JP2017536084A - 口腔癌バイオマーカーの検出に関連する方法及びデバイス - Google Patents

Abstract

ヒト口腔に口腔癌活性が存在するときにヒト口腔内に存在する生体物質中の複数の所定のバイオマーカーを検出するためのエクスビボ方法であって、ｉ）口腔由来の生体物質の試料を受容するための固体支持体を用意するステップと、ｉｉ）生体物質の試料を固体支持体に移すステップと、ｉｉｉ）１以上のエクスビボアッセイを実施して、固体支持体上の複数のバイオマーカーの存在を、口腔癌活性を示す、１種以上の核酸配列、及び／又は１種以上のタンパク質、及び／又は１種以上の酵素の形態で、検出するステップとを含む方法を開示する。上記の方法への使用に適切な試料スワブ１０もまた開示する。【選択図】図１０ａ

Description

本発明は、口腔癌活性が存在する場合の、ヒト口腔内に存在する生体物質中の複数の口腔バイオマーカーを検出及び定量するためのエクスビボ方法に関する。

口腔癌は、発生率及び死亡率が世界中で増加している、驚くべき公衆衛生上の問題として出現した。口腔癌（主に口腔扁平上皮癌、ＯＳＣＣ）は、高い罹患率及びおよそ５０％の５年死亡率を有する、最も一般的なヒト悪性腫瘍の６位であり、このことは５０年以上大きく変わっていない。したがって、より新しいスクリーニング及び早期検出のアプローチの実現が非常に重要であり、このことにより、この疾患に関連する罹患率及び死亡率を低下させることが可能である。ＯＳＣＣ患者に現在提供される治療方法は、腫瘍転移リンパ節基準及び組織学的悪性度に基づく。残念ながら、同じ進行度及び悪性度の２つの腫瘍は、多くの場合非常に異なる挙動を示し、一方は療法に応答し、他方は死に至ることがあるので、これらの予測因子は主観的であり、相対的信頼性を欠く。したがって、口腔癌の生物学的性状及び攻撃性の診断のための生体インジケーターの同定に焦点を当てた、その基礎研究に捧げられる努力は成長し続けている。

バイオマーカー、例えば：カルボニル、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）、乳腺セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｍａｓｐｉｎ）、Ｋｉ６７、リン酸化−Ｓｒｃ（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｒｃ）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（ＣｙｃＤ１）、メタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ＯＳＣＣに関連するものであることが以前に示唆されている（主に組織分析による）。さらなる標的はＨＰＶを含むと思われる。一組のバイオマーカーの総説がＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４ ３：３に記載されている。

複数のバイオマーカーは、臨床的に同時には使用されていなかった。

血清検査の非侵襲的代替手段である口腔のサンプリングが、口腔癌の診断的及び予後予測のための、並びに患者の治療後状態のモニタリングの有効な様式として本発明の発明者らによって特定された。しかし、ＯＳＣＣの検出又は予後予測のための口腔のサンプリングデバイス又は試験は、現在のところ市販品として提供されていない。

本明細書において、口腔癌のスクリーニングアプローチを容易にするＷｈａｔｍａｎ ９０３（登録商標）セルロースろ紙などの紙基材からなる固体支持体における口腔生体物質の収集／保存を提唱する。代替の試料収集材料としては、アルギン酸塩、さらに無害な化学物質でコーティングされた材料などの他の固体材料を挙げることができる。タンパク質の変性はＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどのアプローチにおいて免疫学的検出システムを制限するので、タンパク質の変性を引き起こさない固体支持体材料を使用することが重要である。

紙基材、アルギン酸塩又は同様の無害及び非変性固体支持体を口腔収集及び保存デバイスに組み込むことは、以下の技術を可能にする；ｉ）患者に恒久的な損傷を全く与えない、口腔からの細胞の直接サンプリング及びｉｉ）分子検出段階の際に、非コーティング（及び特定の化学的コーティングを有する）固体支持体が、収集された試料の少量を切り取り、検出試薬の溶液中に直接入れる、直接／パンチ・イン・ワークフローに使用可能である。これらの技術は、口腔癌バイオマーカーを含有し得る唾液の直接サンプリングを容易にする。

米国特許出願公開第２０１１／０３１８７６３号明細書

本明細書において、口腔癌をモニタリングするための新しいスワブデバイス及び試験を記載する。唾液腫瘍マーカーの癌に関連する変化の特定を補助するデバイス及び試験は、診断、予後及び術後のモニタリングのためのツールとして使用することができる。本発明者らは、唾液及び口腔癌病変の近接が、口腔内の腫瘍マーカーの測定を血清及び組織検査の魅力的な代替手段にすることを確立した。さらに、本発明者らは、肝臓癌細胞由来の任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質分子及び目的の任意の他の被験物質が唾液から簡便に得られ、新規なスワブデバイスに収集及び保存可能であることを確立した。本明細書に記載の新規な試験は、（直接ＰＣＲ、ＲＴ ＰＣＲ、タンパク質、酵素分析、キャピラリー電気泳動、ＴＯＦ ＭＳ及び他の公知の方法を用いた）本スワブデバイスにおいて得られるバイオマーカーの直接分析によるパンチ・イン・システムを伴う。

本発明は、請求項１に従属する請求項により定義される好ましい特徴を有する、請求項１に記載の方法を提供する。本発明は、請求項１２に従属する請求項により定義される好ましい特徴を有する、請求項１２に記載のスワブデバイスもまた提供する。

