CN107158040B - 一种口腔微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种口腔微生态制剂，是由植物乳杆菌KF‑18、乳酸乳球菌KF‑20、乳酸乳球菌KF‑22和肠膜明串球菌KF‑15分别发酵后经真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉，将单菌菌粉混合，再与抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉和甜味剂混合制得。所述植物乳杆菌KF‑18、乳酸乳球菌KF‑20、乳酸乳球菌KF‑22和肠膜明串球菌KF‑15保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为GDMCC 60118、GDMCC 60116、GDMCC 60139和GDMCC 60138。该制剂可替代抗生素，有效减少抗生素的使用，增强人体免疫能力，降低口腔疾病的发病率，用于维持口腔疾病正常微生态的环境。

Description

一种口腔微生态制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生态技术领域技术领域，更具体地，涉及一种口腔微生态制剂及其制备方法。
背景技术
抗生素的滥用导致了大量耐药菌株的出现，乳酸菌是一类具有抗菌活性的物质，在人体的天然免疫中起着重要的作用。乳酸菌具有广谱抗菌、抗真菌的作用，并对多种口腔细菌有抑制作用，且抗菌肽较难产生耐药性。
龋齿和牙周炎是比较典型的由牙菌斑细菌引起的口腔疾病，主要是由变异链球菌(Streptococcus mutans)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivali)引起的。关于乳酸菌对口腔疾病的研究目前尚处于初级阶段，筛选或改良出对口腔疾病治疗效果较好的菌株是所面临的重大问题，要求益生菌菌株主要通过产细菌素和过氧化氢达到最终的抑菌目的。
乳酸菌细菌素是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。它们通常不仅抑制与其亲缘关系相近的乳酸菌，对非乳酸菌的G+菌也具有一定的抑制作用。
微生物代谢产物有细菌素和胞外多糖等，主要用于饲料行业的使用，对其深加工的技术研究还不够多，通过将代谢产物结合活菌做成制剂达到治疗护理效果最佳，以期许能够将乳酸菌的优势能够发挥到最佳。现在市面上的很多活菌饮料和牙膏等产品其活菌含量不高，甚至不能在牙膏中生存乳酸菌，这大大限制了乳酸菌的开发利用，通过优化将制剂中的活菌数增加，并且适合在极端环境中生存。因此，研究和开发开菲尔微生态制剂可赋予微生态制剂新的保健功能，具有极大的发展潜力。
发明内容
本发明的目的是针对现有口腔微生态制剂中活菌数不高以及微生物代谢产物不能加以利用的缺点，提供一种口腔微生态制剂。该口腔微生态制剂可替代抗生素，有效减少抗生素的使用，增强人体免疫能力，降低口腔疾病的发病率，用于维持口腔疾病正常微生态的环境。
本发明另一个目的是提供上述口腔微生态制剂的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种口腔微生态制剂，所述口腔微生态制剂是先将菌株分别接种于MRS培养基培养后，经真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉，再将所述单菌菌粉混合成混合菌粉，并与抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味剂和辅料混合制备而成；
所述菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-20、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22和肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60118；
所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-20于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60116。
所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60139。
所述肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC 60138。
优选地，所述MRS培养基的配方为：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g和蒸馏水1000mL；所述菌株相对于MRS培养基的接种量为1～10％。
优选地，所述混合菌粉是由植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22、肠膜明串球菌KF-15的单菌菌粉按(1～3)：(1～3)：1：1的质量比混合；所述混合菌粉为15.4～19.48％，奶粉为61.6～77.92％，抗菌肽粗品1～8％，胞外多糖粗品1～9％，甜味剂0.5～3％，辅料0.1～3％。
植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22和肠膜明串球菌KF-15单菌菌粉的制备包括如下步骤：
