CN107075438A - 涉及检测口腔癌生物标记的方法和装置 - Google Patents

Abstract

公开了一种在人口腔中存在口腔癌活性时检测所述口腔中存在的生物材料内多种预定口腔生物标记的离体方法，所述方法包括以下步骤：i)提供用于从口腔接受生物材料样品的固体载体；ii)使生物材料样品转移到固体载体；iii)进行多种离体测定中的一种或多种，以检测固体载体上指示所述口腔癌活性的一种或多种核酸序列和/或一种或多种蛋白质和/或一种或多种酶形式的所述多种生物标记的存在。本发明也公开了适用于以上方法的样品拭子10。

Description

涉及检测口腔癌生物标记的方法和装置

发明领域

本发明涉及在口腔癌活性存在时检测和定量人口腔中存在的生物材料内多种口腔生物标记的离体方法。

发明背景

口腔癌已成为令人担忧的公共健康问题，在全世界具有增加的发病率和死亡率。口腔癌(主要为口腔鳞状细胞癌，OSCC)是人的第六最常见恶性肿瘤，具有高发病率和接近50%的五年死亡率，这在超过50年内未显著改变。因此，实行较新筛选和早期检测方法极为重要，这可减少与此疾病相关的发病率和死亡率。目前提供给OSCC患者的治疗方式基于肿瘤转移结标准和组织学分级。遗憾的是，这些预测指标是主观的，且相对不可靠，因为具有相同分期和分级的两种肿瘤通常表现非常不同，尽管一种响应治疗，另一种可能是致命的。因此，一直不断努力致力于口腔癌的基础研究，集中在鉴定用于诊断其生物性质和进攻性的生物标记。

以前已提出生物标记与OSCC相关(主要通过组织分析)，例如：羰基、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(Maspin)、Ki67、磷酸化-Src (phospho-Src)、细胞周期蛋白D1 (CycD1)、金属蛋白酶-9 (MMP-9)和乳酸脱氢酶(LDH)。另外的靶可能涉及HPV。一组生物标记的综述已描述于Cheng et al. Clincal Translational Medicine 2014 3:3 。

临床上未同时使用多种生物标记。

口腔采样，血清检验的非侵袭性替代方法，已由本发明的发明人确定为诊断和预后预测口腔癌以及监测患者疗法后状况的有效方式。然而，目前商业上没有提供口腔样品装置或检验以检测或预测OSCC进展。

本文提出在由基纸(例如Whatman 903 ®纤维素滤纸)组成的固体载体上收集/储存口腔生物材料，这将有利于口腔癌筛选方法。供选的样品收集材料可包括其它固体材料，例如藻酸盐和甚至用无害化学物质涂覆的材料。重要的是，所用固体载体材料不导致蛋白质变性，因为变性可将免疫检测系统限制于诸如ELISA、蛋白质印迹等方法。

基纸、藻酸盐或类似无害和非变性固体载体并入口腔收集和储存装置将容许以下技术：i)从口腔的直接细胞采样，而对患者无任何显著持久伤害；和ii)在分子检测阶段期间，可在直接/穿孔(punch-in)工作流程中使用非涂覆(和某些化学涂覆)固体载体，其中小部分收集样品被切除并直接放入检测试剂溶液。这些技术有利于潜在包含口腔癌生物标记的唾液的直接采样。

发明概述

本文描述一种用于监测口腔癌的新拭子装置和检验。所述装置和检验，作为鉴定唾液肿瘤标记中癌相关变化的辅助，可用作诊断、预后和术后监测的工具。发明人已确定，唾液和口腔癌损伤的邻近性使口腔中肿瘤标记测量成为血清和组织检验的有吸引力替代。另外，发明人已确定，源自活癌细胞的任何DNA、RNA、蛋白质分子和任何其它目的分析物可方便地从唾液得到，并潜在收集和储存在新拭子装置上。本文所述的新检验包括穿孔系统(punch-in system)，其直接分析拭子装置上得到的生物标记(通过直接PCR、RT PCR、蛋白质、酶分析、毛细管电泳、TOF MS和其它已知方法)。

本发明提供权利要求1的方法，该方法具有由从属于权利要求1的权利要求限定的优选特征。本发明也提供权利要求12的拭子装置，该装置具有由从属于权利要求12的权利要求限定的优选特征。

