ES2950581T3 - Procedimiento para enriquecer ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para inmovilizar las células nucleadas propias del cuerpo y/o nucleoproteínas/nucleopéptidos, ácidos nucleicos, células nucleadas, bacterias y virus de fluidos y tejidos corporales, que comprende un soporte de muestra que es adhesivo para células nucleadas endógenas específicas y/o nucleoproteína/nucleopéptidos, ácidos nucleicos y un kit que comprende dicho portador de muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para enriquecer ácidos nucleicos

La invención se refiere a un procedimiento para enriquecer ácidos nucleicos.

El análisis de células que se encuentran en términos fisiológicos o fisiopatológicos en fluidos corporales generalmente requiere el enriquecimiento o purificación de estas células o sus componentes antes del análisis. Las matrices de muestra más importantes para los análisis son sangre, materiales de frotis, líquido y orina, que a menudo, por ejemplo, en el contexto de diagnósticos médicos, deben examinarse en busca de marcadores citológicos, inmunológicos o biológicos moleculares o patógenos de enfermedades infecciosas. Se han desarrollado varios procedimientos para extraer selectivamente poblaciones individuales de células sanguíneas tales como eritrocitos o leucocitos o ácidos nucleicos. Los primeros procedimientos utilizados para esto fueron, por ejemplo, las técnicas de sedimentación de leucocitos (García A, Niubo J, Benitez MA, Viquera M, Pérez JL. Comparison of two leukozyte extraction methods for zytomegalovirus antigenemia assay. J Clin Microbiol 1996, 182-184) o técnicas de lisis en las que, por ejemplo, se destruyen los eritrocitos para separarlos de los leucocitos.

La lisis también puede liberar el ARN de los leucocitos añadiendo agua y dietilpirocarbonato (Shi YJ, Liu, JZ. Direct reverse trancription-polymerase chain reaction from whole blood without RNA extraction. Genet Anal Tech Appl 1992, 9, 149-150). Otro ejemplo para el enriquecimiento o disminución de concentración de los leucocitos de la sangre es el uso de gránulos Dynabeads, que portan un anticuerpo anti-CD45 en la superficie. Asimismo, se puede realizar el enriquecimiento mediante procedimientos microfluídicos mediante marginación en capilares finos (Shevkoplyas SS, Yoshida T. Bitensky W. Biomimetic autoseparation of leukocytes from whole blood in microfluidic device. Anal Chem 2005, 77, 933-937; Choi J, Hyun J, Yang S. On-chip extraction of intracellular molecules in white blood cells from whole blood. Informes científicos 2015, 5, número de artículo: 15167) o también en el separador de células (FACS).

Una alternativa es la disolución completa de las células a analizar para enriquecer y/o purificar componentes moleculares como ácidos nucleicos o proteínas de suero, células o virus (Thatcher SA. DNA/RNA Preparation for Molecular Detection. Clinical Chemistry 2015. 61:189-199. Tan SC, Yiap BC. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. J Biomed Biotechnol, 2009, artículo ID 574398).

La limpieza debería contribuir a que los componentes que interfieren no afecten negativamente los análisis posteriores de las biomoléculas aisladas. Un componente que interfiere puede ser, por ejemplo, la inmunoglobulina G, que es un importante inhibidor de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del suero (Abu Al-Soud W, Jonsson LJ, Radstrom P. Identification and characterization fo immunglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR. J Clinical Microbiol 2000, 38, 345-350).

Otros factores que interfieren en la detección molecular pueden ser la hemoglobina y la lactoferina de eritrocitos o leucocitos. Estos provocan, entre otras cosas, una inhibición de la PCR debida al hierro, que contienen ambas proteínas, pero también a los productos de degradación del hemo (Abu-Al-Soud, Radstrom P. Purification and characterization of PCR-Inhibitory components in blood. J clin Micorbiol 2001, 39, 485-493). El uso de equipos de purificación de ácidos nucleicos antes de la realización de la mayoría de las pruebas de diagnóstico molecular es una práctica actual. Sin embargo, el costo de los reactivos para estos equipos, así como el costo de la realización de la purificación del ácido nucleico, es una parte significativa del costo total de cualquier análisis molecular.

El esfuerzo manual podría reducirse en gran medida mediante la automatización de la purificación de ácidos nucleicos, pero los costos más altos de los reactivos y los costos de la tecnología de automatización compensan parcialmente esta ventaja. El uso directo de sangre en el equipo de PCR directo mediante sangre utilizando polimerasas y tampones especialmente formulados (Zhang Z, Kermekchiev MB, Barnes WM. Direct DNA amplification from Crude clinical samples using PCR enhancer cocktail and novel mutants of Tac. J Mol Diagn 2010, 12, 152-161) representa una opción lógica de minimizar estos costos, pero aún no se ha impuesto para aplicaciones de diagnóstico. Como potenciador para mejorar la eficiencia de la PCR, Zhang et al. utilizaron nonidet, trehalosa y carnitina y también Omni Klentaq u Omni Taq, lo que limita significativamente la flexibilidad de los protocolos de PCR directa al elegir las condiciones de reacción durante el desarrollo de la prueba y no conduce al éxito para todos los inhibidores y dianas. Otra desventaja de la PCR directa con sangre es la dificultad de liberar los ácidos nucleicos diana para la PCR de las células sanguíneas.

En el caso más simple, la sangre se congela y descongela para la lisis de los leucocitos aislados, lo que aumenta el rendimiento de ácido nucleico para la PCR. A veces es necesario eliminar la sangre precipitada mediante centrifugación (Burkhardt J. Amplification of DNA from full blood. PCR Methods y Applications 1994, 3, 239-243). Si se lisan los eritrocitos, después de varias etapas de lavado de los leucocitos restantes, la PCR en tiempo real también es posible en el marco de los análisis genéticos moleculares (Martiniez-Serra JM, Robles J, Besalduch J. Fluorescence resonance energy transfer-based real-time polymerase chain reaction method without DNA extraction of F5, F2, F12, MTHFR and HFE. J Blood Med 2014, 5, 99-106). Asimismo, las manchas secas de la capa leucocitaria se pueden utilizar directamente en la PCR en tiempo real (de Gasperis MR, Caione MD, Concato C, Fiscarelli E, di Pietro N, Salotti V, Putignani L, Menichella D, Callea F. Quantitative recovery of proviral HIV-1 DNA from leukocyctes by dried buffy coat spot method for realtime PCR determination. J Virol Meth. 2010, 170, 121-127). Sin embargo, la producción de las manchas y el punzonado de las manchas de la matriz significan un esfuerzo manual considerable para el usuario, en particular en el caso de grandes series de muestras.

Además del análisis de células aisladas de fluidos corporales como la sangre en la PCR, también es posible examinar células aisladas citológicamente, por ejemplo, después de hibridación fluorescente in situ, o mediante inmunocitoquímica. Con estos métodos, por ejemplo, la expresión de genes a nivel de ARNm y proteína, se pueden examinar roturas o mutaciones de doble cadena de ADN. Una aplicación diagnóstica es, por ejemplo, las pruebas de transformación de linfocitos para medir la actividad de los linfocitos después de la estimulación con antígeno. En todos los casos, los pasos de preparación necesarios implican un importante gasto de tiempo, material y trabajo, lo que merma la rentabilidad de los análisis posteriores.

Los procedimientos a modo de ejemplo de la técnica anterior para enriquecer ácidos nucleicos se describen en los documentos EP 1167518 A1, WO 2014/186607 A1, DE 10236 101 A1 y DE 2552510 A1.

Las desventajas de la técnica anterior enumeradas anteriormente son los costos adicionales de material para la preparación de muestras y los pasos de preparación manuales complejos, como la centrifugación en gradientes de densidad usando centrífugas o consumibles costosos en procedimientos automatizados para la purificación de ácidos nucleicos. Antes del análisis, las biomoléculas purificadas deben transferirse desde los recipientes en los que se realizó la extracción a los recipientes de reacción, lo que requiere adicionalmente una logística para la transferencia y, dado el caso, el almacenamiento.