S1.将植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22和肠膜明串球菌KF-15菌株分别进行传代两次进行培养活化；
S2.将植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22和肠膜明串球菌KF-15菌株以1～10％的接种量分别用MRS培养基培养之后，加入牛奶溶液保护剂，然后经-36～-40℃，24～30h真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉。
所述抗菌肽粗品的制备包括如下步骤：
S11.将植物乳杆菌KF-18按1～8％的接种量接种到MRS培养基中，在35～37℃静置培养18～24h；
S12.再将步骤S11培养的植物乳杆菌KF-18以3～5％的接种量接种到10～15％的牛奶溶液中培养18～24h得到发酵液A；
S13.将发酵液A以3500～4500rpm的转速，4～10℃的条件下离心20～30min，取上清液B，将上清液B过1～3K的膜包，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h得到抗菌肽粗品。
所述胞外多糖粗品的制备包括如下步骤：
S21.将乳酸乳球菌KF-22按3～5％的接种量接种到MRS培养基中，35～37℃静置培养18～24h；
S22.再将步骤S21培养的乳酸乳球菌KF-22以3～5％的接种量接种到10～15％的牛奶溶液中培养18～24h得到发酵液C；
S23.将发酵液C经煮沸10～15min，冷却后以3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min得到上清液D；
S24.将三氯乙酸水溶液加入上清液D中，在3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min得到上清液E；然后在上清液E中加入无水乙醇静置20～24h，再以3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min收集沉淀物；
S25.沉淀物用超纯水溶解后过1～3K的的膜包，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h制得胞外多糖粗品。
优选地，步骤S24中所述三氯乙酸水溶液的浓度为50～80％，所述三氯乙酸水溶液的体积为上清液D体积的7～10％，所述无水乙醇与上清液E的体积比为(4～5)：1，步骤S25中所述超纯水与步骤S22中所述发酵液C的体积相同。
优选地，所述的甜味剂为赤藓糖醇、木糖醇或山梨醇。
优选地，所述的辅料为羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁，所述羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁的质量比为(1～6)：1。
上述口腔微生态制剂的制备方法，包括如下具体步骤：
S31.将植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22、肠膜明串球菌KF-15分别优化活菌数培养后，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h得到相应的单菌菌粉，并将单菌菌粉混合；
S32.将植物乳杆菌KF-18菌株发酵产物分离纯化得到抗菌肽粗品；
S33.将乳酸乳球菌KF-22发酵产物分离纯化得到胞外多糖粗品；
S34.将混合的单菌菌粉、抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味剂和辅料混合打成粉状，用10～40目过筛后压制成片剂，即为口腔微生态制剂。
本发明开菲尔粒是天然共生菌群，含有乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)、醋酸菌和酵母菌，其发酵产物开菲尔被认为是高加索地区人们长寿的重要原因之一，具有抗菌和抗癌等多种功效。本发明采用高产过氧化氢的抗菌肽以及胞外多糖的乳酸菌菌株活菌及其代谢产物分离提纯、甜味剂进行科学配伍，抗菌肽可以有效抑制口腔中变异链球菌和牙龈卟啉杆菌，同时胞外多糖可以增加产品的抗氧化能力以及抑制变异链球菌的生物膜生长，并且乳酸菌活菌本身作为益生菌可以粘附口腔黏膜上皮细胞，对病原菌的入侵起到阻隔作用，通过植物乳杆菌的代谢耗氧制造厌氧环境，以及胞外多糖对口腔益生菌的促生长和对病原菌的抑制作用，从而维持正常的口腔菌群平衡，对病原菌的入侵形成立体屏障，起到保护口腔微生态平衡的作用。
乳酸菌胞外多糖(Exopoly Saccharides，LAB EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，具有很多的生理功能，如抗肿瘤活性、免疫调节、益生、抗氧化、抗菌和降胆固醇等其他功能，而关于抗氧化的研究逐渐增多。LAB EPS抗氧化主要是通过是在体外实验中对清除自由基、抑制脂质过氧化作用、抑制亚油酸氧化等指标检测。
与其它多糖相比，LAB EPS具有以下几点优势：(1)与植物多糖相比，虽然LAB EPS的产量一般较低，但只要充分了解LAB EPS的形成机制，进行有效的生物调控，就可以建立克隆体系，实现大量表达EPS，从而简便提取工艺，降低生产成本；(2)LAB是公认的绿色安全(GRAS)的食品级微生物，其代谢产生的EPS在安全性上更为可靠；(3)食品级的产EPS乳酸菌菌株可直接以活菌的形式进入人体，除了EPS的生物活性外，菌株自身还可以发挥多种生理功能，促进人体健康；(4)LAB EPS的溶解性较好，可以经膳食进入人体，通过食物的形式发挥功效，更容易被消费者所接受。