本发明扩展到本文所公开特征的任何组合，无论是否本文明确提到此组合。另外，在组合提到两种或更多种特征时，旨在不扩展本发明范围的情况下可单独要求保护这些特征。

附图简述

本发明可以多种方式实施，以下参考附图描述其说明性实施方案，其中：

图1显示蛋白质回收结果图解；

图2a、2b、2c和2d显示酶回收结果图解；

图3a和3b显示另外的蛋白质回收结果图解；

图4a、4b、4c和5a显示DNA回收结果；

图6a和6b显示RNA回收结果；

图7a至11b显示适用于本文所述采样技术的拭子装置；并且

图12a和12b显示用于前图中所示拭子装置的支架。

发明详述

通过参考以下详述并结合附图，可更好地理解本发明与其目的和优势，其中在图中相似的参考数字表示相似的元件。

检测口腔癌的特异生物标记是筛选、诊断、分级和跟踪这种恶性肿瘤的最可能的有效方法。与其它深组织癌不同，口腔癌只位于口腔，在本文中，该术语旨在包括人的口和上喉(咽)。因此，唾液和来自口腔癌损伤的细胞直接接触使唾液和损伤区域中的肿瘤标记测量成为侵袭性血清和组织检验的有吸引力替代。源自活癌细胞的DNA、RNA、蛋白质分子和其它目的分析物可方便地从唾液和损伤在拭子类装置上得到，然后储存，如果需要。在本文中，术语‘生物标记’包括收集的DNA、RNA、蛋白质分子和其它目的分析物以及由存在那些生物标记导致或由于存在那些生物标记形成的其它次生生物材料。术语“生物标记”也包括可能引发癌活性的OSCC前体，例如病毒。在本文中，‘癌活性’包括与OSCC相关的癌前活性，例如病毒活性。

因此，在本文中描述一种适用于收集口腔癌生物标记的新方法和收集装置，作为基于血清、组织和活检生物标记收集的替代。所述方法为早期诊断、预后和监测治疗后状况的有效方法。

各种技术对基因组学和蛋白质组学提供高通量方法的机会；其可用于评价口腔癌患者唾液中基因和蛋白质靶的变化表达。在固体载体上收集/储存例如唾液和/或癌细胞中的口腔生物标记，随后可进行简单直接或穿孔技术，其中固体载体上的样品直接加到检测试剂，并进行生物标记检测方法，例如但不限于免疫测定和核酸扩增技术，不用预先纯化目的生物标记或分析物。

本文所述采样装置的替代方法是使用Whatman Easicollect ®装置与非化学涂覆滤纸(例如903®)组合。重要的是，所用固体载体材料不导致蛋白质变性，因为变性可将免疫检测系统限制于诸如蛋白质印迹等方法。使用非化学涂覆的固体载体减小伤害患者的可能性。

未涂覆的普通滤纸、藻酸盐或类似无害和非变性固体载体(并入轻微磨损吸收基质)并入唾液/细胞收集和储存装置将允许与潜在癌细胞相关的生物标记的直接采样。

发明人已考查数种基因组和蛋白质组生物标记和/或其它目的分析物对口腔癌的重要性，并提出在以上提到Whatman提供的固体载体上收集这些标记。考虑的检测方法包括使用RT-PCR的基因表达或蛋白表达谱分析和/或使用基于未处理的纸和下游蛋白质的测定，以及聚合酶链反应(PCR)、定量PCR (qPCR)、qPCR前的微阵列测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、其它免疫技术、凝胶电泳(2DE)、毛细管电泳(TOF MS)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱(MS)、火焰光度法、原子吸收和分光光度法。

表 I - OSCC候选物：

表1给出指示口腔中癌活性或癌前活性的候选生物标记的实例。以下描述可进行的多种测定，以检测在固体载体上收集的生物材料中这些生物标记的存在，并且在一些情况下对它们定量。虽然列表包含多种蛋白质和酶，但可通过mRNA分析检测这些，而不是检测蛋白质自身，反之亦然。以下还显示了包括适用于收集生物材料的固体载体的拭子装置。

实施例1：自固体载体直接测量白介素(IL)

