CN107164446A - 鹿血肽的制备方法及其抗疲劳作用 - Google Patents

鹿血肽的制备方法及其抗疲劳作用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鹿血肽的制备方法及其抗疲劳作用，属于医药领域。鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为26000～30000转/min；鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g；鹿血肽的纯化：膜滤和凝胶层析。本发明采用小鼠抗疲劳实验对鹿血肽进行活性研究。动物实验表明，利用最佳水解工艺生产的多肽能显著延长小鼠的游泳时间和低压耐缺氧能力，肝糖原含量明显高于对照组，血乳酸含量明显低于对照组；表明鹿血肽具有较好的抗疲劳效果。

Description

鹿血肽的制备方法及其抗疲劳作用
技术领域
本发明属于医药领域。
背景技术
鹿血系为鹿科动物的膛中血或茸血，其性热，味甘咸，归肝、肾二经，具有滋阴助阳、益精生津、行血祛瘀、消肿疗伤等作用，系一种很名贵的中药。自古至今就是达官显贵及宫廷皇族治病健身的良药，深受亲睐。鹿血在民间亦广为使用，用于治疗风湿和类风湿症。经近代动物实验和临床研究证实，鹿血除有以上作用外，在治疗心悸、失眠、健忘、跌伤、及抗衰老等方面的疗效也较为突出。同时，鹿血在中医临床医学上也有着不容小觑的地位。
鹿血的含水量百分比为80％-81％，有机成分占16％-17％，无机成分占2％-4％，灰分占3％-4％。其主要有机成分是蛋白质，此外，鹿血中还含有超氧化物歧化酶(SOD)、脱氢酶等具有抗衰老作用的酶类。还含有19种氨基酸、脂类、固醇类、游离脂肪酸类、磷脂类、糖脂类、多糖类以及多种激素和多种维生素。鹿血中亦含有若干种有益的微量元素及痕量元素。并且，磷酸肌酸激酶、甲羟丁酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶覆酶和心脏机能相关。运用现代先进技术，可加工出含水量1％以下，蛋白质含量96％以上的新鲜鹿血粉，经检测比较，在提供的生物活性物质多少方面，新鲜鹿血粉明显优于优质鹿茸，鹿血的以上成分影响着鹿血的药理作用。近年来，鹿血的药用、保健价值得到了国内外的广泛重视，对鹿产业的开发研究也不断深入，并且，人们对天然绿色保健型食品和药品的亲睐给市场创造了很大的需求空间，为我国鹿业及相关医药、保健品产业的发展带来广阔的空间。
鹿血的主要功效
(1)治疗老年人心悸：鹿心血、天冬、百合、生地、阿胶、沙参共同研磨并制成药丸口服。
(2)治疗痿吐血：将鹿血、枣仁、朱砂、研磨后与甜酒共同服用效果极佳。
治疗失眠、心悸：将鹿血与黄酒同服，每日坚持饮用5-10克即可。
(4)治疗几种常见的血液病：以鹿血浸酒，制成鹿血含量为10％的鹿血酒，每日饮用，一日三次，一次10ml。对血小板和白细胞的减少、化学药物性贫血以及再生障碍性贫血所引起的头疼、头晕、无力、牙龈出血及失眠等各种症状均有很好的疗效。
(5)治疗失眠症：将鹿血与五味子等其他成分混合泡酒，每天服用，每天睡前坚持服用50毫升左右,会有效改善失眠症，并且对无明显失眠症状者会提高睡眠质量。
(6)治疗阳痿、早泄、形寒肢冷、精神不振、腰酸背痛等症状，妇人性冷淡、头晕、目眩、精神不振等症：将鹿血与蛇床子、灵仙牌等配伍浸酒。每日服用，一日3次，每次10-20ml，对缓解以上症状有及其明显的功效，有效率为95％。并且没有副作用。
(7)治疗风湿性以及类风湿性关节痛：用鹿血调制成百分比为15％的鹿血酒。每日坚持口服，但要注意适量。
鹿血的药理作用
中医的传统理论认为，血的生理功能有二：一是营养，二是滋润。具有良好的营养滋润功效，在延缓衰老方面的功效，完全符合中医养生学观点，经常服用确可收到预防早衰、保健防老的效果。