另外，本发明的特征之一是选用赤鲜糖醇、木糖醇或山梨醇作为甜味剂适于需蔗糖口感的食品，不被酶所降解，只能透过肾(易被小肠吸收)从血液中排至尿中排出，不参与糖代谢和血糖变化，故也适宜于糖尿病患者食用。在结肠中不被肠道菌群发酵，可避免肠胃不适，且不会造成龋齿。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明口腔微生态制剂可替代抗生素，有效减少抗生素的使用，增强人体免疫能力，降低口腔疾病的发病率，用于维持口腔疾病正常微生态的环境。这是由于采用乳酸菌活菌及其代谢产物分离提纯，与甜味剂进行科学配伍，抗菌肽可以有效抑制口腔中变异链球菌和牙龈卟啉杆菌，同时胞外多糖可以增加产品的抗氧化能力以及抑制变异链球菌的生物膜生长，并且乳酸菌活菌本身作为益生菌可以粘附口腔黏膜上皮细胞，对病原菌的入侵起到阻隔作用，通过植物乳杆菌的代谢耗氧制造厌氧环境和胞外多糖对口腔益生菌的促进生长作用，对病原菌的抑制和对益生菌的促进从而维持正常的口腔菌群平衡，对病原菌的入侵形成立体屏障，起到保护口腔微生态平衡的作用。
2.本发明用赤藓糖醇、木糖醇等糖醇作为甜味剂可适于需蔗糖口感的食品，且不会造成龋齿。这是由于糖醇不易被酶降解，只能透过肾被小肠吸收，从血液中排至尿中排出，不参与糖代谢和血糖变化，故也适宜于糖尿病患者食用。在结肠中不被肠道菌群发酵，可避免肠胃不适。
3.本发明口腔微生态制剂可增加口腔中益生菌数量，增加口腔环境中抗菌肽和过氧化氢的含量达到抑制口腔不良菌株的效果，促进口腔微生态的稳定，增强口腔清洁，并且有效的控制口腔疾病的发生，可成为一种新的抗生素替代品，并为辅助治疗牙周疾病等提供新方法。
附图说明
图1为对分离菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到菌种基因的组指纹图谱。
图2为制备微生态制剂的工艺流程图。
图3为本发明口腔微生态制剂对变异链球菌的抑菌活性图。
图4为葡萄糖浓度的苯酚硫酸法标准曲线。
图5为本发明口腔微生态制剂中各菌株产胞外多糖的含量。
图6为过氧化氢浓度的标准曲线。
图7为本发明口腔微生态制剂对变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的影响。
图8为标准钙浓度的标准曲线。
图9为本发明口腔微生态制剂对变异链球菌降解羟基磷灰石的关系曲线。
图10为本发明口腔微生态制剂对牙龈卟啉单胞菌降解羟基磷灰石的的关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中所述MRS培养基的配方为：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g和蒸馏水1000mL。
实施例1植物乳杆菌KF-18菌株的分离与鉴定
1.菌株分离
(1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18是从开菲尔酸奶中分离获得。具体分离方法如下：将实验室保存的开菲尔原液用MRS液体培养基富集乳酸菌，然后经过稀释涂布划线得到纯化的菌株。
(2)上述分离得到菌株植物乳杆菌KF-18具有产抗菌肽，具有能够抑制致病菌生长的特征。
2.菌株鉴定
提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其序列，并测序分析，得到16S rDNA测序鉴定结果如SEQ ID NO：1所示，显示其与目前已公开的开菲尔乳酸菌的菌株均不同。
同时，结合其他鉴定数据结果显示，该菌株为植物乳杆菌种的一个新菌株，将该菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18，于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC 60118，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
Rep-PCR指纹图谱是一种揭示菌株和种属遗传差异和多样性的分析技术。原理是利用特定的引物扩增细菌基因组的进化过程中高度保守的短重复序列，得到系列的特定谱带，即细菌基因的指纹图谱，对细菌进行鉴定和多态性研究。对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到植物乳杆菌KF-18菌种基因组的指纹图谱如图1(a)所示。其中，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。从图1(a)中可知，植物乳杆菌KF-18特有的Box-PCR主条带约4条，(GTG)5-PCR主条带为8～10条，Rep-PCR主条带为7～10条，大小集中在0.3k～4kbp之间，由此指纹图谱可对该植物乳杆菌KF-18进一步鉴定和多态性研究。
实施例2乳酸乳球菌KF-20菌株的分离与鉴定
1.菌株分离
(1)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-20是从开菲尔酸奶中分离获得。具体分离方法如下：将开菲尔原液用MRS液体培养基富集乳酸菌，然后经过稀释涂布划线得到纯化的菌株。
(2)上述分离得到乳酸乳球菌KF-20菌株具有产过氧化氢的量为3％左右的特征。
2.菌株鉴定
