CN107075498A

CN107075498A - 发酵中的选择优势

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Publication number: CN107075498A
Application number: CN201580030620.2A
Authority: CN
Inventors: E.H.格林哈根; M.哈米尔顿; W.G.拉托夫; A.L.康西利奥; K.M.麦克尤恩; A.J.肖四世
Original assignee: Novogy Inc
Current assignee: Novogy Inc
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2017-08-18
Also published as: EP3129479A4; EP3129479A2; AU2015243881A1; AU2021211986A1; US20170096691A1; WO2015157431A2; US11674162B2; WO2015157431A3; AU2015243881B2

Abstract

本文公开了转化的细胞和相关的核苷酸和蛋白质序列及发酵组合物和方法，其全部涉及在发酵中提供选择优势。例如，选择优势产生于用允许转化的细胞代谢与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢的一种或多种含氮、含磷和/或含硫化合物的核酸转化细胞，并产生于所述转化的细胞利用一种或多种进料(例如分级分离的谷物)的发酵，所述进料缺乏或不含与转化的细胞同一物种的天然细胞可代谢的常规的含氮、含磷和/或含硫化合物。还公开了在需氧或微需氧发酵中输氧改进的方法。

Description

发酵中的选择优势

优先权要求

本申请要求2014年4月8日提交的美国临时专利申请号61/976,672和2014年11月24日提交的美国临时专利申请号62/083,540的优先权的权益；其每一个通过引用以其整体结合到本文中。

发明背景

由于环境顾虑和预期的未来化石燃料耗竭所致，越来越多地通过发酵在生物学上产生传统上在石油化工过程中制造的燃料和化学品。已成功地将可通过厌氧发酵生产的大量生产型化学品引入市场，大部分因为它们可从廉价的糖(例如玉米淀粉)中生产。其它化学品(例如脂质、三酰甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃、烯烃、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3-丙二醇、1,4-丙二醇、琥珀酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇、赤藓糖醇)的生产需要需氧或微需氧发酵环境，但在传统的玉米乙醇发酵中，发酵液的粘度减少氧气传送到如此程度，使得氧气不能支持充足的需氧生产力用于经济上确实可行的工艺过程。因此，需氧和微需氧过程通常使用昂贵的碳源，例如葡萄糖。

另外，如同任何发酵过程一样，需氧和微需氧发酵需要用于控制污染(例如污染性细菌)的方法。加入选择性生长抑制剂(例如细菌抗生素)为对生长抑制剂有抗性的转化的细胞提供选择优势；然而，抗生素常常是不合乎需要的或不可实行的，并且常常发生自发抗性污染。另外，噬菌体也可能污染发酵，而且选择性生长抑制剂在对抗噬菌体污染时是无效的。

发明概述

在一些实施方案中，本发明涉及发酵的方法，所述方法包括将转化的细胞在发酵混合物中孵育。发酵可为需氧或微需氧发酵。发酵混合物可包含下文所述第一部分和第二部分。第一部分可包含分级分离的谷物部分，例如胚乳部分。第一部分基本上可由分级分离的谷物部分(例如胚乳部分)组成。第二部分可包含选自如下文所述的含氮化合物、含磷化合物和含硫化合物的一种或多种化合物。转化的细胞可选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。在一些实施方案中，转化的细胞可代谢一种或多种化合物(即分别利用所述一种或多种含氮、含磷和含硫化合物作为氮、磷和/或硫的来源)。在一些实施方案中，与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢一种或多种化合物。转化的细胞可包含能够使细胞代谢所述一种或多种化合物的遗传修饰。在一些实施方案中，转化的细胞包含赋予噬菌体抗性的遗传修饰。在一些实施方案中，发酵混合物不含抗生素。

在一些实施方案中，选择优势产生于细胞用核酸转化，所述核酸允许转化的细胞代谢与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢的一种或多种含氮、含磷和/或含硫化合物；并且产生于转化的细胞利用一种或多种进料(例如分级分离的谷物)的发酵，所述进料耗尽或不含与转化的细胞同一物种的天然细胞可代谢的常规含氮、含磷和/或含硫化合物。转化的细胞相对于天然细胞的这类选择优势允许减少由天然细胞和其它生物引起的污染。

附图简述

图1描述三聚氰胺降解途径的图示。1 – 三聚氰胺脱氨酶(tzrA) (EC 3.5.4.-)；2 –三聚氰酸二酰胺脱氨酶(鸟嘌呤脱氨酶) (EC 3.5.4.3)；3 – N-异丙基氰尿酰胺异丙基氨基(三聚氰酸一酰胺)水解酶(EC 3.5.99.4)；4 – 氰尿酸水解酶(EC 3.5.2.15)；4a – 羧基缩二脲脱羧酶，自发反应；5 – 缩二脲酰胺水解酶(EC 3.5.1.84)；6 – 脲基甲酸水解酶(EC3.5.1.54)。可如下使氮同化(作为NH₃)：通过作用于三聚氰胺的完整途径的作用，每mol三聚氰胺释放6 mol NH₃，或通过作用于途径中间体的一亚组酶(例如，作用于氰尿酸的步骤4、4a、5和6，每mol氰尿酸释放3 mol NH₃)。

图2描述氨腈同化途径的图示。在通过氨腈水合酶(EC 4.2.1.69)将氨腈转化成脲后，脲可通过脲酶(EC 3.5.1.5)或通过脲羧化酶(EC 6.3.4.6)和脲基甲酸水解酶(EC3.5.1.54)降解。

图3 – 10描述本发明的不同质粒。

图11描述含有不同浓度的铵离子或三聚氰胺的培养基中NS88和NS91 (对照)的生长进程。

图12描述含有不同浓度的铵离子或缩二脲的培养基中NS90和NS91 (对照)的生长进程。

图13描述48小时后拍摄的在具有不同氮源的MOPS培养基中生长的培养物的图像。从左到右：含10 mM三聚氰胺的NS88；含10 mM三聚氰胺的NS91；含10 mM缩二脲的NS90 (重复1)；含10 mM缩二脲的NS90 (重复2)；和含10 mM缩二脲的NS91。

图14描述与NH₄Cl上的天然生物的标准曲线相比，0.25 mM三聚氰胺上本发明的4种生物的生长(NS91 = 对照)。因为三聚氰胺具有6个氮原子，具有利用三聚氰胺的能力的生物应约6倍更有效(参见例如与1.5 mM NH₄Cl上的天然生物相比，0.25 mM三聚氰胺上的NS110)。

图15描述与NH₄Cl上的天然生物的标准曲线相比，0.25 mM三聚氰酸二酰胺上本发明的4种生物的生长(NS91 = 对照)。因为三聚氰酸二酰胺具有5个氮原子，具有利用三聚氰胺的能力的生物应约5倍更有效(参见例如与1.25 mM NH₄Cl上的天然生物相比，0.25 mM三聚氰酸二酰胺上的NS110)。

图16描述0.5 mM NH₄Cl上本发明的不同生物的生长。

图17描述不含氮的培养基上本发明的不同生物的生长。

图18描述含有0.5 mM三聚氰胺的培养基上本发明的不同生物的生长。

图19描述不同有机磷化合物的名称和结构。

图20描述不同有机硫化合物的名称和结构。

图21描述不含氮源、含脲或含氨腈的培养基中NS100 (对照)和NS101的生长进程。

图22描述含脲培养基中NS100 (对照)和NS101的群体部分。

图23描述含氨腈培养基中NS100 (对照)和NS101的群体部分。

图24描述在不含氮源的培养基或含氨腈的培养基中NS100 (对照)和NS101的生长进程。

图25描述在抗生素存在下在不同的含氮培养基上的本发明生物的生长。

图26是使用3种不同的进料在1升生物反应器中以1000 rpm混合发酵混合物所需转矩的图表。

图27是显示使用3种不同进料的1升发酵混合物的葡萄糖消耗的曲线图。

图28显示pKD46-recA质粒，所述质粒编码组成型表达的大肠杆菌(Escherichia coli) recA+以及野生型rpsL。

图29显示用于产生重组DNA分子和基因置换的策略。(A)重组寡核苷酸用与靶标上的序列相同的5′ 30–50 nt (阴影矩形)和与待引入的盒的末端同源的3′ 20 nt (箭头)以化学法合成。盒通过PCR产生，所述盒的两侧是存在于靶标上的30 bp-50 bp同源物。(B)针对Exo、Beta和Gam功能，诱导在染色体或在质粒上携带靶DNA的细胞。使这些细胞能用于电穿孔，并与扩增的盒混合。(C)在电穿孔后，在线性盒和靶标上的同源序列之间发生重组，将靶区段用盒置换。

发明详述

定义

冠词“a”和“an”在本文用来指冠词的语法对象的一个或一个以上(即至少一个)。举例来说，“要素”意指一个要素或一个以上要素。

术语“噬菌体(bacteriophage/phage)”是指选择性地感染一个或多个细菌物种的病毒。在一些实施方案中，噬菌体是裂解的，而在其它实施方案中，噬菌体是溶原的。裂解噬菌体是遵循裂解途径通过完成裂解周期而非进入溶原途径的噬菌体。裂解噬菌体进行病毒复制，导致细胞膜裂解、细胞破坏并释放能够感染其它细胞的子代噬菌体颗粒。溶原噬菌体是能够进入溶原途径的噬菌体，在溶原途径中噬菌体在裂解周期完成之前变成细胞基因组的潜伏的被动部分。可用于本发明的噬菌体包括但不限于属于下列病毒科的任一个的噬菌体：覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)和复层噬菌体科(Tectiviridae)。

术语“编码”是指包含编码区、编码区的一部分或其互补序列的核酸。DNA和RNA两者均可编码基因。DNA和RNA两者均可编码蛋白质。

术语“分级分离的谷物”和“分级分离的谷物醪”是指被分离成基本上没有胚、麸、胚乳或前述的两种(即胚和麸、胚和胚乳或麸和胚乳)的部分的谷物。在本发明的一些实施方案中，分级分离的谷物或分级分离的谷物醪基本上由胚乳组成。分级分离的谷物醪是已加工将谷物淀粉分解成糖的分级分离的谷物。除非另有说明，否则术语“分级分离的谷物”和“分级分离的谷物醪”可互换使用。

本文所用术语“基因”可包括含有内含子，具体地讲编码参与具体活性的多肽序列的多核苷酸序列的基因组序列。该术语还包括非来源于基因组序列的合成核酸。在某些实施方案中，基因没有内含子，因为它们根据已知的cDNA和蛋白质序列的DNA序列合成。在其它实施方案中，基因是合成的非天然cDNA，其中例如根据密码子使用，密码子被优化以在大肠杆菌或其它生物中表达。该术语可进一步包括包含上游、下游和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。

术语“遗传修饰”是指转化的结果。根据定义，每次转化引起遗传修饰。

术语“诱导型启动子”是指在响应特定刺激时介导有效连接的基因转录的启动子。

术语“整合的”是指作为插入至细胞基因组(例如插入至染色体)、包括插入至质粒基因组中而保留在细胞中的核酸。

术语“有效连接”或“呈有效连接”意指两个核苷酸序列，例如控制序列(通常为启动子)和连接序列(通常为编码蛋白质的序列，亦称编码序列)之间的功能性连接。启动子如果可介导基因转录，则是与基因呈有效连接。

术语“天然”是指在转化事件之前细胞或亲本细胞的组成。

术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何功能。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、自连锁分析确定的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸结构的修饰如存在，则可在聚合物装配之前或之后提供。多核苷酸可通过例如与标记组分缀合被进一步修饰。在本文提供的所有核苷酸序列中，U核苷酸可与T核苷酸相互交换。

