CN103119448A - 用于生物过程操作的拉曼光谱 - Google Patents

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L.马尔姆伯格
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Abstract

表征用于生物过程操作的多组分混合物的方法，其包括提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品；对所述多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析；从所述生物过程操作中提供多组分试验混合物；对所述多组分试验混合物进行拉曼光谱分析；并比较所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物的分析以表征所述多组分试验混合物。在一个实施方案中，所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物都包含下列物质的一种或多种、至少两种、至少三种、或每一个：多糖(例如，蔗糖或甘露醇)、氨基酸(例如，L-精氨酸、L-组氨酸或L-鸟氨酸)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)和pH缓冲剂(例如，柠檬酸盐制剂)。

Description

用于生物过程操作的拉曼光谱
本申请要求2010年9月17日提交的U.S.S.N. 61/384,131和2011年3月15日提交的U.S.S.N. 61/452,978的优先权日期的权益，其二者均以其整体内容通过引用并入本文。
1. 简介
本申请涉及使用拉曼光谱用于监测和控制生物过程操作的过程的方法。
2. 背景
用于生物过程操作的典型监测和控制包括生产过程中的试验（in-process test），例如pH、导电性、蛋白质浓度和渗透压或分析技术如基于ELISA或HPLC的方法。这些方法常太泛化或太繁琐并且耗时。生物制剂过程中间体的化学组分对于控制和/或提高生物过程操作的一致性或质量常是必需的。亟需迅速和准确测试这种生物制剂过程中间体的多组分混合物的方法以提供质量和组成的实时或接近实时保证。
3. 概述
在某些实施方案中，目前公开的主题提供了表征用于生物过程操作的多组分混合物的方法，其包括：提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品；对所述多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析；从所述生物过程操作中提供一种或多种多组分试验混合物；对所述多组分试验混合物进行拉曼光谱分析；和比较所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物的分析以表征所述多组分试验混合物。例如，比较所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物的分析以表征所述多组分试验混合物能包括通过统计学方法拟合从多组分混合物标准品获得的数据以获得校正模型并随后使用它来测定多组分试验混合物中的浓度。
在某些实施方案中，多组分混合物标准品和多组分试验混合物都包含下列物质的一种或多种、至少两种、至少三种、或每一个：糖类(例如，甘露醇)、氨基酸(例如，L-精氨酸、蛋氨酸、L-组氨酸、L-鸟氨酸脯氨酸、丙氨酸、l-精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、组氨酸和谷氨酸)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、Tween™和pH缓冲剂(例如，柠檬酸盐制剂、Tris缓冲剂或醋酸盐缓冲剂)。这些制剂混合物能包含其它组分，例如抗菌剂(例如，苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯酚、间甲酚)，或螯合剂如EDTA，或其它组分如多元醇、PEG等，或蛋白质如BSA等，或盐如氯化钠、琥珀酸钠、硫酸钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙，或醇如乙醇。
在某些实施方案中，能随机选择具有预定量的已知组分的一系列多组分混合物标准品，并对一系列多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析。数据处理和主成分方法能确保可靠的可预测性。例如，能对一系列多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析的偏最小二乘回归分析以开发模型(例如，校正曲线)。
在某些实施方案中，多组分混合物为适用于给予动物个体(例如，人个体)的制剂。例如，多组分混合物能为意图与生物活性剂(例如，单克隆抗体)结合的制剂缓冲剂。在某些这样的实施方案中，多组分混合物(包含或不含生物活性剂)进行了并且已经获得管理机构(例如，美国食品和药品监督管理局)的管理批准。在某些实施方案中，生物活性剂为单克隆抗体(例如，阿达木单抗)。
