CN107074829A - 用于抑制微粒体前列腺素e2合成酶‑1的新型甲基‑哌啶化合物 - Google Patents

用于抑制微粒体前列腺素e2合成酶‑1的新型甲基‑哌啶化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供式(1)化合物或其药学上可接受的盐，

Description

用于抑制微粒体前列腺素E2合成酶-1的新型甲基-哌啶化合物
本发明涉及新型化合物；包含所述化合物的药物组合物；使用所述化合物治疗与关节炎相关的疼痛和/或炎症的方法；以及可用于合成所述化合物的中间体和方法。
关节炎涉及关节的炎症并且常常伴随着疼痛和僵硬。关节炎的最常见形式骨关节炎是复杂的关节退化疾病，其特征在于关节软骨、关节周围结构（包括骨、滑膜和相关的纤维性关节组织）的渐进性破坏；和不同程度的发炎。使用非甾体抗炎药（NSAIDs）和环氧合酶-2抑制剂（COX-2抑制剂）的现有药物疗法可减轻与骨关节炎相关的疼痛，但随着时间可能仅中度有效并且各自具有变化的风险/益处考量。
NSAIDs和COX-2抑制剂通过抑制COX-2酶而减轻炎症和疼痛。作为对促炎性刺激的响应，COX-2酶将花生四烯酸代谢为前列腺素H2 (PGH2)。PGH2进一步被各种酶代谢为其它类花生酸(eicosanoid)，包括前列腺素E2 (PGE2)、前列腺素I2 (PGI2)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素D2 (PGD2)和血栓素A2 (TXA2)。已知这些代谢物诱发生理学和病生理学效应。据信，药物介导的PGI2和TXA2的不平衡可解释NSAIDs和COX-2抑制剂为何产生有害的胃肠和心血管副反应。因此，对许多患者而言，由于先前存在或出现的心血管和/或胃肠病况，这些类别的药物可能是禁忌的。另外，患者随着时间可能难以用特定药物疗法治疗。
在花生四烯酸代谢物中，PGE2已被鉴定为与骨关节炎相关的病况（例如，发烧、疼痛和炎症）的重要介体。前列腺素 E2特定地经由微粒体前列腺素 E2合成酶-1 (mPGES-1)对PGH2的代谢来产生。据信，选择性抑制mPGES-1可为患有关节炎的患者提供新的治疗选项。
公开案WO 2013/146970公开了三取代的喹啉化合物并提出所公开的化合物可尤其用于治疗炎性疾病。然而，所述公开案没有公开如本申请中请求保护的化合物。
仍然需要另外的选项以治疗炎症并减轻与关节炎相关的疼痛。本发明提供抑制mPGES-1并且可能有益于治疗患有关节炎和骨关节炎的患者的新型化合物。
本发明提供式1化合物或其药学上可接受的盐，
其中R1是H或-CH3；R选自：
, 和; 且
G选自：
, 和 。
本发明提供式2化合物或其药学上可接受的盐：
其中：R1是H或-CH3；R选自：
,和; 且
G选自：
, 和。
本发明还提供式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-CH3。
对于优选的式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，R选自：
, 和 。
对于更优选的式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，R选自：
, 和 。
对于再更优选的式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，R选自：
和。
对于优选的式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，G是：
或。
本发明还提供式3化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，式1、2或3的化合物以中性物质的形式提供。在另一个实施方案中，所述化合物以药学上可接受的盐的形式提供。在一种优选的盐形式中，式3化合物以盐酸盐形式提供。
本发明还提供药学上可接受的组合物，所述组合物包括式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供治疗需要治疗与关节炎或骨关节炎相关的疼痛的患者的方法。所述方法包括给予所述患者有效量的包括式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药学上可接受的组合物。
本发明还提供治疗需要治疗关节炎或骨关节炎的患者的方法。在一种形式中，本发明提供治疗患者的骨关节炎体征和/或症状的方法。所述方法包括给予所述患者有效量的式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供治疗需要治疗与关节炎或骨关节炎相关的炎症的患者的方法。所述方法包括给予所述患者有效量的包括式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药学上可接受的组合物。