使重组IL-2 ± 载体(R & D Systems;分别为Cat. 202-IL-CF-10μg; 批次AE4309112和Cat. 202-IL-10μg; 批次AE4309081)以50pg或100pg/μl溶于血液(TCS Biosciences)。将等分试样(1μl，包含50 (B) or 100 (A) pg IL-2)施加到Whatman 903滤纸。

使这些样品在环境温度和湿度干燥过夜。使用适当大小的打孔器(punch)，从各纸类型提取出3mm直径的穿孔圆盘(punched disk)。利用来自完全10配置IL-2 QuantikineELISA试剂盒(R & D Systems, Cat.D2050, 批次273275)的试剂直接分析单个圆盘的IL-2。直接测定以“在孔中的穿孔物(punch in well)”进行，即，在此穿孔出部分903滤纸，并沉积在常规多孔板的反应孔中。

在完成测定时，在450nm监测光密度。通过将值与已知IL-2浓度的标准曲线比较而测定IL-2的回收率。回收率显示于图1中，表明可回收有效量IL，然后使IL沉积到固体载体上。

实施例2：从转移到固体载体的细胞或酶进行模式酶检测

根据制造商说明书，利用完全配置DNA酶和RNA酶 Contamination试剂盒(DNase &RNAase Alert QC Systems, 目录编号AM1970 & AM1966, Life Technologies)，进行蛋白质和酶检验。

双脱氧核糖核酸酶(DNA酶)

在第一系列试验中，将0.125-0.5 U DNA酶以10µl体积施加到Whatman FTA和903纸。如下概括的测量DNA酶和RNA酶活性。

在第二系列试验中，从已如上以10µl体积施加到FTA和903纸的106人胚胎干细胞(GE Healthcare; 细胞系ref: WCB307 GEHC 28)取1.2mm穿孔物(punch)。如下概括的测量DNA酶和RNA酶活性。

在第三系列试验中，从已以10µl体积施加到FTA和903纸的106人胚胎干细胞(GEHealthcare; 细胞系ref: WCB307 GEHC 28)(包含加到这些细胞的0.5U DNA酶或10µU RNA酶)取1.2mm穿孔物。

使用可裂解荧光标记DNA酶底物，如下进行DNA酶活性检测。将各穿孔物弹射到96孔板的单独孔。使经冻干DNA酶Alert底物溶于TE缓冲液(1ml)，并分配(10μl)到96孔板的检验孔。加入10X DNA酶 Alert缓冲液(10μl)和无核酸酶的水(80µl)，并在37℃孵育检验溶液(100µl) 60分钟。DNA酶Alert QC System底物为在由DNA酶裂解时发射粉红色荧光的经修饰DNA寡核苷酸。对于此测定，荧光在Tecan Ultra (激发/发射535/595nm，使用介质增益)上测量。包含DNA酶活性的溶液产生粉红色荧光，而没有DNA酶活性的溶液不发荧光。因此，较高水平DNA酶相当于光输出量增加。阴性对照由无核酸酶的水(80µl)代替样品组成。可用903或FTA滤纸作为固体载体，以速率依赖性方式检测和量化DNA酶活性。图2a表明可在FTA化学处理的滤纸上回收酶，且图2b表明可在903未处理的滤纸上回收酶。

核糖核酸酶(RNA酶)

使用可裂解荧光标记的RNA酶底物，如下进行RNA酶检测。将各穿孔物弹射到96孔板的单独孔。使经冻干RNA酶Alert底物溶于TE缓冲液(1ml)，并分配(10μl)到96孔板的检验孔。加入10X RNA酶Alert 缓冲液(10μl)和无核酸酶的水(80µl)，并在37℃孵育检验溶液(100µl) 60分钟。RNA酶Alert QC System底物为在由RNA酶裂解时发射绿色荧光的经修饰RNA寡核苷酸。对于此测定，荧光在Tecan Ultra (激发/发射485/535nm，使用介质增益)上测量。包含RNA酶的溶液产生绿色荧光，而没有RNA酶活性的溶液不发荧光。因此，较高水平RNA酶相当于光输出量增加。阴性对照由无核酸酶的水(80µl)代替样品组成。图2c和2d表明，可用903或FTA纸以速率依赖性方式检测和量化RNA酶活性。

实施例3：测量乳酸脱氢酶(LDH)