提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其序列，并测序分析，得到16S rDNA测序鉴定结果如SEQ ID NO：2所示，显示其与目前已公开的开菲尔乳酸菌的菌株均不同。
乳酸乳球菌KF-20菌株为乳酸乳球菌种的一个新菌株，将该菌株命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-20，于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC 60116，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到乳酸乳球菌KF-20菌种基因组的指纹图谱如图1(b)所示。其中，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。从图1(b)中可知，乳酸乳球菌KF-20特有的Box-PCR主条带约7条，(GTG)5-PCR主条带为8～10条，Rep-PCR主条带为7～10条，大小集中在0.3k～4kbp之间，由此指纹图谱可对该乳酸乳球菌KF-20进一步鉴定和多态性研究。
实施例3乳酸乳球菌KF-22菌株的分离与鉴定
1.菌株分离
(1)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22是从开菲尔酸奶中分离获得。具体分离方法如下：将开菲尔原液用MRS液体培养基富集乳酸菌，然后经过稀释涂布划线得到纯化的菌株。
(2)上述分离得到的乳酸乳球菌KF-22菌株具有产胞外多糖的量达到特征。
2.菌株鉴定
提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其序列，并测序分析，得到16SrDNA测序鉴定结果如SEQ ID NO：3所示，显示其与目前已公开的开菲尔乳酸菌的菌株均不同。
乳酸乳球菌KF-22菌株为乳酸乳球菌种的一个新菌株，将该菌株命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactisKF-22，于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC60139，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到乳酸乳球菌KF-22基因组的指纹图谱如图1(c)所示。其中，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。从图1(c)中可知，乳酸乳球菌KF-22特有的Box-PCR主条带约9条，(GTG)5-PCR主条带为8～10条，Rep-PCR主条带为7～10条，大小集中在0.3k～4kbp之间，由此指纹图谱可对该乳酸乳球菌KF-22进一步鉴定和多态性研究。
实施例4肠膜明串球菌KF-15菌株的分离与鉴定
1.菌株分离
肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15是从开菲尔酸奶中分离获得。具体分离方法如下：将开菲尔原液用MRS液体培养基富集乳酸菌，然后经过稀释涂布划线得到纯化的菌株。
2.菌株鉴定
提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其序列，并测序分析，得到16SrDNA测序鉴定结果如SEQ ID NO：4所示，显示其与目前已公开的开菲尔乳酸菌的菌株均不同。
肠膜明串球菌KF-15菌株为乳酸乳球菌种的一个新菌株，将该菌株命名为肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15，于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC60138，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
对上述分离的菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增得到肠膜明串球菌KF-15菌种基因组的指纹图谱如图1(d)所示。其中，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。肠膜明串球菌KF-15基因指纹图谱，泳道1为BOX-PCR谱带；泳道2为(GTG)5-PCR谱带；泳道3为Rep-PCR谱带；泳道M为DNA Marker III。从图1(d)中可知，肠膜明串球菌KF-15特有的Box-PCR主条带约9条，(GTG)5-PCR主条带为8～10条，Rep-PCR主条带为7～10条，大小集中在0.3k～4kbp之间，由此指纹图谱可对该肠膜明串球菌KF-15进一步鉴定和多态性研究。
实施例5口腔微生态制剂的制备
图2为制备口腔微生态制剂的工艺流程图，具体步骤如下：
1.将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis subsp)KF-20、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22、肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15复壮后，分别按4％的接种量加入MRS培养基培养，将其以3500rpm转速，4℃的条件下离心20min得到相应的单菌菌体，然后用10％的牛奶溶液作为保护剂冻干得到单菌菌粉，将相应的单菌菌体按质量比为1:1:1:1制成混合菌粉；