术语“亲本细胞”是指细胞从其中传代的每个细胞。细胞的基因组由亲本细胞的基因组和亲本细胞基因组的任何后续的遗传修饰组成。

本文所用术语“质粒”是指与生物基因组DNA在物理上分离的环状DNA分子。质粒在导入宿主细胞之前可被线性化(本文亦称为线性化质粒)。线性化质粒可能不是自我复制的，但可整合至生物的基因组DNA中并与之一起复制。

“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必需核苷酸序列。启动子还任选包括远端增强子或阻遏物元件，所述增强子或阻遏物元件可距转录起始位点多达几千个碱基对。

“重组”是指因外源核酸的导入或天然核酸的改变而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因此，例如，重组细胞可表达天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因或表达不同于由非重组细胞表达的那些基因的天然基因。重组细胞可包括而不限于编码基因产物或抑制元件(例如降低细胞中活性基因产物的水平的突变、敲除、反义物、干扰RNA (RNAi)或dsRNA)的重组核酸。“重组核酸”是一般来说使用例如聚合酶、连接酶、外切核酸酶和内切核酸酶通过操作核酸最初在体外形成的核酸，或以别的方式呈一般不存在于自然界的形式。重组核酸例如可通过使两个或更多个核酸有效连接来产生。因此对于本发明的目的，通过连接自然界一般不连接的DNA分子而体外形成分离的核酸或表达载体均被视为重组。一旦重组核酸产生并导入宿主细胞或生物中，便可利用宿主细胞的体内细胞机器复制；然而对于本发明的目的，所述核酸一旦重组产生，虽然随后在胞内复制，但仍被视为重组的。同样，“重组蛋白”是采用重组技术制备(即通过重组核酸表达)的蛋白质。

本文所用术语“抗性的”和“抗性”是指对噬菌体有抗性。在一些实施方案中，转化的细胞对噬菌体有抗性，因为相对于与转化的细胞同一物种的天然细胞，转化的细胞对噬菌体繁殖或感染的易感性降低。在一些实施方案中，转化的细胞对噬菌体有抗性，因为相对于与转化的细胞同一物种的天然细胞，转化的细胞对噬菌体繁殖具有低易感性。例如，转化的细胞对噬菌体繁殖的易感性可以是相同物种的天然细胞的至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/10,000或1/100,000。在一些实施方案中，抗性是指在噬菌体耗尽感染的细胞的代谢资源之前导致所述细胞死亡的遗传修饰(例如，遗传修饰通过顿挫型感染系统赋予抗性)。例如，相对于与转化的细胞同一物种的天然细胞，转化的细胞可产生较少的噬菌体子代，例如至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/10,000或1/100,000的子代。

“转化”是指核酸转移至宿主生物或宿主生物的基因组中，导致遗传学上的稳定遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为“重组”、“转基因”或“转化的”生物。因此，可将本发明的分离多核苷酸掺入能够导入宿主细胞并在其中复制的重组构建体(通常DNA构建体)中。所述构建体可为载体，其包括能够在指定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的复制系统和序列。通常，表达载体包括例如在5'和3'调节序列的转录控制下的一个或多个克隆基因和选择标记。所述载体还可含有启动子调节区(例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调节的或位点特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合部位、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

术语“转化的细胞”是指已进行转化的细胞。因此，转化的细胞包含亲本的基因组和可遗传的遗传修饰。

术语“载体”是指核酸可籍以增殖和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移的工具。载体包括能够或不能够自主重复或整合到宿主细胞染色体中的质粒、线性DNA片段、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等。

微生物工程改造

A. 概述

基因和基因产物可被导入微生物宿主细胞中。按照本发明的不同实施方案用于基因和核酸分子表达的合适的宿主细胞包括广泛存在于藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母科的微生物宿主。

合适的酵母的实例包括Arxula、曲霉属(Aspegillus)、Aurantiochytrium、假丝酵母属(Candida)、麦角属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、Ogataea、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、酒曲菌属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Wickerhamomyces和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)，例如，酵母细胞可选自Arxula adeninivorans、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、Aurantiochytrium limacinum、产朊念珠菌(Candida utilis)、麦角菌(Claviceps purpurea)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、日本小克银汉霉(Cunninghamella japonica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、Ogataea polymorpha、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、Prototheca zopfii、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、脑状银耳(Tremella enchepala)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)和亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)。

合适的藻类的实例包括雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Aurantiochytrium spp、微拟珠藻(Nannochloropsis spp.)、四爿藻(Tetraselmis spp.)、巴夫藻(Pavlova spp.)和等鞭金藻(Isochrysis spp)。细胞可选自thraustochytrids(Aurantiochytrium)和无叶绿素单细胞藻类(Prototheca)。

合适的细菌的实例包括醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、节细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳球菌属(Lactococcus)、微球菌属(Micrococcus)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚珠藻属(Synechococcus)、热厌氧菌属(Thermoanaerobacter)和黄单胞菌属(Xanthomonas)。例如，细菌可选自醋杆菌、乙酸钙不支杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、富养产碱菌(Alcaligenes eutropha)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniforms)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、溶壁微球菌(Paracoccus denitrificans)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、链霉菌、细长聚球藻(Synechococcus elongates)、热厌氧菌(Thermoanaerobacter/Thermoanaerobacterium spp)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。

合适的真菌的实例包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、根霉(Rhizopus spp.)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。

细胞可选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角属、隐球菌属、小克银汉霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、酒曲菌属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、耶罗维亚酵母属、衣藻、Aurantiochytrium、微拟珠藻属(Nannochloropsis)、四爿藻属(Tetraselmis)、巴夫藻属(Pavlova)、等鞭金藻属(Isochrysis)、醋杆菌属、不动杆菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属、Clostridium、棒状杆菌属、埃希氏菌属、乳球菌属、微球菌属、副球菌属、假单胞菌属、链球菌属、链霉菌属、聚珠藻属、热厌氧菌属、曲霉属、青霉属(Penicillium)、根霉菌属(Rhizopus)和木霉属(Trichoderma)。

在一些方面，本发明涉及包含含有本文公开的核苷酸序列的任一个的基因的转化的细胞。在某些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO. 1-30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52和54-71、73、75、77、79、81、83、85和87-102所示核苷酸序列的任一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的转化的细胞。在一些实施方案中，本发明涉及包含编码与SEQ ID NO. 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、72、74、76、78、80、82、84和86所示氨基酸序列的任一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的转化的细胞。

含有指导外源蛋白质表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员已知的。这些的任一种可用来构建嵌合基因以产生本发明序列的基因产物的任一种。然后可通过转化技术将这些嵌合基因导入合适的微生物中以表达酶或噬菌体抗性基因。

例如，可将编码酶的基因克隆至合适的质粒中，且上述作为宿主的起始母株可用所得质粒转化。该方法可加入编码酶的各基因的多个拷贝，因此，可提高酶的活性。质粒不受特别限制，只要它赋予微生物子代可遗传的所需基因。

可用于合适宿主细胞转化的载体或盒是本领域众所周知的。通常载体或盒含有指导相关基因转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含带有转录起始控制的基因的区域5'和控制转录终止的基因的区域3'。当两个控制区来源于与转化的宿主细胞同源的基因时是优选的，尽管要了解，所述控制区不必来源于对选择作为生产宿主的具体物种是天然的基因。

启动子、cDNA和3'UTR以及载体的其它元件可使用自天然来源分离的片段通过克隆技术产生(Green和Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版,2012)；美国专利号4,683,202，通过引用结合到本文中)。或者，元件可采用已知方法合成产生(Gene 164:49-53 (1995))。

B. 载体和载体组分

鉴于本文的公开内容，可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备根据本发明用于转化微生物的载体。载体通常含有一个或多个基因，其中各基因编码所需产物(基因产物)的表达，并且与调节基因表达或使基因产物靶向重组细胞中的特定位置的一个或多个控制序列有效连接。

1. 控制序列

控制序列是调节编码序列表达或引导基因产物至细胞内或外的特定位置的核酸。调节表达的控制序列包括例如调节编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一个控制序列是位于编码聚腺苷酸化信号的编码序列末端的3'非翻译序列。引导基因产物至特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些控制序列，所述控制序列引导其所连接的蛋白质至细胞内或外的特定位置。

因此，用于基因在微生物中表达的示例性载体设计含有所需基因产物(例如选择标记或酶)的编码序列，其与在宿主细胞中有活性的启动子有效连接。或者，如果载体不含与目标编码序列有效连接的启动子，则编码序列转化到细胞中，使得它在整合点上与内源启动子有效连接。

用于表达基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或不同的启动子。

启动子一般可表征为组成型或诱导型。组成型启动子一般是有活性的或总是(或在细胞生命周期的某些时间)以相同的水平起驱动表达的作用。相反地，诱导型启动子只在响应刺激时是有活性的(或使之失活)或显著增量调节或减量调节。两种类型的启动子均用于本发明的方法。可用于本发明的诱导型启动子包括在响应刺激(例如外源提供的小分子、温度(热或冷)、培养基中缺氮等)时介导有效连接的基因转录的那些启动子。合适的启动子可激活实质上沉默的基因转录或增量调节、优选显著地增量调节有效连接的以低水平转录的基因转录。

终止区控制序列的加入是任选的，如果采用，则选择主要是便利的选择，因为终止区是相对可互换的。终止区对于例如目标DNA序列可以是天然的，或可获自另一来源(参见例如Chen和Orozco, Nucleic Acids Research 16:8411 (1988))。

2. 基因和密码子优化

通常，基因包括启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术装配时，基因可称为表达盒，且侧翼可为限制位点以便于插入用于将重组基因导入宿主细胞的载体中。表达盒的侧翼可为来自基因组或其它核酸靶的DNA序列以促进通过同源重组将表达盒稳定整合至基因组中。或者，载体及其表达盒可保持非整合的(例如作为附加体)，在此情况下，载体通常包括能够提供载体DNA复制的复制起点。

存在于载体上的通用基因是编码蛋白质的基因，所述基因的表达允许含有所述蛋白质的重组细胞与不表达该蛋白质的细胞区分开来。所述基因及其相应的基因产物称为选择标记或选择标志。各种选择标记的任一种可应用于转基因构建体，所述构建体可用于本发明的生物。

对于重组蛋白的最适表达，产生具有由待转化的宿主细胞最适使用的密码子的mRNA的编码序列是有利的。因此，转基因的适当表达可能需要转基因的密码子选择匹配转基因在其中表达的生物的具体密码子偏倚。在这种效应基础上的确切机制有许多，但是包括可用的氨基酰化tRNA库与细胞中待合成的蛋白质的适当平衡，当该需要满足时与转基因信使RNA (mRNA)更有效的翻译。当转基因中的密码子选择未优化时，可用的tRNA库可能不足以允许转基因mRNA有效翻译，导致了核糖体停转和转基因mRNA的终止和可能的不稳定。

C. 两个或更多个外源基因的表达

另外，转化的细胞可包含和表达一个以上的外源基因。一个或多个基因可利用诱导型启动子表达，这允许这些基因表达的相对时机受控制。两个或更多个外源基因的表达可在相同的诱导型启动子或不同的诱导型启动子的控制下。在后一情况下，可诱导第一外源基因的表达持续第一时段(期间可诱导或不诱导第二外源基因的表达)，并可诱导第二或更多的外源基因的表达持续第二时段(期间可诱导或不诱导第一外源基因的表达)。

