固定效率的检测:
取实施例1制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。之后设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,通入靶标蛋白FKBP12(100nM)300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,结果显示,雷帕霉素与FKBP12蛋白有显著(P<0.05)的SPR信号,如图1所示,其为10mmol/L的雷帕霉素所对应的SPR信号,其包括了6个不同监测点(6个重复)所得的曲线(即曲线1-6)、1个控制点所得曲线(即DMSO空白对照,即曲线7),其中6个不同检测点所得曲线基本吻合、无显著性差异,说明本发明的检测方法稳定性好、重现性高;且有明显的SPR信号值,与空白对照SPR信号相比较,差异显著(P<0.05)。这说明雷帕霉素已被固定在光交联芯片上,由此还可知,用同样方法固定的其余小分子化合物也固定在了光交联芯片上,因此,采用本发明实施例1的方法构建的小分子芯片,光交联芯片与小分子化合物之间的固定效率高,固定效果好。
实施例2~实施例5制备的小分子芯片的固定效率的检测:
取实施例2~实施例5制备的小分子芯片均进行固定效率的检测,检测方法与上述实施例1小分子芯片的检测方法相同,所得检测结果与上述实施例1小分子芯片的检测结果相似,即本发明实施例2~实施例5提供的方法构建的小分子芯片,光交联芯片与小分子化合物之间的固定效率高,固定效果好。
实施例7 小分子芯片与SOX18蛋白结合试验
样品制备:
样品Ⅰ:取GSK3β蛋白与生理盐水混合,得到浓度为22nM的GSK3β蛋白溶液。
样品II:取SOX18蛋白与生理盐水混合,制得浓度为180nM的SOX18蛋白溶液。
样品III:生理盐水。
试验组1:取实施例1制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以Tris-NaCl缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素相比于空白对照有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为25℃下,通入制得的样品Ⅰ300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
试验组2:与试验组1相比,通入制得的样品II代替样品Ⅰ,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
试验组3:与试验组1相比,通入制得的样品III代替样品Ⅰ,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
所得试验结果如下表所示:
表1 小分子化合物与所测物质孵育后相对于与空白对照孵育后的SPR信号
显著(P<0.05)
表2 小分子化合物与样品Ⅰ~样品III孵育后的Kd值
由以上数据可知,小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯、2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑与样品II孵育后,与空白对照孵育后相比有显著(P<0.05)的SPR信号,Kd值分别为2.5nM、15nM、18nM、13nM,样品Ⅰ、样品III和上述小分子化合物孵育后没有SPR信号。由于样品II相对于样品Ⅰ、样品III增加了SOX18蛋白,上述小分子化合物和样品II孵育后和空白对照孵育后相比有显著SPR信号,与样品Ⅰ、样品III孵育后没有SPR信号,由此可知,小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯、2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑可以特异性地与SOX18蛋白结合。
实施例8 小分子芯片准确性的检测
取样品a~样品f,已知样品a~样品f中的GSK3β蛋白和SOX18蛋白情况如下:
表3 已知样品a~样品f中的GSK3β蛋白和SOX18蛋白情况
蛋白 |
样品a |
样品b |
样品c |
样品d |
样品e |
样品f |
SOX18蛋白 |
+ |
+ |
— |
— |
+ |
— |
GSK3β蛋白 |
— |
+ |
+ |
— |
— |
+ |
“+”表示含有;“—”表示不含。
取待测样品a~待测样品f,分别采用实施例1制备的小分子芯片进行检测,检测方法如下:
试验组1:取实施例1制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素相比于空白对照有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为25℃下,通入上述样品a 300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
试验组2:与试验组1相比,通入上述样品b代替样品a,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
试验组3:与试验组1相比,通入上述样品c代替样品a,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
试验组4:与试验组1相比,通入上述样品d代替样品a,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
试验组5:与试验组1相比,通入上述样品e代替样品a,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
试验组6:与试验组1相比,通入上述样品f代替样品a,其余制备方法和采用的小分子芯片与试验组1完全相同。
所得试验结果如下表所示:
表4 小分子化合物与测试样品孵育后相对于空白对照孵育后的SPR信号