2.将1％抗菌肽粗品，1％胞外多糖粗品，奶粉15.4％，菌粉77.9％，0.5％的硬脂酸镁，3％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，1.2％的赤藓糖醇混合用药材搅碎机处理5s，过20目筛，用压片机制作口腔微生态制剂。
口腔微生态制剂按原料的质量百分比计为：混合菌粉为15.4～19.48％，奶粉为61.6～77.92％，抗菌肽粗品1～8％，胞外多糖粗品1～9％，甜味剂0.5～3％，辅料0.1～3％。
实施例6口腔微生态制剂的质量检测
1.口腔微生态制剂的检测：主要分为口腔微生态制剂的外观和口感两部分，检测标准如表1。本发明制剂的外观色泽均已为乳白色，每一片均为0.5g，无松片裂片等现象，口腔细腻，无颗粒感，甜度适中，说明制剂通过成型工艺和口感工艺的优化能使制剂的外观更美观，口感更细腻符合大众口味。
表1制剂外观检测标准
Figure GDA0001339955390000101
2.片重差异的检查方法：取口腔微生态制剂20片，精密称定每片的片重并求得平均片重，然后以每片片重与平均片重比较，超出差异限度(±7.5％)的药片不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。检测结果：每一片均为0.5g，结果说明制剂压片工艺优化得到片中差异很小。
3.硬度的检查方法：取口腔微生态制剂20片从1.5m高自由下落，每片重复2到3次，该口腔微生态制剂没有明显碎片或断裂，说明该口腔微生态制剂硬度合格。
4.检测制剂的活菌数方法：取2片口腔微生态制剂称重(约1g)粉碎，用无菌生理盐水稀释至10mL，再取1mL作10倍递增稀释，取10-9，10-10和10-11三个稀释度，分别吸取1mL注入MRS琼脂柱中培养至少48h，计算活菌数。检测结果为2.5×1011cfu/g，说明经过优化之后制剂比市面上生产的产品中活菌数106cfu/g提高了5个等级。
5.检测口腔微生态制剂的理化指标：按GB5009的方法检测口腔微生态制剂的理化指标，包括口腔微生态制剂中蛋白质含量、水分含量、脂肪含量以及还原糖含量等。
(1)蛋白质含量的检测：采用凯氏定氮法测定化合物或混合物中总氮量，即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量。经检测蛋白质含量为26.41％，高于DBS15/002-2013食品安全地方标准含乳固态成型制品中蛋白质含量6.5％，口腔微生态制剂的蛋白质含量远高过国标中的要求，说明这对于氮的获取是有利的。
(2)水分含量的检测：采用直接干燥法，原理为利用食品中水分的物理性质，在101.3KPa(一个大气压)，温度101～105℃下采用挥发方法测定口腔微生态制剂中干燥减失的重量，包括吸湿水、部分结晶水和该条件下能挥发的物质，再通过干燥前后的称量数值计算出水分的含量。经检测口腔微生态制剂中的水含量为5.08％，小于DBS15/002-2013食品安全地方标准中含乳固态成型制品中水含量14％，口腔微生态制剂的水分含量很少，有利于口腔微生态制剂的存放，延长货架期，且不易吸潮。
(3)脂肪含量的检测：采用目前国内外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法(Soxhletextractor method)是公认的经典方法，也是我国粮油分折首选的标准方法。经检测制剂中的脂肪含量为7.1％，结果说明制剂中脂肪含量很少。
(4)还原糖含量的检测：采用3,5-二硝基水杨酸法，区别于传统的滴定法，分光度法灵敏且准确，可重复性强，便于操作。检测结果：还原糖含量为11.89％，结果说明碳水化合物含量较高，糖醇能达到蔗糖等糖的增加甜味的作用。
(5)贮藏试验及产品品质变化分析：压得的片重约为3.0g，采用两种不同的包装材料(铝箔袋和夹链袋)进行密封分装，每袋150片，置于-18℃、4℃和室温的环境中，一开始1个月中测1次/半个月，后续每月取样测定1次，主要检测指标有活菌数、硬度、脆碎度及感官评价。检测结果：口腔微生态制剂在-18℃可以储存一年，4℃放半年和室温可以储存三个月，结果说明该口腔微生态制剂由于其独特的抑菌活性可延长货架期，有利于改制剂的运输保藏。
实施例7口腔微生态制剂生物活性指标的测定
1.抑菌活性测定：处理乳酸菌，10000转离心20min得到发酵上清液，然后先调pH到7再加过氧化氢酶到10mg/mL在37℃水浴2h然后6000转离心5min过0.22μL的滤膜除菌，然后把牛蛋培养基加热倒薄薄的一层，然后再倒第二层是100ml的牛蛋含有200μL的要做一个生长曲线(或者用稀释涂布法)的培养基再一薄薄的一层，然后放上牛津杯，然后打入200μL的处理样品。4℃下静置30min，37℃下静置培养24h，测量抑菌圈直径，并换算成效价，结果如表2所示，从表2中看出具有广谱抑菌活性，植物乳杆菌细菌素对口腔致病菌变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌菌具有抑制作用，说明制剂对口腔致病菌有抑制作用。图3为口腔微生态制剂对变异链球菌的抑菌活性图。其中，图3a图为空白对照，图3b为口腔微生态制剂的抑菌图，从图3中可以看出口腔微生态制剂具有明显的抑菌圈，说明该口腔微生态制剂对口腔致病菌活性很强，抑菌圈效果明显。
表2植物乳杆菌细菌素抑菌谱
Figure GDA0001339955390000121
注：0-5+、5-10++、10-15+++、15-20++++