经现代科学技术分析，鹿血要比一副标准的同质量梅花鹿二杠茸提供的生物活性物质还要多,它的多种微量元素和其它营养素比例适当,经检测证实，鹿血蛋白质含量高达96％，富含包括色氨酸等8种人体必需氨基酸在内的19种氨基酸；含固醇类、磷脂类、多种不饱和脂肪酸、多种维生素和微量元素，特别是其中白蛋白、免疫球蛋白等的含量均高于人体正常值的几倍至几十倍。这些可以补充人体所需的能量，促进人体新陈代谢，保证人体正常生命活动。鹿血因所含营养成分丰富，它能迅速补充人体在运动中消耗的大量能量物质，促进代谢产物排泄，进而达到抗疲劳作用，并明显降低运动后体内的乳酸和肌尿素氮含量。增强有氧运动能力，提高人体内脏的运动耐力，对体力劳动者及脑力劳动者的疲劳恢复效果明显。同时，鹿血还是临床行之有效的补虚强壮之剂，对体弱病后有较好疗效。另外，鹿血中白蛋白和免疫球蛋白含量极高，服用后可明显提高机体免疫力和抗病能力，还能显著升高白细胞和血小板，抑制肿瘤细胞生长，对肿瘤细胞的防治效果明显。
(1)延缓衰老
目前关于抗衰老学说的论点有很多，对其研究也较为广泛和深入，但是仍未研究出延缓衰老的秘方。现代医学研究证明，哺乳动物在衰老过程中，机体内的单胺氧化酶(MAO)的活性升高，超氧化物歧化酶(SOD)的活性下降，脂质的过氧化作用有所加强。体内的自由基(O2、H2O2)大量积累，因其为强氧化剂，所以会在体内将细胞膜的不饱和脂肪酸氧化，这就导致了脂质的过氧化，从而形成过氧化脂质(LPO)，并且其与蛋白质结合又形成了多种酶都难以分解的脂褐素，导致细胞膜失去应有的生理功能，进而导致组织及器官发生老化，代谢功能降低，睾酮的合成功能受到阻碍，使血液睾酮含量下降，导致蛋白质的合成功能降低，骨质疏松，肌肉萎缩，牙齿出现松动甚至脱落，性功能也出现不同程度的下降甚至丧失。而鹿血中的次黄嘌呤、尿喀啶和磷脂类等物质具有抑制单胺氧化酶(MAO)活性的功能，减少自由基的形成。鹿血中的无机元素锰、镁、铜及锌是构成超氧化物歧化酶(SOD)的核心成分，因而鹿血能够激活SOD酶的合成和活化，并能促进SOD的合成，在合成过程中促使O2转化成H2O2，并在谷胱甘肽由还原形转变为氧化形的过程中将H2O2中的O2吸收，从而使H2O2还原成水。并在鹿血中维生素E的作用下，对细胞膜起到保护作用，进而增强组织及器官的各项功能。同时体内新陈代谢增强。肝、脑等组织器官中的过氧化脂质(LPO)的含量亦有所降低。又因鹿血能增加血清睾酮的含量，所以鹿血不仅在提高机体性功能及保护副性征能方面功效显著，还在多种氨基酸及钙、磷、铜等的参与下，大大加速了钙的沉积，从而抑制了骨骼和牙齿的松动、脱落。所以，鹿血有延年益寿的作用。
(2)补血功能
经现代动物实验研究证实，鹿血中的维生素E能起到保护细胞膜的作用；铜在机体内生成的铜蓝蛋白能促进铁的运输和吸收；铁以及多种氨基酸为血细胞的成分；维生素B6、维生素B12及钴元素能增强骨髓的造血功能，使白细胞和血小板的数量明显增加。并且，针对失血性贫血鹿血有较为明显的补血作用，针对盐酸苯肼的溶血性贫血有保护作用。
(3)抗辐射作用
经动物实验研究证实，鹿血抗钴60的辐射能力很强。
(4)抗疲劳作用
通过动物实验研究证实，用鹿血灌服小鼠，可以明显地延长小鼠的活动时间，其抗疲劳作用较为明显。
(5)影响神经功能
通过动物实验研究证实,给小鼠口服鹿血后，小鼠的睡眠时间出现明显的延长现象，睡眠时间是对照组的2.5倍，从而证实鹿血对中枢神经系统有一定的抑制作用。
(6)对代谢的影响
对大鼠灌服鹿血口服液，经研究发现其对谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性无明显影响，从而说明鹿血口服液对动物体内的氨基酸代谢过程无显著影响。但在研究过程发现鹿血可显著降低LPO的含量，从而证明鹿血具有降低LPO的作用和抗氧化作用。
(7)补肾益精作用
经动物实验和临床研究证实，口服鹿血能提高睾丸酮的含量和机体性功能，促进性器官发育增长，鹿血能起到性激素的作用，对性功能障碍有很好的改善和治疗作用。
(8)促进创伤愈合作用
