CN117736257A - 一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用，所述富集方法包括：将蛋白样本与DTT、IAM混合孵育；将烷基化处理后的蛋白样本与磁珠混合孵育，进行磁分离后与酶混合，收集多肽样本；将多肽样本与SH2‑琼脂糖珠混合孵育，离心取上清，洗脱，脱盐，即得。本发明采用微量离心柱代替常规离心管进行微量样本pY富集，有效降低实验的复杂程度、缩短实验时间、有效富集pY多肽。

Description

一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用。

背景技术

生物体常见的蛋白质翻译后修饰有磷酸化、泛素化、糖基化等，其中蛋白质磷酸化因分布广泛，功能重要而被广泛研究。蛋白质磷酸化是通过特异性激酶的作用将腺嘌呤核苷三磷酸的磷酸基团转移到底物特定氨基酸残基上而实现。真核细胞的蛋白质磷酸化分为三种，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation，pY)。真核细胞中磷酸化的丝氨酸:苏氨酸:酪氨酸的相对丰度约为1000:100:1。尽管已知的磷酸化酪氨酸所占比例小，但其功能极为重要，任何底物蛋白酪氨酸磷酸化的失调或者酪氨酸激酶的失控都将带来人类的疾患，甚至决定细胞和个体的命运。例如癌症的演化、细胞间的信号传递都与酪氨酸磷酸化有着密不可分的关系。通过对鉴定的酪氨酸磷酸化位点数据进行深入的生物信息学分析，关联对应的酪氨酸激酶，可鉴定疾病发生发展过程失调的激酶通路及潜在的靶向调节药物，支撑基于蛋白质组学的精准治疗。

目前酪氨酸磷酸化多肽富集方案主要有抗体亲和富集、固相金属离子亲和层析(IMAC)、金属氧化物亲和层析(MOAC)和SH2超亲体(SH2 superbinder)富集等方法。对于抗体亲和富集，酪氨酸侧链上具有丝/苏氨酸侧链所没有的苯环，磷酸化酪氨酸的抗原决定簇比丝氨酸和苏氨酸的大，所以酪氨酸磷酸化抗体的特异性远强于其他两种氨基酸，因此抗体亲和富集在酪氨酸磷酸化蛋白质组研究中是一种非常经典的方法。根据酪氨酸磷酸化抗体亲和力特性的不同，可将蛋白质消化成肽段后进行酪氨酸磷酸化抗体亲和富集，或者用酪氨酸磷酸化抗体直接亲和富集酪氨酸磷酸化修饰的蛋白质。对于IMAC和MOAC富集，与丝氨酸和苏氨酸磷酸化相似，酪氨酸磷酸化肽段也可利用离子间相互作用进行固相金属离子亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)富集，或者通过金属氧化物与磷酸基团相互作用进行金属氧化物亲和层析(Metal oxide affinitychromatography，MOAC)富集。它们不同的填料会对不同的基团展现亲和性，进而表现出不同的基团偏好性。IMAC中的Fe³⁺、Ti⁴⁺等和MOAC中的TiO₂、ZrO₂等对磷酸基团表现出较好的偏好性。对于SH2超亲体(SH2 superbinder)富集，通过对SH2结构域进行选择性突变，导致对磷酸化酪氨酸多肽的捕获能力提升1000倍，并且具有特异性。

虽然目前已存在多种酪氨酸磷酸化多肽/蛋白富集方法，但仍存在着一些不足。如抗体亲和富集，由于特异性磷酸化酪氨酸抗体种类有限，且还存在部分酪氨酸磷酸化蛋白易丢失，重现性较差且成本高的局限性，导致该方法很难进行大规模的应用；IMAC和MOAC对磷酸化多肽富集没有特异性，即无偏的富集所有磷酸化多肽，由于酪氨酸磷酸化的发生频率比丝氨酸/苏氨酸磷酸化的发生频率低得多，在人类整个磷酸化蛋白质组中占比1％左右，故该方法对低丰度的酪氨酸磷酸化多肽不能很好的检出，即鉴定深度不够；SH2超亲体(SH2superbinder)富集，是目前酪氨酸磷酸化多肽富集效率更高且成本较低的一种富集方法，对常规水平多肽(≥200μg)进行pY富集是最优的选择，虽然也存在操作繁琐，离心时间长，且富集效率低的问题，而实际情况下，一些样本比较珍贵且样本量少，酶切得到的多肽量很少(＜50μg)，用常规方法富集会造成更多样本损失，且pY鉴定数量也不太理想，即该方法不适用于微量样本pY富集。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法，所述方法包括：

(1)还原烷基化：将蛋白样本与DTT、IAM混合孵育；

(2)SP3蛋白酶切：将烷基化处理后的蛋白样本与磁珠混合孵育，进行磁分离后与酶混合，收集多肽样本；

(3)富集：将多肽样本与SH2-琼脂糖珠混合孵育，离心取上清，洗脱，脱盐，即得。

本发明所述富集方法实现微量样本pY富集，简化常规SH2 superbinder富集技术的操作流程、缩短实验时间、提高pY鉴定量和富集效率。

优选地，步骤(3)所述多肽样本的体积为20-100μL，例如20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(3)所述孵育采用带有筛板的离心柱。