La invención se basa ahora en el objetivo de evitar o al menos reducir los problemas de la técnica anterior. En particular, cuando se preparan muestras para llevar a cabo una PCR, la implementación debe limitarse a unos pocos pasos de trabajo sencillos, no se deben usar reactivos tóxicos para, por ejemplo, la lisis celular o los pasos de lavado y se deben garantizar bajos costos de material para los recipientes de reacción y los consumibles. Los pasos de procedimiento y, en particular, todo el procedimiento debe ser lo más tolerantes posible con respecto a las fluctuaciones de los parámetros y las influencias externas, de modo que el gasto necesario en términos de aparatos sea limitado. También es deseable poder eliminar por lavado los componentes perturbadores de la matriz de la muestra de la forma más sencilla posible en la medida necesaria para el respectivo análisis posterior.

Este objetivo se logra mediante un procedimiento con las características de las reivindicaciones independientes.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento de ácidos nucleicos a partir de una muestra que contiene ácidos nucleicos, en donde la muestra comprende un líquido o tejido que puede ser extraído directamente del organismo, o se compone de uno de estos, en donde el procedimiento comprende las siguientes etapas en el orden indicado:

i) poner en contacto la muestra con una proteinasa a un valor de pH de al menos 8 y excluyendo sales caotrópicas y detergentes;

ii) iniciar la unión de los ácidos nucleicos de la muestra en una superficie de un portamuestras ajustando el valor de pH a un valor inferior a 8; y a continuación

iii) lavar el portamuestras;

iv) secar el portamuestras con la muestra unida; y

v) realizar una PCR en el mismo portamuestras, en particular una reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real;

en donde la superficie del portamuestras se pone en contacto con la muestra antes o después del paso i) y en donde el portamuestras comprende o se compone de una poliolefina, seleccionada en particular del grupo polietileno, polipropileno, policarbonato, polibutileno y/o sus copolímeros.

Sorprendentemente, se ha demostrado que la superficie de un portamuestras convencional es adhesiva con respecto a las sustancias relevantes y esta adhesividad se puede utilizar mediante el presente procedimiento para inmovilizar las sustancias.

Además, se ha demostrado que esta adhesión de las moléculas se produce en un número mensurable cuando se lleva a cabo un paso de lisis, en particular si la lisis se lleva a cabo con una proteinasa. Sin embargo, no es necesario el uso de sales caotrópicas y reactivos que comprenden detergentes comúnmente utilizados. Estos incluyen, en particular, alcoholes, cloruro de gudinio y urea en una concentración eficaz. Por "eficaz" se entiende una concentración superior a la naturalmente presente en la orina, con respecto a la urea y preferentemente en una concentración de 4­ 8 M, y con respecto a Tween y Triton una concentración superior al 0,01% en peso ya que, en el caso de la última, el procedimiento suministra peores rendimientos sucesivamente medibles por cada 0,01%. La adición de detergentes es ventajosa para lisar muestras que son difíciles de lisar en condiciones estándar, como se describe en los ejemplos. La lisis significa la liberación de ácidos nucleicos o complejos de nucleopéptidos en una forma que se une al soporte y la provisión simultánea de las condiciones de unión o las condiciones de unión después de la adición del reactivo de unión a la muestra lisada para la unión al soporte.

Además, los productos de dichos reactivos no son compatibles con PCR y afectarían negativamente los resultados analíticos en concentraciones superiores a las mencionadas. Por lo tanto, es esencial para la invención que preferentemente no se usen sales caotrópicas cuando se lleva a cabo una lisis en el paso i).

Sorprendentemente, se ha demostrado que la limpieza de la muestra o el aislamiento de los ácidos nucleicos después del uso del paso de lisis conduce a una mejora en los resultados. Se supone que los fragmentos formados durante la lisis con una proteinasa forman complejos con los ácidos nucleicos (en lo sucesivo, complejos peptídicos de ácidos nucleicos), que promueven la adhesión a la superficie de la muestra. Otra posible explicación es que los fragmentos celulares, es decir, los péptidos, actúen como moléculas de captura y sean, por así decirlo, promotores de la adhesión entre la superficie y la molécula diana.

El uso de péptidos como moléculas de captura es particularmente preferido para la inmovilización de ácidos nucleicos. Estos péptidos se pueden producir a partir de proteínas o mezclas de proteínas en la síntesis de péptidos definida o mediante proteólisis. Las proteínas de la matriz de la muestra después de la digestión con una proteasa como, por ejemplo, la proteinasa K son particularmente efectivas con respecto a la cantidad de ácidos nucleicos enriquecidos y la disponibilidad. En las mezclas de péptidos complejos los péptidos facilitan la unión entre la superficie del soporte y los ácidos nucleicos de manera que mediante la diversidad fisioquímica del cóctel de péptidos resultante de la digestión de proteínas pueden emplearse una pluralidad de materiales de soporte económicos con diferentes propiedades superficiales de idoneidad comparable. Se obtuvieron efectos de enriquecimiento similares para el ADN genómico usando placas PCR de polipropileno estándar o también usando placas Nucleolink PCR de policarbonato modificado con amino. Como resultado, el sistema de enriquecimiento logra un alto nivel de flexibilidad en términos de adaptación a una amplia variedad de procedimientos de análisis. También es posible inmovilizar moléculas de captura específicas como lectinas, histonas, anticuerpos, oligonucleótidos o péptidos en la superficie del soporte.

La invención también se basa en el conocimiento de que la adhesividad de la superficie del portamuestras puede iniciarse o mejorarse mediante un tampón de unión. Este tampón de unión se utiliza en forma de tampón de pH, en donde una reducción del valor de pH de la muestra mejora la adhesión a la superficie del portamuestras.

Por consiguiente, la adhesividad de la superficie del portamuestras se inicia mediante la formación de péptidos de ácido nucleico a partir de ácidos nucleicos y fragmentos de proteínas en el paso i) y/o la reducción del valor de pH en el paso ii). Los dos efectos se refuerzan mutuamente, de modo que una combinación de ambos pasos produce rendimientos de inmovilización particularmente buenos.

En el presente caso, por adhesivo se entiende una superficie configurada para unirse a eucitos, es decir, células nucleadas, complejos nucleoproteicos, complejos de nucleopéptidos y/o ácidos nucleicos, de modo que las células o moléculas se adhieren a la superficie de manera alineada o aleatoria y, en particular en los procesos de lavado, no se eliminan de la superficie por lavado o como mucho parcialmente, tanto en términos de número como de fracciones de células. Dicho enlace puede ser, por ejemplo, covalente como, por ejemplo, puentes de azufre. Alternativamente, la unión es más una cuestión de interacciones de coordinación tales como fuerzas de van der Waals, interacciones hidrofóbicas, atracción electrostática o coordinación de ligandos. Además, se prefiere que las interacciones de coordinación sean interacciones electrostáticas o polares suficientemente fuertes.

En el presente caso, por ácidos nucleicos debe entenderse ARN, ARNm, miARN, ARNt, así como ADN genómico. Además, por complejos nucleoproteicos deben entenderse proteínas no degradadas en forma nativa y desnaturalizada con y sin modificación postraduccional que están complejados con ácidos nucleicos. Los complejos de nucleopéptidos, por el contrario, se entienden como dipéptidos a polipéptidos, con y sin modificación postraduccional como, por ejemplo, glicosilación, citrulinación, fosforilación, que se producen parcial o completamente complejados con el ADN proteolíticamente a partir de tejido, suero o sangre, a partir de la autolisis de proteasas o a partir de síntesis peptídica.

El ADN: por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, productos de amplificación, ADN que circula libremente en suero, plasma o sangre, ADN modificado epigenéticamente, ADN metilado, ADN mitocondrial.