本发明还提供治疗需要治疗与关节炎相关的疼痛的患者的方法。所述方法包括给予所述患者有效量的式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供治疗患者的与骨关节炎相关的疼痛的方法。所述方法包括给予所述患者有效量的式1、2或3的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供用作药物的式1、2或3的化合物。所述药物或化合物可用于疗法。所述疗法可包括治疗患者的关节炎或骨关节炎。在一个实施方案中，所述疗法可以是治疗与关节炎或骨关节炎相关的疼痛或炎症。
本发明还提供所述化合物用于制备治疗关节炎或骨关节炎的药物的用途。在一种形式中，所述药物用于治疗与关节炎或骨关节炎相关的疼痛或炎症。
如本文所用，术语“治疗”或“以治疗”包括遏止或降低与关节炎或骨关节炎相关的现有症状或病症（尤其是疼痛和/或炎症）的严重程度。
如本文所用，术语“患者”是指哺乳动物，例如豚鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、绵羊、山羊或人；或家禽例如鸡或鸭。优选的患者是哺乳动物，更优选人。
本发明的示例性化合物可根据所接受的实践配制成药物组合物。药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂的实例可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro,Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa. 1990。非限制性实例包括下列：淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、单硬脂酸甘油酯；吸附载体如高岭土和膨润土；以及润滑剂如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁，和固体聚乙二醇（polyethyl glycols）。在一种形式中，所述药物制剂包括25 mM磷酸盐缓冲液（pH 2）中的20% Captisol。
优选的药物组合物可配制为用于口服给药的片剂或胶囊或配制为可注射溶液。片剂、胶囊或溶液包括有效治疗需要治疗的患者的量的本发明的化合物。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量，所述量或剂量在单剂量或多剂量给药于患者后提供所需要的效应，例如，减轻或消除诊断或治疗下的患者的疼痛和/或炎症。
有效量可容易地由主治诊断医师通过使用已知技术和通过类似情况下获得的观察结果而确定。在确定患者的有效量时，可由主治诊断医师考虑多种因素，包括但不限于：哺乳动物的物种，其大小、年龄和一般健康状况；症状的严重程度；个体患者的反应；给药模式；式1、2或3化合物或其药学上可接受的盐形式作为配制的药物产品在所选给药方案中的生物利用度特征；使用的伴随药物；和其它相关情形。
在一个实施方案中，有效量可以是约0.0005 mg/kg体重至约100 mg/kg。更优选地，有效量可以是约0.001 mg/kg至约50 mg/kg。再更优选地，有效量可以是约0.001 mg/kg至约20 mg/kg。
本发明的化合物可以与其它治疗方法和/或另外的治疗剂组合。优选本发明化合物可与也有效治疗关节炎或骨关节炎的其它药剂组合。这些另外的治疗剂的实例包括：NSAIDs或COX-2抑制剂，如布洛芬、阿司匹林、对乙酰氨基酚、塞来昔布、萘普生和酮洛芬；阿片类如羟考酮和芬太尼；和皮质类固醇类如氢化可的松、泼尼松龙和泼尼松。
本发明的化合物和另外的治疗剂可经由相同递送途径和装置如单一丸剂、胶囊片剂或溶液一起给药；或在单独的递送装置中同时分别给药或依序给药。
本发明化合物可以以药学上可接受的盐形式提供。“药学上可接受的盐”是指被认为是临床和/或兽医使用可接受的本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐和制备它们的常用方法是本领域公知的。参见，例如，P. Stahl等人, Handbook of PharmaceuticalSalts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge等人,"Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1,January 1977。