本発明は、本明細書において明確に述べられているかどうかにかかわらず、本明細書に開示の特色の任意の組合せにまで拡がる。さらに、２以上の特色が組合せて述べられる場合、このような特色は、本発明の範囲を拡げることなく、個別に特許請求され得ることが意図される。

本発明は多数の方法で実行でき、その例示的実施形態を、図面を参照しながら下記に記載する。

タンパク質回収結果のチャートを示す。 酵素回収結果のチャートを示す。 酵素回収結果のチャートを示す。 酵素回収結果のチャートを示す。 酵素回収結果のチャートを示す。 さらにタンパク質回収結果のチャートを示す。 ＤＮＡ回収結果を示す。 ＤＮＡ回収結果を示す。 ＲＮＡ回収結果を示す。 本明細書に記載のサンプリング技術に適切なスワブデバイスを示す。 本明細書に記載のサンプリング技術に適切なスワブデバイスを示す。 本明細書に記載のサンプリング技術に適切なスワブデバイスを示す。 本明細書に記載のサンプリング技術に適切なスワブデバイスを示す。 本明細書に記載のサンプリング技術に適切なスワブデバイスを示す。 図１から１１に示すスワブデバイスのホルダーを示す。

本発明並びにその目的及び有利性は、下記の説明を添付の図面と併せて参照することによってより理解を深められると考えられ、図面において同様の参照番号は図中の同様の要素を特定するものである。

口腔癌に特異的なバイオマーカーの検出は、この悪性腫瘍のスクリーニング、進行度診断及び追跡のための最も有効な方法であると思われる。他の深部組織癌とは異なり、口腔癌は口腔にのみ見つかるものであり、口腔という用語は、本明細書においてヒトの口及び喉上部（咽頭）を含むことを意図する。したがって、唾液及び口腔癌病変由来の細胞の間の直接接触は、唾液及び病変領域中の腫瘍マーカーの測定を、侵襲的な血清及び組織検査の魅力的な代替手段にする。肝臓癌細胞由来の任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質分子及び目的の任意の他の被験物質を、唾液及び病変からスワブデバイスに簡便に収集し、その後必要に応じて保存可能である。本明細書において、「（１以上の）バイオマーカー」という用語は、収集されたＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質分子及び目的の他の被験物質並びにそれらのバイオマーカー存在の結果としてもたらされる、又は形成される二次生体物質を含む。「バイオマーカー」という用語は、癌活性を開始できるウイルスなどのＯＳＣＣ前駆体も含む。本明細書において「癌活性」という用語は、前癌活性、例えばＯＳＣＣに関連するウイルス活性を含む。

したがって、血清、組織に基づく、生検バイオマーカー収集に対する非侵襲的代替手段として、口腔癌バイオマーカーの収集に適切な新規な方法及び収集方法を本明細書において記載する。記載する方法は、早期診断、予後及び治療後状態のモニタリングのための有効な方法である。

様々な技術により、ゲノミクス及びプロテオミクスへの高性能なアプローチの機会が提供され、ゲノミクス及びプロテオミクスは、口腔癌患者の唾液中の遺伝子及びタンパク質標的の発現の改変を評価するために使用可能である。例えば唾液及び／又は癌細胞中の口腔バイオマーカーの固体支持体への収集／保存の後で、固体支持体上の試料を検出試薬に直接加える単純な直接又はパンチ・イン技術を行い、目的のバイオマーカー又は被験物質の予備精製をせずに、限定するものではないが、免疫学的アッセイ及び核酸増幅技術などのバイオマーカー検出方法に供する。

本明細書に記載のサンプリングデバイスへの代替のアプローチは、Ｗｈａｔｍａｎ Ｅａｓｉｃｏｌｌｅｃｔ（登録商標）デバイスと、９０３（登録商標）などの非化学的コーティングろ紙との併用である。タンパク質の変性は免疫学的検出システムをウエスタンブロットなどのアプローチに制限し得るので、タンパク質の変性を引き起こさない固体支持体材料を使用することが重要である。非化学的コーティング固体支持体の使用は、患者を損傷する可能性を低減する。

唾液／細胞の収集及び保存デバイス内の弱研磨性吸収性マトリックスへの非コーティングの単純なろ紙、アルギン酸塩又は同様の無害及び非変性固体支持体の組み込みは、潜在的癌細胞に関連するバイオマーカーの直接サンプリングを可能にする。

本発明者らは、口腔癌に関するいくつかのゲノミクス及びプロテオミクスバイオマーカー及び／又は目的の他の被験物質を総括し、上述のＷｈａｔｍａｎにより供給された固体支持体へのこれらのマーカーの収集を提案する。企図される検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲを使用する遺伝子発現又はタンパク質発現プロファイリング、及び／又は未処理紙及び下流のタンパク質ベースのアッセイの使用並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ｑＰＣＲの前のマイクロアレイアッセイ、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、他の免疫学的技術、ゲル電気泳動（２ＤＥ）、キャピラリー電気泳動（ＴＯＦ ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、炎光光度法、原子吸光及び分光光度法が挙げられる。