D. 转化

可通过任何合适的技术，包括例如生物射弹(biolistics)、电穿孔、玻璃珠转化和碳化硅晶须转化，将细胞转化。用于将转基因导入微生物的任何方便的技术可应用于本发明中。可通过例如D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68:326 (1979))的方法、通过用氯化钙增加接受细胞对DNA的通透性的方法(Mandel和Higa, J. Molecular Biology, 53:159 (1970))等，来实现转化。用于转化细菌(例如大肠杆菌)的实例是众所周知的(参见例如Green和Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版, 2012))。

用于转化本发明的微生物的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。在一个实施方案中，用于基因在微生物中表达的示例性载体设计含有编码与在微生物中有活性的启动子有效连接的酶的基因。或者，如果载体不含与目标基因有效连接的启动子，则基因可转化至细胞中，使得它在整合点上与天然启动子有效连接。载体还可含有编码蛋白质的第二基因。任选，一个或两个基因后面是含有聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码两个或更多个基因的表达盒可在载体中或在单独的载体中物理连接。还可进行微生物的共转化，其中同时使用截然不同的载体分子以转化细胞(Protist 155:381-93 (2004))。任选可根据在抗生素或其它选择标记存在下在缺乏抗性盒的细胞在其中不能生长的条件下的生长能力，来选择转化的细胞。

E. 重组工程化

重组工程化(Recombineering) (产生重组的工程改造)是用来修饰DNA的基于同源重组的技术。在表达重组工程化酶的宿主细胞中通过同源重组精确改变靶DNA分子(质粒、BAC载体或宿主染色体)。大肠杆菌中的重组工程化常常利用噬菌体λ Red重组功能(Murphy, J Bacteriol 1998, 180:2063-2071；Datsenko和Wanner, Proc Natl Acad Sci USA 2000,97:6640-6645)。参与Red重组的λ基因为exo、bet和gam。exo (Reda)基因产物具有5′-3′外切核酸酶活性，而bet (Redb)基因产物是促进退火的单链DNA结合蛋白。gam基因产物抑制RecBCD核酸酶，防止了线性DNA (即PCR产物)降解。Nature Technologies Inc.开发了两个质粒用于重组工程：pKD46-RecA (图28)和pKD46-RecA_pa。

由Bet (一种ssDNA退火蛋白)和Exo (一种5'-3' dsDNA外切核酸酶)组成的λ Red重组系统促进电穿孔的线性DNA底物以极高的效率进行基因置换入大肠杆菌K-12染色体中。为了进行重组工程，需要表达噬菌体重组系统的细菌菌株。产生包含新的遗传修饰的转化的大肠杆菌的第一步是制备已表达重组工程化功能的电感受态(electrocompetent)细胞(在这种情况下为用pKD46-RecA质粒转化的大肠杆菌菌株)。pKD46-RecA含有重组所必需的噬菌体λ Red基因。下一步是用双链线性DNA (例如表达酶的基因或噬菌体抗性基因)转化。在转化后，重组发生在线性DNA上的同源序列和靶序列之间，用表达盒置换靶区(图29)。

示例性转化细胞

1. 代谢含氮化合物的转化细胞

在某些实施方案中，本发明涉及转化细胞，其中转化细胞包含编码选自以下酶的遗传修饰：脲基甲酸水解酶、缩二脲酰胺水解酶、氰尿酸酰胺水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、三聚氰酸二酰胺水解酶、三聚氰酸一酰胺水解酶、三聚氰胺脱氨酶、异丙基氰尿酰胺异丙基氨基水解酶、氨腈水合酶、脲酶和脲羧化酶。按照本发明的某些实施方案可代谢含氮化合物的示例性转化细胞描述于PCT专利申请公布号WO 2014/107660，通过引用结合到本文中。

在某些实施方案中，遗传修饰是用包含选自以下基因的核酸转化：atzF、DUR1,2、YALI0E 07271g、atzE、atzD、trzC、trzD、trzE、atzD、guaD、blr3880、GUD1/Y DL238C、YAL10E2 5740p、trzA、triA、atzC和cah。在某些实施方案中，遗传修饰是用包含选自以下基因的核酸转化：atzF、DUR1,2、YALI0E 07271g、atzE、atzD、trzD、atzD、guaD、blr3880、GUD1/Y DL238C、YAL10E2 5740p、trzA、triA、atzC和cah。任何生物可用作基因的来源，只要基因具有所需的酶促活性。可通过分离补充没有酶促活性的变异品系的营养缺陷型的DNA片段，从生物的染色体DNA获得基因。或者，如果已经阐述基因的核苷酸序列，则可使用染色体DNA作为模板，使用根据已知核苷酸序列合成的引物，通过PCR获得基因(Biochemistry, 22:5243-49 (1983)；J. Biochemistry 95:909-16 (1984)；Gene 27:193-99 (1984)；Microbiology 140:1817-28 (1994)；Molecular Genetics & Genomics 218:330-39(1989)；Molecular Microbiology 6:317-26 (1992))。

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码选自以下酶的遗传修饰：来自红球菌(Rhodococcus sp.)菌株Mel的trzE、来自豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)的trzE (trzC MEL、trzC 12227)、来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)Fo5176的cah、来自F. pseudograminaearum CS3096的cah、来自玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae) PH-1的cah、白曲霉(Aspergillus kawachii) IFO 4308的cah、黑曲霉CBS 513.88的cah、来自黑曲霉ATCC 1015的cah、来自米曲霉3.042的cah、来自酿酒酵母FostersB的cah、来自假单胞菌菌株ADP的atzF、来自酿酒酵母的DUR1,2、来自亚罗解脂酵母CLIB122的YALI0E 07271g、来自假单胞菌菌株ADP的atzE、来自假单胞菌菌株ADP的atzD、来自假单胞菌菌株NRRLB-12227的trzD、来自红球菌Mel的atzD、来自红球菌Mel的trzD、来自大肠杆菌K12菌株MG1566的guaD、来自Bradyrhizobium japonicum USDA 110的blr3880、来自酿酒酵母的GUD1/Y DL238C、来自亚罗解脂酵母CLIB122的YAL10E2 5740p、Williamsiasp. NRRL B-15444R的trzA、来自假单胞菌菌株NRRL B-12227的triA、来自假单胞菌菌株ADP的atzC和疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)的cah。

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码一种或多种酶的遗传修饰，所述酶可催化三聚氰胺降解途径中的步骤。在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，所述细胞表达可催化三聚氰胺降解途径中的步骤的酶。

表1

参与三聚氰胺降解途径的酶的DNA和蛋白质序列。

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码一种或多种酶的遗传修饰，所述酶可催化氨腈至脲、脲至氨、脲至脲基甲酸酯或脲基甲酸酯至氨的转化。在某些实施方案中，本发明涉及表达酶的转化的细胞，所述酶催化氨腈至脲、脲至氨、脲至脲基甲酸酯或脲基甲酸酯至氨的转化。

2. 代谢含磷和含硫化合物的转化细胞

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码选自以下一种或多种酶的遗传修饰：亚磷酸脱氢酶、次磷酸/2-酮戊二酸加双氧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶(sn-甘油3-磷酸：NAD(+)氧化还原酶，EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、有机磷酸降解酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、脱硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物单加氧酶、2-羟基联苯-2-亚磺酸亚磺基裂解酶、二苯并噻吩单加氧酶和NADH-FMN氧化还原酶。可代谢按照本发明的某些实施方案的含磷和含硫化合物的示例性转化细胞描述于PCT专利申请公布号WO 2015/031441，通过引用结合到本文中。

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码选自以下一个或多个基因的遗传修饰：dszABC、dszA、dszABCD、dszB、dszC、dszD、gpdQ、hocA、htxA、htxABCDEFHGIJKLMN、htxB、htxC、htxD、htxE、htxF、htxG、htxH、htxI、htxJ、htxK、htxL、htxM、htxN、opdA、ophA、pde、pdeA、phoA、ptxABCDE、ptxD、ugpA、ugpAECB、ugpB、ugpC、ugpE、updA、updABDE、updB、updD和updE。

在某些实施方案中，本发明涉及转化的细胞，其中转化的细胞包含编码选自以下一个或多个基因的遗传修饰：食酸丛毛单胞菌(Delftia acidoorans)磷酸二酯酶pdeA、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) updABDE gpdQ、无周质前导序列的产黄菌属(Flavobacterium) opdA、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 phoA、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii) C11 hocA、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) WM88htxABCDEFHGIJKLMN、施氏假单胞菌WM88 ptxABCDE、红球菌属(Rhodococcus) dszD和红球菌属dszABC。

3. 鉴定代谢含氮、含磷和含硫化合物的其它酶

任何生物都可用作基因的来源，只要基因具有所需酶促活性。可通过分离补充没有酶促活性的变异品系的营养缺陷型的DNA片段，从生物的染色体DNA中分离基因。或者，如果已经阐述了基因的核苷酸序列，则可使用染色体DNA作为模板，使用根据已知核苷酸序列合成的引物通过PCR获得基因。

核苷酸序列可包含保守取代、缺失或插入同时仍保持功能活性。例如，可针对特定的宿主细胞使密码子优化；出于方便可替换不同的密码子，例如以引入限制位点或产生最适PCR引物，或可替换密码子用于另一目的。同样地，可改变核苷酸序列以产生保守氨基酸取代、缺失和/或插入。保守取代表是本领域众所周知的(Creighton, Proteins (第2版,1992))。

可采用重组DNA操作容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于DNA序列操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，在DNA的预先确定的位点进行取代突变的技术为本领域技术人员所熟知，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB, Cleveland, OH)、Quick Change位点定向诱变(Stratagene, San Diego, CA)、PCR介导的位点定向诱变和其它位点定向诱变方案。

为了测定2个氨基酸序列或2个核苷酸序列的百分比同一性，可针对最适比较目的对序列进行比对(例如，可将空位引入第一和第二氨基酸或核苷酸序列的一个或两个中用于最适比对，且可忽略不相同的序列用于比较目的)。针对比较目的比对的参比序列的长度可为参比序列长度的至少95%。然后可比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的位置被与第二序列相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该位置处的分子是相同的。(本文所用氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑空位数和各空位的长度，2个序列间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数的函数，所述空位需被引入以用于2个序列的最适比对。

序列的比较和2个序列间百分比同一性的测定可应用数学算法实现。在一个实施方案中，2个氨基酸序列间的百分比同一性可采用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，应用Needleman和Wunsch算法(J.Molecular Biology 48:444-453 (1970))测定，所述算法已并入GCG软件包的GAP程序(可获自http://www.gcg.com)中。在又一个实施方案中，2个核苷酸序列的百分比同一性可采用NWSgapdna. CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，应用GCG软件包的GAP程序(可获自http://www.gcg.com)测定。在另一实施方案中，2个氨基酸或核苷酸序列间的百分比同一性可采用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分，应用E. Meyers和W. Miller的算法(Computer Applications in the Biosciences4:11-17 (1988))测定，所述算法已并入ALIGN程序(2.0或2.0U版)中。

可用来测定2个序列间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP，以及Clustal程序，例如ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。

当相对于GenBank DNA序列和其它公众数据库中的核苷酸序列评价指定核苷酸序列时，序列检索通常应用BLASTN程序进行。BLASTX程序有效用于搜索以GenBank蛋白质序列和其它公众数据库的氨基酸序列为标准所有读框均翻译的核苷酸序列。

为测定两个或更多个序列间的“%同一性”，可应用例如CLUSTAL-W程序进行所选序列的比对。

“编码序列”或“编码区”是指具有在序列表达时产生蛋白质产物(例如氨基酸或多肽)所需序列信息的核酸分子。编码序列可包含翻译区内的非翻译序列(包括内含子或5'或3'非翻译区)和/或由其组成，或可缺乏这类间插的非翻译序列(例如在cDNA中)。