用于LDH的酶测定

LDH是很多不同类型细胞中存在的胞质酶。在质膜受损伤时，LDH被释放到围绕细胞的浴介质(bathing medium)。释放的LDH可通过偶联酶反应量化。首先，LDH通过将NAD+还原成NADH催化乳酸转化成丙酮酸。其次，黄递酶用NADH使四唑鎓盐(INT)还原成红色甲产物。因此，甲生成的水平与介质中释放的LDH量成正比。通过转移穿孔物并添加细胞或LDH酶或进入微量板并添加试剂盒试剂(LDH Cytotoxicity Assay Kit; Thermo Scientific,Product Code 88953)进行测定。在室温孵育30分钟后，停止反应，并通过在490nm的分光光度吸光度测定LDH活性。

用于LDH的免疫测定

一种供选的更灵敏方法包括使用LDH的免疫测定检测(LDHB人ELISA试剂盒(abcam产品编码116693)。该系统包括用如上穿孔系统(punch in system)定量测量细胞和组织裂解液中的人LDHB蛋白。该测定利用对包被在96孔板上的人LDHB特异的抗体。将样品吸取到孔中，并使样品中存在的LDHB通过固定化抗体结合到孔。洗涤孔，并加入抗LDHB检测抗体。在洗掉未结合的检测抗体后，将对检测抗体特异的HRP-缀合标记吸取到孔。再次洗涤孔，向孔中加入TMB底物溶液，颜色以与结合的LDHB量成比例显现。在600nm测量显蓝色。任选通过加入盐酸停止反应，盐酸使颜色从蓝变成黄，并且可在450nm测量强度。

图3a和3b显示LDH测量结果，表明可对固体载体检测和量化LDH。

实施例4：从在Whatman FTA和903卡上保存的血液的直接聚合酶链反应(PCR)

经证明，Thermo Scientific Phusion Blood Direct PCR试剂盒支持直接从一系列固体载体上储存的血样扩增DNA，固体载体包括Whatman 903、FTA和FTA洗脱卡(Elute card)(Chum and Andre 2013; Thermo Fisher Scientific)。FTA和FTA洗脱卡为化学涂覆纸基卡的实例，而903卡没有任何施加的化学物质。在直接扩增工作流程中，不需要先前DNA提取或纯化步骤，且仅将卡的切除部分加到PCR反应混合物。选择血液作为生物样品，因为这被认为是由其产生PCR扩增子的最有挑战性的样品类型。这是由于存在作为有效PCR抑制剂的血红素(Akane et al 1994, J. Forensic Sci., 39, 362-372)。

样品制备：将新鲜血液或利用肝素(1.4 IU/ml)、K2EDTA (1.8mg/ml)或柠檬酸钠(109mM)保存的血液施加到Whatman 903卡、FTA洗脱卡或FTA基因卡(Gene Card)，并根据制造商的说明书干燥。对于直接PCR，从样品穿孔出1mm直径圆盘，并按以下PCR反应体积使用，Whatman 903：10-50μl，FTA洗脱卡：25-50μl，FTA基因卡：50μl。在使用较大穿孔物或较小反应体积时，在50℃用20μl H₂O洗涤穿孔物3分钟。在去除H₂O后，将PCR组分直接加到经清洗的穿孔物。所用参数和试剂列于以下表II、III和IV中。

表II - PCR反应混合物：

表III- PCR热循环规程- 在引物Tm值为69-72℃时使用二步规程：

表IV- 用于扩增目的基因的特异引物：

图4a显示来自用肝素处理和保存在不同卡上的人血的500bp基因组DNA片段的直接扩增。反应从经清洗或直接放入50、25或10μl体积PCR反应的穿孔物进行。使用2-步PCR规程。图例显示于图下。

图4b显示来自用EDTA处理和保存在不同卡上的人血的1kb、3.8kb和7.5kb gDNA扩增子的直接PCR。反应以50μl反应从1mm穿孔物进行(FTA基因卡打孔器如7.5kb片段的材料和方法中所述清洗)。对1kb和7.5kb片段使用2-步规程，对3.8kb扩增子使用3-步规程。图例提供于图下。