表１は、口腔における癌又は前癌活性を示すバイオマーカー候補の例を挙げている。固体支持体に収集された生体物質中のこれらのバイオマーカーの存在を検出し、場合によりこれらを定量するために実施可能な様々なアッセイを以下に記載する。このリストは様々なタンパク質及び酵素を含むが、タンパク質それ自体を検出するのではなく、ｍＲＮＡ分析を用いてこれらを検出することも可能であり、逆もまた同様である。さらに、生体物質の収集に適切な固体支持体を備えるスワブデバイスを以下に示す。

実施例１：固体支持体からのインターロイキン（ＩＬ）の直接測定
組換えＩＬ−２±キャリア（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれ、カタログ番号２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９１１２及びカタログ番号２０２−ＩＬ−１０μｇ；ロットＡＥ４３０９０８１）を血液（ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に５０ｐｇ又は１００ｐｇ／μｌで溶解した。アリコート（５０（Ｂ）又は１００（Ａ）ｐｇのＩＬ−２を含有する１μｌ）を、Ｗｈａｔｍａｎ９０３ろ紙に適用した。

これらの試料を、周囲温度及び湿度において一晩乾燥させた。パンチした直径３ｍｍのディスクを、適切なサイズのパンチを使用して各紙タイプから切り取った。単一のディスクを、１０の完全に構成されたＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ２０５０、ロット２７３２７５）の試薬を用いて、ＩＬ−２に関して直接分析した。直接アッセイを、「パンチ・イン・ウェル」で実施した、すなわち、９０３ろ紙の一部をパンチにより切り取り、従来型のマルチウェルプレートの反応ウェルに置いた。

アッセイが完了したら、光学密度を４５０ｎｍにおいてモニターした。ＩＬ−２の回収を、公知のＩＬ−２濃度の標準曲線と値とを比較することによって決定した。回収率を図１に示し、ＩＬの有効量が回収され、その後ＩＬが固体支持体に付着され得ることを実証している。

実施例２：細胞又は固体支持体に移行された酵素からのモデル酵素の検出
タンパク質及び酵素試験を、完全に構成されたＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＡＭ１９７０及びＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って実施した。

ジデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）
実験の第１段階において、０．１２５−０．５ＵのＤＮａｓｅをＷｈａｔｍａｎ ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで適用した。ＤＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した。

実験の第２段階において、ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで上記のように適用された１０⁶のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍのパンチを採取した。ＤＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、下記に要約したように測定した。

実験の第３段階において、ＦＴＡ及び９０３紙に体積１０μｌで適用された、これらの細胞に加えられた０．５ＵのＤＮａｓｅ又は１０μＵのＲＮａｓｅのいずれかを含有する１０⁶のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；細胞系参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ２８）から、１．２ｍｍのパンチを採取した。

ＤＮａｓｅ活性の検出を、切断可能な蛍光標識ＤＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）及びヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍの基質はＤＮａｓｅにより切断されると、ピンク色の蛍光を発する改変されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ５３５／５９５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ ｇａｉｎ）使用）で測定した。ＤＮａｓｅ活性を含む溶液はピンク色の蛍光を発生し、一方、ＤＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＤＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。ＤＮＡａｓｅ活性は、９０３又はＦＴＡろ紙を固体支持体として使用して、変化量依存様式で検出及び定量することができる。図２ａは、化学的に処理されたＦＴＡろ紙において酵素の回収が可能であることを実証しており、図２ｂは、９０３未処理ろ紙において酵素の回収が可能であることを実証している。

リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）
ＲＮａｓｅの検出を、切断可能な蛍光標識ＲＮａｓｅ基質を使用して下記のように実施した。各パンチを９６−ウェルプレートの個別のウェル内に取り出した。凍結乾燥ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質をＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェル内に分注した（１０μｌ）。１０×ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔバッファー（１０μｌ）及びヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）を加え、この試験溶液（１００μｌ）を３７℃において６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣ Ｓｙｓｔｅｍの基質はＲＮａｓｅにより切断されると、緑色の蛍光を発する改変されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関しては、蛍光はＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ４８５／５３５ｎｍ、中感度（ｍｅｄｉｕｍ ｇａｉｎ）使用）において測定した。ＲＮａｓｅを含む溶液は緑色の蛍光を発生し、一方、ＲＮａｓｅ活性のない溶液は蛍光を発さなかった。したがって、高レベルのＲＮａｓｅは光の出力量の増加に対応した。陰性対照は、試料のかわりにヌクレアーゼ非含有水（８０μｌ）で構成された。図２ｃ及び２ｄは、ＲＮＡａｓｅ活性が、９０３又はＦＴＡ紙を使用して、変化量依存様式で検出及び定量可能であることを実証している。

実施例３：乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の測定
ＬＤＨの酵素アッセイ
ＬＤＨは、多数の異なるタイプの細胞に存在する細胞質内酵素である。細胞膜が損傷された時、ＬＤＨが、細胞を取り巻く外部媒体（ｂａｔｈｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に放出される。放出されたＬＤＨは、共役酵素反応により定量することができる。第１に、ＬＤＨは、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を介して乳酸のピルビン酸への変換を触媒する。第２に、ジアフォラーゼは、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）から赤いホルマザン生成物への還元にＮＡＤＨを使用する。したがって、ホルマザン形成レベルは、媒体中に放出されたＬＤＨの量に直接比例する。このアッセイを、細胞又はＬＤＨ酵素を添加したパンチをマイクロプレートに移し、キットの試薬（ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品コード８８９５３）を加えることによって実施する。室温において３０分間インキュベーション後、反応を停止させ、ＬＤＨ活性を４９０ｎｍにおける吸光度により決定する。