2.胞外多糖含量测定：吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入1.0ml的6％苯酚和5.0ml浓硫酸，摇匀冷却室温放置20min以后于490nm测光密度。以标准曲线计算多糖含量，结果如图4和图5所示。其中，图4为苯酚硫酸法标准曲线。标准曲线方程为y＝0.0268x-0.0139，R2＝0.9977，结果表明该标准曲线可以作为测胞外多糖含量的曲线，利用该曲线方程，算出对应每株菌产生的胞外多糖的含量，再进行筛选。图5为各菌株产胞外多糖的含量，从图5中可以看出乳酸乳球菌KF-22产胞外多糖的量最多，达到68.85mg/L，相对于其他从开菲尔里面筛出的产胞外多糖54mg/L的乳酸菌还高，说明KF-22株菌是高产胞外多糖的菌株。
图6为过氧化氢的标准曲线。过氧化氢含量测定：取200μL的细胞培养液，12000r/min离心5min，取上清液再过0.22μm的有机滤膜得到澄清菌液，再取1mL加9mLPBS稀释10倍后测定OD510值，然后根据图5为标准曲线计算过氧化氢的含量，标准曲线方程为y＝0.1159x-0.0085，R2＝0.9991。结果表明该标准曲线可以作为测过氧化氢含量的曲线，利用该曲线方程，算出对应每株菌发酵液产生的过氧化氢的含量，再进行筛选。
表3为过氧化氢的筛选结果。从表3中可知乳酸乳球菌KF-15、KF-18、KF-20和KF-22四种菌株均产生过氧化氢，其中，乳酸乳球菌KF-20产过氧化氢的量最多，达到27.9μg/mL，换算为2.79％的过氧化氢，这接近于文献中报道3％过氧化氢含量是最适度的清洁口腔的量，由于过多的过氧化氢会腐蚀口腔，过少达不到效果，说明KF-20菌株产出的过氧化氢能达到很好的清洁口腔的效果。
表3过氧化氢的筛选结果
Figure GDA0001339955390000131
实施例8口腔微生物制剂的抑制作用
1.评价口腔微生态制剂抑制变异链球菌菌膜的能力
将2.5mL MRS培养基与2.5mL TSB培养基混合并加入5％蔗糖与0.5％2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液。取100μL变异链球菌(1×109cfu/mL)接入此培养基中，于37℃摇床培养12h后，接入同浓度的乳酸菌菌液，继续培养12h。吸出培养基，用PBS缓冲液洗涤3次。将稳定黏附于试管表面的菌膜经超声处理30min，使其均匀分散于等体积的生理盐水中，梯度稀释涂布于TSB固体培养基中。根据变异链球菌与乳酸杆菌菌落形态的差异，分别对菌膜中乳杆菌与变异链球菌进行菌落计数。对照组不接入乳杆菌，结果如图7所示。图7为本发明口腔微生态制剂对变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的影响。其中，a为变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌，b为植物乳杆菌。从图7可以看出，植物乳杆菌对口腔致病菌变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的生物膜的抑制作用，先测得变异链球菌生物膜在TSB培养基上培养12h后的活菌数为108.3cfu，牙龈卟啉单胞菌生物膜在血平板上培养48h后的活菌数108.5cfu，同时测了植物乳杆菌在MRS培养基上的培养12h的活菌数108.0cfu，然后将变异链球菌生物膜与植物乳杆菌混合培养之后分别将其在TSB和MRS上培养活菌数均降低了1个数量级，同时植物乳杆菌的菌落数也降低了，说明植物乳杆菌和口腔致病菌发生共聚作用，导致了致病菌生物膜的活菌数的降低。
2.评价口腔微生态制剂降解羟磷灰石的能力
采用钙检测试剂盒(甲基百里香酚蓝法MTB法)测定菌株对于羟磷灰石的降解能力，试剂盒组成如表4所示。
表4钙检测试剂盒组成
Figure GDA0001339955390000141
标准曲线的制作：
用去离子水将2.5mM钙标准液稀释成0.0625mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.625mM、1mM和2mM不同的浓度。
按表5加样混匀，放5min后，分光光度计波长610nm，用空白管调零，读取各管吸光度，制作标准曲线如图8所示。图8为标准钙浓度的标准曲线，从图8中可知标准曲线的回归系数为0.9994，具有很高的回归系数，说明这条标准曲线可作为测试样品的对照曲线。
表5标准钙浓度的标准曲线制作加样表
Figure GDA0001339955390000151
表6测试样品的加样表
Figure GDA0001339955390000152
将变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌的血培养基进行离心获得上清液，按表6加样混匀，放5min后，分光光度计波长610nm，用空白管调零，读取各管吸光度。图9为本发明口腔微生态制剂对变异链球菌降解羟基磷灰石的关系曲线。其中，a为变异链球菌，b为植物乳杆菌，c为变异链球菌和植物乳杆菌混合。可以看出植物乳杆菌能降低变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌降解羟基磷灰石的能力，未加入植物乳杆菌的变异链球菌释放Ca的含量吸光度值是0.6，但是加入植物乳杆菌之后，变异链球菌释放Ca的含量降低到了吸光度值为0.2，显著降低了变异链球菌降解羟基磷灰石的能力。图10为本发明口腔微生态制剂对牙龈卟啉单胞菌降解羟基磷灰石的的关系曲线。其中，a为牙龈卟啉单胞菌，b为牙龈卟啉单胞菌和植物乳杆菌混合。从图10中可以看到牙龈卟啉单胞菌释放Ca的含量由原来吸光度值0.8降低到了0.2，说明了本发明的口腔微生态制剂具有降低牙龈卟啉单胞菌降解羟基磷灰石的能力，也说明植物乳杆菌能够有效的预防龋齿。