整个说明书中提及包含核苷酸序列和/或由其组成的核酸所用的缩略语为常规一字母缩略语。因此当包括在核酸中时，天然存在的编码核苷酸缩写如下：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。此外，本文提供的核苷酸序列为5'→3'方向。

本文所用术语“互补的”及其派生词在提及核酸配对时使用，核酸配对遵循众所周知的A与T配对或U和C与G配对的规则。互补可为“部分的”或“完全的”。在部分互补中，只有一些核酸碱基按照碱基配对规则匹配；而在完全或全部互补中，所有碱基均按照配对规则匹配。核酸链间互补的程度可对核酸链间杂交的效率和强度具有重要作用。所述杂交的效率和强度取决于检测方法。

4. 对噬菌体有抗性的转化细胞

噬菌体无所不在的分布和丰度对细菌工业应用具有重大影响。已培养了多个细菌菌株用于发酵和生物技术过程，但驯化的细菌常常易遭受噬菌体攻击。因此，当使用细菌(例如大肠杆菌)生产产品时，通常必须克服噬菌体污染。根据菌株多样性、噬菌体不敏感突变体和携带噬菌体抗性机制的质粒，设计了不同的策略以对抗噬菌体。按照本发明的一些实施方案，转化细胞可含有赋予噬菌体感染抗性的一个或多个突变。

天然细菌发展出靶向噬菌体生命周期的不同步骤的各种天然防御机制，例如通过阻断吸附、防止DNA注入、限制进入的DNA和顿挫型感染系统。这些抗病毒屏障可被改造并操纵以更好地控制噬菌体群(参见例如Chibani-Chemoufi等, J. Bacteriol., 186:3677(2004)；Sturino和Klaenhammer, Nat. Rev. Microbiol., 4:395 (2006))。

可根据其遗传组成和/或其病毒体形态，将噬菌体彼此区分开来。一些噬菌体具有双链DNA基因组，包括以下的噬菌体：覆盖噬菌体科、脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)、芽生噬菌体科(plasmaviridae)、肌尾噬菌体科(myrovridae)、长尾噬菌体科、sulfolobusshibate、短尾噬菌体科、复层噬菌体科和微小纺锤形噬菌体科(fuselloviridae)。其它噬菌体具有单链DNA基因组，包括微小噬菌体科和丝状噬菌体科的噬菌体。其它噬菌体具有RNA基因组，包括光滑病毒科和囊状噬菌体科的噬菌体。示例性噬菌体包括噬菌体Wphi、Mu、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1、P2、P4、P22、fd、phi6、phi29、phi31、phiC31、phi35、phi36、phi48、phi50、phi80、phiX174、SP01、M13、MS2、PM2、SSV-1、L5、PRD1、Qbeta、λ、UC-1、HK97和HK022。因此，在一些实施方案中，转化细胞包含赋予选自以下噬菌体抗性的遗传修饰：Wphi、Mu、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1、P2、P4、P22、fd、phi6、phi29、phi31、phiC31、phi35、phi36、phi48、phi50、phi80、phiX174、SP01、M13、MS2、PM2、SSV-1、L5、PRD1、Qbeta、λ、UC-1、HK97和HK022。

对噬菌体感染重要的宿主和噬菌体蛋白质是本领域已知的，并且可通过本领域技术人员采用常规方法进行突变。对噬菌体感染有抗性的细菌还可通过筛选突变型(自发或诱导的)细菌获得。例如，噬菌体抗性可通过如描述于美国专利号7,435,434 (通过引用结合到本文中)的随机基因失活实现。

噬菌体抗性细菌常常具有抑制或大大降低一种或多种类型的噬菌体将其遗传物质插入细菌细胞中的能力的细胞性质。因此，一些噬菌体抗性细菌具有防止或抑制噬菌体与细菌细胞表面连接和/或将噬菌体遗传物质插入细菌胞质中的细胞性质。产生噬菌体抗性细菌的方法是本领域众所周知的(美国专利号5,240,841、5,538,864、5,432,066、5,538,864、5,629,183、5,658,770、5,677,166和5,824,523以及美国专利公布号2006/0019370、2011/0002889和2012/0015426，其每一个通过引用结合到本文中)。

用于产生噬菌体抗性的任何策略可用于本发明的实施方案。普通类别的噬菌体抗性包括(1)阻断噬菌体受体，(2)抑制噬菌体DNA进入，(3)钝挫型噬菌体感染系统，(4)胞外基质分泌，(5)相转变，(6)竞争抑制剂的产生，(7)限制/修饰系统，和(8)基于CRISPR的系统(参见Labrie, S.J.等, Nature Review Microbiology 8:317 (2010))。在一些实施方案中，转化细胞包含如下赋予噬菌体抗性的遗传修饰：通过阻断一种或多种噬菌体受体；通过抑制噬菌体DNA进入细胞；通过顿挫型感染系统；通过编码防止感染的胞外基质蛋白；通过触发新的基因表达谱(相转变)；通过编码结合噬菌体受体的竞争抑制剂；通过消化或修饰噬菌体核酸；或通过编码CRISPR基因座的一个或多个组分。例如，Rex系统是顿挫型感染系统，该系统需要感知噬菌体感染开始的RexA蛋白(由rexA基因编码)和通过开启导致过早细胞凋亡的细胞膜离子通道来响应激活的RexA的RexB蛋白(由rexB基因编码)。在一些实施方案中，转化的细胞包含通过阻断噬菌体受体而赋予噬菌体抗性的遗传修饰。在一些实施方案中，转化细胞包含通过防止噬菌体DNA进入细胞而赋予噬菌体抗性的遗传修饰。核苷酸序列在一些实施方案中，转化的细胞包含通过钝挫型噬菌体感染系统而赋予噬菌体抗性的遗传修饰。

代表性噬菌体抗性基因包括imm、sp、traT、llp、SieA、sim、rexA、rexB、lit、prrC、prrD和pifA。在一些方面，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中修饰是用包含选自以下基因的核酸转化：imm、sp、traT、llp、SieA、sim、rexA、rexB、lit、prrC、prrD和pifA。例如，转化的细胞可包含rexA基因和rexB基因。同样，转化的细胞可包含prrC基因和prrD基因。

在一些实施方案中，转化的细胞用包含与SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ IDNO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87所示核苷酸序列有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸转化。在某些实施方案中，转化的细胞用包含SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO:87所示核苷酸序列的核酸转化。在一些实施方案中，转化的细胞用编码SEQ ID NO: 72、SEQID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 88所示氨基酸序列的核酸转化。在一些实施方案中，转化的细胞用编码与SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 78、SEQ IDNO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 86或SEQ ID NO: 88所示序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸转化。在一些实施方案中，转化的细胞包含与SEQ ID NO: 73所示序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的核苷酸序列和与SEQ ID NO:75所示序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的核酸序列。在一些实施方案中，转化的细胞包含编码与SEQ ID NO: 74所示序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核苷酸序列和编码与SEQ ID NO: 76所示序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些方面，将噬菌体抗性转化细胞和细胞对其有抗性的噬菌体用于培养基(例如发酵混合物)中以提供转化的细胞相对于对噬菌体无抗性的污染性细胞的选择优势。因此，在本发明的一些实施方案中，发酵混合物包含遗传修饰赋予其抗性的噬菌体。

示例性化合物

在某些方面，本发明涉及发酵混合物(例如用于需氧或微需氧发酵的发酵混合物)，其中：发酵混合物包含第一部分和第二部分；第一部分基本上由分级分离的谷物(例如分级分离的谷物醪)组成；而第二部分包含一种或多种化合物。在一些实施方案中，一种或多种化合物选自含氮化合物、含磷化合物和含硫化合物；转化的细胞可代谢一种或多种化合物(即转化的细胞可利用一种或多种化合物作为氮、磷或硫的来源)；而与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢所述一种或多种化合物。在一些实施方案中，含氮化合物、含磷化合物和/或含硫化合物非天然存在于谷物中。在一些实施方案中，发酵混合物不含抗生素。

1. 含氮化合物

在一些实施方案中，发酵混合物包含含有量为约10%重量-约100%重量的选自式I、式II和式III中的一种或多种含氮化合物或其盐的部分。在某些实施方案中，与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢(即作为氮源使用)所述一种或多种含氮化合物。按照本发明的某些实施方案的示例性含氮化合物描述于PCT专利申请公布号WO 2014/107660，通过引用结合到本文中。

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种式I的含氮化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

为5、6、9或10元芳基或杂芳基；

R为-OH、-CO₂H、-NO₂、-CN、取代或未取代的氨基或取代或未取代的烷基；和

n为0、1、2、3、4或5。

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种式II的含氮化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

X为-NH-、-N(烷基)-、-O-、-C(R¹)₂-、-S-或不存在；

Y为-H、-NH₂、-N(H)(烷基)、-N(烷基)₂、-CO₂H、-CN或取代或未取代的烷基；和

R¹为-H、-OH、-CO₂H、-NO₂、-CN、取代或未取代的氨基或取代或未取代的烷基。

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种式III的含氮化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

Y为-H、-NH₂、-N(H)(烷基)、-N(烷基)₂、-CO₂H、-CN或取代或未取代的烷基。

在某些实施方案中，发酵混合物包含上述含氮化合物的任一种，其中一种或多种含氮化合物选自：

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种含氮化合物，其中一种或多种含氮化合物选自肼、5-氨基四唑、四唑、三聚氰胺、氨腈、2-氰基胍、叠氮化钠、碳酰肼、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,3-二氨基胍HCl、三聚氰酸二酰胺、1,3,5-三嗪、氨基乙腈、氰基乙基肼、偶氮二碳酰胺、联二脲、氨基甲肟、1,2-二甲基肼、1,1-二甲基肼、乙基肼、乙二胺、双氰胺钠、碳酸胍、甲胺、三聚氰酸一酰胺、羟胺、丙二腈、缩二脲、二乙基三胺、六亚甲基四胺、三亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、三亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、羟基脲、四亚乙基五胺、硫脲、琥珀腈、氰氨化钙、氰尿酸、氨基乙基哌嗪、哌嗪、二甲胺、乙胺、dalfampridine、四硝基甲烷、咪唑烷基脲、三硝基甲烷、丙二酰胺、氯胺、脲基甲酸酯(Allophante)、三甲胺、硝基甲烷、乙醛肟、二唑烷基脲(Diazolidinyl urea)、1,2-环己烷二酮二肟、丙酮肟、硫代乙酰胺、硫氰酸钠、异噻唑、噻唑、二甲基乙酰胺、异噻唑啉酮、亚甲基蓝、二乙醇胺、阿司帕坦(Aspartame)、苯并异噻唑啉酮和乙酰舒泛钾。

表2

各种有机氮化合物和各化合物的化学式。

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种含氮化合物，其中一种或多种含氮化合物具有低分子量。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的分子量介于约30 Da和约800 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的分子量介于约40 Da和约600 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的分子量为约40 Da、约50 Da、约60 Da、约70 Da、约80 Da、约90 Da、约100 Da、约110 Da、约120 Da、约130 Da、约140 Da、约150 Da、约160 Da、约170Da、约180 Da、约190 Da、约200 Da、约220 Da、约240 Da、约260 Da、约280 Da、约300 Da、约320 Da、约340 Da、约360 Da、约380 Da、约400 Da、约420 Da、约440 Da、约460 Da、约480Da、约500 Da、约520 Da、约540 Da、约560 Da、约580 Da或约600 Da。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物具有小于12个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物具有小于8个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物具有1、2、3、4、5、6或7个碳原子。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的辛醇-水分配系数(log P)小于约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5-约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5、约0、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4或约4.5。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物在约20℃下可以介于约0.01 g/L-约1000 g/L之间的浓度溶于水。在某些实施方案中，发酵混合物包含含氮化合物，其中含氮化合物在约20℃下可以约0.01 g/L、约0.05 g/L、约0.1 g/L、约0.5 g/L、约1 g/L、约5 g/L、约10 g/L、约15 g/L、约20 g/L、约25 g/L、约30 g/L、约35 g/L、约40g/L、约45 g/L、约50 g/L、约55 g/L、约60 g/L、约65 g/L、约70 g/L、约75 g/L、约80 g/L、约85 g/L、约90 g/L、约95 g/L或约100 g/L的浓度溶于水。