ＬＤＨの免疫アッセイ
代替のより感度の高いアプローチはＬＤＨの免疫アッセイ検出（ＬＤＨＢ ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ製品コード１１６６９３））の使用を伴う。このシステムは、上記のパンチ・イン・システムを使用した、細胞及び組織溶解物中のヒトＬＤＨＢタンパク質の定量的測定を伴う。このアッセイは、ヒトＬＤＨＢに特異的な抗体によりコーティングされた９６ウェルプレートを用いる。試料をピペットでウェルに入れ、試料中に存在するＬＤＨＢを固定された抗体によりウェルに結合させる。ウェルを洗浄し、抗ＬＤＨＢ検出抗体を加える。未結合の検出抗体を洗い流した後で、該検出抗体に特異的なＨＲＰ結合標識をウェルにピペットで加える。このウェルを再度洗浄し、ＴＭＢ基質溶液をウェルに加え、ＬＤＨＢの結合量に比例した発色を得る。青い発色が６００ｎｍにおいて測定される。場合により、反応は塩酸を添加することによって停止させることができ、塩酸は色を青色から黄色に変化させ、４５０ｎｍにおいて強度が測定可能になる。

図３ａ及び３ｂはＬＤＨの測定結果を示し、固体支持体のＬＤＨが検出及び定量可能であることを実証している。

実施例４：Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ及び９０３カードに保存された血液からの直接ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ は、 Ｗｈａｔｍａｎ９０３、ＦＴＡ及びＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード（Ｃｈｕｍ ａｎｄ Ａｎｄｒｅ ２０１３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む様々な固体支持体に保存された血液試料からの直接ＤＮＡ増幅を支援することを実証した。ＦＴＡ及びＦＴＡ ｅｌｕｔｅカードは、化学的にコーティングされたカードの例であり、一方９０３カードはどのような化学物質も適用されていない。直接増幅ワークフローにおいて、事前のＤＮＡ抽出又は精製ステップは必要なく、カードの切り取った部分をＰＣＲ反応混合物に加えるだけである。血液を生体試料として選択したが、血液は、ＰＣＲ増幅産物の製造が最も困難な試料タイプであると考えられる。これは潜在的ＰＣＲ阻害剤であるヘム（ｈｅａｍ）の存在によるものである（Ａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ １９９４，Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．，３９，３６２−３７２）。

試料調製：新鮮な血液及びヘパリンと一緒に保存された血液（１．４ＩＵ／ｍｌ）、Ｋ２ＥＤＴＡ（１．８ｍｇ／ｍｌ）又はクエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）を製造業者の取り扱い説明書に従ってＷｈａｔｍａｎ ９０３カード、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード又はＦＴＡ Ｇｅｎｅカードに適用し、乾燥させた。直接ＰＣＲのために、直径１ｍｍのディスクを試料から切り取り、下記の体積のＰＣＲ反応液に使用した：Ｗｈａｔｍａｎ ９０３：１０−５０μｌ、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード：２５−５０μｌ及びＦＴＡ Ｇｅｎｅカード：５０μｌ。これよりも大きなパンチ又は少ない反応液体積を使用する場合、パンチを２０μｌのＨ₂Ｏを用いて５０℃において３分間洗浄した。Ｈ₂Ｏを除去後、ＰＣＲ成分を、すすいだパンチに直接加えた。使用したパラメーター及び試薬を、下記の表ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに記載した。

図４ａは、ヘパリンで処理され、様々なカードにおいて保存されたヒト血液からの、５００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片の直接増幅を示す。反応を、すすいだ、又は体積５０、２５又は１０μｌのＰＣＲ反応液に直接置いたかいずれかの１ｍｍパンチから実施した。２ステップＰＣＲプロトコルを使用した。解説を図の下に示す。

図４ｂは、ＥＤＴＡで処理し、様々なカードに保存したヒト血液由来の１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂのｇＤＮＡ増幅産物の直接ＰＣＲを示す。反応を、１ｍｍのパンチから５０μｌの反応液において実施した（ＦＴＡ Ｇｅｎｅカードのパンチは、７．５ｋｂ断片について材料及び方法に記載したようにすすいだ）。２−ステッププロトコルを１ｋｂ及び７．５ｋｂ断片に使用し、３．８ｋｂの増幅産物には３−ステッププロトコルを使用した。解説を図の下に提供する。

図４ｃは、ＥＤＴＡで処理し、９０３及びＦＴＡ Ｇｅｎｅカードに保存したいくつかの哺乳動物種由来の血液に実施した直接ＰＣＲを示す。反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔに含まれるユニバーサル対照プライマー及び体積２０μｌの反応液を使用して１ｍｍのパンチから実施した（ＦＴＡ Ｇｅｎｅカードはすすいだ）。Ｍ＝サイズマーカー、−＝陰性対照、＋＝陽性対照（精製されたヒトゲノムＤＮＡ）。

