CN107080280B - 一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法及烟 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌在酱香风味烟上的应用，是以保藏号为CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为生产菌种，生产酱香风味烟。本发明具有改善卷烟香型、丰富香烟种类，提高市场竞争力的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌的应用，特别是一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法及烟。
背景技术
酱香风味的研究包括酱香的香气成分的分析、形成机制的以及产酱香功能菌的分离。
最初，横冢认为4-乙基愈创木酚为酱油的主体香味物质。以此为依据，1964年到1966年轻工部组织科技人员在贵州茅台酒厂进行研究试点，首次报道了不同风格酒的香气成分，最早提出4-乙基愈创木酚是茅台酒的主体香成分。然而，直到1997年胡国栋在茅台酒中监测到其他酚类，推翻了之前的4-乙基愈创木酚是茅台酒的主体香成分的观点。1982年，贵州轻工业局对三种单型酒的气相色谱分析，认为酱香为复合香，包括前香和后香。周良彦从酱香就中检测到7种呋喃酮，3种麦芽酚，8种吡喃酮，4种环戊二烯酮，1种环戊烯酮，并在文章中提出酱香型白酒的主体香味物质可能主要是呋喃类以及呋喃类衍生物。季克良，郭坤亮等用气相色谱在酱香型白酒中检测出963个峰，其中有酸类，酯类，醇类，酮类，醛类等。赵书圣从酒醅中测出9种呋喃类物质，包括大量糠醛。王传荣研究表明，茅台酒的香味成分多达 1400 余种,但酱香型白酒的主体香味成分至今尚未定论。
于1912年提出美拉德反应，又称为羰氨反应，是以羰基化合物（还原糖）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）为反应物，在高温条件发生的复杂的化学反应并生成棕色或黑色的大分子物质类黑精或拟黑精，并附带产生一定香味的“非酶促褐变反应”。美拉德反应最终会生成棕褐色的化合物。大量的研究表明，在生产酱香型白酒的过程中，大曲堆积时会发生美拉德反应，但是，已经有研究证明，酱香型白酒中所发生的美拉德反应与其他食物中发生的“非酶促反映”不完全一致，它更加依赖于产酱香功能的菌。
对产酱香功能菌的研究最早开始于上世纪60年代，有研究人员就对茅台酒高温曲的微生物进行了研究，认为茅台酒的曲中含有大量的细菌，其中芽孢杆菌数量众多，并用这些芽孢杆菌发酵碎麦，可以产生像茅台酒曲的香味。1975年贵州轻工业研究所从酱香酒曲中分离坚定出17株枯草芽孢杆菌，其中有5株能产酱香。1982年贵州轻工业研究所从酱香酒酒曲中分离出95种微生物菌株，其中6株细菌和7株酵母菌能产酱香。1992年谢和等从茅台高温大曲中分离出产酱香的嗜热芽孢杆菌。2012年，罗建超等人从贵州省赤水县茅台酒厂的不同生产环节中选择25个采样时间点，无菌操作采集样品25份，从中筛选出产酱香风味物质的菌株25株。本发明的S1011菌株就是从茅台酒厂的制曲车间里分离出的。罗建超等人对S1011菌株做了形态学、生理生化以及分子鉴定，确定S1011菌株是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
贵州是我国烤烟四大产区之一,仅次于云南,其产量、质量都在全国占有重要的地位。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法及烟。本发明具有改善卷烟香型、丰富香烟种类，提高市场竞争力的特点。
本发明的技术方案：一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，是以保藏号为CGMCC No.8720的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为生产菌种，生产酱香风味烟，所述解淀粉芽孢杆菌于2014年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述风味香烟具有酱香风味。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述风味烟的制备方法包括如下步骤：
步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到分离培养基上，经多次转接以活化菌种；
步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液，按1-3%的比例接种到发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序升温各发酵15-30h；
步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入无水乙醇溶液，浸提8-15h，再将提取液以3000-4000r/min离心10-30min；
步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.01-1%往烟叶中喷施提取液，并混匀；
步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入30-40℃干燥箱中至完全干燥。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤一中，是将解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤一中，转接次数为2-3次。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤二中，是选择步骤一中的单菌落接种到种子培养基，按2%的比例接种到发酵培养基中，并升温各发酵24h。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤三中，是浸提12h后，再将提取液以4000r/min离心20min。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤四中，按烟叶的质量百分比喷加提取液的量为0.1%。
前述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，所述步骤五中，干燥温度为35℃。
一种酱香风味的烟，该酱香风味烟由前述方法制得。
本发明的有益效果：
本发明主要利用解淀粉芽孢杆菌发酵的方式制作酱香风味烟，大大降低了生产成本，目前，市场上销售的酱香烟其酱香主要来源于酱香酒，其成本较高，而本发明为了降低成本，利用产酱香解淀粉芽孢杆菌发酵产香，达到了降低成本的目的，并且利用本发明的生产方式可以使酱香留香更持久。
本发明在贵州茅台酒厂制曲车间分离到一株解淀粉芽孢杆菌，其于2014年1月保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.8720，gyrB基因序列号为gb|DQ309311.1。名称为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S1011。