图4c显示对来自用EDTA处理和保存在903和FTA基因卡上的数种哺乳动物种类的血液进行的直接PCR。反应用包括在Phusion Blood Direct PCR试剂盒和20μl反应体积(清洗FTA基因卡)的通用对照引物从1mm穿孔物进行。M=大小标记，- =阴性对照，+ =阳性对照(经纯化人基因组DNA)。

PCR研究证实，可直接从不同滤卡上储存的生物样品扩增DNA。从903卡得到的样品几乎不显示抑制，并且1mm穿孔物可利用低至10μl反应体积。Whatman FTA和FTA洗脱滤纸(Whatman FTA处理的滤纸的变型)显示不同程度的抑制。FTA洗脱卡(elute)略微抑制直接PCR反应，25-50μl反应中的1mm圆盘良好起作用，但在放入10μl反应时，PCR受到完全抑制。FTA基因卡显示最大水平抑制。不用任何预处理，FTA基因卡的1mm穿孔物只在50μl反应体积中良好起作用。对于较小反应体积，很简单的洗涤规程足以从FTA洗脱和FTA基因卡二者去除抑制剂。在用H₂O洗涤卡穿孔物3分钟后，以所有检验的反应体积，利用Phusion BloodDirect PCR试剂盒，样品具有足够用于直接PCR反应的纯度。

利用对1kb、3.8kb和7.5kb扩增子特异的引物，在50μl反应体积中使用来自903卡的穿孔物和来自FTA洗脱和FTA基因卡的经清洗穿孔物(均具有1mm直径)。在所有情况下，PCR反应产生适合大小的扩增产物。Phusion Blood Direct PCR试剂盒与来自多个物种的血液相容。SOX21基因上游的高保守237bp区(A. Woolfe, M. Goodson, PLoS Biol. 3,e7; 2004)成功地从在903和FTA基因卡上干燥的很多脊椎动物种类的血液扩增。

虽然已描述和说明了两个实施方案，但对技术人员显而易见的是，可在不脱离所要求保护的本发明的范围下对那些实施方案进行添加、省略和修改。例如。

实施例5：使用施加到固体载体材料的生物样品进行基因分型

很多癌与基因重排相关。尤因肉瘤断点区1 (EWSR1)在很多肉瘤中易位。最近，其重排已描述于唾液腺透明化的透明细胞癌(Shah AA et al 2013 Am J Surg Pathol. 37:571-8 EWSR1 genetic rearrangements in salivary gland tumors: a specific and verycommon feature of hyalinizing clear cell carcinoma(唾液腺瘤中的EWSR1基因重排：透明化的透明细胞癌的具体和非常普遍的特征))。以下所述研究说明本文献中所述固体载体材料和想法对复杂哺乳动物基因组内此类基团重排进行潜在筛选的可能性。

DNA样品收集、储存和检测

将来自c57BL/6小鼠和NOS3缺失小鼠(在129/B6背景中)的鼠组织施加到各种不同的纸基固体载体上。使小鼠安乐死，并解剖，以收集器官(血液、心、脑、肺、肝和肾)。将器官“夹”在两个纸层之间。通过无菌吸移管施加压力，以使组织包埋在各纤维素基质中。对于组织匀浆，用塑料杜恩斯匀浆器在1.5ml微量离心管中处理约5g组织，随后施加到适合纸基质。在施加后，在具有干燥剂的密封袋中储存之前，使所有样品空气干燥2小时。在一些情况下，在处理前，储存样品多达2个月。

DNA纯化、基因分型和量化

用Harris一次性微型打孔器(1.2mm或3mm直径)以穿孔圆盘形式分别从纸卡切除经干燥组织样品。样品圆盘从经干燥样品中心切除，并放入洁净无DNA酶的1.5ml微量离心管。利用内皮一氧化氮合酶(eNOS)外显子10-特异正向引物(见序列表1)、eNOS Neo-特异正向引物(见序列表2)和eNOS外显子12-特异反向引物(见序列表3)，通过基因组DNA的PCR扩增确定NOS3缺失或基因敲除小鼠。使用MJ Research热循环仪，利用最初10min变性步骤，随后94℃经历35sec，65℃经历1min，和72℃经历1min的36个循环；随后在72℃经历5min最后延伸，扩增靶DNA。用Experion毛细管电泳系统显示所得PCR产物。按照制造商的说明书，使用用于小鼠样品(gDNA-mo-q-DD)的Primer Design基因组DNA量化试剂盒实现小鼠DNA量化。将单独野生型(WT)和NOS缺失的组织样品分别施加到不同的纸卡。为了举例说明区分来自纸基质上储存的DNA的基因型变体的能力，对WT和转基因(NOS3缺失，基因敲除)小鼠进行某一区的PCR扩增。