En un iii-ésimo paso, la superficie se separa del líquido sobrenadante y la superficie del portamuestras se lava, quedando en la superficie las células nucleadas, los complejos de nucleoproteínas, los complejos de nucleopéptidos y/o los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. A la preparación de la muestra que comprende los pasos i a iii le sigue un paso de análisis que tiene lugar en particular en la fase líquida sobre la superficie del portamuestras. De acuerdo con la invención, la fase líquida también incluye moléculas que están inmovilizadas con partes de la molécula sobre el soporte y con otras partes que sobresalen en el medio de reacción circundante.

La ventaja del procedimiento de acuerdo con la invención en comparación con los métodos convencionales es que se utiliza una adhesividad inherente de la superficie de la muestra para inmovilizar células específicas y se mantiene durante el procedimiento. Esto elimina la necesidad de utilizar moléculas de captura adicionales. Además, se ha demostrado que el procedimiento de acuerdo con la invención solo requiere posiblemente la adición de un anticoagulante, incluso cuando se usa material de muestra no purificado, es decir, por ejemplo, fluido corporal extraído directamente, para obtener resultados de análisis significativos e informativos.

Además, el portamuestras es al mismo tiempo el recipiente de reacción para el análisis subsiguiente de las células o de los componentes de estas células. Por lo tanto, no es necesario proporcionar recipientes adicionales para la preparación de muestras ni transferir las muestras preparadas al recipiente de reacción. Sin embargo, también es posible separar las células/ácidos nucleicos/complejos peptídicos de ácidos nucleicos inmovilizados del portamuestras y transferirlos a otro recipiente de análisis antes del análisis así como, en particular al dividir las muestras para varios análisis, distribuirlos en varios recipientes de reacción. Los recipientes de reacción comprenden formatos estándar en diagnósticos de laboratorio. Por un lado, estos encajan en la mayoría de los aparatos de análisis para una amplia variedad de análisis y pueden procesarse automáticamente por los sistemas estándar de manipulación de líquidos. En esto se basa una ventaja adicional del procedimiento de acuerdo con la invención que consiste en el hecho de que mediante la unión de células de mezclas complejas como fluidos corporales, las células o los componentes celulares de la muestra pueden enriquecerse de manera específica utilizando exclusivamente unos pocos pasos de pipeteo. Ya no son necesarios otros pasos de trabajo como la producción de puntos y el troquelado de puntos, la centrifugación, la separación magnética o la transferencia de muestras entre diferentes recipientes. Todos los pasos de trabajo, el contacto del soporte con la muestra, la eliminación de la muestra, los pasos de lavado, dado el caso, la lisis de las células, así como la adición de los reactivos para el análisis, se pueden realizar exclusivamente mediante pipeteo y, por lo tanto, se pueden automatizar muy fácilmente. Esto se aplica en particular a las máquinas totalmente automáticas que realizan la preparación de muestras y el análisis posterior de manera integrada, pero también para laboratorios más pequeños y para análisis rápidos.

El portamuestras es preferentemente un recipiente de reacción como una placa de microtitulación, microplacas de análisis, cubreobjetos, portaobjetos, varillas de vidrio, vasos de precipitados, cavidades, sistemas microfluídicos o similares. Alternativamente, el portamuestras también puede tener la forma de una plaqueta, en particular incluir adicionalmente una realizada de manera más preferente como una malla o tamiz. Esta configuración aumenta la superficie funcional del portamuestras y, por lo tanto, el rendimiento, mientras que al mismo tiempo se puede reducir la duración del procedimiento ii). Este último es el caso en particular cuando la parte similar o tamiz del portamuestras se mueve a través del líquido o el líquido se mueve a través de la parte similar al tamiz o malla.

En una configuración preferida de la invención está previsto que el portamuestras comprenda o se componga de una poliolefina seleccionada del grupo polietileno, polipropileno, polibutileno y/o sus copolímeros. Dichos materiales se caracterizan ventajosamente por una superficie que interactúa de manera coordenada con células nucleadas, complejos nucleoproteícos, complejos de nucleopéptidos y/o ácidos nucleicos, de modo que un portamuestras que comprende estos materiales ya presenta una superficie que, al menos en pequeña medida actúan de forma adhesiva para células nucleadas, complejos nucleoproteícos, complejos de nucleopéptidos y/o ácidos nucleicos, en particular si se proporcionan las condiciones adecuadas para ello durante un paso de unión. Al mismo tiempo, el soporte debería diseñarse de tal manera que las moléculas de analito unidas no se eluyan durante el paso de lavado posterior. Sin embargo, preferentemente por el medio de reacción de la posterior reacción de detección. La naturaleza del soporte se diseña de manera particularmente preferida de manera que en el paso de unión se unen complejos nucleoproteicos y/o nucleopéptidos y durante un paso de elución a través del contacto con un reactivo de elución o con el reactivo de detección solo eluyen los ácidos nucleicos y no las proteínas o péptidos, lo que da como resultado ácidos nucleicos de mayor pureza. Sin embargo, si los péptidos unidos comprenden el analito, los ácidos nucleicos que interfieren pueden reducirse alternativamente de esta manera.

Como alternativa o adicionalmente, el portamuestras comprende preferentemente policarbonato, poliestireno, polimetacrilato, copolímeros, pero también vidrio, metal o cerámica. Además, el material del portamuestras está configurado ventajosamente en términos ópticos transparente, semitransparente o no transparente, blanco o negro u otro color. Se recomienda en particular material transparente si el análisis posterior debe evaluarse a través del soporte, p. ej. por microscopía inversa.

Se consigue una reducción de un efecto agresivo relacionado con la inmovilización o adsorción o el aumento del efecto adsorbente de la superficie sobre células nucleadas, complejos nucleoproteicos, complejos de nucleopéptidos y/o ácidos nucleicos, por ejemplo, por la presencia de grupos funcionales en la superficie en cuestión. Dichos grupos son en particular grupos carboxilo, hidroxilo, amino, sulfhidrilo, epoxi y aldehído. Dependiendo de la aplicación concreta, el experto en la materia conoce otras opciones para diseñar los grupos funcionales en la superficie del soporte. También es posible aplicar hidrogeles a la superficie de los soportes, por ejemplo, mediante ácido poliacrílico o polietilenglicol o por medio de química de clic, o mediante la introducción de masa de relleno funcionalizados o funcionalizables.

Las masas de relleno pueden ser masas de relleno de un solo componente o de varios componentes. El curado puede iniciarse mezclando los componentes antes de la introducción o mediante luz ultravioleta o efecto de la temperatura después de la introducción. La introducción de masas de relleno tiene la ventaja de que de esta manera se puede proporcionar fácilmente una funcionalización universal a una amplia variedad de materiales a partir de los cuales se pueden fabricar los recipientes de reacción. Las masas de relleno introducidas pueden introducirse como una película fina, como manchas o como relleno parcial del espacio de reacción. Las sustancias sin propiedades de fluorescencia intrínsecas disruptivas o solo bajas, como siliconas transparentes, resinas epoxi, metacrilatos o poliestireno, se utilizan preferentemente como masas de relleno. Estos pueden estar funcionalizados en sí mismos, pero también dopados con componentes, sustancias o partículas funcionalizados.

En otra forma de realización preferida de la invención está previsto que la muestra contenga sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, material de frotis o material de biopsia, esté compuesta por ellos o sea el producto de una preparación de los mismos, en particular como suero o plasma. Sorprendentemente, se ha demostrado que una purificación del fluido corporal o el aislamiento de los ácidos nucleicos, en particular utilizando el paso de lisis con un agente de lisis que contiene detergentes, conduce a un deterioro de los resultados. Se supone que los fragmentos formados durante la lisis con una proteinasa forman complejos con los ácidos nucleicos que promueven la adhesión a la superficie de la muestra, que se reduce con los detergentes. Por otro lado, los detergentes pueden mejorar el lavado de los inhibidores, por lo que la composición del reactivo de lisis y la solución de lavado deben adaptarse al tipo de muestra y al análisis planificado. La robustez y flexibilidad del procedimiento lo hace posible de una forma única y sencilla.