鹿血中含有一种多胺类化合物，这种化合物可以激活体内RNA聚合酶活性，进而促进体内蛋白质的合成，加快创伤处的肌肉再生以及伤口的愈合。鹿血中还含有锌元素，众所周知，机体内100多种生物酶的组成均离不开锌元素，它能促进伤口的愈合及组织的修复再生，对人体内、外部伤口的愈合起到极大地促进作用。
活性肽类物质的研究进展
蛋白质是一切生命活动的重要物质基础，其在生物体内的地位举足轻重，生命活动的主要表现形式是新陈代谢，构成新陈代谢的所有化学反应都需要酶作为催化剂来进行，然而，几乎体内所有的酶都是蛋白质，因而，生长、免疫、呼吸、消化等一切生命活动均是通过蛋白质来实现的。因此，有关蛋白质的研究一直以来倍受生物技术领域研究人员的重视。
蛋白质分子是由19种氨基酸以肽键的方式连接而成的大分子物质，其分子量约在几万到几十万Da之间，蛋白质不仅在医药领域中具有重要的加工特性，而且在生物学上也具有不容忽视的生物学功能：(1)酶的催化作用：细胞内所有的生物化学反应都需要酶的参与，生物体内有上千种酶，每一种酶都催化一种化学反应，因此，任何生物体的正常运转都依赖于酶的催化作用；(2)储存及运输作用：某些蛋白质有储存及运输氧气、金属离子、葡萄糖和酯类等的作用，是生物体内的必要物质；(3)防御作用：许多蛋白质可以抵抗外来物的入侵，它们能识别、沉淀或中和入侵的细菌或病毒，它们能与入侵的外来物结合，抑或将外来物包围，致其失活；某些蛋白质还可使细胞或组织产生收缩，通过改变形状来起到防御损伤的保护作用；(4)调节作用：有一些蛋白质能够调节细胞活性，还有一些能够影响细胞的生理功能，这类蛋白质中最常见的是激素蛋白。其它种类的调节蛋白能够与脱氧核糖核酸键结合，调节酶与核糖核酸(RNA)的生物合成反应。
生物活性肽(bioactive peptides)是一类结构相对简单、具有特殊生理活性的小分子蛋白物质，也即一种具有特殊生物学功能的肽。氨基酸之间彼此以酰胺键相互连接而成的化合物称作肽，跟据组成氨基酸残基数目的多少可以分为寡肽和多肽，其中含10个以上氨基酸残基的肽称为多肽或大肽，其分子量区间为5000～10000；含10个以下氨基酸残基的肽称为寡肽(或称低聚肽、小肽)，其分子段为180～1000。由于肽的相对分子质量与蛋白质相比小很多，但其生物活性却很高，因而也称小肽为生物活性肽。
活性肽类物质的生理功能
生物活性肽是具有一定生理功能的肽,对机体有益，其作用主要表现在传递生理信息，此外，它在调节生命活动的生理功能方面也起着不容小觑的作用。总之，生物活性肽在维持人体内正常生理活动方面作用显著。大量研究结果表明，生物活性肽不仅能提供人体生长发育所需的各类营养物质，还能够调节体内的新陈代谢和免疫过程，也正是因为它在人体内分泌量的增多或减少，人类才会有由幼年、成年、老年到死亡的过程，因而，注射活性肽可以将人体内正常的生命周期打破，延缓衰老的速度。历年来，科学家陆续提取出了可有效清除皮肤中超氧阴离子和羟自由基的活性肽、具有抑制血管紧张素转化酶的活性肽以及一系列抗菌肽。
小肽将人们日常所食的各种营养物质输送到人体的各个部位，充分发挥了其作为生物体内载体和运输工具的功能，而且，小肽作为生物体内的神经递质，为一些反应过程传递信息。小肽具有极强的活性和多样性，可多方面对人体的生理功能进行一定的调节，从而增强人体内的生理活性。小肽能促进对人体有益的多种菌类的生长，例如，酵母菌、乳酸菌、双岐杆菌等，小肽的该方面作用能在很大程度上影响人体对食物中营养的消化和吸收。经科学家研究发现，有些小肽除具有以上作用外，还具有蛋白质或其他组成氨基酸所没有的对机体很重要的生理机能。
活性肽的吸收机制与氨基酸有很大差异，它们是两种相互独立的完全不同的吸收机制。传统观念认为，蛋白质先在体内被水解成为氨基酸，然后进入血液循环系统，之后被转运至机体的各个组织、器官，以上是蛋白质参与代谢的过程，其各种生物学活性就是在此过程中得到发挥的。自从1952年研究者首次观察到活性肽的一个特性之后，生物学界对小肽的研究便有了一个新的认识，该发现被总结为肠道能够完整地吸收双甘肽并将其转运到机体的各个组织。1960年小肽能够被完整吸收得到了证实；1984年科学家在小肠粘膜上发现了一种能够转运小肽的载体蛋白；1994年与1996年分别克隆出了能够转运小肽的Ⅰ型载体蛋白和Ⅱ型载体蛋白。至此，小肽能够被肠道直接并完整吸收的观点才被生物学家所接受。