在图5a中显示PCR扩增子，与NOS基因座相关，用DNA作为从纸卡从组织分离的扩增模板。泳道1-5为从WT小鼠组织(分别为心、肝、脑、肺和肾)分离的DNA。泳道6-10为从NOS小鼠组织(分别为心、肝、脑、肺和肾)扩增的DNA。

表V：

在以上表V中，记录从不同固体载体A、B、C和D上储存的组织分离的DNA的成功扩增。DNA从1.2mm穿孔物分离。‘+’表示存在扩增子。ND = 未测定。

图5a和以上表V显示分别从WT和NOS3缺失的基因敲除小鼠二者得到的DNA扩增产物。结果表明，对于两种样品源，从施加到固体纸-载体基质的所有器官/组织源分离的DNA产生合适大小的DNA扩增子。这些数据表明，1.2mm Harris微型打孔器可从固体纸载体上储存的组织切除足够DNA以区分两种遗传变体。

实施例6：RNA收集、纯化和量化

如所述的，将组织样品施加到固体载体纸卡，切除样品穿孔物，并如下所述用GEHealthcare illustra ® RNA spin试剂盒分离RNA。利用市售mRNA量化试剂盒，在ABI7900实时PCR系统上进行RNA量化。

使用Harris 3mm一次性微型打孔器，从经干燥样品点的中心切除穿孔物，并放入洁净无RNA酶的1.5ml微量离心管。使illustra缓冲液RA1 (350μl)与3.5μl β-巯基乙醇混合，并将溶液加到圆盘。用20号针将圆盘匀浆化。将所得匀浆转移到RNAspin Mini过滤柱，用于随后去除残余物质。使柱在11,000 x g离心1min，并弃去RNAspin Mini滤器。匀浆化的裂解液包含RNA，将此滤液转移到新的无RNA酶的1.5ml微量离心管。

将乙醇(70%; 350μl)加到匀浆化的裂解液，并通过涡旋2 x 5sec脉冲而混合。对于各制备，将裂解液上下吸移2–3次，并施加到放入2ml微量离心管的RNA Mini-离心柱。使管在8000 x g离心30sec，弃去穿流物(flow through)。将RNA离心柱转移到新收集管。

加入illustra MDB缓冲液(350μl)，使管在11 000 x g离心1min。再一次弃去穿流物，将柱返回到收集管。根据制造商说明书制备DNA酶反应混合物，并加到在RNA离心柱内包含的滤器的表面。在室温进行这种DNA酶孵育15min。

将洗涤缓冲液RA2 (200μl)施加到RNA Mini-离心柱，并使柱在11 000 x g离心1min。再一次弃去穿流物，将柱返回到收集管。

将缓冲液RA3 600μl施加到RNA Mini-离心柱，并使柱在11 000 x g离心1min，弃去穿流物，将柱返回到收集管。也用缓冲液RA3 (250μl)进行另外的柱洗涤。为了使膜完全干燥，使柱在11 000 x g离心2min，最后将柱放入无核酸酶的1.5ml微量离心管。

将无RNA酶的水(40μl)施加到柱，使柱在11 000 x g离心1min。经纯化RNA在下游应用立即使用，或在-80℃储存直至使用。

为了确定在长期储存后来自多种组织的RNA的完整性，对从纸卡上储存的小鼠组织样品分离的RNA进行实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。这些在干燥剂存在下储存2个月。mRNA量化根据制造商说明书进行，使用i)ABI Taqman啮齿动物GAPDH对照试剂盒(part# 4308313)，ii)Invitrogen real-time LUX mRNA引物组，用于鼠HPRT、GAPDH和β-肌动蛋白基因(分别为cat.105M-02、100M-02和101M-02)，或iii)组织特异基因引物组，来自Applied Bio-systems。