在某些实施方案中，以在线、离线或线旁（at-line）方式从生物过程操作(例如，过滤或纯化操作)中进行在多组分试验混合物的拉曼光谱分析。例如，在某些实施方案中，可定期获得样品以作为质量控制程序的一部分。
4. 附图简述
图1：包含氨基酸、pH缓冲剂物质和糖的3组分(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)缓冲剂体系的拉曼光谱。使用Umetrics SIMCA P+ V 12.0.1.0产生该图。X轴为数据点数。各个数据点为拉曼位移波数。能在X轴上使用拉曼位移波数(cm-1)重新绘制它。数据从波数1800(= Num 0)开始至800(= Num 1000)。拉曼光谱原始数据是强度(与散射光子数相关)的单位。该图显示三个单独组分(在水中)的平均中心光谱数据。光谱的平均值为0。其它值相对于可能来自平均值的标准偏差。
图2：具有随机值的3组分缓冲剂体系(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)的实际对比预测浓度的比较。使用现有模型建立该图以预测新溶液的浓度。x-轴和y-轴为浓度(mM)。
图3：3组分缓冲剂体系(精氨酸/柠檬酸/海藻糖)中单独组分的实际对比预测浓度的比较。
图4. 4组分缓冲剂体系(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/Tween™)的纯组分原始光谱。y-轴为光谱强度，x-轴为波数cm-1。
图5. 4组分缓冲剂体系(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/Tween™)的纯组分原始光谱。y-轴为光谱强度，x-轴为波数cm-1。图5为图4显示的光谱的更详细视图，其中 “指纹”区已被展开。
图6. 4组分缓冲剂体系(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/Tween™)的纯组分 SNV/DYDX/平均值中心化光谱（Mean Center spectra）。图6显示的数据基于在所有预处理后的图4-5显示的相同数据，所述预处理为用于强度归一化的标准正态变量(SNV)、用于基线归一化的1阶导数和用于刻度的平均值中心化。
图7. 具有随机值的4组分缓冲剂体系(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/Tween™)的实际对比预测浓度的比较。使用现有模型建立该图以预测新溶液的浓度。
图8. 3组分缓冲剂体系(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/ Tween™)中单独组分的实际对比预测浓度的比较。
图9. 具有显示拉曼强度的蛋白质(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)原始光谱的3组分缓冲剂体系的纯组分原始光谱。
图10. 具有蛋白质(甘露醇/蛋氨酸/组氨酸/阿达木单抗)的3组分缓冲剂体系的纯组分原始光谱，详细显示指纹区(800 – 1700 cm-1)。
图11. 纯组分 SNV/DYDX/平均值中心化 – 具有蛋白质的3组分缓冲剂体系。图11显示的数据基于在所有预处理之后的图9-10显示的相同数据：用于强度归一化的标准正态变量(SNV)、用于基线归一化的1阶导数和用于刻度的平均值中心化。
图12. 具有蛋白质的3组分缓冲剂体系中单独组分的实际对比预测浓度的比较。
图13. 使用拉曼光谱作为处理和/或质量控制的一部分的阿达木单抗纯化过程。
图14. 包含缓冲剂、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的透析过滤过程的在线拉曼浓度预测。
图15. 包含缓冲剂、糖和氨基酸(蛋氨酸/甘露醇/组氨酸)的三组分混合物的重复透析过滤过程。包含另外的数据点用于增加分辨率。
图16. 糖(甘露醇)/蛋白质(阿达木单抗)溶液的拉曼校正。
图17. 其中使用甘露醇溶液代替抗体水溶液以提供糖/蛋白质(甘露醇/阿达木单抗)溶液的透析过滤缓冲剂交换过程的在线拉曼浓度预测。缓冲剂交换随后是蛋白质浓度。
图18. 其中蛋白质浓度相扩大至180 g/L的图17实验的重复。
图19. 拉曼校正组氨酸和阿达木单抗溶液。
图20. 其中使用组氨酸溶液代替蛋白质水溶液的透析过滤缓冲剂交换过程的在线拉曼浓度预测。组氨酸交换随后是阿达木单抗浓度。
图21A-C. 具有蛋白质的2组分缓冲剂体系中单独组分的实际对比预测浓度的比较：A. Tris浓度；B. 醋酸盐浓度；和C. 阿达木单抗浓度。
图22. 具有蛋白质的1组分缓冲剂体系中单独组分的实际对比预测浓度的比较：A. Tween™浓度；和B. 阿达木单抗浓度。