En un procedimiento particularmente preferido está previsto lisar las células específicamente inmovilizadas en el portamuestras o las células sanguíneas de los soportes cubiertos con sangre mediante la adición de un reactivo de lisis. Esto permite reducir la inhibición de las reacciones de detección aguas abajo, lo que se refleja en menos fallos en las determinaciones en una serie de muestras o en una menor dispersión de los resultados de medición en una serie de muestras. A este respecto la presencia de una proteasa tal como, por ejemplo, proteinasa K, proteasa de Rhizopus sp. o proteasa de Aspergillus melleus en el reactivo de lisis con una concentración de 0,01 a 50 U/10 μl de muestra/preparación de lisis si los ácidos nucleicos de la muestra deben enriquecerse en el portamuestras (figuras 3 y 5 y 6). Es especialmente ventajosa la proteinasa K en una concentración de 0,1 U-5 U / 10 μl de muestra/preparación de lisis. La proteólisis parcial de los componentes de la muestra y/o la adición de proteínas o péptidos a la muestra da como resultado complejos de nucleopéptido o nucleoproteína, que se concentran de forma especialmente eficaz en los pasos posteriores (Figuras 5 y 6). Por consiguiente se prefiere que la proteinasa del paso (i) se seleccione de la proteinasa K, proteasa de Rhizopus sp. y/o proteasa de Aspergillus melleus en el reactivo de lisis, preferentemente con una concentración en el intervalo de 0,01 a 50 U/10 μl de muestra/preparación de lisis. Estos mostraron rendimientos de inmovilización particularmente buenos.

El valor de pH en el paso (i) se ajusta a un valor de al menos 8, preferentemente de al menos 9. Esto respalda la lisis. Para ajustar el valor de pH, se emplea preferentemente NaOH, en particular 0,01-100 mM de NaOH, carbonato o tris y de manera particularmente preferente 0,05 mM de Tris-HCl, ya que estos también pueden permanecer en la solución en los pasos posteriores sin interferir en ninguno de los pasos secundarios. En particular, son compatibles con PCR.

El reactivo de lisis es ventajosamente hipotónico, ya que esto facilita la lisis de las células nucleadas de la muestra, como, por ejemplo, los leucocitos, y las sales tampón son menos disruptivas en los pasos posteriores del procedimiento que en concentraciones más altas. El paso de lisis se lleva a cabo entre 10 y 80 °C, preferentemente entre 25 y 65 °C y más preferentemente entre 35 y 55 °C. La duración de los pasos de lisis se sitúa entre 1 segundo y 4 horas, pero preferentemente entre 1 minuto y 1 hora, de forma especialmente preferente 5 minutos. Mediante este paso de lisis el procedimiento también puede aplicarse en otras células como eucitos como, por ejemplo, hongos y bacterias o componentes de muestra no celulares como virus o priones, algunos de los cuales son mucho más difíciles de lisar que los eucitos.

El paso de lisis también puede degradarse proteolíticamente las moléculas de captura previamente inmovilizadas en la superficie del portamuestras, de manera que la capacidad de unión de la superficie del portamuestras mejora para el paso de unión posterior. Sin embargo, también se puede omitir un paso de unión subsiguiente, ya que las moléculas de analito ya se unen al soporte en el reactivo de lisis, lo que indica la solidez del procedimiento.

La unión de los complejos de nucleoproteína/nucleopéptido formados en la muestra antes, durante o después de la lisis (figuras 5 y 6) o de los ácidos nucleicos (figura 4) al portamuestras ya puede tener lugar durante la lisis en el reactivo de lisis o después. Sin embargo, se añade preferentemente un reactivo de unión al reactivo de lisis que, en la cantidad y concentración añadida, reduce el valor de pH de la solución de reacción hasta el rango ácido. Después de la adición del reactivo de unión, el valor de pH de la mezcla está entre 1 y 10, preferiblemente entre pH 2 y pH 5 y de manera especialmente preferente entre 2,5 y 3 y contiene preferentemente 0,01-50 mM de HCl, citrato y/o de manera especialmente preferente fosfato. La molaridad del reactivo de unión está entre 1 y 2000 mM, preferentemente entre 50 y 800 mM y de forma especialmente preferente 200 mM. Dependiendo de las propiedades de unión del portamuestras para proteínas o ácidos nucleicos bajo estas condiciones de unión, los complejos de nucleoproteína/nucleopéptido o ácidos nucleicos que van a analizarse se unen a la superficie del portamuestras. A este respecto, el rango ácido y la presencia de iones fosfato y/o iones citrato u otros iones permiten una densidad de carga particularmente alta con estos analitos, que se alcanza después de un breve tiempo de unión (figuras 11 y 12). El paso de unión se lleva a cabo entre 10 y 80 °C, preferentemente entre 25 y 65 °C y más preferentemente entre 35 y 55 °C. La duración del paso de unión es de 1 segundo a 10 horas, preferentemente entre 1 minuto y 1 hora y de manera especialmente preferente 5 minutos Como portamuestras son preferentemente microplacas de ensayo disponibles comercialmente o recipientes de reacción para llevar a cabo PCR o PCR en tiempo real con superficie hidrófoba, cargada positiva o negativamente (figuras 7-10).

Al centrifugar la mezcla después de agregar el reactivo de unión, es posible sedimentar y unir agregados más grandes de complejos de nucleoproteína/nucleopéptido o ácidos nucleicos a la superficie del portamuestras. La fuerza centrífuga que va a utilizarse se sitúa preferentemente entre 1000 y 30000 g.

En otras palabras, en una configuración preferida de la invención, en el paso (ii) el valor de pH se reduce a un valor por debajo de 6, en particular a un valor por debajo de 5, preferentemente a un valor por debajo de 3, mediante la adición de un reactivo de unión. El tampón HCl y/o fosfato, el tampón fosfato/citrato y el tampón citrato con o sin la adición de otras sales como, por ejemplo, NaCl, MgCh o CaCh han demostrado ser reactivos de unión especialmente adecuados para el procedimiento de acuerdo con la invención.

Al llevar a cabo el paso i), esto significa que el valor de pH se puede "cambiar", por así decirlo. Dado que, en particular con los reactivos preferidos, no se forman subproductos que interfieran, únicamente se debe eliminar la solución sobrenadante mediante la eliminación de la solución y un paso de lavado para preparar el análisis. A este respecto, se usa preferentemente agua para el lavado y en particular ningún detergente como alcohol o similares, que separarían los ácidos nucleicos y los complejos de ácidos nucleicos y péptidos unidos a la superficie.

Después de eliminar el reactivo de lisis, el reactivo de unión o la mezcla de reactivo de lisis y de unión del portamuestras, tienen lugar de ningún a varios, preferentemente 1-6 y de manera especialmente preferente 3 pasos de lavado. La duración de un paso de lavado es de 0-10 min y de manera particularmente preferible de 0 min, es decir, el soporte se humedece con la solución de lavado, que luego se elimina de nuevo inmediatamente. Los pasos de lavado se realizan preferentemente con agua, isopropanol o tampones ligeramente ácidos con y sin detergentes para evitar o provocar la separación de los analitos de la superficie del portamuestras. Puede ser deseable, después del lavado, separar los analitos de la forma más eficaz posible, preferentemente añadiendo un tampón ligeramente básico. Para ello, se utilizan preferiblemente soluciones de tris o tampones de tris-HCL que contienen detergentes apropiados que no interfieren en la posterior reacción de detección. La ventaja de separar los analitos del portamuestras es que los analitos de una muestra se pueden distribuir en varias reacciones de detección diferentes, lo que puede reducir en gran medida los costes del análisis previo por muestra en el caso de determinaciones múltiples. También se prefiere llevar a cabo la reacción de detección directamente en el portamuestras sin un paso de elución adicional.

Después de eliminar la solución de lavado, la superficie del soporte se seca preferentemente a una temperatura de -20 a 100 °C, preferentemente entre 70 y 95 °C y de manera especialmente preferente a 95 °C. Como resultado, no hay entrada de residuos líquidos en la mezcla de reacción del análisis posterior y del cambio asociado en la concentración de los componentes de la mezcla.