图6a显示使用ABI Taqman啮齿动物GAPDH对照试剂盒，来自数种组织源的GADPH的相对表达水平。通过与从小鼠RNA标准样品的量化滴定曲线产生的已知值比较，测定从施加到固体载体卡(载体材料A和B)的样品得到的RNA水平。从两种纸类型分离的RNA检测可比GAPDH RNA水平。

利用适合的Invitrogen real-time LUX引物组，进行编码HPRT、GAPDH和β-肌动蛋白的鼠mRNA的绝对量化。通过与从小鼠RNA标准样品的量化滴定曲线产生的已知值比较，测定从施加到固体载体材料A的样品得到的RNA水平。与分离RNA相关的鼠RNA回收数据描述于图6b中，表明该材料能够支持来自多种组织类型的RNA的储存和稳定。类似观察结果对载体材料B上储存的RNA是显而易见的。

概括地讲，以上实施例表明，可从不同构造的固体载体回收具有与表I中所给目的OSCC生物标记相同或类似生物结构的宽范围分析物。

以下更详细参考图7至12描述包括固体载体收集器的适合拭子装置。

图7a和7b分别显示用于拭子10的脊(spine)构件20(组装显示于图11a)的平面图和侧视图。脊20包括柄部22和端桨24，在平面图中端桨24宽于柄22，但在从侧面观察时具有与柄差不多相同的宽度。脊可以一件注射模塑。在桨上，与柄相邻，在相反侧上沉积附着用于收集生物材料样品的固体载体的压敏粘合剂26。在此情况下利用两个条26。柄22，在沿其长度近似一半，具有突出构造28，用于附着图11a中所示的罩40。

图7c和7d分别显示供选脊构件21的平面图和侧视图，除了脊21具有在桨24中的窗23外，脊21具有与脊20相同的结构。

图8a显示适用于收集唾液样品且适合通过图7a和7b中所示粘合条固定到桨24的上述类型的固体载体30的平面图。图8b显示沿图8a中所示线8b-8b的纸横截面，图8c显示固体载体的侧视图。在此情况下，固体载体为例如以商品名Whatman 903销售的类型的纤维素纸片，在其边缘已折叠和密封。纸具有虚线(weakness) 34和端区32，其旨在要通过粘合剂26固定到桨。端区36用于收集样品S。

图9a显示适用于收集唾液样品且适合通过图7a至7d中所示粘合条固定到桨24的上述类型变型固体载体31的平面图。图9b显示沿图9a中所示线9b-9b的纸横截面，图9c显示固体载体的侧视图。固体载体为相同的折叠纤维素纸片。纸具有穿孔虚线35和端区33，其旨在要通过粘合剂26固定到桨。样品收集区37位于与区36相同的区域。变型包括带(cord)39，在折叠时带39位于纸下，但伸出超出一个边缘，以便其在使用时被抓住和拉扯，以在使用时撕扯开纸，并释放样品区39。

图10a和10b显示通过粘合剂26(不可见)固定在一起的组装的脊20和固体载体31的平面图和侧视图。虽然图解那样，但具有固体载体30的组装体将相同。

图11a和11B显示用可除去罩40覆盖的图10a和10B中所示组装体的平面图和侧视图，罩40在7a图中所示的突出体28连接到柄22。

在使用中，由柄22把持和操纵拭子10。除去罩以露出固体载体30或31，即可使用。可取唾液样品(可以为自身样品)，由采样器代替罩，用于送到实验室进一步处理。在实验室，可从其余拭子部分除去固体载体，然后可除去用于纸的部分用于检验，例如通过使用打孔器。如果使用脊21，则可在不从脊除去固体载体的情况下除去部分固体载体，因为可通过窗23产生穿孔物或类似物。

在获取多个样品时，可使用干燥支架50，如图12a和12b中所示，其中将多个拭子10柄向下放入支架中的孔52中，且将罩40除去。

对于两种或更多种指示口腔癌活性的目的生物标记的存在情况，根据任何上述技术之一离体检验各固体载体30/31。

虽然以上描述了很多实例、技术和实施方案，但对技术人员显而易见的是，在不脱离本文所述的本发明范围的情况下，其它添加、变型和省略也是可能的。例如，虽然本文描述普通903纸固体载体30/31，但也可使用其它固体载体。例如，可使用利用防腐化学物质处理的滤纸，如以商品名Whatman FTA或FTA洗脱卡(Elute)销售的，它们分别经过预处理。FTA用稳定试剂混合物预处理，该混合物包含弱碱和螯合剂、尿酸或尿酸盐和阴离子表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)和/或月桂基肌氨酸钠(SLS))。FTA洗脱卡用包含硫氰酸胍型离液盐的稳定试剂混合物预处理。在使用FTA或FTA洗脱卡时，采样技术可包括获取唾液样品，然后将其转移到固体载体，以避免口腔和经处理固体载体之间的直接接触。在使用稳定试剂的情况下，已发现，在检测步骤加入环糊精作为螯合剂，从而提高直接PCR、qPCR和其它核酸扩增的效率。