本发明的化合物或其盐可通过本领域已知的各种程序制备，一些程序例示于以下的方案、制备例和实施例中。本领域普通技术人员会认识到，用于所述各路径的具体合成步骤可以以不同方式组合，或与不同方案的步骤联合，以制备本发明的化合物或其盐。以下方案中各步骤的产物可通过常规方法回收或纯化，包括萃取、蒸发、沉淀、层析、超临界流体层析、过滤、研磨和结晶。
单个异构体、对映异构体或非对映异构体可由本领域普通技术人员在合成式1化合物中的任何方便时间点通过诸如选择性结晶技术或手性层析的方法分离或拆分(参见例如J. Jacques等人, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley andSons, Inc., 1981, 和E.L. Eliel和S.H. Wilen,”Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994)。此外，下列制备例中所述的中间体含有氮和氧保护基。保护和脱保护条件是技术人员公知的并且描述于文献中(参见例如“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, 第四版, Peter G.M. Wuts和Theodora W.Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。
试剂和起始物质通常是本领域普通技术人员容易获得的。其它的可通过有机和杂环化学的标准技术和以下制备例和实施例中描述的程序制备。
如下所例示的用穿过键的线描绘键指示取代基与分子剩余部分的连接点。
本文所用的缩写根据 Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984定义。其它缩写如下定义：“δ”是指相对于四甲基硅烷低场的百万分率；“ATCC”是指美国模式菌种收集中心；“BOP”是指 (苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CDI”是指1,1’-羰基二咪唑；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“DCM”是指二氯甲烷；“DIC”是指1,3-二异丙基碳二亚胺；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ee”是指对映体过量；“EIA”是指酶免疫分析法；“EIMS”是指电子电离质谱；“ESMS”是指电喷雾质谱；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇（ethanol）或乙醇（ethyl alcohol）；“Ex. No.”是指实施例编号；“HATU”是指(1-[双(二甲基氨基)亚甲基-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化物六氟磷酸盐)；“HBTU”是指(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基氨基)-N,N-二甲基甲铵六氟磷酸盐；“HOAT”是指1-羟基-7-偶氮苯并三唑；“HOBT”是指水合1-羟基苯并三唑；“IC50”是指产生该试剂可能的最大抑制反应的50%的试剂浓度；“i-PrOH”是指异丙醇（isopropanol）或异丙醇（isopropyl alcohol）；“LPS”是指脂多糖；“MeOH”是指甲醇；“min”是指分钟；“NSAIDs”是指非甾体抗炎药；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PGE2”是指前列腺素 E2；“PGH2”是指前列腺素 H2；“PGI2”是指前列腺素 I2；“PyBOP”是指(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)；“PyBrOP”是指溴(三吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐；“rhIL-1β”是指重组人白介素1β；“SCF”是指超临界流体；“SFC”是指超临界流体层析；“TBME”是指叔丁基醚甲基醚；“THF”是指四氢呋喃；“tR”是指保留时间。