El procedimiento demuestra ser inesperadamente robusto, ya que incluso cuando se usa el reactivo de unión como reactivo de lisis o viceversa, los complejos de nucleoproteína/nucleopéptido o incluso los ácidos nucleicos se unen al soporte. Sin embargo, a este respecto la eficiencia de carga del soporte disminuye según la composición de los reactivos utilizados y las propiedades superficiales aplicadas del soporte.

En el presente caso, la etapa de análisis significa llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa como parte del procedimiento de acuerdo con la invención. Una reacción cualitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real, denominada PCR en tiempo real, se lleva a cabo de forma especialmente ventajosa después del procedimiento de acuerdo con la invención. La inmovilización de acuerdo con la invención de eucitos, ácidos nucleicos y sus complejos a partir de fluidos corporales ha tenido un éxito en particular en estos procedimientos posteriores.

En otra configuración preferida de la invención está previsto que la reacción en cadena de la polimerasa se lleve a cabo en una solución sobre el mismo portamuestras. Esto tiene la ventaja obvia de ahorrar material y costos, así como una ganancia en el rendimiento.

El portamuestras presenta de forma especialmente preferente otras moléculas de captura. Dependiendo de la meta del procedimiento, las otras moléculas de captura son células del mismo tipo específicamente o de otro tipo. Por un lado, se puede aumentar el rendimiento de las mismas células o, en particular cuando las moléculas de captura están dispuestas clasificadas por secciones y yuxtapuestas, se pueden inmovilizar varios tipos de células al mismo tiempo.

El rendimiento de células iguales puede aumentarse aún más añadiendo partículas funcionalizadas al líquido corporal antes o durante el paso ii). La funcionalización se logra en particular a este respecto mediante la disposición de moléculas de captura en la superficie de partícula. Las partículas son preferentemente de tamaño micro o nano, es decir, preferentemente tienen un diámetro de partícula en el rango de 0,5-20 μm (micropartículas) o más pequeño (nanopartículas).

También es posible diseñar la superficie de las micropartículas de manera que los complejos de nucleoproteína/péptido o ácidos nucleicos se unan a ella mediante la adición de reactivos de lisis y a continuación de unión de la manera descrita anteriormente para las microplacas de ensayo.

Las partículas pueden proporcionarse como partículas magnéticas, codificadas por fluorescencia, codificadas por tamaño o forma que tienen una funcionalización superficial a través de la cual se unen segundas moléculas de captura. Las segundas moléculas de captura pueden provenir de las mismas clases de moléculas que las primeras moléculas de captura, pero se caracterizan por la misma pero preferiblemente diferente especificidad de unión en relación con las células y los componentes de las células o las sustancias liberadas de las células.

Además, las partículas se añaden preferentemente a la muestra antes, durante o después de que la muestra se ponga en contacto con el soporte en el recipiente de reacción. Estos luego se unen a células, componentes celulares o sustancias liberadas por las células a través de segundas moléculas de captura. A continuación, las micropartículas entran en contacto con el soporte por sedimentación magnética, gravimétrica o por flujo de líquido en el recipiente de reacción, uniéndose al soporte directamente a través de las primeras moléculas de captura o indirectamente a través de las células, componentes o sustancias liberadas previamente unidas a las partículas. Esta configuración del procedimiento hace posible un enriquecimiento particularmente fuerte de células, componentes o sustancias liberadas en el portamuestras o hacerlos accesibles para el análisis subsiguiente. Este procedimiento se puede utilizar, por ejemplo, para analizar células tumorales circulantes en la sangre o para analizar células fetales de la sangre de la madre. Mediante el uso de partículas de poblaciones de partículas codificadas de forma diferente, es posible utilizar una segunda molécula de captura diferente con cada población de micropartículas para examinar las células, los componentes y las sustancias liberadas de las células en el análisis posterior en formato multiplex, por ejemplo, al crear hemogramas o detección de anticuerpos múltiple.

En resumen, las moléculas diana permanecen en la superficie del portamuestras incluso después del paso de lavado, de modo que el portamuestras se puede usar para el siguiente paso de análisis y no se produce ninguna transferencia costosa a otro portamuestras y con ello la reducción en el rendimiento asociada.

Por consiguiente, se prefiere especialmente que todas las etapas del procedimiento incluyan el uso solo de un portamuestras, en particular se lleva a cabo una PCR, en particular una reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real, en el mismo portamuestras.

Además, dependiendo del análisis posterior de las moléculas que van a inmovilizarse y de la naturaleza de la muestra original, se prefiere que el procedimiento comprenda pasos adicionales, en particular la incubación antes y/o después del paso (ii), el secado de la muestra unida después del paso (iii) y/o una elución del ADN unido, en particular después del paso (iii). Esto puede mejorar el rendimiento y la calidad del análisis en casos específicos, pero no es necesario, en particular para el análisis cualitativo.

A menos que se indique lo contrario en el caso individual, las diversas formas de realización de la invención mencionadas en esta solicitud se pueden combinar ventajosamente entre sí.

La invención se explica a continuación en ejemplos de realización por medio de los correspondientes dibujos. Muestran:

figura 1 una micrografía de fluorescencia de leucocitos inmovilizados según una configuración preferida del procedimiento de acuerdo con la invención,

figura 2 una comparación gráfica en forma de intensidades de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutación TaqMan después de la unión de células a un soporte (véase la figura 1) de una muestra de acuerdo con la invención,

figura 3 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutación TaqMan en función de la presencia de una proteasa durante la lisis de una muestra de acuerdo con la invención con una muestra con un reactivo de lisis sin proteasa,

figura 4 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutación TaqMan en función de la presencia de reactivo de lisis y de reactivo de unión durante la unión de una muestra de acuerdo con la invención con una muestra incubada únicamente con agua,

figura 5 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutaciones TaqMan en función de la presencia de suero humano y ADNg humano como muestra de acuerdo con la invención con una muestra que contiene únicamente ADNg humano,

La figura 6 muestra una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutación TaqMan en función de la presencia de albúmina sérica humana y ADNg humano como muestra de acuerdo con la invención con una muestra que contiene únicamente ADNg humano,

Figura 7-10 respectivamente una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR de una detección de mutación TaqMan dependiendo del uso de varios soportes disponibles comercialmente para el enriquecimiento de ácidos nucleicos a partir de una muestra de acuerdo con la invención. 7: Polipropileno transparente (Biozym, REF 712545), 8: Polipropileno esmerilado (Biozym, REF 712546), 9: Polipropileno blanco (Biozym, REF 712547), 10: Polipropileno blanco (Thermo Fischer, REF AB 1815100),

Figura 11 Representación de una separación electroforética en gel y tinción de fluorescencia de productos de amplificación (carriles 1-4) del análisis PCR de una muestra de acuerdo con la invención. La muestra se purificó mediante barras Nucleolink, en las que se llevó a cabo a continuación también el análisis PCR,

Figuras 12-13respectivamente una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención en función de la duración de los pasos de lisis y unión utilizando la detección de mutación TaqMan,

figura 14-15 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención de los medios de incubación utilizados durante el paso de unión utilizando la detección de mutación TaqMan,

figura 16: una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención utilizando detección de mutaciones de LoopTag de Attomol.

figura 17 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención utilizando la detección de mutaciones TaqMan, que comprende un gran exceso de ADNg humano al que se le añadieron diferentes cantidades de un plásmido como patrón interno antes de llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invención,

figura 18 una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención utilizando la detección de mutaciones TaqMan, repitiéndose varias veces el paso de unión al haberse trasferido la mezcla de muestra, reactivo de lisis y reactivo de unión a un nuevo recipiente de reacción como soporte después de 5 min.

La figura 1 muestra una micrografía de fluorescencia de leucocitos inmovilizados de sangre humana, que se unieron a un soporte de un pocillo de fondo plano (microplaca de ensayo) de acuerdo con la invención mediante las moléculas de captura histona y fitohemaglutinina-L y se marcaron con fitohemaglutinina-L-. Atto647N. La evaluación se llevó a cabo utilizando un microscopio de fluorescencia IX81 (Olympus).