图23. 当使用未修饰蛋白质的光催化交联(PICUP)单独聚集两种抗体(D2E7和ABT-874)时使用的条件。将抗体暴露于聚集光源0– 4 小时。
图24. 图23描述的交联的尺寸排阻色谱结果。
图25. 使用D2E7样品的主成分分析的拉曼光谱和光谱建模，表明聚集的样品具有独特的主成分得分并且能使用拉曼光谱从聚集体中辨别。
图26. 使用ABT-874样品的主成分分析的拉曼光谱和光谱建模，表明聚集的样品具有独特的主成分得分并且能使用拉曼光谱从聚集体中辨别。
图27A-B. 使用(A) D2E7样品和(B) ABT-974样品的偏最小二乘分析的拉曼光谱和光谱建模，表明拉曼光谱结果和SEC测量值之间的一些相关性。
5. 详细描述
为了清楚目的并且不作为限制，将本发明的详细描述分为下列分段：
(i) 定义
(ii) 可用方法和系统；和
(iii) 拉曼光谱仪器和技术。
5.1 定义
如本文使用的，术语“糖类”包括通式(CH2O)n的化合物及其衍生物，并且还包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。本文糖的非限制性实例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、丙三醇、葡聚糖、赤藓糖醇、丙三醇、阿糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨醇、甘露醇、蜜二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽糖醇等。
如本文使用的，术语“表面活性剂”是指表面活化剂。在一个实施方案中，表面活性剂是非离子表面活化剂。表面活性剂的实例包括但不限于聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton™；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或硬脂酰基-肌氨酸；亚油醇基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUAT™系列(Mona Industries, Inc.，Paterson，New Jersey)；聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics™、PF68™等)等。
如本文使用的，术语“pH缓冲剂”是指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。控制pH的pH缓冲剂的实例包括tris、三乙醇胺、磷酸盐、双-tris丙烷、组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、双甘氨肽和其它有机酸缓冲剂。
如本文使用的，“生物制剂”是指来自重组或天然来源的细胞、分子、细胞器(天然或合成的)或衍生自非合成化学源的活生物体的其它物质。实例包括但不限于DNA、RNA、病毒、病毒亚单位、病毒样颗粒、肽(合成和天然的)、蛋白质。这些分子中的任一个都能提供能被检测并能用于系统的监测和控制的拉曼信号。
如本文使用的，术语“以工业规模提供”是指生物过程，其中例如，在连续的基础上(除了维修或升级必需的中断之外)生产治疗性(例如，用于给予人的单克隆抗体)或其它最终产品达延长的时间段(例如，达至少一周或一个月或一年)，期望从商业上关注的治疗性或其它最终产品的销售或分配产生收入。工业规模的生产不同于实验室“台式”设置，其通常仅维持有限的实验或研究时间，并且为了研究目的而进行并且不期望从由此生产的最终产品的销售或分配中产生收入。
5.2 可用方法和系统
本发明的某些实施方案使用拉曼光谱技术以表征用于生物过程操作的组分(例如，多组分混合物)。例如，在某些实施方案中，拉曼光谱能用于表征意图与生物活性剂(例如，单克隆抗体)组合的制剂。这些制剂有时称为“制剂缓冲剂”通常为测定生物制剂中的赋形剂水平的多组分混合物。例如，这类制剂通常包含下列的一种或多种：pH缓冲剂(例如，柠檬酸盐、Tris、醋酸盐或组氨酸化合物)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、糖或糖醇(例如，甘露醇)和/或氨基酸(例如，L-精氨酸或蛋氨酸)。制剂缓冲剂中的误差常导致不合格批次，其又导致严重损失。
在某些实施方案中，拉曼光谱技术能用于识别蛋白质聚集。例如，但不作为限制，在某些实施方案中，本发明的拉曼光谱技术能识别蛋白质药物和药物产品样品的聚集，例如抗体药物和药物产品样品。
在某些实施方案中，拉曼光谱技术能用于检验药物和药物产品样品中赋形剂的浓度。在某些这样的实施方案中，基于单一读数检验赋形剂浓度以作为质量控制过程的一部分，避免需要一系列分析试验。在某些实施方案中，拉曼光谱还能用于包括产品稀释和pH调整的生物过程。