显著(P<0.05)
表5 小分子化合物与所测试物质孵育后的Kd值
由以上数据可知,样品a、b、e与小分子3',4',5,7-四羟黄酮、1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(2-硝基苯)-3,5-吡啶二羧酸异丁甲酯、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯、2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑孵育后,与空白对照孵育后相比有显著(P<0.05)的SPR信号,Kd值分别为2.5nM、15nM、18nM、13nM,由此可知,样品a、b、e中含有可与上述小分子化合物结合的SOX18蛋白,与样品中含有该蛋白的实际情况一致。样品c、d、f与上述小分子化合物孵育后,无SPR信号,表明样品c、d、f中不含SOX18蛋白,与样品中不含该蛋白的实际情况一致。
综合上述试验结果,本发明提供的小分子芯片可以用来检测SOX18蛋白,检测准确率为100%。
将本发明实施例2~实施例5的小分子芯片均用同样的方法检测样品a~样品f的SOX18蛋白,检测结果和上述检测结果相同,检测准确率为100%。
实施例9 小分子芯片的稳定性检测
试验组:取实施例1~实施例5制备的小分子芯片120个,分为3组,3组中小分子芯片数量和种类完全相同,每组设置有40个小分子芯片,其中实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5制备的小分子芯片各8个。
对照组:取Elabscience公司生产的SOX18ELISA试剂盒120个,分为3组,3组中试剂盒的种类和数量完全相同,每组设置40个SOX18ELISA试剂盒。
所检测样品:样品a,已知样品a中含有SOX18蛋白。
将上述试验组和对照组进行如下检测:
检测1:取1组试验组的小分子芯片和1组对照组的ELISA试剂盒,每个小分子芯片和试剂盒均在生产当天进行样品a的检测。
检测2:取1组试验组的小分子芯片和1组对照组的ELISA试剂盒,每个小分子芯片和试剂盒均在生产后,常温下放置30天,30天后进行样品a的检测。
检测3:取1组试验组的小分子芯片和1组对照组的ELISA试剂盒,每个小分子芯片和试剂盒均在生产后,60℃下放置60天,60天后进行样品a的检测。
统计检测结果,并计算检测的准确率,如果检测结果和实际情况一致,说明检测结果准确;如果检测结果和实际情况相反或检测失败,说明检测结果不准确。所得检测结果及准确率数据计算如下表所示:
表6 检测结果统计
由以上结果可知,试验组的小分子芯片在检测1~检测3中,随着小分子芯片放置时间的增长和温度的升高,小分子芯片检测待测样品的准确率未变化,均为100%,由此说明,小分子芯片检测的准确率受周围环境的影响较小,检测性能稳定。
此表还可看出,对照组采用ELISA试剂盒来检测样品,在检测1~检测3中,随着放置时间的增长和温度的升高,ELISA试剂盒检测的准确率也在不断的下降,从100%下降为42.5%,由此说明,ELISA试剂盒检测的准确率受周围环境影响较大,检测性能不稳定。
综合上述实验结果可知,相比于ELISA试剂盒,本发明提供的小分子芯片检测性能稳定,便于储藏和运输。
实施例10 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品1的制备:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加SOX18蛋白,最终浓度为1μg/mL,即得待测样品。该生物样品中含有SOX18蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例1制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为25℃下,通入上述待测样品1 300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
所得试验结果如下:
表7 小分子化合物与待测物孵育后,相对于与空白对照孵育后的SPR信号
由以上试验结果可知,小分子化合物与待测样品1孵育后,与空白对照孵育后相比具有显著(P<0.05)SPR信号,Kd值分别为2.5nM,15.1nM,17.9nM,13.2nM,表明待测样品1中含有SOX18蛋白。
实施例11 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品2的制备:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加SOX18蛋白,最终浓度为2ug/mL,即得待测样品。该生物样品中含有SOX18蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例2制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
设定进样方法,在温度为30℃下,通入待测样品2300s,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
试验结果如下:
表8 小分子化合物与所测试物质孵育后,相对于空白对照孵育后的SPR信号和Kd值
由以上数据可知:小分子化合物与待测样品2孵育后,,与空白对照孵育后相比具有显著(P<0.05)SPR信号,Kd值分别为2.4nM,14.9nM,18.1nM,13.0nM,表明待测样品2中含有SOX18蛋白。