La figura 2 muestra células que se inmovilizaron y lavaron en un tubo de PCR según la figura 1. A continuación, se detectó una mutación en una muestra mutante homocigótica utilizando un equipo comercial (Attomol-MTHFR 1298A>C Realtime TM, #1202) en combinación con el ciclador de PCR en tiempo real AriaMX (Agilent). 1-FAM: curso de señal de sonda específica natural; 2-HEX: curso de señal de la sonda específica de cada mutación.

Se demostró que después de una incubación de 0,5-20 minutos, en el caso de sangre como material de muestra, ya estaban unidos al soporte tantos leucocitos de la sangre que había casi una capa celular cerrada en su mayor parte (figura 1). La densidad celular se puede aumentar aún mediante agitación durante la incubación, pero esto no es necesario para la mayoría de los análisis de estas células. Si solo hay muy pocas células en el líquido corporal, por ejemplo, cuando las células tumorales circulantes se aíslan de la sangre, se usa agitación a intervalos de 30 segundos para poner en contacto más células tumorales con las moléculas de captura anticuerpos anti-EPCAM (EPCAM, molécula de adhesión celular epitelial) que se inmovilizaron previamente sobre el soporte. La duración de los intervalos y la intensidad de la agitación dependen de la aplicación respectiva.

Después de poner en contacto las moléculas de captura o la superficie del portamuestras con la muestra, lo que con respecto al tipo de la muestra empleada o análisis realizado posteriormente tiene una duración diferente y puede comprender una lisis y un paso de unión, la muestra se elimina preferentemente mediante un paso de pipeteo. Si para el análisis posterior fuera necesario reducir aún más los componentes de la muestra, se llevan a cabo pasos de lavado opcionales utilizando una o diferentes soluciones de lavado como, por ejemplo, agua. Por lo general, no es necesaria una agitación, ya que se puede lograr una mezcla completa del medio simplemente pipeteando la solución de lavado. La solución de lavado es preferentemente una solución de lavado isotónica de tampón con pH, protegiendo así a las células de daños innecesarios. Si las células en el contexto del análisis, p.ej., in vitro se cultivan o estimulan, el lavado cuidadoso es esencial. Por otro lado, también puede ser el objetivo lisar específicamente las células antes, durante o después del lavado. Esto puede tener lugar preferentemente añadiendo una solución hipotónica como agua destilada o soluciones alcalinas, ácidas, alcohólicas o hipertónicas y otros detergentes. Entre el último paso de lavado y la adición de la mezcla de reacción para la reacción de detección, es ventajoso secar los residuos líquidos de la solución de lavado o centrifugarlos fuera del recipiente de reacción. Esto intensificaría la lisis y evitaría falsificaciones perturbadoras del volumen de reacción, que finalmente pueden conducir a la dilución o inhibición de la mezcla de reacción. Un paso de lisis térmica es particularmente adecuado, de manera especialmente preferente después de la adición de la solución de reacción para el análisis posterior, por ejemplo, mediante PCR en tiempo real. Una ventaja particular de la lisis térmica es que no se transmiten reactivos de lisis a la solución de reacción. Además, las células y, por tanto, las condiciones naturales en las que se producen los analitos, se conservan hasta justo antes de la reacción, lo que reduce su exposición a las enzimas degradantes. Sin embargo, también es posible inmovilizar fragmentos de células o células muertas que hayan estado almacenadas durante mucho tiempo o, por ejemplo, que hayan sido congeladas o lisadas previamente. El procedimiento ha demostrado ser sorprendentemente robusto en lo que respecta al almacenamiento de muestras en el caso de la sangre, en la que los análisis correctos de los polimorfismos de genes humanos aún podrían llevarse a cabo después de 3 semanas de almacenamiento a 4 °C o después de la congelación a -20 °C (Fig. 2). Se prefiere particularmente lisar las células unidas al soporte por medio de uno o más pasos de lavado en una solución de lavado hipotónica para eliminar los inhibidores de la reacción de detección de las células. Los analitos de alto peso molecular, no solubles o aquellos unidos de otro modo dentro de la célula, permanecen preferentemente en las células lisadas para luego detectar los analitos en la reacción de detección. A este respecto es definitivamente ventajoso eliminar los analitos de las células después de los pasos de lavado para el análisis o separarlos del portamuestras.

Si las células van a alimentarse a un análisis microscópico, el procedimiento comprende el uso de recipientes de reacción con un fondo plano transparente, como portaobjetos o microplacas de ensayo. Para poder estabilizar las células para esta aplicación, se fijan preferentemente sobre el soporte mediante el uso de soluciones que contienen paraformaldehído, glutaraldehído o alcohol o mediante secado directamente en el recipiente de reacción después de su inmovilización. También se utiliza preferentemente un soporte plano si el análisis subsiguiente se va a realizar usando un biochip. Los biochips comprenden, por ejemplo, biomoléculas impresas en microplacas de ensayo o en portaobjetos de vidrio o en biosensores como sensores moleculares, pero también micropartículas codificadas por fluorescencia o codificadas de otro modo inmovilizadas en el soporte, en cuya superficie se han acoplado biomoléculas específicas de la población como sensores moleculares. Específico de la población significa que todas las micropartículas de una codificación portan los mismos sensores moleculares.

La figura 3 muestra una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR en función de la presencia de una proteasa durante la lisis de una muestra de acuerdo con la invención con una muestra con un reactivo de lisis sin proteasa.

Cuando se analizan muestras complejas como la sangre con EDTA, que se usa muy a menudo en el diagnóstico molecular, la adición de una proteasa al reactivo de lisis es muy ventajosa. Esto aumenta la sensibilidad del procedimiento, ya que las proteínas que interfieren se descomponen y los inhibidores de las reacciones de detección posteriores se reducen y los analitos se liberan mejor. Esto se manifiesta en valores de ct más pequeños y una reducción en la dispersión de los valores de ct o la dispersión y/o aumento de las intensidades de señal en ^p C^r en tiempo real. Además, el número de muestras fallidas durante la reacción de detección se puede reducir significativamente. Además, de este modo se pueden proporcionar más y mayores complejos de nucleoproteínanucleopéptido, lo que aumenta el rendimiento del procedimiento de acuerdo con la invención, con respecto a la cantidad de analito. Las proteínas o los péptidos en la preparación de reacción pueden entrecruzar moléculas de analito e inmovilizarse como agregados partículares o multimoleculares en la superficie del soporte en una densidad particularmente alta. Asimismo, las cargas negativas de los ácidos nucleicos se reducen por la agregación, lo que reduce su repulsión intermolecular y, por lo tanto, también aumenta inesperadamente la densidad de empaquetamiento en el soporte, más de lo que sería posible con el reactivo de unión solo sin péptidos o proteínas.

La figura 4 muestra una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR en función de la presencia de reactivo de lisis y de unión durante la unión de una muestra de acuerdo con la invención con una muestra incubada únicamente con agua.

La robustez del procedimiento con una mezcla de reactivo de lisis/unión que contiene proteasa también se refleja en el hecho de que, pueden procesarse muestras con complejos muy diferentes, aunque la eficacia del enriquecimiento de los ácidos nucleicos puede variar mucho. A este respecto, la presencia de suero o incluso solo de albúmina sérica u otras proteínas séricas, tales como fibrinógeno o inmunoglobulina en la muestra, es inesperadamente ventajosa para enriquecer más ADNg que en el caso de que la muestra contenga exclusivamente ADNg. Para lograr valores de ct comparables como se muestra en la figura 3, se deben usar cantidades de muestra de ADNg puro significativamente mayores que en comparación con la presencia de suero o proteínas séricas en el reactivo de lisis.

Las Figuras 7 a 10 muestran respectivamente una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR en función del uso de varios soportes comercialmente disponibles para el enriquecimiento de ácidos nucleicos a partir de una muestra de acuerdo con la invención. 7: Polipropileno transparente (Biozym, REF 712545), 8: Polipropileno esmerilado (Biozym, REF 712546), 9: Polipropileno blanco (Biozym, REF 712547), 10: Polipropileno blanco (Thermo Fischer, REF AB 1815100).