在某些实施方案中，拉曼光谱能用于测试和表征过滤操作(例如，超滤/透析过滤过程)中存在的制剂，例如其中生物活性剂如单克隆抗体(例如，阿达木单抗)被纯化的过滤操作。例如，但不作为限制，本发明的拉曼光谱技术能用于获得在线或离线获得的样品以确定单一读数中存在的组分的特性和数量。在某些实施方案中，除了赋形剂浓度之外能测定蛋白质浓度。在某些这样的实施方案中，能分析0至150 mg/ml的蛋白质浓度。
在某些实施方案中，拉曼光谱能用于监测、检验、测试并由此控制生物过程操作。与生物过程操作一起使用的单元操作，例如，层析、过滤、pH改变、通过组分的添加或溶液的稀释进行的组成改变都导致由有机或无机组分和生物分子组成的混合物。因此，例如，通过使用拉曼光谱迅速和精确检测中间体的组成提供了提高和保持操作以及生物产品的一致性和质量的机会。
在某些实施方案中，通过拉曼光谱检测混合物中各个组分的组成允许这种含有和不含生物分子的混合物的精确制备。例如，在某些实施方案中，这种检测适用于制备广泛用于生物过程操作的缓冲剂溶液，益处为提高制备的一致性或提供接近实时的缓冲剂溶液的制备。在某些实施方案中，这将排除需要用于制备的复杂设备、缓冲剂溶液的保持和传送。在某些实施方案中，拉曼光谱的使用允许能被提供的缓冲剂溶液的测试和释放，其中使用简单仪器实时检测缓冲剂制剂中的可能误差(例如，化学组分浓度、错误化学品等)。能被测试的制剂包括但不限于不含蛋白质的三-组分制剂(缓冲剂+糖+氨基酸)、蛋白质和糖制剂、蛋白质和表面活性剂制剂以及蛋白质和缓冲剂制剂。
在某些实施方案中，溶液组成的精确检测允许调整生物溶液以便能实现添加剂(阴离子、阳离子、疏水性、溶剂等)的正确目标组成。目前这种检测是烦琐的并且需要不便于实现实时使用的复杂的分析方法。拉曼光谱的使用允许进行用文件提供非常高度的担保的检测，其为受管制行业的期望。
在某些实施方案中，本发明的技术允许监测和控制通过化学、物理或生物方法实现的蛋白质 – 蛋白质反应、蛋白质 – 小分子反应和/或蛋白质修饰的能力。在某些这样的实施方案中，使用拉曼光谱监测反应物(生物的，处于其原始状态)和产物(生物的，处于其最终状态)以及其它反应物/催化剂（本质上为化学或生物学的）的独特生物化学特征。此外，以该方式监测反应物和产物允许反应条件和反应物量的反馈控制。在某些实施方案中，还可能的是设计体系以去除反应副产物和/或连续优化产物，提高或保持产物质量或这样的体系的性能。
在某些实施方案中，拉曼光谱还允许在色谱操作中的生物产物分离和纯化。在某些这样的实施方案中，能监测产物/产物变体/产物亚型或杂质的洗脱并能基于目标产物质量或加工性能进行柱流出物的分馏。在某些实施方案中，还能将拉曼光谱应用于其它单元操作中馏分的分离/浓缩，例如但不限于过滤和非色谱分离。
在某些实施方案中，拉曼光谱能够被部署为非侵入性工具。例如但不作为限制，能通过不干扰信号的物质进行拉曼光谱检测。这提供了其中保持包含这些混合物的容器/器皿的完整性是关键的生物过程操作中另外独特的优点。
在某些实施方案中，拉曼光谱能为检测包含其它组分的溶液的“污染物”的非常有价值的方法。在某些这样的实施方案中，使用统计或光谱比较技术将从污染的溶液中获得的拉曼光谱数据与预期光谱比较，并且在它们用于生物过程之前如果不同能允许这些溶液的制剂中误差的迅速检测。
在某些实施方案中，如通过下文实施例作为概念证明所证实的，能使用拉曼光谱定量检测包含来自包含主体细胞蛋白质、DNA、脂质等的细胞培养基收获物质的杂质的混合物中抗体的浓度。在这样的实施方案中，所述方法能用于监测来自包含不纯混合物的生物过程操作的流入物和流出物。实例能包括但不限于针对柱的装载和洗脱操作、过滤器和非色谱分离设备(膨胀床、流化床、两相萃取等)。提供的实例表明能在包含来自装载有从化学确定培养基类细胞培养方法制备的澄清收获溶液的蛋白质A亲和色谱柱的未结合馏分的基质中定量0.1至1 g/L的抗体浓度。如果线内（in-line）并入拉曼光谱，则这样的检测能实现柱负载的直接监测和控制，能实现在代表动态结合容量或静态(平衡)容量的百分比的预先确定的结合容量下柱的一致性和最佳负载。
对本领域技术人员明显的是将这样的技术应用于上述各种其它操作。
在某些实施方案中，拉曼光谱能用于生物过程纯化操作中的质量控制和/或反馈控制(例如，控制阿达木单抗纯化过程的线内缓冲剂稀释)。在某些这样的实施方案中，如在以其整体内容通过引用并入本文的Anal. Chem.，77:1228-1236(2005)中描述的，拉曼光谱能用于包括蛋白质结合反应或其它化学反应(例如，液相Heck反应)的过程中的质量控制和/或反馈控制。
在目前公开主题的各个实施方案中，本文公开的拉曼光谱技术用于上述以工业规模提供的生物过程操作。
尽管仅为了方便，本申请的主题主要在生物过程方法的背景下描述的，但还提供了用于进行生物过程本身的系统(参见例如，实施例13)。因此，本申请的某些实施方案提供了用于进行包括以工业规模提供的生物过程系统的生物过程操作的系统，其中拉曼探针与从各个过程中在线或离线采集的样品流体互通。关于系统本身的信息能从相应过程的描述中获得。
5.3 拉曼光谱仪器和技术