优选地，步骤(3)所述孵育中多肽样本与离心柱筛板不接触。

在富集中采用离心柱，可以通过离心将上清去除，减去手动去除上清的操作，缩短了实验时间。

优选地，所述筛板的孔径为25-35μm，例如25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(2)所述孵育的时间为55-65min，例如55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(2)所述酶包括胰酶。

优选地，步骤(3)所述洗脱前还包括清洗。

优选地，所述清洗包括采用高盐缓冲液和低盐缓冲液依次清洗。

优选地，所述高盐缓冲液包括Tris 45-55mM、NaCl 240-260mM。

所述Tris的摩尔浓度可以选择45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM等，NaCl的摩尔浓度可以选择240mM、242mM、244mM、246mM、248mM、250mM、252mM、254mM、256mM、258mM、260mM等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述地盐缓冲液包括NH₄HCO₃45-55 mM，例如45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述高盐缓冲液的pH为7.5-8.0，例如7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述离心的转速为800-1200g，时间为20-40s。

所述转速可以选择800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g等，所述时间可以选择20s、22s、24s、26s、28s、30s、32s、34s、36s、38s、40s等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法在酪氨酸磷酸化多肽富集中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

在基于SH2超亲体(SH2 superbinder)富集方法的基础上，结合微量离心柱的3点优势：1.柱体积小，在微量样本pY富集时不会因为反应体系小导致更多样本的挂壁损失；2.可通过直接离心去上清，减去手动去上清的复杂操作；3.离心较短时间(＜1min)就可以将上清完全去除(常规方法需要每次离心5min，且手动去上清去除不干净)；用微量离心柱代替常规离心管(1.5ml离心管或200μL PCR管)进行微量样本pY富集，进而有效降低实验的复杂程度、缩短实验时间、有效富集pY多肽，扩大SH2 superbinder富集技术的应用范围。

附图说明

图1是微量离心柱示意图。

图2是pY鉴定结果图。

图3是pY富集效率结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

K562-PV细胞进行微量pY富集

1、蛋白提取：将收集到的一盘15cm培养皿培养的K562细胞沉淀用300μL尿素裂解液进行蛋白裂解(裂解液：8M尿素，50mM Tris，1％Triton X-100，0.5％蛋白酶抑制剂，1％磷酸酶抑制剂，pH 7.4)，涡旋振荡至出现絮状物(核酸团块)，然后转至研磨管进行4℃研磨(研磨程序设置为“rotation：60s，hold：60s，6个cycle，6000rpm离心1min，4℃”)，最后15000g离心5min，转移上清至新管并记录体积，BCA方法对蛋白上清液进行蛋白定量，蛋白浓度为5.597μg/μL。

2、蛋白烷基化：

1)样本中加入5μL 1M DTT，混匀后室温静置孵育1h；2)样本中加入20μL1M IAM，混匀后室温避光静置孵育30min；3)样本中加入10ul 1M DTT，混匀后室温静置30min。

3、蛋白分装：

600μg/管进行分装，并记录对应体积。

4、SP3蛋白酶切

(1)制备SP3磁珠：将Sera-Mag SpeedBead羧基磁珠1(亲水，50μg/μL)和Sera-MagSpeedBead羧基磁珠2(疏水，50μg/μL)以1:1比例混合(在干净离心管内加入磁珠1时，管壁上划线)，轻微涡旋震荡30s混匀，瞬离，置于磁力架上2min，弃上清；(每管磁珠体积不超过1mL)；

(2)加入1mL超纯水，轻微涡旋震荡30s，置于磁力架上2min，弃上清，清洗三次。最后用超纯水配置成100μg/μL的磁珠储液(即重悬磁珠至划线位置)，4℃储存备用；

(3)将600μg蛋白样本体积用裂解液补齐到600μL，加入60μL制备好的100μg/μL的SP3磁珠混悬液(蛋白量/磁珠量＝1:10)，再加入660μL无水乙醇(使体系有机相为50％)，样本管放在混悬仪上室温混悬15min；

(4)孵育完成后，瞬离样本，将样本置于磁力架上静置2min，待溶液澄清以后用移液器转移上清至新管，标注为SP3 binding SQ，-80℃保存；加入1000μL80％乙醇，错孔吸附30s，置于磁力架上静置2min，弃上清，总计漂洗3次(最后一次清洗，加入500μL 80％乙醇，且将上清去除干净，室温或吹风干燥，使磁珠表面呈粗糙状无液体反光状态即可，同时避免过干出现裂纹状态)；