在一些实施方案中，发酵混合物包含含有以重量计约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%的一种或多种含氮化合物的部分。

在某些实施方案中，含氮化合物基本上是非杀生物的。含氮化合物基本上可为生物可降解的。

2. 含磷化合物

在某些实施方案中，本发明包含含有约10%重量-约100%重量的式IV-VI中任一个的一种或多种含磷化合物或其盐的部分。在某些实施方案中，与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢(即作为磷源使用)一种或多种含磷化合物。按照本发明的某些实施方案的示例性含磷化合物描述于PCT专利申请公布号WO 2015/031441，通过引用结合到本文中。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式IV的一种或多种含磷化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R为-H、烷基、-OH、-OR²、-SH或-SR²；

R¹为-H或烷基；

Y为O或S；

Y¹为O或S；和

R²为烷基。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式V的一种或多种含磷化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R¹为-H或烷基；和

Y¹为O或S。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式VI的一种或多种含磷化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R³为-H、-OH、-OR⁴、-SH、-SR⁴、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基；和

R⁴为烷基或芳基。

在某些实施方案中，发酵混合物包含选自以下的一种或多种含磷化合物：

表3

各种有机磷化合物和各化合物的化学式

次磷酸	H₃PO₂
		亚磷酸(亚磷酸盐)	H₃PO₃
磷酸二乙酯	C₄H₁₁O₄P
		磷酸三乙酯	C₆H₁₅O₄P
磷酸三甲酯	(CH₃)₃PO₄
		磷酸二甲酯(DMP)	C₂H₇O₄P
亚磷酸二乙酯	C₄H₁₁O₃P
		亚磷酸三乙酯	C₆H₁₅O₃P
亚磷酸三甲酯	C₃H₉O₃P
		亚磷酸二甲酯	C₂H₇O₃P
草甘膦(round-up)	C₃H₈NO₅P
		O,O,O-三乙基硫代磷酸酯	C₆H₁₅O₃PS
依替膦酸	C₂H₈O₇P₂
		亚甲基二膦酸二钠	CH₄Na₂O₆P₂
亚甲膦酸	CH₆O₆P₂
		氯膦酸	CH₄Cl₂O₆P₂
替鲁膦酸	C₇H₉ClO₆P₂S
		唑来膦酸	C₅H₁₀N₂O₇P₂
奥昔膦酸	CH₆O₇P₂

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种含磷化合物，其中一种或多种含磷化合物具有低分子量。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的分子量介于约30 Da和约800 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的分子量介于约40 Da和约600 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的分子量为约40 Da、约50 Da、约60 Da、约70 Da、约80 Da、约90Da、约100 Da、约110 Da、约120 Da、约130 Da、约140 Da、约150 Da、约160 Da、约170 Da、约180 Da、约190 Da、约200 Da、约220 Da、约240 Da、约260 Da、约280 Da、约300 Da、约320Da、约340 Da、约360 Da、约380 Da、约400 Da、约420 Da、约440 Da、约460 Da、约480 Da、约500 Da、约520 Da、约540 Da、约560 Da、约580 Da或约600 Da。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物具有小于12个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物具有小于8个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物具有1、2、3、4、5、6或7个碳原子。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的辛醇-水分配系数(log P)小于约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5-约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5、约0、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4或约4.5。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物在约20℃下以约0.01 g/L-约1000 g/L的浓度溶于水。在某些实施方案中，发酵混合物包含含磷化合物，其中含磷化合物在约20℃下以约0.01 g/L、约0.05 g/L、约0.1 g/L、约0.5 g/L、约1 g/L、约5 g/L、约10 g/L、约15 g/L、约20 g/L、约25 g/L、约30 g/L、约35 g/L、约40 g/L、约45g/L、约50 g/L、约55 g/L、约60 g/L、约65 g/L、约70 g/L、约75 g/L、约80 g/L、约85 g/L、约90 g/L、约95 g/L或约100 g/L的浓度溶于水。

在一些实施方案中，发酵混合物包含含有以重量计约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%的一种或多种含磷化合物的部分。

在某些实施方案中，含磷化合物基本上是非杀生物的。含磷化合物基本上可为生物可降解的。

3. 含硫化合物

在某些实施方案中，发酵混合物包含式VII-XIV中任一个的一种或多种含硫化合物或其盐。在某些实施方案中，与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢(即作为硫源使用)一种或多种含硫化合物。按照本发明的某些实施方案，示例性含硫化合物描述于PCT专利申请公布号WO 2015/031441，通过引用结合到本文中。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式IV的一种或多种含硫化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R⁵为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SO₂H、-NHR⁷或-NH-C(=O)-R⁷；

R⁶为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SO₂H、-NHR⁷或-NH-C(=O)-R⁷；和

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式VIII、式IX或式X的一种或多种含硫化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R⁸为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SO₂H、-NHR⁷或-NH-C(=O)-R⁷；

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式XI、式XII或式XIII的一种或多种含硫化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R⁹为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SO₂H、-NH₂、-NHR⁷或-NH-C(=O)-R⁷；

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环；

R¹⁰为羟基烷基、R⁹或-(CH₂)_xR⁹；和

x为1、2、3或4。

在某些实施方案中，发酵混合物包含式XIV的一种或多种含硫化合物或其盐：

其中，独立地对于每次出现，

R⁹为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-SO₂H、-NH₂、-NHR⁷或-NH-C(=O)-R⁷；和

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环。

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种含硫化合物，其选自：

表4

各种有机硫合物和各化合物的化学式

二甲亚砜	C₂H₆OS
		二苯并噻吩	C₁₂H₈S
乙硫醇	C₂H₆S
		二巯基丁二酸	C₄H₆O₄S₂
硫代乙酸	C₂H₄OS
		叔丁基硫醇	C₄H₁₀S
硫脲	CH₄N₂S
		硫氰酸钠	NaSCN
硫代乙酰胺	C₂H₅NS
		异噻唑	C₃H₃NS
苯并异噻唑啉酮	C₇H₅NOS
		异噻唑啉酮	C₃H₃NOS
甲磺酸	CH₄O₃S
		硫代甘油	C₃H₈O₂S
偏亚硫酸氢钾	K₂O₅S₂
		乙酰舒泛钾	C₄H₄KNO₄S
苯磺酸	C₆H₅SO₃H
		环拉酸钠	C₆H₁₂NNaO₃S
糖精	C₇H₅NO₃S
		多库酯钠	C₂₀H₃₇NaO₇S
2,4-二硫杂戊烷	C₃H₈S₂
		甲基异噻唑啉酮	C₄H₅NOS
甲基氯异噻唑啉酮	C₄H₄ClNOS
		环丁砜	C₄H₈O₂S

在某些实施方案中，发酵混合物包含一种或多种含硫化合物，其中一种或多种含硫化合物具有低分子量。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的分子量介于约30 Da和约800 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的分子量介于约40 Da和约600 Da之间。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的分子量为约40 Da、约50 Da、约60 Da、约70 Da、约80 Da、约90Da、约100 Da、约110 Da、约120 Da、约130 Da、约140 Da、约150 Da、约160 Da、约170 Da、约180 Da、约190 Da、约200 Da、约220 Da、约240 Da、约260 Da、约280 Da、约300 Da、约320Da、约340 Da、约360 Da、约380 Da、约400 Da、约420 Da、约440 Da、约460 Da、约480 Da、约500 Da、约520 Da、约540 Da、约560 Da、约580 Da或约600 Da。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物具有小于21个碳原子，例如小于12个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物具有小于8个碳原子。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的辛醇-水分配系数(log P)小于约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5-约5。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物的辛醇-水分配系数(log P)为约-0.5、约0、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4或约4.5。

在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物在约20℃下以约0.01 g/L-约1000 g/L的浓度溶于水中。在某些实施方案中，发酵混合物包含含硫化合物，其中含硫化合物在约20℃下以约0.01 g/L、约0.05 g/L、约0.1 g/L、约0.5 g/L、约1 g/L、约5 g/L、约10 g/L、约15 g/L、约20 g/L、约25 g/L、约30 g/L、约35 g/L、约40 g/L、约45g/L、约50 g/L、约55 g/L、约60 g/L、约65 g/L、约70 g/L、约75 g/L、约80 g/L、约85 g/L、约90 g/L、约95 g/L或约100 g/L的浓度溶于水中。

在一些实施方案中，发酵混合物包含含有以重量计约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%的一种或多种含硫化合物的部分。

在某些实施方案中，含硫化合物基本上是非杀生物的。含硫化合物基本上可为生物可降解的。

发酵的示例性方法

1. 使用分级分离的谷物改进输氧

在一些方面，本发明涉及包含分级分离的谷物的组合物和在需氧或微需氧发酵过程中使用分级分离的谷物的方法。在发酵混合物中使用分级分离的谷物(例如胚乳部分)降低其粘度，这改进在需氧和微需氧发酵过程中的输氧。谷物的类型不是关键的。例如，谷物可为玉米、小麦、高粱、黑麦、小黑麦、燕麦、稻、小米、大麦、画眉草(teff)、野生稻、斯卑尔脱小麦、荞麦、苋、昆诺阿藜、kaniwa或fonio。分级分离的谷物可为分级分离的谷物醪。在一些实施方案中，分级分离的谷物醪为分级分离的玉米醪。

为了加工谷物(例如玉米)用于厌氧发酵，典型的干磨设备可研磨整个玉米粒至0.5-3 mm，将碾碎的谷物与水混合，将混合物与α-淀粉酶一起在70-90℃下孵育几分钟以产生糖糊精(a/k/a糖化)，然后用添加的葡糖淀粉酶继续进行发酵以释放葡萄糖用于通过酿酒酵母转化。在加工整个谷粒(例如玉米粒)时，整个谷粒的所有氮和磷存在于发酵期间。

或者，可选择性地研磨谷物以产生3个流分：i)胚乳部分，其主要为淀粉，ii)胚部分，其主要为蛋白质和油，和iii)麸部分，其主要为纤维。易发酵的碳水化合物的大部分存在于胚乳部分中，其可由传统干磨工艺磨碎，并进行发酵。分级分离的谷物可基本没有胚、基本没有麸或两者。在一些实施方案中，分级分离的谷物基本上由胚乳(例如玉米胚乳)组成。

谷物可通过任何方法(例如本领域已知方法)分级分离。谷物分级分离技术的实例包括描述于以下文献的技术：美国专利号2,108,655、U.S. 4,301,183、U.S. 8,113,447、U.S. 3,399,839、U.S. 4,986,997、U.S. 7,419,108、U.S. 7,138,257、U.S. 7,553,507和U.S. 7,938,345；以及美国专利申请公布号2007/0184541，其每一个通过引用以其整体结合到本文中。备选的分级分离方法也是本领域已知的，例如包括谷物最初的浸泡和干磨步骤之前的酶处理的方法，例如Wang P等, Cereal Chemistry Journal, 82:734–738(2005)中所述。