ＰＣＲ研究により、ＤＮＡが様々なろ紙カードに保存された生体試料から直接増幅可能であることが確認された。９０３カード由来の試料はほとんど阻害されず、１ｍｍのパンチは、１０μｌほどの少ない反応液体積にも使用可能であった。Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ及びＦＴＡ Ｅｌｕｔｅろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ処理ろ紙の変形）は、様々な程度の阻害を示した。ＦＴＡ ｅｌｕｔｅは、直接ＰＣＲ反応をわずかに阻害し、２５−５０μｌの反応液中の１ｍｍのディスクはよく反応したが、１０μｌの反応液に置いた場合、ＰＣＲは完全に阻害された。ＦＴＡ Ｇｅｎｅカードは、最も高いレベルの阻害を示した。予備処理を全く行わないと、ＦＴＡ Ｇｅｎｅカードの１ｍｍのパンチは、体積５０μｌの反応液においてのみよく反応した。より少ない体積の反応液については、非常に単純な洗浄プロトコルが、ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ Ｇｅｎｅカードの両方から阻害剤を除去するために十分であった。カードのパンチを３分間、Ｈ₂Ｏで洗浄した後で、試料は、すべての被験反応体積においてＰｈｕｓｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いた直接ＰＣＲへの使用に十分な純度であった。

９０３カード由来のパンチ及びＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ及びＦＴＡ Ｇｅｎｅカード由来のすすいだパンチ（すべて直径１ｍｍ）を、１ｋｂ、３．８ｋｂ及び７．５ｋｂの増幅産物に特異的なプライマーを含む、体積５０μｌの反応液に使用した。すべての事例において、ＰＣＲ反応は、適切なサイズの増幅産物を生成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔは、様々な種由来の血液に適合可能である。ＳＯＸ２１遺伝子の上流にある高度に保存された２３７ｂｐ領域（Ａ．Ｗｏｏｌｆｅ，Ｍ．Ｇｏｏｄｓｏｎ，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．３，ｅ７；２００４）を、９０３及びＦＴＡ Ｇｅｎｅカードにおいて乾燥させた、多数の脊椎動物種の血液から増幅することに成功した。

２つの実施形態を記載及び例示してきたが、特許請求する発明の範囲から逸脱することなくそれらの実施形態に対する付加、省略及び改良が可能であることは当業者には明らかであると思われる。例えば、
実施例５：固体支持体材料に適用された生体試料を使用する遺伝子型判定
多数の癌が、遺伝子再配列と関係がある。Ｅｗｉｎｇ ｓａｒｃｏｍａ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｉｏｎ１（ＥＷＳＲ１）は多数の肉腫において転座している。近年、その再配列が、唾液線硝子化明細胞癌において記載された（Ｓｈａｈ ＡＡ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．３７：５７１−８ ＥＷＳＲ１ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ：ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｙ ｃｏｍｍｏｎ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｈｙａｌｉｎｉｚｉｎｇ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。下記の研究は、複雑な哺乳動物ゲノム内のこのような遺伝子再配列のスクリーニングを可能にする、本文献に記載の固体支持体材料及び着想の有望性を例示する。

ＤＮＡ試料の収集、保存及び検出
ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＮＯＳ３ヌルマウス（バックグラウンド１２９／Ｂ６）由来のネズミ組織を、様々な異なる紙ベース固体支持体に適用した。これらのマウスを安楽死させ、解剖して臓器（血液、心臓、脳、肺、肝臓及び腎臓）を収集した。臓器を２枚の紙の層に「サンドイッチ」した。それぞれのセルロースマトリックスに挟まれた組織に滅菌ピペットにより圧力を印加した。組織ホモジネート用に、およそ５ｇの組織を、プラスチックダウンス型ホモジナイザーを使用して、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて処理し、次いで適切な紙マトリックスに適用した。適用後、すべての試料を２時間風乾させ、その後密閉されたポーチにおいて乾燥剤と一緒に保存した。場合により、試料は処理まで最大２ヶ月保存した。

ＤＮＡの精製、遺伝子型判定及び定量
Ｈａｒｒｉｓの使い捨てマイクロパンチ（直径１．２ｍｍ又は３ｍｍ）を使用して、紙カードから乾燥組織試料を、それぞれパンチされたディスクの形態で切り取った。試料ディスクを乾燥試料の中心から切り取り、清潔なＤＮａｓｅ非含有１．５ｍｌ微小遠心管に入れた。ヌル又は遺伝子ノックアウトＮＯＳ３マウスを、内皮型酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）エクソン１０特異的フォワードプライマー（配列リスト１を参照されたい）、ｅＮＯＳ Ｎｅｏ特異的フォワードプライマー（配列リスト２）及びｅＮＯＳエクソン１２特異的リバースプライマー（配列リスト３を参照されたい）を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定した。標的ＤＮＡを、初回１０分の変性ステップ、次いで９４℃３５秒、６５℃１分及び７２℃１分を３６サイクル、その後７２℃５分間の最終伸長で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを使用して増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎキャピラリー電気泳動システムを使用して可視化させた。マウスＤＮＡの定量を、マウス試料用Ｐｒｉｍｅｒ ＤｅｓｉｇｎゲノムＤＮＡ定量キット（ｇＤＮＡ−ｍｏ−ｑ−ＤＤ）を使用して製造業者の使用説明書に従って行った。個別の野生型（ＷＴ）及びＮＯＳヌルの組織試料を、異なる紙カードに別々に適用した。紙マトリックスに保存されたＤＮＡから遺伝子型変異体を識別する能力を例示するために、ある領域のＰＣＲ増幅をＷＴ及びトランスジェニック（ＮＯＳ３ヌル、遺伝子ノックアウト）マウスに実施した。