拉曼光谱基于在物质上的单色入射辐射以特定方式被反射、吸收或散射的原理，其依赖接收辐射的特定分子或蛋白质。尽管大部分能量在相同波长下被散射(Rayleigh散射)，但少量(例如，10-7)的辐射在一些不同波长下被散射(Stokes和Antistokes散射)。该散射与旋转、振动和电子能级跃迁（ electronic level transition）相关。散射光子波长的变化提供化学和结构信息。
在某些实施方案中，能对多组分混合物进行拉曼光谱以提供组分高度特定的“指纹”。由混合物的拉曼光谱分析产生的光谱指纹是各个单独组分的叠加。带的相对强度与特定组分的相对浓度相关。因此，在某些实施方案中，拉曼光谱能用于定性和定量表征组分的混合物。
拉曼光谱能用于表征大多数样品，包括固体、液体、浆体、凝胶、膜、粉末和一些气体，具有非常短的信号采集时间。通常，能直接从讨论中的生物过程采集样品，而不需要特殊的制备技术。而且，入射光和散射光能在长距离上传送从而允许远程监测。此外，因为水仅提供了弱的拉曼散射，因此能表征水性样品而没有水的显著干扰。
能基于商购拉曼光谱分析仪分析本文描述的可用方法和组合物。例如，能使用商购自Kaiser Optical Systems, Inc.(Ann Arbor, MI)的RamanRX2™分析仪或其它分析仪。或者，商购自例如，PerkinElmer(Waltham, MA)、Renishaw(Gloucestershire, UK)和Princeton Instruments(Trenton, NJ)的拉曼分析仪。能从各个供应商获得商购的拉曼光谱分析仪的技术细节和操作参数。
能基于例如，拉曼光谱分析仪和使用它的过程(例如，在提供UF/DF生物过程操作的实时监测的过程中)测定合适的暴露时间、样品尺寸和取样频率。类似地，还能基于分析仪和使用分析仪的过程确定适当的探针放置。例如，提供足够信号的浸入探针的样本尺寸能小于20 mL或小于10 mL(例如，8 mL或更少)。提供足够信号的暴露时间能小于2分钟或小于1分钟(例如，30秒)。
例如，对于期望量化和以多于一种pH依赖离子化形式(例如，组氨酸)存在的组分，能在不同浓度下和/或在各个pH下进行拉曼校正以预测在给定pH范围上的浓度使得组分(例如，组氨酸)的检测不是pH-依赖的。例如，处于不同pH-依赖形式的组氨酸的校正模型能用于检测和定量多种电离形式的组氨酸以便能确定溶液性质。能进行信号处理，其能包括强度校正(例如，标准正态变量(SNV))和/或基线校正(例如，一阶导数)。
能通过检测代表性测试溶液的CCD饱和度并确保它们在可接受的仪器范围内(例如，40%-80%)来测定暴露时间。
如上面提到的，在一些实施方案中，将pH控制或pH范围建模用于特定组分(例如，缓冲剂如组氨酸)。在一些实施方案中，将入射光最小化，其能例如，通过使用掩蔽物阻止环境光源干扰光谱(例如，铝箔)实现。
在某些实施方案中，其中例如，使用非带电物质浓缩蛋白质(例如抗体)，除了大量的溶质之外，蛋白质占据大量的溶液体积。这导致非带电物质浓度的净减少。将该效应称为“体积排阻”，其与蛋白质浓度成比例。
在某些实施方案中，例如包括带电组分的检验的那些实施方案，由于在较高浓度下发生唐南效应，蛋白质电荷变得明显有助于溶液中全部带电物质。由于期望在膜的任何一侧建立平衡，因此电中性要求导致在膜的滞留侧上带正电物质(例如，缓冲剂物质)的净减少。将该现象称为唐南效应。
根据本发明的某些实施方案，使用RamanRX2™分析仪。该分析仪以及其它商购拉曼分析仪提供了监测多达四通道同时全光谱覆盖的能力。在某些实施方案中，标准NIR激光激发用于最大化样品相容性。能使用可编程连续监测模式，例如，通过RamanRX2™ 分析仪，并且装置与过程光学相容，能使一种分析仪类型从发现相使用到产品相。便携式附件和光纤取样界面允许分析仪用于多个位置。
在目前公开主题的某些实施方案中，通过拉曼光谱表征包含预定量的已知组分的至少一种多组分混合物标准品(即，多组分混合物标准品)以获得用于包含未知组分和/或未知浓度的已知或未知组分的混合物的模型(例如，校正曲线)。优选地，通过拉曼光谱表征具有预定量的已知组分的一系列多组分混合物标准品以用于获得模型的目的。
本领域一般技术人员能确定用于获得用于具有未知组分和/或未知浓度的已知或未知组分的混合物的模型的方法。例如，偏最小二乘回归分析基于预期在多组分测试混合物中存在的主成分。而且，可从拉曼光谱供应商得到的软件程序能用于设计多组分混合物标准品，其反过来能用于开发用于多组分测试混合物的模型。
此外，应当理解关于“提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品”和“对多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析”和更通常地，开发模型以表征具有未知组分或未知浓度的组分的多组分混合物包括平行分析(即，“现场”获得的数据)以及参照多组分混合物标准品的前面获得的或前面记录的结果(例如，拉曼光谱指纹)，即，具有已知组分与已知浓度的多组分混合物。例如，参照从供应商产品文献获得的拉曼光谱结果包括在“提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品”和“多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析”中。