一、S1011菌株的分离方法
（一）采样的地点
贵州茅台酒厂制曲车间
（二）解淀粉芽孢杆菌S1011的分离步骤
1、先称取样品10g放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡均匀，制成10-1的菌悬液。再稀释成10-2-10-7不同稀释度的样品悬液，选择10-3至10-7 4个稀释度涂布于分离培养基平板中。30℃倒置培养24h。挑取单菌落用无菌生理盐水适当稀释后经平板划线纯化，简单染色镜检为纯种后接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，30℃恒温培养24h，4℃冰箱保存备用。
、将分离得到的菌株经两次活化，接种于种子培养基（50mL/ 250mL），30℃、150r/min摇床培养24h，按2%的量接种于已灭菌发酵培养基，30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃升温发酵各24h，发酵结束后筛选出产香菌株，对初筛获得的S1011菌株进行多次重复纯种发酵，确定其是发酵结果稳定的产酱香的细菌。
（三）主要培养基
分离培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20g/L，自来水1000mL,pH7.2-7.4，121℃，0.1Mpa，灭菌30min。
种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，自来水1000mL,pH 7.2-7.4，121℃，0.1Mpa，灭菌30min。
发酵培养基：黄豆用水浸泡3-8h，去皮，分装三角瓶（100g/500mL），121℃，0.1Mpa，灭菌30min。
（四）菌种的保种与传代
用15×150mm的试管，盛牛肉膏蛋白胨固体培养基5mL，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。
（五）菌种的形态特征
将本发明菌种接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，30℃，培养16-18h，菌体呈杆状，两端钝圆，细胞大小为0.7-0.8x1.8-3.0um，革兰氏阳性。芽孢呈圆形或柱形，芽孢近中生，孢囊不膨大。
（六）细菌的生理生化特征
本发明的菌种能利用多种糖，如D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖。耐盐性为2%-10%，生长温度为10℃到55℃。VP反应呈阳性。能生成氧化酶、接触酶、淀粉酶。
（七）分子鉴定
对该菌的gyrB基因进行PCR扩增，回收扩增产物测序，序列与GenBank数据库中已登记的序列进行同源性比较，该菌株的gyrB基因序列与解淀粉芽孢杆菌同源性达99%。
（八）鉴定结果
参照伯杰氏细菌鉴定手册描述，并结合分子鉴定的结果，将这一菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
二、实验例
按烟叶的质量百分比喷加提取液的量分别为0.01%、0.1%和1%，按照本发明相同的方法制备出3批香烟，如表1所示，并给专家品评。
| 实验组 | 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | 实验组4 | 实验组5 |
| 提取液喷洒量（%） | 0.01 | 0.05 | 0.1 | 0.5 | 1 |
品评结果显示，实验组1和2只有较淡的酱香味，几乎被烟的本味掩盖。实验组3的整体效果较好，酱香味浓郁，且几乎没有杂味，酱香味和烟的本味能够很好的融合，整体香味较和谐。实验组4和5除了有浓郁的酱香味及烟的本味外，还有大量杂味，影响了整体的味道。经品评，最终选择实验组3为最佳的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
本发明的实施例
实施例1：一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，是以保藏号为CGMCCNo.8720的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为生产菌种，然后根据下列步骤生产：
步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经2次转接以活化菌种；
步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液，按2%的比例接种到100g发酵培养基，30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序升温各发酵24h；
步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提12h，再将提取液以4000r/min离心20min；
步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.1%往烟叶中喷施提取液，并混匀；
步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入35℃干燥箱中至完全干燥。
实施例2：一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，是以保藏号为CGMCCNo.8720的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为生产菌种，然后根据下列步骤生产：
步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经3次转接以活化菌种；
步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液，按1%的比例接种到100g发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序升温各发酵15h；
步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提8h，再将提取液以3000r/min离心30min；
步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.01%往烟叶中喷施提取液，并混匀；
步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入30℃干燥箱中至完全干燥。
实施例3：一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，是以保藏号为CGMCCNo.8720的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为生产菌种，然后根据下列步骤生产：