図５ａにおいて、紙カード由来の組織から単離されたＤＮＡを増幅鋳型として使用した、ＮＯＳ遺伝子座に関係するＰＣＲアンプリコンを示す。レーン１−５はＷＴマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺及び腎臓）から単離されたＤＮＡである。レーン６−１０は、ＮＯＳマウス組織（それぞれ、心臓、肝臓、脳、肺及び腎臓）から増幅されたＤＮＡである。

上記の表Ｖにおいて、様々な固体支持体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに保存された組織から単離されたＤＮＡの増幅が成功したことが記録されている。ＤＮＡを１．２ｍｍのパンチから単離した。「＋」は、アンプリコンの存在を示す。ＮＤ＝未判定
上記の図５ａ及び表Ｖは、ＷＴ及びＮＯＳ３ヌル遺伝子ノックアウトマウス両方に由来するＤＮＡ増幅産物をそれぞれ示している。結果は、両方の試料源に関して、正確にサイズ決定されたＤＮＡアンプリコンが、固体支持体マトリックスに適用されたすべての臓器／組織源から単離されたＤＮＡから製造されたことを示している。これらのデータは、１．２ｍｍのＨａｒｒｉｓマイクロパンチが紙固体支持体に保存された組織から十分なＤＮＡを切り取り、２つの遺伝子型変異体を識別可能であることを示している。

実施例６：ＲＮＡの収集、精製及び定量
組織試料を、上記のように固体支持体紙カードに適用し、試料のパンチを切り取り、ＲＮＡを、下記のようにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｉｌｌｕｓｔｒａ（登録商標）ＲＮＡ ｓｐｉｎ ｋｉｔを使用して単離した。ＲＮＡの定量を、ＡＢＩ７９００リアルタイムＰＣＲシステムにおいて市販のｍＲＮＡ定量キットを利用して実施した。

Ｈａｒｒｉｓの３ｍｍ使い捨てマイクロパンチを使用して、パンチを乾燥試料スポットの中心から切り取り、清潔なＲＮａｓｅ非含有１．５ｍｌの微小遠心管に入れた。ｉｌｌｕｓｔｒａバッファーＲＡ１（３５０μｌ）を３．５μｌのβ−メルカプトエタノールと組合せ、この溶液をディスクに添加した。ディスクを、２０ゲージの針を使用して均質化した。得られたホモジネートを、その後で残留物質を除去するためにＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターカラムに移した。このカラムを１１，０００×ｇで１分間遠心分離して、ＲＮＡｓｐｉｎミニフィルターを廃棄した。均質化された溶解物はＲＮＡを含有し、このろ液を新しいＲＮａｓｅ非含有の１．５ｍｌ微小遠心管に移した。

エタノール（７０％；３５０μｌ）を均質化溶解物に添加し、２×５秒のパルスでボルテックスにより混合した。各調製物に関して、溶解物をピペットにより２−３回上下させ、２ｍｌの微小遠心管に入れたＲＮＡミニスピンカラムに適用した。この遠心管を８０００×ｇで３０秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。ＲＮＡスピンカラムを新しい採取管に移した。

ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭＤＢバッファー（３５０μｌ）を加え、この管を１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。ＤＮａｓｅ反応混合物を製造業者の使用説明書に従って調製し、ＲＮＡスピンカラム内に入っているフィルター表面に添加した。このＤＮＡｓｅインキュベーションは、室温に置いて１５分間実施した。

洗浄バッファーＲＡ２（２００μｌ）をＲＮＡミニスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。もう一度フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。

６００μｌのバッファーＲＡ３をＲＮＡ Ｍｉｎｉスピンカラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄して、カラムを採取管に戻した。バッファーＲＡ３（２５０μｌ）でさらにカラムを洗浄した。膜を完全に乾燥させるために、カラムを１１０００×ｇで２分間遠心分離し、このカラムを最終的にヌクレアーゼ非含有１．５ｍｌ微小遠心管内に入れた。

ＲＮａｓｅ非含有水（４０μｌ）を該カラムに適用し、このカラムを１１０００×ｇで１分間遠心分離した。精製されたＲＮＡは、直ちに下流の用途に使用するか、又は使用まで−８０℃において保存するかのどちらかであった。

長期保存後の複数組織由来のＲＮＡの完全性を判定するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、紙カードに保存されたマウス組織試料から単離されたＲＮＡに対して実施した。これらを、乾燥剤の存在下で２ヶ月保存した。ｍＲＮＡの定量を、製造業者の使用説明書に従って、ｉ）ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎの齧歯類ＧＡＰＤＨ コントロールキット（部品番号４３０８３１３）、ｉｉ）ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのネズミＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ及びＢｅｔａ−Ａｃｔｉｎ遺伝子用リアルタイムＬＵＸｍＲＮＡプライマーセット（それぞれ、カタログ番号１０５Ｍ−０２、１００Ｍ−０２及び１０１Ｍ−０２）又はｉｉｉ）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓによる組織特異的遺伝子プライマーセットのいずれかを使用して成し遂げた。

図６ａは、ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ齧歯類ＧＡＰＤＨコントロールキットを使用した、いくつかの組織源からのＧＡＤＰＨの相対発現レベルを示す。固体支持体カード（支持体材料Ａ及びＢ）に適用され他試料由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。同程度のＧＡＰＤＨ ＲＮＡレベルが、両方の紙タイプから単離されたＲＮＡから検出された。

ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチンをコードするネズミｍＲＮＡの絶対定量を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの適切なリアルタイムＬＵＸプライマーセットを用いて実施した。 紙支持体材料Ａに適用された試料由来のＲＮＡレベルを、マウスＲＮＡ基準試料による定量滴定曲線から求めた公知の値と比較することによって決定した。ＲＮＡの単離に関係するネズミＲＮＡ回収データを図６ｂに記載するが、このデータは、材料が多数の組織型由来のＲＮＡの保存及び安定化を支持できることを実証している。同様の観察が、支持体材料Ｂに保存されたＲＮＡに関しても明らかであった。

要約すれば、上記の実施例は、異なる構造の固体支持体から、表Ｉに記載の目的のＯＳＣＣバイオマーカーと同じ又は同様の生物学的構造を有する広範囲の被験物質を回収可能であることを実証している。

固体支持体回収器を備えた適切なスワブデバイスを、図７から１２を参照しながら、以下により詳細に記載する。

図７ａ及び７ｂは、それぞれ、スワブ１０の軸棒（ｓｐｉｎｅ）部材２０の平面図及び側面図を示す（組立て体を図１１ａに示す）。軸棒２０は、ハンドル部分２２及び末端パドル２４を備え、平面図ではパドル２４はハンドル部分２２より広いが、側面から見るとほぼ同じ幅である。軸棒部分は一体型として射出成形可能である。ハンドルに隣接するパドルの上の両側に、生体物質試料の収集用固体支持体を取り付けるための感圧性接着剤２６を配置する。この場合、２つのストリップ２６を用いた。ハンドル２２は、長さに沿っておよそ半分のところに図１１ａに示すカバー４０を取り付けるための突出構造２８を有する。

図７ｃ及び７ｄは、代替の軸棒部材２１のそれぞれ平面図及び側面図を示し、この軸棒２１はパドル２４に窓２３を有することを除いて、軸棒２０と同じ形状を有する。

図８ａは、唾液試料の収集に適切であり、図７ａ及び７ｂに示す（１以上の）接着ストリップを用いた、パドル２４への貼り付けに適切な、上記のタイプの固体支持体３０の平面図を示す。図８ｂは、図８ａに示すた線８ｂ−８ｂに沿った紙の断面を示し、図８ｃはこの固体支持体の側面図を示す。この場合、該固体支持体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ９０３の商標で販売されているタイプのセルロース紙シートであり、折り畳みその端を密閉されている。この紙は、脆弱線３４及び接着剤２６を用いてパドルに固定することを意図した末端領域３２を有する。末端領域３６は試料Ｓを収集するために使用する。

図９ａは、唾液試料の収集に適切であり、図７ａから７ｄに示す（１以上の）接着ストリップを用いた、パドル２４への貼り付けに適切な、上記のタイプの変形固体支持体３１の平面図を示す。図９ｂは、図９ａに示す線９ｂ−９ｂに沿った紙の断面を示し、図９ｃはこの固体支持体の側面図を示す。固体支持体は同じ折り畳んだセルロース紙シートである。この紙は、脆弱穴あき線３５及び接着剤２６を用いてパドルに固定することを意図した末端領域３３を有する。試料収集領域３７は、領域３６と同じ場所にある。この変形は、使用時につかむことができ、紙を裂くために引っ張り、使用時に試料領域３９を切り離すような、折り畳んだ時に紙の下にあるが、片側の端を超えて飛び出しているひも３９を備える。

図１０ａ及び１０ｂは、接着剤２６（この図では見えない）を用いて組立て、１つに貼り付けた軸棒２０及び固体支持体３１の平面図及び側面図を示す。固体支持体３０を有するアセンブリを例示しており、同じものである。

図１１ａ及び１１ｂは、図７ａに示す突出構造２８においてハンドル２２に取り付けられた、取り外し可能なカバー４０で覆われた、図１０ａ及び１０ｂに示すアセンブリの平面図及び側面図を示す。

使用時に、ハンドル２２を用いてスワブ１０をつかみ、操作する。カバーは取り外すことができ、固体支持体３０又は３１を使用に備えて・き出しにする。唾液試料を採取し（自己試料であってもよい）、試料の採取者がカバーを元に戻し、さらなる処理のために実験室に送付することができる。実験室において、固体支持体は残りの亜スワブパーツから取り外され、次いで、紙の部分を、例えばパンチを使用して、試験用に切り取ることができる。軸棒２１を使用する場合、その際は、窓２３を介してパンチなどを製造可能なので、軸棒から固体支持体を取り外さずに固体支持体の一部を切り取ることができる。

複数の試料を採取する場合、その際は、図１２ａ及び１２ｂに例示する乾燥ラック５０を使用することができ、この場合、複数のスワブ１０を、それらのカバー４０を取り外して、ハンドルを下にしてラックのウェル５２に置く。