通用LCMS方法。所有分析使用Agilent 1200 Infinity Series LiquidChromatography (LC)系统进行，该系统由以下组成：1260 HiP脱气装置(G4225A)、1260二元泵 (G1312B)、1290自动进样器(G4226A)、1290恒温柱温箱(G1316C)和与Agilent 6150单四级杆质谱(MS)检测器偶联的1260二极管阵列检测器(G4212B)。MS使用电喷雾电离源(ESI)在正&负离子模式下操作。喷雾器压力设置为50 psi，干燥气温度和流速分别为350℃和12.0 L/min。使用的毛细管电压为正离子模式下4000 V和负离子模式下3500 V。数据采集使用Agilent化学工作站软件进行。
HPLC方法1。在Daicel ChiralPak AD-3R柱 (长度100 mm, 内径4.6 mm, 粒径3 μm)上进行分析。使用的流动相为：A2=含10 mM碳酸氢铵的水，用氢氧化铵调节至pH 9；和B2= 乙腈。在温度25℃和流速1.5 mL/min下，使用50 %至95 % (B2)梯度洗脱3.0 min，接着在95 % (B2)保持3.0 min来进行运行。UV (DAD)采集在40 Hz下使用190–400 nm的扫描范围(步进5 nm)进行。在MS检测器前使用1:1分流比。MS采集范围设置为100–800 m/z，步长0.2m/z，两种极性模式。碰撞电压设置为70 (ESI+)或120 (ESI-)，增益设置为 0.40 (ESI+)或1.00 (ESI-)，离子计数阈值设置为4000 (ESI+)或1000 (ESI-)。总MS扫描周期时间为0.15s/周期。
SFC方法1。在Daicel ChiralPak OJ-H柱(长度100 mm, 内径4.6 mm, 粒径5 μm)上进行分析。流动相为：8 % (20 mM NH3/i-PrOH)和92 % CO2(scf), 压力为100巴。在温度35℃和流速3 mL/分钟下进行运行。UV (DAD)采集在波长220 nm下进行。
SFC方法2。在Daicel ChiralPak AS-H柱 (长度100 mm, 内径4.6 mm, 粒径5 μm)上进行分析。流动相为：20 % (20 mM NH3/i-PrOH)和80 % CO2(scf), 压力为100巴。在温度35℃和流速5 mL/分钟下进行运行。UV (DAD)采集在波长220 nm下进行。
以下方案进一步说明本发明。
方案1
在方案1、步骤1中，在哌啶上安装三氟甲基磺酰基以在随后的步骤2的反应中充当离去基。“PG”是针对氨基开发的保护基，例如氨基甲酸酯和酰胺。步骤1的产物接着使用钯催化剂进行羰基化以得到步骤2的酯产物。四氢吡啶中的双键可在氢化条件下还原。在步骤3、子步骤2中，哌啶胺可在酸性条件下脱保护。步骤3的哌啶产物可接着与卤素取代的G基团在适于亲核芳香族取代的条件下反应生成步骤4的产物。例如，可使用无极碱诸如K2CO3或有机碱诸如N,N-二异丙基乙胺、吡啶或三乙胺以生成步骤4、子步骤1的产物。或者，步骤3的哌啶产物可利用活化剂诸如PyProp与喹诺酮N-氧化物反应以生成步骤4的产物。哌啶羧基的脱保护可在标准条件下使用无极碱诸如氢氧化钠或氢氧化锂的水溶液来完成以生成步骤4、子步骤2的产物，或在酸性条件下使用4 M HCl或硫酸水溶液来完成。
方案2
在方案2中，步骤4的哌啶羧酸产物可与合适的胺R-NH2在酰胺化条件下使用有机碱诸如三乙胺或二异丙基乙胺、偶联剂诸如EDCI和偶联添加剂诸如HOBT偶联以生成步骤5、子步骤1的化合物。本领域技术人员会认识到，存在多种方法和试剂用于自羧酸与胺的反应形成酰胺。例如，胺化合物与合适的羧酸在偶联剂存在下（使用或不使用有机碱）的反应可提供式1化合物。偶联剂包括碳二亚胺，如DCC、DIC、EDCI，或羰基二咪唑，如 CDI。可使用酰胺偶联添加剂如HOBT和HOAt 以增强反应。此外，可使用非亲核阴离子的脲鎓或鏻盐如 HBTU、HATU、BOP、PyBOP和PyBrOP来代替更多的传统偶联剂。可使用添加剂如DMAP以增强反应。如果必要，步骤5、子步骤1的产物可接着在标准条件下使用无机碱如氢氧化钠或氢氧化锂水溶液在溶剂如MeOH和THF中脱保护以生成式1化合物。
本发明化合物的药学上可接受的盐（如盐酸盐）可例如通过合适的式1的游离碱与合适的药学上可接受的酸（如盐酸）在合适的溶剂如乙醚中在标准条件下的反应来形成。此外，此类盐的形成可在脱去氮保护基时同时发生。此类盐的形成是本领域公知和了解的。参见，例如，Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,”International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J.等人. “Salt Selection andOptimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,”Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); 和Berge, S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。