步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上，经4次转接以活化菌种；
步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液，按3%的比例接种到100g发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序升温各发酵30h；
步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入100mL无水乙醇溶液，浸提15h，再将提取液以4500r/min离心10min；
步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的1%往烟叶中喷施提取液，并混匀；
步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入40℃干燥箱中至完全干燥。
实施例4：一种酱香风味的烟，该酱香风味烟由上述方法制得。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州大学
<120> 一种产酱香的解淀粉芽孢杆菌及其在酱香风味烟上的利用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1171
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
ggaagcggat ataaagtatc cggcggtctt cacggtgttg gggcgtctgt cgtaaacgcc 60
ttatcgacca ctcttgacgt tacggttcat cgtgacggga aaatccatta tcaggcgtat 120
gaacgcggtg taccggtggc cgatcttgaa gtgatcggtg acactgataa gaccggaacg 180
attacgcact tcgttcccga tccggaaatt ttcaaagaaa caaccgtata cgactatgat 240
ctgctttcaa accgtgtccg agaattggcc ttcctgacaa agggcgtcaa catcacgatt 300
gaagacaaac gtgaaggaca agaacggaaa aacgagtacc actacgaagg cggaatcaaa 360
agctacgttg agtacttaaa ccgttccaaa gaagtcattc atgaagagcc gatttatatc 420
gaaggcgaga aagacggcat aacggttgaa gttgcattgc aatacaacga cagctataca 480
agcaacattt attctttcac gaataacatc aacacatacg aaggcggcac gcacgaagcc 540
ggatttaaaa ccggtttgac ccgtgtcata aacgactatg caagaagaaa agggattttc 600
aaagaaaatg atccgaatct gagcggtgat gatgtgagag aagggctgac tgccatcatt 660
tcaattaagc accctgatcc gcaattcgaa gggcagacga aaacgaagct cggcaactct 720
gaagcgagaa cgattactga tacgctgttt tcttccgcac tggaaacatt ccttcttgaa 780
aatccggact cagcccgtaa aatcgttgaa aagggcttaa tggccgcaag agcgcggatg 840
gcggcgaaaa aagcgcggga attgacccgg cgtaaaagcg cacttgagat ttccaatttg 900
ccgggtaaac tggcggactg ttcttctaaa gatccgagca tttccgagct gtatatcgta 960
gagggtgact ctgcgggcgg atcagcgaaa cagggacggg accgtcattt ccaagccatt 1020
ctgccgctgc ggggtaagat tctgaacgtt gagaaagcaa gacttgataa gattctctca 1080
aacaatgagg tcagatcaat gattacggct ctcgggacag gaatcggaga agactttaat 1140
cttgaaaaag cgcgttatca taaagtggtt a 1171
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Claims (8)
1.一种利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：是以保藏号为CGMCCNo.8720的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为生产菌种，生产酱香风味烟；制备方法包括如下步骤：
步骤一：活化；将所述解淀粉芽孢杆菌接种到分离培养基上，经多次转接以活化菌种；
步骤二：发酵；挑取步骤一中的菌落接种到种子培养基，制作菌悬液，按1-3%的比例接种到发酵培养基，以30℃-35℃-40℃-45℃-50℃-55℃程序升温各发酵15-30h；
步骤三：提取；往发酵后的培养基中加入无水乙醇溶液，浸提8-15h，再将提取液以3000-4000r/min离心10-30min；
步骤四：喷加提取液；按烤烟质量的0.01-1%往烟叶中喷施提取液，并混匀；
步骤五：干燥；将喷加了提取液的烤烟放入30-40℃干燥箱中至完全干燥。
2.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤一中，是将解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨平板上。
3.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤一中，转接次数为2-3次。
4.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤二中，是选择步骤一中的单菌落接种到种子培养基，按2%的比例接种到发酵培养基中，并升温各发酵24h。
5.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤三中，是浸提12h后，再将提取液以4000r/min离心20min。
6.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤四中，按烟叶的质量百分比喷加提取液的量为0.1%。
7.根据权利要求1所述的利用解淀粉芽孢杆菌制备酱香风味烟的方法，其特征在于：所述步骤五中，干燥温度为35℃。
8.一种酱香风味的烟，其特征在于：该酱香风味烟由权利要求1-7任一项权利要求所述方法制得。
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