6. 实施例
通过下面提供的实施例进一步描述本发明。这样的实施例的使用仅为例示性的并且绝不限制本发明或任何实施例术语的范围和含义。同样地，本发明不限于本文描述的任何特别优选的实施方案。实际上，在阅读该说明书后，本发明的许多修改和变化对于本领域技术人员而言是明显的。因此，本发明仅受附加的权利要求的术语连同权利要求给予的等同物的全部范围限制。
6.1 3- 组分制剂缓冲剂的试验
使用水溶剂制备包含精氨酸、柠檬酸和海藻糖的预定混合物的制剂缓冲剂。组分从0至100 mM变化。
使用RAMANRXN2™分析仪(2光谱/混合物)针对15 mL等分试样的各个混合物获得800至1700 cm-1范围内的拉曼光谱。将光谱滤波参数设置为标准正态变量(SNV)强度归一化，具有15点平滑的1阶导数(间隙点（gap）)基线校正，和平均强度值 = 0的平均值中心化差分光谱。这被认为是数据换算而非光谱过滤器。使用浸入探针收集光谱，暴露时间为30秒每样品。
主成分方法用于开发模型。将PLS(偏最小二乘法预测潜在结构) 模型应用于各个三种组分以确定组分间相关性。这结果是转变光谱强度(例如，从1700 – 800 cm-1)为浓度(ax1 + bx2 + ……+ zx900 =浓度)的线性模型。用于本文显示的校正结果的软件为来自Thermo Galactic的具有PLSplus/IQ插件的GRAMS/AI V 7.02。SIMCA P+用于许多图表和实验模型设计。通过去除两个样品交叉验证样品。进行数据分析以便重复测试相关性和交叉验证的步骤直至组分间相关性低于2%的误差阈值。使用单一读数能提供缓冲剂组分(例如，在2%内)的精确量化。
能使用随机混合物设计获得校正曲线。将上面开发的3-组分模型用于产生关于精氨酸、柠檬酸和海藻糖的随机混合物的光谱的预测。将这些预测与实际光谱比较以确认模型具有±2%的预定公差界限。结果在图2和3中示出。获得随机混合物的独立测量值以验证模型能被用于形成测量值。
6.2 4- 组分制剂缓冲剂的试验
将实施例6.1的方法应用于包含4组分的制剂缓冲剂，其中组分为甘露醇、蛋氨酸、组氨酸和Tween™(聚山梨醇酯80)。预定混合物的检测光谱在图4-6中示出。波数从远-IR区至中-IR区。由于蓝宝石覆盖的限制，在该特定实施例中能不考虑100-800 cm-1的范围并且校正在800-1800 cm-1发生。
以与在实施例6.1中获得的3组分模型相同的方式获得4组分缓冲剂体系的模型。将基于获得的模型的预测与随机混合物的实际光谱比较以确定模型足够精确。结果在图7和8中示出。
6.3 具有蛋白质的 3- 组分制剂缓冲剂的试验
将实施例6.2的方法应用于包含3组分以及浓度为0至100 mg/ml的蛋白质的制剂缓冲剂。组分为甘露醇、蛋氨酸、组氨酸和D2E7(阿达木单抗)。预定混合物的检测的光谱在图9-11中示出。
以与实施例6.2中获得的4组分模型相同的方式获得具有蛋白质的3组分缓冲剂体系的模型。将基于获得的模型的预测与随机混合物的实际光谱比较以确定模型足够精确。结果在图12中示出。实际与预测光谱的决定系数(R2)和交叉验证标准误差(SECV)值在下列表1中示出。
表1. 模型拟合总结
组分 R2 SECV(g/L)
阿达木单抗 0.995 1.96
甘露醇 0.994 2.35
蛋氨酸 0.989 3.27
组氨酸 0.992 2.75
6.4 阿达木单抗 UF/DF 过程
如图13所示，建立超滤/透析过滤过程(UF/DF)以将赋形剂引入至阿达木单抗的溶液。进料泵(100)提供了通过切向流过滤膜的交叉流，输送容器中包含阿达木单抗的溶液通过膜。将透析过滤缓冲剂(制剂缓冲剂，包含蛋氨酸、甘露醇和组氨酸)泵入容器以匹配膜的过滤速率(流动通过膜渗透侧的液体)(110)。离开进料罐的进料流(120)通过泵(130)定向至膜组件(140)。具有相对较小的分子尺寸的包含水、缓冲剂组分等的渗透流(150)通过膜组件。包含浓阿达木单抗的滞留流(160)定向返回至进料罐，其由滞留阀(170)控制。
将可与来自Kaiser Opticals的RamanRX2™分析仪(190)兼容的拉曼探针(180)放置在进料罐内以提供定期表征罐的内含物的能力。使用校正文件将获得的光谱转化为组分浓度，因此能监测透析过滤过程的进展。此外，能监测并任选控制由于蛋白质浓度增加发生的赋形剂浓度的变化(由唐南效应和电荷排阻效应产生的)。除了RamanRX2™分析仪之外的其它拉曼系统还能用于定期表征来自超滤/透析过滤过程的在线样品作为阿达木单抗纯化过程的质量控制的一部分。例如，得自拉曼分析的结果能用于评价透析过滤过程的完成和最终赋形剂浓度。
通过UF/DF膜将组氨酸、甘露醇和蛋氨酸的混合物透析过滤。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露，重复10次(10次扫描)。图14-15显示透析过滤过程中浓度的变化。如预期的，透析过滤过程中各个组分浓度增加达到稳定。