虽然优选由纤维素纸形成的固体载体，但也可利用其它载体，例如织造或非织造纤维材料，包括人造或天然存在的聚合物纤维；矿物纤维基材料，例如玻璃纤维材料；表面处理的固体材料，例如化学或机械处理的材料，包括激光蚀刻表面，这些均提供有主要保持DNA RNA和蛋白质分子足够粗糙度的表面微粗糙度。虽然本说明书涉及固体载体，但该术语也旨在包括有足够强度以接受唾液样品的凝胶型软载体，例如藻酸盐。

Claims (15)

1.一种在人口腔中存在口腔癌活性时检测所述口腔中存在的生物材料内多种生物标记的离体方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供用于从口腔接受生物材料样品的固体载体；

ii)在固体载体上沉积生物材料样品；

iii)进行多种离体测定，以检测固体载体上沉积的生物材料样品中所述多种生物标记的存在。

2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括量化所述多种生物标记的至少一种的步骤。

3.权利要求1或2的方法，其中所述生物标记为来自本文表I中所列那些候选物的多种选择。

4.权利要求1、2或3的方法，其中所述多种选择为指示所述口腔癌活性的一种或多种核酸、和/或一种或多种蛋白质和/或一种或多种酶或其它分析物的形式。

5. 权利要求1至4中任一项的方法，其中所述一种或多种测定包括选自以下的一种或多种测定：使用RT-PCR的基因表达或蛋白质表达谱分析、聚合酶链反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、等温扩增、免疫-PCR、微阵列测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫技术、凝胶电泳(2DE)、毛细管电泳(TOF MS)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱(MS)、火焰光度法、原子吸收分光光度法和可见光分光光度法。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中测定包括例如使用打孔器，除去部分固体载体的步骤。

7. 权利要求1至6中任一项的方法，其中固体载体包括纤维素基纸；织造或非织造纤维材料，包括人造或天然存在的聚合物纤维；矿物纤维基材料，例如玻璃纤维材料；或表面处理的固体材料，例如化学或机械处理的材料，包括激光蚀刻表面，均提供有主要保持DNARNA和蛋白质分子的足够粗糙度的表面微粗糙度；或凝胶例如藻酸盐，均任选用稳定试剂或试剂混合物化学处理。

8.权利要求7的方法，其中所述试剂或试剂混合物包括：弱碱和螯合剂、任选尿酸或尿酸盐和任选阴离子表面活性剂，或包括：离液物质，例如离液盐，例如硫氰酸胍。

9.权利要求7或8的方法，其中在固体载体经化学处理时，权利要求1的步骤ii)包括从口腔获取生物材料样品，并将所述样品转移到所述经化学处理的固体载体上，而不使所述经化学处理的固体载体接触口腔。

10.权利要求9的方法，其中权利要求1的步骤iii)在环糊精存在下进行。

11.权利要求1至10中任一项的方法，所述方法进一步包括提供用于固定固体载体的拭子的步骤，所述拭子包括脊，所述脊包括柄部和在柄一端用于保持固体载体的桨部。

12.一种适用于从人口腔获取样品和保持指示口腔中口腔癌活性的多种生物标记的生物样品拭子，所述拭子包括柄部和在柄一端用于保持围绕桨两侧形成的材料片形式的固体载体的桨部。

13.权利要求12的样品拭子，其中固体载体可从桨除去，且任选进一步包括在固体载体中或固体载体下形成的撕扯带，以允许所述除去至少部分固体载体。

14.一种基本上如本文中关于附图所述的拭子或一种基本上如本文所述的方法。

15.一种用于权利要求1至11中任一项的方法的样品拭子。