Como portadores del procedimiento, se pueden utilizar microplacas de ensayo comerciales de polipropileno inesperadamente robustas, en las que se enriquecen los ácidos nucleicos, preferentemente a partir de sangre, y a continuación se llevan a cabo análisis mediante PCR en tiempo real. Si bien la sensibilidad de los análisis apenas difiere entre los diferentes soportes, lo que se expresa en valores de ct en gran medida constantes, a veces hay fluctuaciones de señal considerables o relaciones señal/ruido. En cuanto al uso de placas de PCR comercialmente disponibles, tampoco es absolutamente necesario modificar la superficie de estos soportes mediante la inmovilización de moléculas de captura o de otra manera adecuada, lo que ayuda a evitar costes de producción adicionales.

Puede verse por la figura 11 que el procedimiento de acuerdo con la invención también puede realizarse utilizando soportes de policarbonato, inesperadamente para el experto en la materia, con una eficacia comparable a la utilización de soportes de polipropileno.

Aunque aumentar los tiempos de los pasos de lisis y unión aumenta la sensibilidad del procedimiento, lo que se refleja en valores de ct más bajos, los tiempos de incubación más cortos permiten una eficiencia de enriquecimiento sorprendentemente alta de ácidos nucleicos en el soporte, lo que para los análisis previos con un tiempo muy breve de unos pocos minutos permite sin embargo análisis posteriores seguros. Las figuras 12 y 13 muestran esto.

La figura 14 muestra una comparación gráfica en forma de intensidad de fluorescencia frente a ciclos de PCR del análisis de una muestra de acuerdo con la invención de los medios de incubación utilizados durante el paso de unión.

Mediante el uso específico de medios de incubación, que también pueden usarse sucesivamente mediante adición de medio de incubación A al medio de incubación B, es posible inmovilizar una muestra de acuerdo con la invención, como ADNg de sangre o ADNg purificado en la superficie de una microplaca de ensayo. Otros medios de incubación, como Aqua dest. y tris-HCL pH 9 (para ADNg) no son adecuados para esto. El Tris-HCL pH 9 solo es adecuado para el paso de unión de forma limitada si se utiliza sangre como muestra y, si en particular, adicionalmente contiene proteinasa K. Para el paso de unión se usa de manera particularmente preferida PBS con un pH ácido. En general, debido a la robustez inesperadamente alta del procedimiento, son posibles muchas variantes, de las cuales se selecciona y optimiza la variante preferida para la finalidad de uso.

La flexibilidad del procedimiento de acuerdo con la invención se refleja en la figura 15, según la cual el reactivo de unión que contiene citrato proporciona resultados comparables a los del reactivo de unión que contiene fosfato.

Puede verse en la figura 16 que el procedimiento de acuerdo con la invención proporciona ácidos nucleicos de alta calidad que también pueden analizarse usando procedimientos de detección sensibles tales como PCR en tiempo real y análisis de curvas de fusión usando LoopTag PCR. La calidad de las curvas de fusión y amplificación no difiere de las muestras que se procesaron con procedimientos estándar de extracción de ácidos nucleicos.

El procedimiento de acuerdo con la invención también permite la purificación de ADNg humano a partir de sangre a la que se han añadido 16, 1600 (datos no mostrados) o 160 copias de un plásmido (tamaño aproximado de 5000 pb) como patrón interno, como muestra la figura 17. Sorprendentemente, el patrón interno se puede detectar con una sensibilidad comparable después del enriquecimiento usando el procedimiento de acuerdo con la invención a cuando se pipetea directamente en la mezcla de PCR. La diferencia de sensibilidad es de 10 a 50 veces para el procedimiento de acuerdo con la invención. Sin embargo, la sensibilidad del procedimiento aún es suficiente para detectar el patrón interno en el rango de una sola molécula. Esto es particularmente relevante en la práctica porque muchos patógenos tienen genomas o plásmidos pequeños y, por lo general, deben detectarse con sensibilidad en un gran exceso de ADNg en la muestra, como pudo mostrarse en este caso para un plásmido utilizado como estándar interno de purificación. Incluso los fragmentos de ADN con una longitud de aproximadamente 100 pb pudieron enriquecerse y detectarse de manera comparable en un exceso correspondientemente grande de ADNg de la sangre (datos no mostrados). Esto significa que el procedimiento también es adecuado para el análisis de ADNg libre en suero humano, que está presente en forma muy fragmentada, por ejemplo, en el contexto del diagnóstico de tumores.

La Figura 18 muestra que el procedimiento presenta la ventaja inesperada de que ya en el primer paso de unión la mayor cantidad, es decir, aproximadamente 10-50 veces más del analito se une al soporte que, en comparación con pasos de unión adicionales con la misma mezcla de muestra, reactivo de lisis y de unión. Esto mantiene la pérdida de sensibilidad resultante para muchas aplicaciones, como la detección de patógenos o las pruebas genéticas, dentro de límites aceptables.

Ejemplos de realización:

Ejemplo comparativo 1: Detección de fluorescencia citoquímica de lectina

Preparación del portamuestras:

- irradiación con luz UV con un rango de longitud de onda de 200-400 nm

- pipeteo de solución de histona y fitohemaglutininina-L en tampón de fosfato en una microplaca de ensayo de poliestireno de fondo plano (Greiner)

- eliminación de la solución de los pocillos de la microplaca de ensayo

- secado de la microplaca de ensayo a temperatura ambiente

Inmovilización de leucocitos de la sangre:

- pipeteo de sangre en los tubos e incubación

- eliminación de la sangre mediante un paso de pipeteo

- triple lavado con tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene NaCl al 0,9 %

- eliminación de la solución de lavado

- adición e incubación de un conjugado de fitohemaglutinina-L y Atto647N

- triple lavado con tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene NaCl al 0,9 %

- evaluación de las células en el microscopio de fluorescencia (ver FIG. 1) o mediante PCR (ver ejemplo 2).

Ejemplo 2: PCR en tiempo real en células sometidas a lisis térmica

Preparación del portamuestras:

- pipeteo de solución de histona y fitohemaglutinina-L en tampón de fosfato en tubos PCR de polipropileno, - irradiación con luz UV con un rango de longitud de onda de 200-400 nm,

- eliminación de la solución de los tubos PCR,

- secado de los tubos PCR a temperatura ambiente,

Inmovilización de leucocitos de la sangre

- pipeteo de sangre en los tubos e incubación,

- eliminación de la sangre mediante un paso de pipeteo,

- adición de un tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contenga NaCl al 0,9% y lavado subsiguiente con él, - eliminación de la solución de lavado,

- adición de la mezcla PCR de acuerdo con Attomol MTH-FR 1298A>C Realtime TM, #1202,

- sellado de los tubos y transferencia al ciclador de PCR en tiempo real e inicio de la PCR en tiempo real (ver FIG.

2).

Ejemplo 3: PCR en tiempo real en ADN genómico (ADNg) de células sanguíneas después de la lisis por reactivo de lisis y unión del ADNg al soporte:

- adición de 10 μl de sangre humana EDTA al pocillo del soporte

- adición de 50 μl de reactivo de lisis (10 mM de tris-HCl, pH 9) y 1 U de proteinasa K,

- 5 min de incubación a 50 °C

- adición de 100 μl de tampón de unión (0,1 M de PBS, pH 2,5)

- 5 min de incubación a temperatura ambiente

- lavado triple con Aqua dest.

- eliminación de la solución de lavado,

- secado a 95 °C

- adición de la mezcla PCR de acuerdo con Attomol® Factor V Realtime TM (REF 1198),

- cierre de los tubos y transferencia al ciclador de PCR en tiempo real e inicio de la PCR en tiempo real (ver FIG.

15).