各固体支持体３０／３１を、上記の技術のいずれか１つに従って、口腔癌活性を示す目的の２以上のバイオマーカーの存在に関してエクスビボで試験する。

多数の実施例、技術及び実施形態を上に記載したが、本明細書に説明した本発明の範囲から逸脱することなく、さらなる付加、変形及び省略が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、単純な９０３紙固体支持体３０／３１を記載したが、他の固体支持体も使用可能である。例えば、各々予備処理されているＷｈａｔｍａｎ ＦＴＡ又はＦＴＡ Ｅｌｕｔｅという商標で販売されている、保存用化学物質で処理されたろ紙が使用可能である。ＦＴＡは、弱塩基及びキレート化剤、尿酸又は尿酸塩並びにドデシル硫酸ナトリウム（ｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）（ＳＤＳ）及び／又はナトリウムラウリルサルコシネート（ＳＬＳ）などの陰イオン性界面活性剤を含む安定化試薬ミックスで予備処理されている。ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅは、チオシアン酸グアニジンの形態でカオトロピック塩を含む安定化試薬ミックスで予備処理されている。ＦＴＡ又はＦＴＡ Ｅｌｕｔｅを使用する場合、サンプリング（ｓａｐｌｉｎｇ）技術は、唾液試料を採取するステップ、その後、該試料を固体支持体へ移して、口腔と処理された固体支持体との間の直接接触を回避するステップを伴ってよい。安定化剤を使用する場合、検出ステップにおけるシクロデキストリンの添加が捕捉剤として作用し、それによって、直接ＰＣＲ、ｑＰＣＲ及び他の核酸増幅技術の効率が改善することが見出されてきた。

セルロース紙から形成された固体支持体が好ましいが、他の固体支持体を用いることもでき、例えば：人工又は天然に存在するポリマー繊維を含む製織又は不織繊維材料、ガラス繊維材料などの鉱物繊維、表面処理固体材料、例えば、レーザーエッチング表面を含む、すべてが、主にＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質分子を保持するための十分な粗さの表面のミクロ粗さを備えた化学的又は機械的に処理された材料を用いることができる。この記載は固体支持体について言及しているが、この用語は、アルギン酸塩などの、唾液試料を受容する十分な強度を有する、ゲル形態の柔軟な支持体も包含することを意図している。

Claims (15)

1. ヒト口腔に口腔癌活性が存在するときにヒト口腔内に存在する生体物質中の複数のバイオマーカーを検出するためのエクスビボ方法であって、
   ｉ）口腔由来の生体物質の試料を受容するための固体支持体を用意するステップと、
   ｉｉ）生体物質の試料を固体支持体に付着させるステップと、
   ｉｉｉ）複数のエクスビボアッセイを実施して、固体支持体に付着させた生体物質中の複数のバイオマーカーの存在を検出するステップと
   を含む方法。
2. 複数のバイオマーカーの１種以上を定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. バイオマーカーが、本明細書の表Ｉに列挙した候補からの複数選択である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 複数選択が、１種以上の核酸及び／又は１種以上のタンパク質及び／又は１種以上の酵素、又は口腔癌活性を示す他の被験物質の形態である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. １以上のアッセイが、ＲＴ−ＰＣＲを使用する遺伝子発現又はタンパク質発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、等温増幅法、免疫学的ＰＣＲ、マイクロアレイアッセイ、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、免疫学的技術、ゲル電気泳動（２ＤＥ）、キャピラリー電気泳動（ＴＯＦ ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、炎光光度法、原子吸光、分光光度法及び可視分光測光からなる群から選択される１以上のアッセイを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. アッセイが、例えばパンチを使用して固体支持体の一部を切り取るステップを含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 固体支持体が、セルロース系紙、人工又は天然に存在するポリマー繊維を含む製織又は不織繊維材料、ガラス繊維材料などの鉱物繊維系材料、又は表面処理固体材料、例えば、レーザーエッチング表面を含む、すべてが、主にＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質分子を保持するための十分な粗さのミクロ粗さの表面を備えた化学的又は機械的に処理された材料、又はアルギン酸塩などのゲルを含み、これらすべてが場合により安定化試薬又は試薬ミックスで化学的に処理されている、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 試薬又は試薬ミックスが、弱塩基及びキレート化剤、場合により尿酸又は尿酸塩並びに場合により陰イオン性界面活性剤を含むか、又はカオトロピック塩、例えばチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック物質を含む、請求項７に記載の方法。
9. 固体支持体が化学的に処理され、請求項１のステップｉｉ）が、口腔から生体物質試料を採取するステップと、化学的に処理された固体支持体が口腔と接触せずに、試料を化学的に処理された固体支持体に移すステップを含む、請求項７又は請求項８に記載の方法。
10. 請求項１のステップｉｉｉ）がシクロデキストリンの存在下で実施される、請求項９に記載の方法。
11. ハンドル部分及びハンドルの一方の末端に固体支持体を保持するためのパドル部分を備える軸棒を備えた、固体支持体を取り付けるためのスワブを用意するステップとをさらに含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ヒト口腔から試料を採取し、口腔において口腔癌活性を示す複数のバイオマーカーを保持するために適切であり、ハンドル部分及びハンドルの一方の末端に、パドルの両側の周りに形成される１枚の材料の形態で固体支持体を保持するためのパドル部分を備える、生体試料スワブ。
13. 固体支持体が、パドルから取り外し可能であり、場合により、固体支持体の中又は下に形成され、固体支持体の少なくとも一部の取り外しを可能にする引き裂きひも（３９）をさらに備える、請求項１２に記載の試料スワブ。
14. 図面を参照しながら本明細書に実質的に記載したスワブ又は本明細書に実質的に記載した方法。
15. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の方法に使用する試料スワブ。