活性肽的制备方法
活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只含有2个氨基酸的二肽，大到复杂的长链或环状多肽。近代生物技术的发展为人们从食品蛋白质中提取特殊的活性肽提供了一定的条件，人们获得活性肽的来源有：生物体内的各类天然活性肽(酶抑制剂、激素类等)；化学合成法(液相或固定相)；酶合成法；重组DNA技术；由体内消化过程或体外水解蛋白质过程产生。
化学合成法
根据介质的状态不同，化学合成法可分为“液相合成”和“固相合成”。液相合成法主要用于合成小分子肽，在合成多肽浓缩片段方面也较为常用，固相合成法在某些方面优于液相合成法，譬如，固相的载体有利于固定肽链和环化肽链，而且其自动化生产过程较为简易，然而，由于相关操作过程及实验用品在规模化生产上的局限性，截至现在，固相合成法主要在快速建立多肽库方面有施展的空间。化学合成法的缺点是：特别在利用固相合成法时，我们要采取相关措施保护肽侧链上的一些基因；合成过程中需要的链接试剂需过量，酰基载体的用量也较大；链接试剂有一定的毒性。
重组DNA法
如果能够建立起来一个重组DNA体系，那么就可以利用廉价的原料经发酵生产出大量的活性肽，然而迄今为止，利用此法制备小分子肽的尝试也没有取得成功。
可控酶解法
目前，研究者们已用木瓜蛋白酶酶解鲢鱼制得降血压肽及用胰蛋白酶酶解紫贻贝制得对于病原菌Botryis Cinerea的抑菌率达70％以上的酶解液。然而由于目前商业用酶的来源局限性，研究者们常常要从大量的酶中进行筛选，虽然酶的专一性及原料蛋白的组成可以作为参考依据，但是这种选择仍存在较大的随机性。随着酶工程技术的发展，研究者们可以根据活性肽的结构特点，利用酶工程技术来生产所需的单一种酶或复合酶系。尽管可控酶解法因其安全系数高、廉价且容易推广成为当今研究的热点，但酶反应体系毕竟是一个十分复杂的体系，复合酶的共同作用机制仍处于探索中。
此外，酶在水相中存在的问题也较为显著，主要是副反应多以及许多氨基酸的衍生物在水中不稳定。而且，蛋白酶水反应会产生苦味肽，其强弱程度是决定水解物能否在食品工业中应用的关键因素。
直接提取法
直接提取分离法制备活性肽就是直接提取天然生物体中原有的各种原生肽类，该提取过程在很大程度上需要各种分离纯化技术的参与与配合，但是，因为这种原生肽在生物体中的含量不高，所以要把其从生物体中纯化出来获得较高纯度的单体化合物，较为复杂的抽提过程是避免不了的，同时，其精制过程也很复杂，这无疑会大大增加实验成本。目前，直接提取分离法主要应用于海洋资源方面，它的最大用途是为蛋白质酶解法以及肽合成法制备活性肽提供先导化合物。
发明内容
本发明涉及一种鹿血肽的制备方法及其抗疲劳作用。
本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为26000～30000转/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的纯化：膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
鹿血肽在制备具有抗疲劳作用的药物中的应用。
本发明采用小鼠抗疲劳实验对鹿血肽进行活性研究。动物实验表明，利用最佳水解工艺生产的多肽能显著延长小鼠的游泳时间和低压耐缺氧能力，肝糖原含量明显高于对照组，血乳酸含量明显低于对照组；表明鹿血肽具有较好的抗疲劳效果。
具体实施方式
实施例1
包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为26000转/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的纯化：膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