实施例12 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品3的制备:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加SOX18蛋白和GSK3β蛋白,最终浓度均为1ug/mL,即得待测样品。该生物样品中含有SOX18蛋白和GSK3β蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例3制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素相比于空白对照孵育后有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定进样方法,在温度为25℃下,通入待测样品3 600s,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
试验结果如下:
表9 小分子化合物与所测试物质孵育后相对于空白对照孵育后的SPR信号和Kd值
由以上数据可知:小分子化合物与待测样品3孵育后,与空白对照孵育后相比具有显著(P<0.05)SPR信号,Kd值为2.5nM,15.1nM,表明待测样品3中含有SOX18蛋白。
实施例13 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品4:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加GSK3β蛋白,最终浓度为1ug/mL,即得待测样品。该生物样品中含有GSK3β蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例1制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以Tris-NaCl缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素和空白对照孵育后相比有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为25℃下,通入待测样品4 300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
所得试验结果如下:
表10 小分子化合物与所测试物质孵育后,相对于空白对照孵育后的SPR信号和Kd值
由以上试验结果可知,小分子化合物与待测样品4孵育后,无SPR信号,表明待测样品4中不含SOX18蛋白。
实施例14 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品1的制备:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加SOX18蛋白,最终浓度为1ug/mL,即得待测样品。该生物样品中含有SOX18蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例4制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以Tris-NaCl缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素相比于空白对照孵育后有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为25℃下,通入待测样品1 300s,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
试验结果如下:
表11 小分子化合物与所测试物质孵育后相对于空白对照孵育后的SPR信号和Kd值
由以上数据可知:小分子化合物与待测样品1孵育后,与空白对照相比具有显著(P<0.05)的SPR信号,Kd值为13.0nM,表明待测样品1中含有SOX18蛋白。
实施例15 小分子芯片用于SOX18蛋白的检测
待测样品2的制备:
从血型、大小相同的成年大鼠的左心房中,抽取血液0.1mL,用PBST稀释10倍至1mL,在其中添加SOX18蛋白,最终浓度为2ug/mL,即得待测样品。该生物样品中含有SOX18蛋白,来源于SELLECK中国,大鼠来源于广州生物医药与健康研究院。
取实施例5制备的小分子芯片,按照SPRi仪器的操作手册安装小分子芯片,以PBST缓冲溶液(pH=7.4,0.05%Tween20)作为流动相,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
待基线稳定后,首先通入蛋白FKBP12(100nM)300s后,实时在线观察,阳性对照雷帕霉素相比于空白对照孵育后有明显的相互作用。
然后,使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液将该小分子芯片重生数次,待基线稳定后,设定样品(2μL/s,300s),重生液(3μL/s 300s),缓冲液(2μL/s,300s)进样方法,在温度为30℃下,通入待测样品2300s,之后使用甘氨酸+盐酸(pH=2.0)水溶液(甘氨酸的浓度为10mmol/L,添加盐酸调至pH=2.0)重生数次,直至基线平稳。
保存完整的数据,然后使用数据分析软件离线处理所得数据,扣除空白背景后,观察SPR信号,计算Kd值。
所得试验结果如下:
表12 小分子化合物与所测试物质孵育后相对于空白对照孵育后的SPR信号
由以上试验结果可知,小分子化合物3',4',5,7-四羟黄酮、(S)-2-甲基丁酸-(1S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-7-甲基-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代-2H-四氢吡喃基]-乙基}-1-萘酯、2-[[[3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶基]甲基]亚磺酰基]-1H-苯并咪唑与待测样品2孵育后,与空白对照孵育后相比具有显著(P<0.05)的SPR信号,Kd值分别为2.6nM,18.0nM,13.1nM,表明待测样品2中含有SOX18蛋白。
综合上述实验结果,待测样品2中含有SOX18蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。