Ejemplo 4: PCR en tiempo real en células lisadas por NaOH y reactivo de lisis Tuberculosis micobacteriana:

- adición de 10 μl de esputo al soporte control de extracción (ver Attomol-Mycobacterium tuberculosis Realtime LT2, artículo #1190)

- adición de 5 μl de NaOH (5%) e incubación

- adición de 5 μl de HCL (5%)

- adición de 50 μl de reactivo de lisis, tris-HCl (5 mM, pH 9) y 1 U de proteinasa K

- incubación, 50 °C

- adición de 100 μl de reactivo de unión, tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 2,5)

- incubación

- eliminación de la sangre mediante un paso de pipeteo,

- lavado triple con Aqua dest.,

- eliminación de la solución de lavado,

- secado del soporte, a 95 °C

- adición de la mezcla de PCR de acuerdo con (Attomol-Mycobacterium tuberculosis Realtime LT2, artículo n.° 1190), - sellado de los tubos y transferencia al ciclador de PCR en tiempo real e inicio de la PCR en tiempo real (datos no mostrados).

Una ventaja particular del procedimiento consiste en que se puede realizar una variedad de análisis directamente en las células aisladas. Estos pueden ser análisis microscópicos para determinar la citología de las células. Es posible a este respecto investigar la expresión de determinados marcadores, por ejemplo, ARNm o de proteínas de células individuales o de todas las células usando hibridación in situ o inmunocitoquímica. Es posible determinar roturas de doble cadena de ADN en los leucocitos, por ejemplo, para poder evaluar la exposición del paciente a la radiación. También es posible unir células vivas intactas al soporte y analizarlas como parte de un cultivo in vitro o después de una estimulación dirigida. Ejemplos muy relevantes para la práctica son las pruebas de transformación de linfocitos o la determinación de la resistencia a fármacos de células tumorales y bacterias, que se unen al soporte desde el material de muestra respectivo como, por ejemplo, sangre, esputo o tejido tumoral. Por supuesto, también es posible disolver/separar las células antes, durante o después del análisis o de la unión de los analitos al portamuestras para hacer accesibles determinados analitos para el análisis o análisis posteriores. En análisis como PCR, PCR en tiempo real, PCR digital, los ácidos nucleicos que van a analizarse se hacen accesibles para la reacción, preferentemente por lisis térmica o lisis con un reactivo de lisis, de las células inmovilizadas inmediatamente al comienzo de la reacción y al mismo tiempo se inactivan las enzimas degradantes como las proteasas y las nucleasas. Esto sucede, p.ej., preferentemente durante la etapa inicial a 95 °C en la que las polimerasas de inicio en caliente se activan preferentemente al mismo tiempo o durante el secado de las placas después de la finalización de todas las etapas de lavado. Con la PCR in situ, en cambio, las células se estabilizan mediante fijación química para que los analitos puedan detectarse en las células y se retenga la información sobre la localización de los analitos. Además de estas opciones de aplicación diversas, el experto en la materia está naturalmente familiarizado con otras formas de realización de acuerdo con el estado de la técnica. La invención comprende el uso del procedimiento y del equipo para diagnósticos médicos y veterinarios y para bioanálisis forense y de ciencias biológicas.

En comparación con el estado de la técnica, la invención divulgada se caracteriza por consiguiente por las siguientes propiedades:

- se trata de un sistema de preparación de muestras técnicamente muy sencillo, que se traslada de la muestra al análisis con un solo tipo de proceso de trabajo, el pipeteo de analitos, es decir, células, componentes de células o sustancias liberadas por las células y puede combinarse con una etapa de lisis para ciertas aplicaciones.

- La etapa de lisis de acuerdo con la invención no requiere ninguna sustancia peligrosa o altas concentraciones de sales y detergentes que supongan una carga para el medio ambiente o el usuario.

- Mediante la adición de proteinasa K a la solución de muestra, se producen preferentemente fragmentos de proteína que en el paso de unión subsiguiente facilitan la unión del analito al soporte. Las matrices de muestras complejas garantizan a este respecto un cóctel diverso de diferentes péptidos que se unen a una amplia variedad de materiales de soporte, lo que conduce a un alto grado de flexibilidad a la hora de seleccionar el soporte más adecuado para el diseño de la prueba.

- Si es necesario, es posible con el procedimiento después del último paso de lavado, preferentemente con agua, eliminar todos los residuos de reactivos que interfieren en el análisis posterior o, dado el caso, separar los ácidos nucleicos unidos del soporte mediante incubación con un reactivo de elución ligeramente básico y distribuirlos a diferentes análisis. La desprotonación de los ácidos nucleicos que tiene lugar a este respecto da como resultado su repulsión electrostática de la superficie preferentemente hidrofóbica o cargada, en la que la mayoría de los péptidos permanecen unidos. Esto conduce a un desprendimiento del analito de los componentes de la muestra que puedan interferir y que quedan en el soporte.

- La preparación y el análisis de la muestra se realizan preferentemente en el mismo recipiente de reacción, lo que ahorra costes de material y pasos de trabajo. Esto se aplica en particular al uso de microplacas de prueba estándar para PCR, que son solo una fracción del costo de, por ejemplo, cartuchos de filtro para la purificación de ácidos nucleicos. Además, el procesamiento de series de muestras más grandes también es posible sin ningún problema, incluso cuando se trabaja manualmente con pipetas multicanal.

- La lisis o estabilización de las células para liberar o exponer los analitos se puede realizar de manera variable y adaptada al análisis particular.

- Los análisis citológicos pueden combinarse con análisis de PCR directa o sucesivamente.

- Mediante el uso de diferentes moléculas de captura o microplacas de ensayo con propiedades de unión intrínsecas para analitos y micropartículas, los analitos pueden alimentarse selectivamente en formato múltiple.

- La lisis térmica de las células durante el análisis ayuda a evitar procesos de degradación de la muestra que falsearían el resultado.

- El procedimiento divulgado permite la realización y combinación de diferentes procedimientos de análisis para un mismo o diferentes analitos de la muestra.

- Una gran ventaja del procedimiento es que incluso ácidos nucleicos comparativamente pequeños pueden enriquecerse con el procedimiento de acuerdo con la invención, incluso si tienen un gran exceso de ADNg. Este es el requisito previo para la detección de patógenos o para el análisis de biopsias líquidas, por ejemplo, para la detección de ADN tumoral o micro-ARN libremente circulante.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para el enriquecimiento de ácidos nucleicos a partir de una muestra que contiene ácidos nucleicos, en donde la muestra comprende o se compone de un líquido o de un tejido que pueden extraerse directamente del cuerpo, o es el producto de una preparación de este tipo, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos en el orden indicado:

i) poner en contacto la muestra con una proteinasa a un valor de pH de al menos 8 y excluyendo sales y detergentes caotrópicos;

ii) iniciar la unión de los ácidos nucleicos de la muestra en una superficie de un portamuestras ajustando el valor de pH a un valor inferior a 8; y a continuación

iii) lavar el portamuestras;

iv) secar el portamuestras con la muestra unida; y

v) realizar una PCR en el mismo portamuestras, en particular una reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real;

en donde la superficie del portamuestras se pone en contacto con la muestra antes o después del paso i); en donde el portamuestras comprende o se compone de una poliolefina, en particular que puede seleccionarse del grupo polietileno, polipropileno, policarbonato, polibutileno y/o sus copolímeros.

2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la muestra comprende o se compone de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, material de frotis o una muestra de biopsia, o es el producto de una preparación de los mismos, en particular como suero o plasma.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la proteinasa del paso (i) se selecciona de proteinasa K, proteasa de Rhizopus sp. y/o proteasa de Aspergillus melleus en el reactivo de lisis, preferentemente con una concentración en el intervalo de 0,01 a 50 U/10 μl de muestra/preparación de lisis.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el valor de pH en el paso (i) se ajusta a un valor de al menos 9.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en el paso (i) se degradan las proteínas presentes en la muestra.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en la etapa (ii) el valor de pH se reduce por debajo de 6, en particular a un valor por debajo de 5, preferentemente a un valor por debajo de 3, mediante la adición de un reactivo de unión.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que todos los pasos del procedimiento comprenden el uso de un solo portamuestras.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el lavado en el paso (iii) se realiza con agua.