实施例2
包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速，转数为28000转/min，鹿血粉得率为10.607％；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g，通过五次平行实验得到实际水解率为22.13％，与理论值相差0.33％；
(3)鹿血肽的纯化：膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
实施例3
包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为30000转/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g，通过五次平行实验得到实际水解率为22.13％，与理论值相差0.33％。
(3)鹿血肽的纯化：膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
鹿血肽抗疲劳活性实验
(1)小鼠游泳实验
表1 鹿血肽对小鼠游泳时间的影响
与对照组比较：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表1可见，与对照组相比，高剂量和中剂量组中小鼠的负重游泳时间均明显增加(P<0.01)；低剂量组与对照组的负重游泳时间差异不明显(P>0.05)
(2)小鼠耐低压缺氧实验
表2 鹿血肽对小鼠耐低压缺氧实验的影响
与对照组比较：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表2可见，三个高中低剂量组与空白组比较，高剂量组耐低压缺氧能力显著增强(P<0.01)；低、中剂量组与对照组差异不明显(P>0.05)。
(3)小鼠肝糖原、血乳酸的测定
表3 鹿血肽对小鼠肝糖原、血乳酸的影响
与对照组比较：﹡p>0.05,﹡﹡p<0.01
由表3可见，与对照组相比，高剂量组的小鼠肝糖原含量明显增加(P<0.01)，低剂量组差异不显著(P>0.05)；而血乳酸含量则是高剂量组均明显低于对照组(P<0.01)，中、低剂量组差异不显著(P>0.05)。

Claims (3)

1.一种鹿血肽的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为26000～30000转/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的纯化：
膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
2.根据权利要求1所述的一种鹿血肽的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)、鹿血的干燥：采用喷雾干燥机，调节入口温度180℃，出口温度80℃，转速为28000转/min；
(2)鹿血蛋白水解：鹿血蛋白的浓度为3％，采用碱性蛋白酶进行水解，水解的条件为：温度53℃、时间5.5h、pH9.5、酶量1272u/g；
(3)鹿血肽的纯化：
膜滤
将鹿血蛋白水解液透过0.45μm微滤膜，收集一次透过液，再将一次透过液过10000D的超滤膜，收集分子量小于10000D的部分；
凝胶层析
将膜滤二次透过液，采用SephadexG-25、SephadexG-15凝胶层析反复层析，凝胶柱规格为2.0cmx120cm，缓冲液为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠，洗脱速度为10mL/h，收集到管中，为分子量1000D的多肽。
3.鹿血肽在制备具有抗疲劳作用的药物中的应用。
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