本发明的上述实施为较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种口腔制剂微生态制剂及其制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac 60
cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct 120
acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt 180
tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt 240
catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcacc agagtgccca acttaatgct 300
ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga 360
gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc atgtccccga agggaacgtc taatctctta 420
gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca 480
tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac 540
tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca 600
cttagcattc atcgtttacg gtatggacta ccagggtatc taatcctgtt gctacccata 660
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atatatctac gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt 780
ttcccagttt ccgatgcact tcttcggttg agccgaaggc tttcacatca gacttaaaaa 840
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cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta aataccgtca atacctgaac 960
agttactctc agatatgttc ttctttaaca acagagtttt acgagccgaa acccttcttc 1020
actcacgcgg cgttgctcca tcagactttc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc 1080
tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgattaccct ctcaggtcgg 1140
ctacgtatca ttgccatggt gagccgttac cccaccatct agctaatacg ccgcgggacc 1200
atccaaaagt gatagccgaa gccatctttc aagctcggac catgcggtcc aagttgttat 1260
gcggtattag catctgtttc caggtgttat cccccgcttc tgggcaggtt tcccacgtgt 1320
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<211> 1358
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
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ggacgaaagt ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact 360
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caccatggga g 1331

Claims (6)

1.一种口腔微生态制剂，其特征在于，所述口腔微生态制剂是先将菌株分别接种于MRS培养基培养后，经真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉，再将所述单菌菌粉混合成混合菌粉，并与抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味剂和辅料混合制备而成；
所述菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KF-18、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)KF-20、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22和肠膜明串球菌(Leuconostocmesenteroides)KF-15；