2. 分级分离的谷物和含氮、含磷和含硫化合物的组合

在发酵工业中，通常配制细胞培养基以提供宿主细胞系生长所必需的全部营养物，其重点在于满足细胞系对碳、氮、磷、硫和其它主要营养物的需要。一些细胞系需要额外的组分，包括氨基酸、微量无机物和金属及复杂的生长因子。这些营养物的存在为精选的生物及为任何潜在的污染性生物提供合适的生长环境。在该环境下，要求生产生物与细胞培养物中的任何污染生物直接竞争。

即使用健壮的宿主生物，培养物的机会感染和产生于产品生产要求的代谢负荷的组合是单一培养操作的主要顾虑。工业稳健性通常被视为是宿主菌株特有的多基因性状，因此，难以在发育过程后期将稳健性可预测地工程改造至生物中。加入选择性生长抑制剂(例如细菌抗生素)是一种为对生长抑制剂有抗性的宿主生物创造稳健的发酵环境的方法。

还可如下控制微生物的生长和输出：通过限制细胞培养物中的元素(例如N、P或S)，鉴定或加入已知量的含有该受限元素的稀有或人造化学品到细胞培养物中，并使用经遗传工程改造的转化细胞使得它们具有降解稀有或人造化学品的能力以获得其对特殊元素的需要(参见PCT专利申请公布号WO 2015/031441和WO 2014/107660，通过引用结合到本文中)。该策略被特别好地设计为化学成分确定的培养基，其中所有N、P或S源可受严格控制。因此，在一些实施方案中，培养基不含抗生素。然而，许多工业规模生物技术应用利用粗制的非精制碳进料，例如粗糖(例如糖蔗汁、糖浆)、谷物(例如玉米、小麦、稻)和木质素纤维素材料(例如玉米秸杆、甘蔗渣、草、木质材料和糖甜菜浆)。除碳水化合物和其它碳源以外，这些原料含有不同量的矿物质和其它元素，除了通过待被明确转化的细胞利用的含氮、含磷和含硫化合物而向发酵提供以外，这可能影响N、P和S的可得性。

因为分级分离的谷物的胚乳部分的磷和氮水平低(例如蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸、无机磷酸的水平低；参见表5)，所以分级分离的谷物的胚乳部分可用作补充非典型磷和/或氮源的进料，以为可代谢所加含磷和/或含氮化合物的转化细胞提供选择优势。

表5

胚乳，其富含碳水化合物，而蛋白质(氮)和磷减少，是有吸引力的发酵底物用于经工程改造以利用非传统的氮源或磷源的转化细胞。其它的磷可作为例如亚磷酸或亚磷酸盐(K、Na、Mg、Ca)供应，并被包含亚磷酸盐利用基因ptxD (亚磷酸盐:NADH氧化还原酶)的转化细胞利用，以在发酵环境中优先生长。麸也缺乏氮和磷，因此，麸可以是用于经工程改造利用非传统的氮源或磷源的转化细胞的合适底物。表6描述玉米、小麦和稻谷物中的磷分布。

表6

在一些实施方案中，分级分离的谷物的所用部分包含少量或减量(相对于作为整体的谷物)的氮、磷和/或硫。在一些实施方案中，含氮化合物、含磷化合物和/或含硫化合物非天然地存在于谷物中。在本发明的一些实施方案中，包含分级分离的谷物醪的发酵物不含抗生素。

3. 发酵方法

在一些实施方案中，本发明涉及发酵的方法，所述方法包括将转化细胞在发酵混合物中孵育。发酵可为需氧或微需氧发酵。发酵混合物可包含如上所述的第一部分和第二部分。第一部分可包含分级分离的谷物的部分。第一部分基本上可由分级分离的谷物的部分组成。第二部分可包含选自如上所述的含氮化合物、含磷化合物和含硫化合物一种或多种化合物。在一些实施方案中，转化的细胞可代谢一种或多种化合物(即分别使用一种或多种含氮、含磷和含硫化合物作为氮、磷或硫的来源)。在一些实施方案中，与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢一种或多种化合物。可按照本文所述任一个实施方案选择转化的细胞、发酵混合物、第一部分、第二部分、分级分离的谷物、分级分离的谷物的部分、一种或多种化合物、含氮化合物、含磷化合物和含硫化合物。

在一些实施方案中，发酵混合物基本上没有胚，例如，第一部分基本上可由胚乳和/或麸组成。在一些实施方案中，分级分离的谷物的部分是胚乳部分，例如，第一部分基本上可由胚乳部分组成。

4. 发酵产物

需氧和微需氧发酵过程可用来生产一种或多种产品。在一些方面，本发明涉及生产一种或多种产品的方法。在一些实施方案中，转化的细胞将进料(例如分级分离的谷物)转化成一种或多种产品。在某些实施方案中，本发明涉及包括收集一种或多种产品的步骤的方法。在一些实施方案中，一种或多种产品选自脂质、三酰甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃、烯烃、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3-丙二醇、1,4-丙二醇、琥珀酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇和赤藓糖醇。

实例

实施例1 - 包括三聚氰胺降解途径的转化细胞

可对例如亚罗解脂酵母、酿酒酵母和大肠杆菌等细胞进行工程改造以转化三聚氰胺成氨。三聚氰胺(C₃N₆H₆)是一种高含氮化合物，只能被极有限数目的生物(包括红球菌菌株Mel)降解。将用于三聚氰胺降解的途径整合到细胞中，伴以在发酵混合物中利用三聚氰胺作为主要氮源的修饰，产生可适用于多种应用的更稳健的工业生产解决方法。这种修饰的优势大得足以在多种应用中提供优势，包括其中核心技术是对生物的重大遗传负荷的情况。

将来自表1的基因或合适的同系物克隆至宿主菌株例如亚罗解脂酵母、酿酒酵母或大肠杆菌中。对宿主生物是天然的酶，例如脲基甲酸水解酶或鸟嘌呤脱氨酶任选用异源启动子过量表达。通过酶促活性和赋予在合适的途径中间产物中进行氮限制性生长的能力来测定功能表达。最后，通过三聚氰胺限制性连续培养或其它选择方法，选择能够降解三聚氰胺菌株用于途径的改良利用。对于表2所列氮化合物，可设计类似的策略。

实施例2 –通过酵母介导的连接的载体构建

载体pNC10 (SEQ ID NO: 55)含有大肠杆菌pMB1复制起点和氨苄西林抗性基因、酿酒酵母2 µm复制起点和URA3基因，及含有PacI、PmeI和AscI的8-bp识别序列的多个克隆位点。通过酵母介导的同源重组(YML)克隆，将目标DNA插入多个克隆位点(Applied &Environmental Microbiology, 72:5027-36 (2006)；Plasmid, 62:88-97 (2009))。简单地说，使用具有与最终载体中的相邻DNA区段同源的20-40 bp突出端的引物，通过PCR扩增靶DNA序列。然后对pNC10或另一个合适的基础载体进行限制消化，产生线性化质粒。使PCR产物和线性质粒在酿酒酵母中转化，且天然酿酒酵母缺口修复机制根据同源突出端装配完整质粒(图3)。

完整载体通过DNA提取方案自酿酒酵母分离，并用来转化大肠杆菌或其它细菌菌种用于后续扩增。然后可通过DNA质粒mini-prep或其它合适的标准分子生物学方案，从大肠杆菌回收浓缩的载体。

实施例3：大肠杆菌中三聚氰胺同化酶的表达

将来自表1的基因或合适的同系物克隆至宿主菌株(例如大肠杆菌)中。可用异源启动子过量表达对宿主生物是天然的酶，例如脲基甲酸水解酶或鸟嘌呤脱氨酶。

可采用上述酵母介导的连接，通过构建载体，在大肠杆菌中表达三聚氰胺同化基因或其亚类。表达载体由大肠杆菌功能启动子、编码三聚氰胺同化途径的酶的基因和大肠杆菌功能终止子组成。或者，几个基因可从单一启动子表达作为基因操纵子的一部分；在这种情况下，将基因间接头序列置于基因之间。下面列出可用作启动子、终止子和接头的序列以及2个代表性大肠杆菌表达质粒AJS67 (图5，表达用于降解三聚氰胺成为氰尿酸的基因，其每个三聚氰胺释放3个NH₃)和AJS68 (图6，表达降解氰尿酸成为NH₃和CO₂的基因，其每个氰尿酸释放3个NH₃)。

SEQ ID NO: 103

大肠杆菌Ptach启动子：

agctggtgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgaatcgatataaggaggttaatca

SEQ ID NO: 104

大肠杆菌trpT'终止子：

ctcaaaatatattttccctctatcttctcgttgcgcttaatttgactaattctcattagcgaggcgcgcctttccataggctccgcccc

基因间操纵子接头

SEQ ID NO: 105 lacZ-lacY接头：ggaaatccatt

SEQ ID NO: 106galT-galK接头：ggaacgacc

通过酶促活性和赋予在合适的途径中间产物中进行氮限制性生长的能力，来测定功能表达。最后，通过选择方法选择能够在三聚氰胺降解途径中降解化合物的菌株用于途径的改良利用。对于表2所列的氮化合物，设计类似的策略。

实施例4：大肠杆菌中氨腈同化酶的表达

实施例3所述的基因表达方法也可用于实施例4。大肠杆菌菌株不能利用脲作为氮源，因此，还要对这些另外的转化步骤进行改造。除氨腈水解酶以外，必须表达具有合适辅助酶的脲羧化酶/脲基甲酸水解酶系统或脲酶。脲酶可存在于一些大肠杆菌分离株中(Collins和Falkow, J. Bacteriology 172:7138-44 (1990))或异源表达(Cussac等, J.Bacteriology, 174:2466-73 (1992))。或者，可与氨腈水合酶一起表达来自酿酒酵母的DUR1,2基因，如质粒AJS70所示(图8)。

实施例5 - 大肠杆菌中三聚氰胺同化酶的表达

构建含有部分或完全三聚氰胺利用途径的几个大肠杆菌菌株，如表7和8所示。载体和菌株按实施例1-4所述构建。所有载体含有氨苄西林抗性基因，将100 ug/mL氨苄西林加入所有培养基中。使这些菌株在具有不同氮源的MOPS成分确定的培养基中生长。

大肠杆菌菌株和三聚氰胺利用基因(步骤相当于图1)：

NS88 – triA (步骤1)

NS89 – trzA、guaD、trzC (步骤1、2、3)

NS90 - trzD、trzE、DUR1,2 (步骤4、5、6)

NS91 – 无(对照菌株)

NS93 – triA、针对改良的三聚氰酸二酰胺利用选择的天然guaD (步骤1、2)

NS103 – triA、guaD、trzC (步骤1、2、3)

NS109 – triA、guaD、trzC、trzD 12227、trzE、DUR1,2 (步骤1-6)

NS110 – triA、guaD、trzC、atzD ADP、trzE、DUR1,2 (步骤1-6)