图14-15提供了来自透析过滤过程的在线监测的结果。在图14中，提供了各个透析过滤时间的糖、缓冲剂和氨基酸浓度。如图14和15所示，氨基酸为蛋氨酸，并在y-轴上绘制浓度(mM)，糖为甘露醇，并在y-轴上绘制w/v %，以及缓冲剂为组氨酸，并沿着y-轴绘制浓度(mM)。图14-15中各个图的x-轴为保留时间，其中检测0至81分钟的浓度并沿着x-轴绘制。
然后，通过5千道尔顿UF/DF膜(0.1 sq. m)将在水中以约40 mg/ml存在的阿达木单抗透析过滤至糖溶液达7体积倍数(diavolumes)。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露时间，重复10次(10次扫描)。随后，将蛋白质浓缩至140 g/L。
图16提供了从用于UF/DF体系的糖/蛋白质体系(甘露醇/ 阿达木单抗)获得的并如上述检测的校正数据。将来自图16的校正曲线用于确定图17和18中的甘露醇和阿达木单抗浓度。图17和18显示糖的透析过滤过程中浓度的变化。右边的图显示透析过滤和随后超滤过程中的蛋白质浓度。在图17和18中，将糖浓度(%)对保留体积(从0至6)绘图，并将阿达木单抗浓度(g/l)对保留体积(从0至6)绘图。
如预期的，透析过滤过程中糖的浓度增加达到稳定。蛋白质达到目标浓度。在图17中，使用校正至50 g/L的模型。图18显示使用120 g/L蛋白质和糖混合物获得的校正计算的糖和蛋白质浓度。
通过5千道尔顿UF/DF膜(0.1 sq. m)将在水中以约20 mg/ml存在的阿达木单抗透析过滤至组氨酸溶液(50 mM)达7体积倍数(diavolumes)。将拉曼探针放置在滞留物容器中。以规定的时间间隔获得拉曼光谱，各个读数包括30秒的暴露时间，重复10次(10次扫描)。随后，将蛋白质浓缩至50 g/L。图19提供了从缓冲剂(组氨酸)/蛋白质(阿达木单抗)体系获得的校正数据。这是用于多达50 g/L蛋白质的组氨酸/阿达木单抗混合物的校正模型。图20提供了对于缓冲剂/蛋白质体系中低浓度的缓冲剂和蛋白质，透析过滤体积(从0至6 透析过滤体积)对组氨酸浓度(nM)和阿达木单抗浓度(g/l)的图。
该图显示组氨酸(nM)透析过滤过程中浓度的变化。右边的图显示透析过滤和随后超滤过程中的蛋白质浓度(g/l)。如预期的，透析过滤过程中糖的浓度增加达到稳定。蛋白质达到目标浓度。在该图(图19)中，使用校正至50 g/L的模型。图中的浓度由于模型局限性低于预期，随后将其鉴定为与组氨酸的离子化相关。模型能将组氨酸的电离状态与实际总的组氨酸浓度和溶液性质相关联。
数据证实监控使用蛋白质和另外的单一组分的低和高浓度UF/DF操作的能力。能每隔3分钟读取浓度，由此提供实时(或接近实时)监控浓度的能力。在糖/蛋白质体系中，对于所有浓度的蛋白质使用糖获得非常高的精确度。在缓冲剂/蛋白质体系中，在较高缓冲剂浓度和较低蛋白质浓度下获得高的缓冲剂精确度。还提供实时(或接近实时)检测和测定体积排阻效应和唐南效应的能力。因此，将拉曼光谱用作蛋白质溶液中赋形剂浓度检测的工具，并且还提供了检测除了赋形剂浓度之外的蛋白质浓度的能力以提供过程对照。
6.5 具有蛋白质的 2- 组分制剂缓冲剂的试验
将实施例6.1的方法应用于包含2组分Tris和醋酸盐以及蛋白质阿达木单抗的制剂缓冲剂。以下列范围包含组分：Tris 50-160 mM；醋酸盐 30-130 mM；和阿达木单抗 4-15 g/L。
能如实施例6.1所述获得校正曲线。在根据表2的浓度制备的样品中，将上面开发的模型用于产生关于Tris、醋酸盐和阿达木单抗的混合物的光谱的预测：
表2
Tris(mM) 醋酸盐(mM) Ab(g/L)
160 30 4.0
50 130 4.0
50 30 15.0
50 93 8.1
85 30 11.5
99 85 4.0
105 80 9.5
106 59 6.2
100 63 6.4
53 36 14.0
80 72 7.4
102 51 7.5
52 63 11.2
128 52 4.8
128 37 6.4
将这些预测与实际光谱比较以确定模型在预定的公差内。结果在图21A-C中示出。
6.6 具有蛋白质的细胞培养收获物的试验
将实施例6.1的方法应用于包含1组分Tween™和蛋白质阿达木单抗的制剂缓冲剂。从细胞培养批次中收获细胞培养介质，过滤并负载在蛋白质A柱上。将蛋白质A柱流出物（flow through）合并，然后在储存和测试前无菌过滤。
该方法用于测定蛋白质A柱负载的终点。将过滤的细胞培养收获物应用于捕获柱(通常为蛋白质A)。目前用于监测柱负载输出的方法使用A280吸光度。然而，培养收获物包含许多在280 nm下吸收光的成分。A280吸光度通常为饱和的，使得在柱负载阶段过程中A280方法不能检测抗体的重要进展。