(5)加入300μL 50mM HEPES，金属浴上37℃1000rpm震荡，至磁珠散开为止；

(6)加入48μL胰酶储液(0.25μg/μL，蛋白量/Trypsin量＝50/1)，酶切12h；

(7)多肽收样：样本室温15000g离心5min，置于磁力架上静置2min，转移上清至新管，标记清楚并记录体积；

(8)BCA方法多肽定量：多肽定量浓度1.18μg/μL，10μg多肽体积为8μL，共需要8份(80μg)。

5、pY富集

(1)清洗SH2-琼脂糖珠：按每个样本需要15μL40％琼脂糖珠混悬液，共8个样本(共需要120μL)，取200μL40％琼脂糖珠混悬液，用记号笔在最高液面处做标记，1500g室温离心5min，弃上清；加入1mL 1×IAPbuffer(10×IAP buffer：500mM Tris，500mM NaCl，100mMNaH₂PO₄，pH 7.6)，室温rotation 2min，1500g室温离心5min，弃干净上清，共计清洗4次；最后将SH2-琼脂糖珠用1×IAP buffer重悬至划线处；

(2)按表1试剂比例在对应管中加入试剂，盖上管盖后室温rotation 1h(如果加样后体系中有气泡，轻弹管壁，将气泡赶出后再进行混悬孵育，且确保混悬孵育时琼脂糖珠成分散状态)；

表1

(3)SH2-琼脂糖珠富集后清洗：孵育完成后，室温离心转移上清至新的离心管(标注为pYFT，-80℃保存，备后续pST富集用)；加入高盐清洗液(50mM Tris，250mM NaCl，pH7.6)，室温rotation 2min，离心弃上清，共清洗2次；加入低盐清洗液(50mM NH₄HCO₃)，室温rotation 2min，离心弃上清，共清洗2次；

(备注：离心条件，微量离心柱为1000g离心30s，PCR管为1500g离心5min；清洗条件，微量离心柱为100μL清洗液每次，高低盐各清洗4次，PCR管为200μL清洗液每次，高低盐各清洗2次，总清洗液体积分别为400μL；去上清方式，微量离心柱直接离心流出去除，PCR管离心后手动移液去除)

(4)pY洗脱：每次加入50μL 0.5％TFA，室温rotation 5min，离心收集洗脱液，共洗脱3次(离心条件同上，洗脱液现配现用)；

(5)pY浓缩：洗脱液管开盖放入真空浓缩仪中，设置界面：V-AQ，45℃，进行浓缩蒸干，-80℃保存备用；

6、pY ziptip脱盐

1)pY复溶：pY干粉4℃15000g离心5min，加入20μL 0.1％FA，涡旋振荡1min，水浴超声10min，样本调酸至PH＜3(用10％FA调酸)；

2)ziptip脱盐柱活化：将ziptip小柱在100％ACN(0.1％FA)中上下吹打15次；将ziptip小柱在ddH₂O(0.1％FA)上下吹打15次；

3)上样：将ziptip小柱在样品中上下吹打25次，保留流穿液；

4)清洗：将ziptip小柱在ddH₂O(0.1％FA)上下吹打20次，每次吹吸的废液都需要弃掉(吹吸时速度不易过快，否则会影响除盐效率)；

5)洗脱：将ziptip小柱在20μL 30％ACN(0.1％FA)上下吹打25次后完全打干，保留洗脱液；

6)第二次上样：第二次上样脱盐：用同一ziptip小柱重复步骤(2)-(5)操作(洗脱到同一管中)；

7)样本浓缩：洗脱液管开盖放入真空浓缩仪中，设置界面：V-AQ，45℃，进行浓缩蒸干，放置-80℃保存。

7、pY质谱检测

脱盐后的pY多肽干粉，15000g 4℃离心10min，再加入20μL 0.1％FA，涡旋振荡2min，15000g 4℃离心10min，转移18μL至质谱上样小瓶，进行Exploris240质谱仪检测，上样量16μL；质谱采集模式DDA，质谱梯度40min。

8、pY质谱检测

Fragpipe(v17.1)软件进行搜库，搜库结果进行数据比对分析，结果显示微量离心柱方法具有更好的pY鉴定结果及pY富集效率，结果见下图2和图3。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)还原烷基化：将蛋白样本与DTT、IAM混合孵育；

(2)SP3蛋白酶切：将烷基化处理后的蛋白样本与磁珠混合孵育，进行磁分离后与酶混合，收集多肽样本；

(3)富集：将多肽样本与SH2-琼脂糖珠混合孵育，离心取上清，洗脱，脱盐，即得。

2.根据权利要求1所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，步骤(3)所述多肽样本的体积为20-100μL。

3.根据权利要求1或2所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育采用带有筛板的离心柱。

4.根据权利要求3所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，所述筛板的孔径为25-35μm；

优选地，步骤(3)所述孵育中多肽样本与离心柱筛板不接触。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，步骤(2)所述孵育的时间为55-65min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，步骤(2)所述酶包括胰酶。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，步骤(3)所述洗脱前还包括清洗；

优选地，所述清洗包括高盐缓冲液和低盐缓冲液依次清洗。

8.根据权利要求7所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，所述高盐缓冲液包括Tris 45-55mM、NaCl 240-260mM和水；

优选地，所述低盐缓冲液包括NH₄HCO₃45-55 mM和水；

优选地，所述高盐缓冲液的pH为7.5-8.0。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法，其特征在于，所述离心的转速为800-1200g，时间为20-40s。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的酪氨酸磷酸化多肽富集方法在酪氨酸磷酸化多肽富集中的应用。