表7

质粒	Seq ID	描述	基因型
				pNC10	55	大肠杆菌和酿酒酵母克隆/穿梭载体	Amp、ura3
pNC53	56	大肠杆菌启动子(pTac)-终止子(trpT')克隆载体(AJS52)	Amp、ura3
				pNC67	57	大肠杆菌、酿酒酵母和亚罗解脂酵母穿梭载体	Amp、ura3、Hyg、Nat
pNC85	58	大肠杆菌triA表达载体(AJS69)	Amp、ura3
				pNC86	59	大肠杆菌trzA、guaD、trzC表达载体(AJS67)	Amp、ura3
pNC87	60	大肠杆菌trzD、trzE、DUR1,2表达载体(AJS68)	Amp、ura3
				pNC93	61	酿酒酵母cah表达载体(AJS76)	Amp、ura3、Hyg
pNC96	62	酿酒酵母trzE MEL表达载体(AJS79)	Amp、ura3、Hyg
				pNC97	63	酿酒酵母trzE RI表达载体(AJS80)	Amp、ura3、Hyg
pNC101	64	大肠杆菌trzC_12227、guaD、triA表达载体(AJS83)	Amp、ura3
				pNC120	65	大肠杆菌trzD_12227、trzE、DUR1,2 trzC_12227、guaD、triA表达载体(AJS88a)	Amp、ura3
pNC121	66	大肠杆菌atzD_ADP、trzE、DUR1,2 trzC_12227、guaD、triA表达载体(AJS88b)	Amp、ura3

表8

菌株	描述	培养物保藏名称
			NS21	大肠杆菌K12	NRRL B-3707
NS88	具有pNC85的大肠杆菌
			NS89	具有pNC86的大肠杆菌
NS90	具有pNC87的大肠杆菌
			NS91	具有pNC53的大肠杆菌
NS93	选用于三聚氰酸二酰胺利用的具有pNC85的大肠杆菌
			NS103	具有pNC101的大肠杆菌
NS106	大肠杆菌MG1655	ATCC 47076
			NS107	大肠杆菌B	ATCC 11303
NS108	大肠杆菌Crooks	ATCC 8739
			NS109	具有pNC120的大肠杆菌
NS110	具有pNC121的大肠杆菌
			NS120	具有pNC53的大肠杆菌MG1655
NS121	具有pNC121的大肠杆菌MG1655
			NS122	具有pNC121的大肠杆菌B
NS123	具有pNC53的大肠杆菌Crooks
			NS124	具有pNC121的大肠杆菌Crooks
NS8	酿酒酵母	NRRL Y-2223
			NS22	酿酒酵母工业乙醇菌株
NS98	具有pNC96的酿酒酵母工业乙醇菌株
			NS99	具有pNC97的酿酒酵母工业乙醇菌株
NS100	具有pNC67的酿酒酵母工业乙醇菌株
			NS101	具有pNC93的酿酒酵母工业乙醇菌株
NS111	具有pNC93的酿酒酵母NRRL Y-2223
			NS112	具有pNC67的酿酒酵母NRRL Y-2223

图11显示含有不同浓度的氯化铵或三聚氰胺的培养基中NS88和NS91 (对照)的生长进程。在1 mM三聚氰胺中生长的NS88达到与2 mM氯化铵等同利用相当的光密度，表明了通过triA和天然编码的guaD基因从三聚氰胺释放出2 mM氨。对照菌株NS91用三聚氰胺作为氮源无法生长。

图12显示含有不同浓度的氯化铵或缩二脲的培养基中NS90和NS91 (对照)的生长进程。在1 mM缩二脲中生长的NS90达到与3 mM氯化铵等同利用相当的光密度，表明了通过trzE和DUR1,2从缩二脲释放3 mM氨。对照菌株NS91用缩二脲作为氮源无法生长。

图14显示含有0.25 mM三聚氰胺作为唯一氮源的培养基中NS91、NS103、NS109和NS110的生长进程。在从0到1.5 mM的不同氯化铵浓度中生长的所有4个菌株的平均值还显示为用限制性氮生长的标准曲线。三聚氰胺中生长的NS91与0 mM氯化铵对照类似。0.25 mM三聚氰胺中生长的NS103与1 – 0.75 mM氯化铵类似，表明了它大致利用预测的3 mM氨/1mM三聚氰胺。0.25 mM三聚氰胺中生长的菌株NS109和NS110与1.5 – 1.25 mM氯化铵类似，表明了它大致利用预测的6 mM氨/1 mM三聚氰胺。

图15显示含有0.25 mM三聚氰酸二酰胺作为唯一氮源的培养基中NS91、NS103、NS109和NS110的生长进程。从0到1.5 mM的不同氯化铵浓度中生长的所有4个菌株的平均值还显示为用限制性氮生长的标准曲线。三聚氰酸二酰胺中生长的NS91与0 mM氯化铵对照类似。0.25 mM三聚氰酸二酰胺中生长的NS103与0.5 mM氯化铵类似，表明了它大致利用预测的2 mM氨/1 mM三聚氰酸二酰胺。0.25 mM三聚氰酸二酰胺中生长的菌株NS109和NS110与1.25 – 1.0 mM氯化铵类似，表明了它大致利用预测的5 mM氨/1 mM三聚氰酸二酰胺。

图16、17和18显示来源于含有具有完全三聚氰胺利用途径的pNC121或pNC53 (一种对照载体)的大肠杆菌K12、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌B和大肠杆菌Crooks (C)的大肠杆菌菌株。有关菌株细节参见表7和8。含有pNC121的所有菌株能够在作为唯一氮源的0.5 mM三聚氰胺中生长(图18)。这表明三聚氰胺利用途径可被广泛用于通常用于生物技术应用的大肠杆菌菌株。

还可针对改进的三聚氰胺来源的氮源利用选择菌株，在一个实例中，在含0.5 mM三聚氰酸二酰胺作为唯一氮源的MOPS成分确定的培养基中使NS88传代11次连续转移。在最后一次传代后，分离单个菌落，且将其命名为NS93。使NS93和NS91在含0.5 mM氯化铵作为唯一氮源的培养基中生长过夜，然后在含0.5 mM三聚氰酸二酰胺作为唯一氮源的培养基中孵育。NS91在三聚氰酸二酰胺上显示0.024 hr^-1的最大生长速率，而NS93显示0.087 hr^-1的最大生长速率。

培养基利用

使培养物在含100 mg/L氨苄西林情况下在37℃下有氧生长。使预培养物在含100 mg/L氨苄西林的LB培养基中生长，用等量的不含氮的MOPS培养基洗涤一次，并以最终发酵体积的5% v/v接种。MOPS培养基的内含物概括于表9中。

表9

MOPS成分确定的培养基	mM
		葡萄糖	11.1
K₂HPO₄	1.32
		K₂SO₄	0.28
FeSO₄	0.01
		CaCl₂	5E-04
MgCl₂	0.52
		NaCl	50
MOPS	40
		Tricine	4
(NH₄)₆Mo₇O₂₄	3E-06
		H₃BO₃	4E-04
CoCl₂	3E-05
		CuSO₄	1E-05
MnCl₂	8E-05
		ZnSO₄	1E-05
规定的氮源	0.25-10

*另外加入100 ug/mL氨苄西林用于质粒维持。

使不同培养基中的培养物成像

使预培养物在含100 mg/L氨苄西林的LB培养基中生长，使用0.1 mL的各个预培养物直接接种5 mL含有100 mg/L氨苄西林和规定氮源的MOPS培养基。使细胞在37℃下在30 rpm的滚筒(drum roller)中生长(图13)。

实施例6 - 酿酒酵母转化

使5 mL酿酒酵母ura3营养缺陷型菌株的培养物在YPD中在30℃下生长过夜。将1.5 mL的过夜培养物转移到50 mL的新鲜YPD (OD ~ 0.3)中，并在培养瓶中以200 rpm、30℃振荡。使培养物生长约4-5小时至1.0的OD。

将细胞以>5,000 rpm离心1分钟，并重新悬浮于50 mL无菌水中，然后再次以>5,000 rpm离心1分钟。

除去上清液，将1 mL 100 mM乙酸锂(LiAc)加入细胞沉淀中，并将沉淀转移到1.5mL管中。

将细胞以> 12,000 rpm离心10秒钟，除去上清液，并将细胞重新悬浮于400 – 800µL 100 mM LiAc中(各个转化使用50 µL的该细胞悬液)。

制备转化主混合物(master mix)：240 µL 50% PEG-3350、36 µL 1 M LiAc、50 µL2 mg/mL鲑精DNA (通过煮沸10分钟并快速冷却到4℃制备)。通过向1.5 mL管中加入5 µL消化的载体、5 µL各PCR插入物(insert) (约100-200 ng DNA)、加水至34 µL的终体积、326 µL主混合物和50 uL细胞悬液，来制备转化反应物。将管涡旋以完全混合其内含物。将转化反应混合物在30℃下孵育30分钟，然后通过倒置混合，并置于42℃水浴中30分钟。

将细胞以> 12,000 rpm离心10秒钟，除去PEG混合物，并将细胞重新悬浮于1 mL无菌水中。再次将细胞离心，除去800 µL上清液，将细胞重新悬浮于剩余的上清液中，并将细胞涂布在SD-URA板上。将板在30℃下孵育2-4天。

实施例7 - 酿酒酵母中三聚氰胺同化酶的表达

可采用上述酵母介导的连接，通过构建载体，使三聚氰胺同化基因或其亚类在酿酒酵母中表达。表达载体由酿酒酵母功能启动子、编码三聚氰胺同化途径的酶的基因和酿酒酵母功能终止子组成。可将启动子-基因-终止子基序的装配件掺入单一菌株中，可在复制质粒中或整合至染色体。下面列出可能的启动子和终止子。下面表示代表性质粒，在亚罗解脂酵母TEF1启动子和终止子控制下表达trzA三聚氰胺水合酶。

质粒AJS35是通过亚罗解脂酵母TEF1启动子和终止子转录的三聚氰胺脱水酶trzA的实例(图4)。

菌株NS98和NS99是分别携带质粒pNC96 (hyg^R和来自红球菌MEL的密码子优化的trzE)和pNC97 (hyg^R和来自豌豆根瘤菌的密码子优化的trzE)的工业酿酒酵母菌株。菌株NS100是携带质粒pNC67 (hyg^R，nat^R)的相同的工业酿酒酵母菌株，其用作对照菌株。

使菌株NS98、NS99和NS100在含10 mM脲和100 µg/mL潮霉素的成分确定的YNB培养基中在30℃下有氧生长至静止期。然后在含10 mM脲、10 mM缩二脲或无其它氮的相同的成分确定的培养基中制备1/1000 v/v接种物，并使之在相同条件下生长。在72小时后测量光密度，如表10所示。

表10

以不同的氮源生长72小时的酵母菌株的OD600

菌株NS98和NS99能够生长至光密度大致为含有缩二脲的培养基中NS100的两倍，并且还大致为无氮供应的培养基中的两倍。这表明表达trzE基因的酿酒酵母菌株在其缩二脲的利用中是有利的。

SEQ ID NO: 89-95显示可在酿酒酵母中用作基因转录的启动子的核苷酸序列，而SEQ ID NO: 96-102显示可用作转录终止子的核苷酸序列。

实施例8 - 酿酒酵母中氨腈同化酶的表达

实施例5所述基因表达方法还可用于实施例7。酿酒酵母具有通过融合基因DUR1,2中编码的脲羧化酶和脲基甲酸水解酶的作用将脲转化为NH₃和CO₂的天然能力。因此，氨腈水解酶的功能表达足以将氨腈转化成NH₃。氨腈水合酶表达载体(例如图9和10)可包含亚罗解脂酵母TEF1启动子和终止子和来自疣孢漆斑菌的酿酒酵母密码子优化的氨腈水合酶(cah)。