拉曼光谱仪提供了用于捕获柱负载输出流(柱流出物)中抗体的特定检测。该测试通过将各个浓度的纯化的抗体API药物(例如，阿达木单抗)掺入蛋白质A流出物的混合物来模拟推荐的在线抗体检测。用于掺入试验（spiking experiment）的API样品包含0.1% Tween™。在直接掺入试验过程中，Tween™浓度与抗体成正比变化，并在拉曼光谱校正过程中被误认为是抗体。为了避免该情况，将Tween™认为是另外的组分并独立于抗体浓度掺入。因此，以下列范围包含组分：Tween™ 0.1%-1.0%和阿达木单抗 0.1-1.0g/L。
能如实施例6.1所述获得校正曲线。在根据表3的浓度制备的样品中，将上面开发的模型用于产生关于Tween™和阿达木单抗的混合物的光谱的预测：
表3
阿达木单抗(g/L) Tween™(%)
1.0 0.0
0.0 1.0
0.6 0.6
1.0 0.1
0.1 1.0
1.0 1.0
0.1 0.1
0.7 0.4
0.1 0.3
0.5 0.4
0.2 0.7
0.8 0.3
将这些预测与实际光谱比较以确定模型在预定的公差内。结果在图22A-B中示出。
6.7 抗体聚集体检测的试验
使用未修饰蛋白质的光催化交联(PICUP)将两种抗体(D2E7和ABT-874)分别聚集。将抗体暴露于聚集光源0 – 4小时(图23和24)并通过尺寸排阻色谱(SEC)定量聚集。通过拉曼光谱和使用主成分分析(PCA)建模的光谱(图25和26)以及偏最小二乘分析(PLS)(图27A和27B)检测样品。图25和26显示聚集的样品具有独特的主成分得分并能使用拉曼光谱与聚集体区分。图27A和27B显示拉曼光谱结果和SEC检测之间的一些相关性。
* * *
本文引用多个公开，其内容以其整体通过引用并入本文。

Claims (20)

1.表征用于生物过程操作的多组分混合物的方法，其包括：
(a) 提供具有预定量的已知组分的多组分混合物标准品；
(b) 对所述多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析；
(c) 从所述生物过程操作中提供多组分试验混合物；
(d) 对所述多组分试验混合物进行拉曼光谱分析；和
(e) 比较来自步骤(d)的分析与来自步骤(b)的分析以表征所述多组分试验混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物都包含多糖、氨基酸和pH缓冲剂中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物都包含多糖、氨基酸、pH缓冲剂中的至少两种。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述多糖为甘露醇。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述pH缓冲剂选自组氨酸和柠檬酸盐制剂。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物还包含表面活性剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
8.如权利要求1所述的方法，其包括提供具有预定量的随机选择的已知组分的一系列多组分混合物标准品并对一系列多组分混合物标准品进行拉曼光谱分析。
9.如权利要求8所述的方法，其还包括基于对该一系列多组分混合物标准品的拉曼光谱分析的偏最小二乘回归分析开发用于表征所述多组分试验混合物的模型。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述多组分混合物为适用于给予动物受试者的制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者为人。
12.如权利要求11所述的方法，其中将所述制剂与生物活性剂组合，并且其中所述组合的生物活性剂和制剂是由管理机构批准的。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物还包含选自单克隆抗体、DNA、RNA、蛋白质、病毒、病毒亚单位、肽和疫苗的试剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述多组分混合物标准品和所述多组分试验混合物包含单克隆抗体。
15.如权利要求1所述的方法，其中从来自所述生物过程的在线样品中进行在所述多组分试验混合物上的拉曼光谱分析。
16.如权利要求15所述的方法，其中每隔一定时间进行所述拉曼光谱分析以作为质量控制程序的一部分。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述生物过程为过滤或纯化操作。
18.如权利要求1所述的方法，其中将至少一部分所述多组分混合物标准品加入至所述多组分试验混合物。
19.如权利要求2所述的方法，其中所述多组分试验混合物还包含张度剂（tonicizer）、表面活性剂、螯合剂、盐和醇中的至少一种。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体为阿达木单抗。
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