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KF-18于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60118；
所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-20于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC60116；
所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KF-22于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC 60139；
所述肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides)KF-15于2017年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC 60138；
所述MRS培养基的配方为：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母4.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g和蒸馏水1000mL；所述菌株相对于MRS培养基的接种量为1～10％；
所述混合菌粉是由植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22、肠膜明串球菌KF-15的单菌菌粉按(1～3)：(1～3)：1：1的质量比混合；所述混合菌粉为15.4～19.48％，奶粉为61.6～77.92％，抗菌肽粗品1～8％，胞外多糖粗品1～9％，甜味剂0.5～3％，辅料0.1～3％；
其中，所述抗菌肽粗品的制备包括如下步骤：
S11.将植物乳杆菌KF-18按1～8％的接种量接种到MRS培养基中，在35～37℃静置培养18～24h；
S12.再将步骤S11培养的植物乳杆菌KF-18以3～5％的接种量接种到10～15％的牛奶溶液中培养18～24h得到发酵液A；
S13.将发酵液A以3500～4500rpm的转速，4～10℃的条件下离心20～30min，取上清液B，将上清液B过1～3K的膜包，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h得到抗菌肽粗品；
所述胞外多糖粗品的制备包括如下步骤：
S21.将乳酸乳球菌KF-22按3～5％的接种量接种到MRS培养基中，35～37℃静置培养18～24h；
S22.再将步骤S21培养的乳酸乳球菌KF-22以3～5％的接种量接种到10～15％的牛奶溶液中培养18～24h得到发酵液C；
S23.将发酵液C经煮沸10～15min，冷却后以3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min得到上清液D；
S24.将三氯乙酸水溶液加入上清液D中，在3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min得到上清液E；然后在上清液E中加入无水乙醇静置20～24h，再以3500～4500rpm转速，4～10℃的条件下离心20～30min收集沉淀物；
S25.沉淀物用超纯水溶解后过1～3K的膜包，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h制得胞外多糖粗品。
2.根据权利要求1所述口腔微生态制剂，其特征在于，所述单菌菌粉的制备包括如下步骤：
S1.将权利要求1中所述菌株分别进行传代两次进行培养活化；
S2.将权利要求1中所述菌株以1～10％的接种量分别用MRS培养基培养之后，加入牛奶溶液保护剂，然后经-36～-40℃，24～30h真空冷冻干燥得到相应的单菌菌粉。
3.根据权利要求1所述的口腔微生态制剂，其特征在于，步骤S24中所述三氯乙酸水溶液的浓度为50～80％，所述三氯乙酸水溶液的体积为上清液D体积的7～10％，所述无水乙醇与上清液E的体积比为(4～5)：1，步骤S25中所述超纯水与步骤S22中所述发酵液C的体积相同。
4.根据权利要求1所述的口腔微生态制剂，其特征在于，所述的甜味剂为赤藓糖醇、木糖醇或山梨醇。
5.根据权利要求1所述的口腔微生态制剂，其特征在于，所述的辅料为羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁，所述羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁的质量比为(1～6)：1。
6.根据权利要求1-5任一项所述口腔微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S31.将植物乳杆菌KF-18、乳酸乳球菌KF-20、乳酸乳球菌KF-22、肠膜明串球菌KF-15分别优化活菌数培养后，在-36～-40℃经真空冷冻干燥24～30h得到相应的单菌菌粉，并将单菌菌粉混合；
S32.将植物乳杆菌KF-18菌株发酵产物分离纯化得到抗菌肽粗品；
S33.将乳酸乳球菌KF-22发酵产物分离纯化得到胞外多糖粗品；
S34.将混合的单菌菌粉、抗菌肽粗品、胞外多糖粗品、奶粉、甜味剂和辅料混合打成粉状，用10～40目过筛后压制成片剂，即为口腔微生态制剂。
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