实施例9 –经工程改造以利用氨腈的生物

生物

NS100 – 含pNC67 (hyg^R，nat^R)的工业酿酒酵母菌株

NS101 – 含pNC93 (hyg^R，cah)的工业酿酒酵母菌株

NS111 - 含pNC93 (hyg^R，cah)的酿酒酵母NRRL Y-2223

NS112 - 含pNC67 (hyg^R，nat^R)的酿酒酵母NRRL Y-2223

图9描述pNC93，图10描述pNC67。

成份确定的培养基中氨腈的利用

如下评价含不同氮源的成份确定的培养基中生长的NS100和NS101的光密度。使NS100和NS101在YPD培养基中生长过夜，用等量的无菌水洗涤一次，并以3.33% v/v接种。菌株NS101能够用氨腈生长至与用脲的相当的光密度，而NS100生长至与培养基中不存在氮的相当的光密度。数据是96孔板中3个重复孔的平均数；150 μL/孔。30℃，YNB培养基含有20 g/L葡萄糖、1.7 g/L不含氨基酸或硫酸铵的YNB基础培养基、5 g/L硫酸钠、100 μg/mL潮霉素和10 mM脲、10 mM氨腈或无氮源。接种用在脲作为氮源的相同培养基中预生长24小时的5 μL培养物(图21)。

另外，使菌株NS100、NS101、NS111和NS112在含10 mM脲和100 µg/mL潮霉素的成份确定的YNB培养基中在30℃下有氧生长至静止期。然后将1/1000 v/v接种物放入含10 mM脲、10 mM氨腈或无额外的氮的相同的成份确定的培养基中，并在相同条件下生长。在72小时后测量光密度，如表11所示。

表11

菌株NS101和NS111，携带cah基因的两个不同的酿酒酵母菌株，能够生长至与用脲的相当的光密度；然而，只有NS100和NS112能够生长至等于或小于无氮源的培养基的光密度。这表明多个酿酒酵母菌株能够在cah基因存在时利用氨腈。

成份确定的培养基中的竞争

使菌株NS100 (hyg^R，nat^R)和NS101 (hyg^R，cah)在含100 µg/mL潮霉素与作为氮源的脲的成份确定的培养基中生长，然后将两者接种到含有10 mM脲或10 mM氨腈作为氮源的成份确定的培养基中。在生长至静止期时，完成向具有相同组成的新的培养基的1/100 v/v连续转移。通过清点hyg^R、nat^R集落形成单位的数目并从hyg^R集落形成单位中减去，来监测培养物群。(对于在成份确定的基本培养基中的一个实验参见图22和图23)。第二个实验见图25。第二个实验包括成份确定的基本(YNB)和成份确定的复合(YNB+SC氨基酸)培养基组成两种。成份确定的YNB培养基含有20 g/L葡萄糖、不含氨基酸或硫酸铵的1.7 g/L YNB基础培养基、5 g/L硫酸钠和10 mM脲、10 mM氨腈或无氮源。培养基组成见下。

酿酒酵母YNB培养基(每升)

葡萄糖20 g

生物素2 μg

泛酸钙400 μg

叶酸2 μg

肌醇2000 μg

烟酸400 μg

对氨基苯甲酸200 μg

盐酸吡哆醇400 μg

核黄素200 μg

盐酸硫胺400 μg

硼酸500 μg

硫酸铜40 μg

碘化钾100 μg

氯化铁200 μg

硫酸锰400 μg

钼酸钠200 μg

硫酸锌400 μg

磷酸二氢钾1 g

硫酸镁500 mg

氯化钠100 mg

氯化钙100 mg

另外，对于质粒维持适当时加入10 mM浓度的氮源以及抗生素潮霉素(300 ug/mL)或诺尔丝菌素(100 ug/mL)。

SC氨基酸组成(共2 g/L)

生长在30℃下有氧进行。菌落形成单位通过在含300 μg/mL潮霉素或100 μg/mL诺尔丝菌素的YPD培养基中系列稀释计数，并为3个稀释计数的平均数(图22和图23)。

丰富培养基中氨腈的利用

如下评价在含100 µg/mL潮霉素及含和不含10 mM氨腈的丰富YPD培养基中生长的NS100和NS101的光密度。使NS100和NS101在YNB培养基中生长过夜，并以3.33% v/v接种。NS101显示在10 mM氨腈存在时比NS100短的迟滞期。因此，除用作氮的唯一来源以外，氨腈还可起微生物生长阻碍物的作用。数据是96孔板的3个重复孔的平均数；150 μL/孔。30℃，YPD培养基或含10 mM氨腈的YPD培养基。接种物是在脲作为氮源的YNB培养基中预生长24小时的5 μL培养物(图24)。

实施例10 - 包含分级分离的谷物的部分的发酵混合物中脂质的生产

将产油酵母亚罗解脂酵母引入3种发酵条件中。生长培养基和葡萄糖当量在3种发酵间是相同的。在一种发酵中，碳源是可溶性玉米糖浆(如可从湿磨法生产)。在第2反应器中，碳源是分级分离的玉米醪(由NCERC自Cereal Process Technologies试验规模分级分离系统提供)。在第3反应器中，碳源是完整的玉米醪(由NCERC提供)。

图26显示在1 L生物反应器中以1000 rpm混合各条件所需的转矩。在开始发酵时，混合完整玉米醪所需转矩为大于混合可溶性玉米糖浆所需转矩约50%。当玉米粒的非碳水化合物部分通过前端分级分离除去时，转矩仍大于混合玉米糖浆所需转矩，但只大于约25%，而非大于50%。如图27所示，这种粘度降低足以允许输氧改进，使得细胞不再受限于分级分离的玉米醪中的氧，并且能够以相当于可溶性玉米糖浆观察到的速率消耗葡萄糖。

通过引用结合

本文引述的所有美国专利和美国公开的专利申请均通过引用结合到本文中。

等同内容

本领域技术人员应认识到或能够只是采用常规实验便确定本文所述本发明的具体实施方案的许多等同内容。所述等同内容欲包括在随附权利要求书中。

Claims

1.一种用于发酵的组合物，其包含发酵混合物和转化的细胞；其中：

发酵混合物包含第一部分和第二部分；

所述第一部分基本上由分级分离的谷物部分组成；

所述第二部分包含一种或多种化合物；

所述一种或多种化合物选自含氮化合物、含磷化合物和含硫化合物；

所述转化的细胞可代谢所述一种或多种化合物(即利用所述一种或多种化合物作为氮、磷或硫的来源)；和

与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢所述一种或多种化合物。

2.权利要求1的组合物，其中所述含氮化合物、含磷化合物或含硫化合物非天然存在于谷物中。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述第一部分包含少量的氮、磷或硫。

4.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述分级分离的谷物部分是胚乳部分。

5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述谷物是玉米。

6.前述权利要求中任一项的组合物，其中：

所述第二部分包含量为约10%重量-约100%重量的式I-III中任一个的一种或多种含氮化合物或其盐；

所述转化的细胞可代谢(即作为氮源使用)所述一种或多种含氮化合物；

与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢所述一种或多种含氮化合物；和

式I的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

为5、6、9或10元芳基或杂芳基；

n为0、1、2、3、4或5；

式II的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

X为-NH-、-N(烷基)-、-O-、-C(R¹)₂-、-S-或不存在；

R¹为-H、-OH、-CO₂H、-NO₂、-CN、取代或未取代的氨基或取代或未取代的烷基；和

式III的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

7.权利要求6的组合物，其中所述一种或多种含氮化合物选自肼、5-氨基四唑、四唑、三聚氰胺、氨腈、2-氰基胍、叠氮化钠、碳酰肼、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,3-二氨基胍HCl、三聚氰酸二酰胺、1,3,5-三嗪、氨基乙腈、氰基乙基肼、偶氮二碳酰胺、联二脲、氨基甲肟、1,2-二甲基肼、1,1-二甲基肼、乙基肼、乙二胺、双氰胺钠、碳酸胍、甲胺、三聚氰酸一酰胺、羟胺、丙二腈、缩二脲、二亚乙基三胺、六亚甲基四胺、三亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、三亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、羟基脲、四亚乙基五胺、硫脲、琥珀腈、氰氨化钙、氰尿酸、氨基乙基哌嗪、哌嗪、二甲胺、乙胺、dalfampridine、四硝基甲烷、咪唑烷基脲、三硝基甲烷、丙二酰胺、氯胺、脲基甲酸酯、三甲胺、硝基甲烷、乙醛肟、二唑烷基脲、1,2-环己烷二酮二肟、丙酮肟、硫代乙酰胺、硫氰酸钠、异噻唑、噻唑、二甲基乙酰胺、异噻唑啉酮、亚甲基蓝、二乙醇胺、阿司帕坦、苯并异噻唑啉酮和乙酰舒泛钾。

8.前述权利要求中任一项的组合物，其中：

第二部分包含量为约10%重量-约100%重量的式IV-VI中任一个的一种或多种含磷化合物或其盐；

所述转化的细胞可代谢(即作为磷源使用)所述一种或多种含磷化合物；

与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢所述一种或多种含磷化合物；和

式IV的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R为-H、烷基、-OH、-OR²、-SH或-SR²；

R¹为-H或烷基；

Y为O或S；

Y¹为O或S；和

R²为烷基；

式V的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R¹为-H或烷基；和

Y¹为O或S；和

式VI的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R⁴为烷基或芳基。

9.权利要求8的组合物，其中所述一种或多种含磷化合物选自：

。

10.前述权利要求中任一项的组合物，其中

所述第二部分包含量为约10%重量-约100%重量的式VII-XIV中任一个的一种或多种含硫化合物或其盐；

所述转化的细胞可代谢(即作为硫源使用)所述一种或多种含硫化合物；

与转化的细胞同一物种的天然细胞不能代谢所述一种或多种含硫化合物；和

式VII的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环；

式IIX、式IX或式X的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环；

式XI、式XII或式XIII的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环；

R¹⁰为羟基烷基、R⁹或-(CH₂)_xR⁹；和

x为1、2、3或4；和

式XIV的化合物为

其中，独立地对于每次出现，

R⁹为-H、-OH、-OR⁷、-SH、-SR⁷、R⁷、卤素、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基；

R⁷为环烷基、烷基或芳基，或任两个R⁷一起形成5或6元环。

11.权利要求10的组合物，其中所述一种或多种含硫化合物选自：

。

12. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述转化的细胞包含第一遗传修饰，所述第一遗传修饰编码选自以下的酶：脲基甲酸水解酶、缩二脲酰胺水解酶、氰尿酸酰胺水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、三聚氰酸二酰胺水解酶、三聚氰酸一酰胺水解酶、三聚氰胺脱氨酶、异丙基氰尿酰胺异丙基氨基水解酶、氨腈水合酶、脲酶、脲羧化酶、亚磷酸脱氢酶、次磷酸/2-酮戊二酸加双氧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶(sn-甘油3-磷酸：NAD(+)氧化还原酶、EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、有机磷酸降解酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、脱硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物单加氧酶、2-羟基联苯-2-亚磺酸亚磺基裂解酶、二苯并噻吩单加氧酶和NADH-FMN氧化还原酶。

13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述转化的细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。

14.权利要求13的组合物，其中：

所述转化的细胞为细菌；

所述转化的细胞包含第二遗传修饰；和

所述第二遗传修饰赋予对噬菌体的抗性。

15.权利要求14的组合物，其中所述第二遗传修饰赋予对选自以下的噬菌体的抗性：Wphi、Mu、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1、P2、P4、P22、fd、phi6、phi29、phi31、phiC31、phi35、phi36、phi48、phi50、phi80、phiX174、SP01、M13、MS2、PM2、SSV-1、L5、PRD1、Qbeta、λ、UC-1、HK97和HK022。

16.一种用于发酵的方法，所述方法包括孵育前述权利要求中任一项的组合物，从而产生发酵产物(例如脂质、三酰甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃、烯烃、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3-丙二醇、1,4-丙二醇、琥珀酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇和/或赤藓糖醇)。

17.权利要求16的方法，其中所述发酵是需氧或微需氧发酵。