以下制备例和实施例进一步说明本发明。
制备例1
3,3-二甲基-4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
在氮气氛下，将二异丙基胺 (260 mL, 1.85 mol)于THF (1.0 L)中的溶液冷却至–20℃，然后经30分钟逐滴添加正丁基锂溶液(2.50 M于己烷中, 650 mL, 1.60 mol)。使混合物温热至–10℃并搅拌1小时。将混合物冷却至–74℃并经60分钟逐滴添加3,3-二甲基-4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯 (260 g, 1.14 mol)于THF (1.0 L mL)中的溶液。将混合物在–74℃搅拌2小时，然后添加N-苯基双(三氟甲烷磺酰亚胺) (430 g, 1.20 mol)于THF (1.0 L)中的溶液。将混合物温热至0℃并搅拌2小时。使混合物温热至室温并搅拌过夜。用饱和NH4Cl水溶液 (1.0 L)淬灭反应；用水(2.0 L)稀释；分离各层；并用EtOAc (2 × 2 L)萃取水层。合并有机萃取物；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩滤液。使所得粗物质进行硅胶快速层析，用0 %-15 % TBME/己烷梯度洗脱以提供为橙色油状物的标题化合物 (430g, 78%)，其纯度以质量计为约 75%，如通过1H NMR评估。
制备例2
3,3-二甲基-2,6-二氢吡啶-1,4-二甲酸O1-叔丁酯-O4-甲酯
将乙酸钯(II) (4.40 g, 20.0 mmol)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁 (13.3 g, 22.8mmol)、3,3-二甲基-4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(72.0 g, 150 mmol)、无水乙腈(850 mL)、无水MeOH (570 mL)和三乙胺(36.0 mL, 245mmol)在配备有机械搅拌器的2-L PARR™高压釜中合并。将高压釜密封。冲洗，接着用一氧化碳将高压釜增压至689 kPa。将混合物加热至65℃持续2.25小时；将混合物冷却至室温；并且小心地将高压釜排出。(注意! 毒气!)。在减压下浓缩以得到粗物质。将该物质与通过类似程序以相似规模制备的另外5批物质合并。合并的物质进行硅胶快速层析，用0 %-20 %TBME/己烷梯度洗脱，以得到标题化合物(260 g, 88%)，为黄色油状物，纯度以质量计约83%。。
制备例3
(±)-3,3-二甲基哌啶-1,4-二甲酸O1-叔丁酯-O4-甲酯
将钯(10 wt%/碳, 5.4 g, 5.1 mmol)悬浮于MeOH (700 mL)中，然后将3,3-二甲基-2,6-二氢吡啶-1,4-二甲酸O1-叔丁酯-O4-甲酯 (130 g, 396 mmol)溶解于MeOH (700 mL)中的溶液添加至2.25 L PARR™反应器。密封反应器，首先用氮气、接着用氢气进行冲洗。将反应器用氢增压至414 kPa并将混合物在室温下搅拌 1.5小时。释放压力并过滤混合物以除去催化剂。将滤液与获自另一基本相同反应的物质合并并减压浓缩以得到标题化合物(240g, 95%)，为黄色油状物，纯度以质量计约85%。。
制备例4
(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐
将HCl (4.0 M溶液于1,4-二氧杂环己烷中, 2.0 L, 8.0 mol)添加到3,3-二甲基哌啶-1,4-二甲酸 O1-叔丁酯-O4-甲酯 (240 g, 752 mmol)于1,4-二氧杂环己烷 (500 mL)中的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜并减压浓缩。用TBME (500 mL)稀释残余物并通过过滤收集所得固体。用TBME (2 × 400 mL)冲洗滤饼并在真空炉中在35℃下将固体干燥过夜以得到为白色固体的标题化合物 (144 g, 92%)。。
制备例5
(–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸甲酯
将K2CO3 (210 g, 1.52 mol)添加到3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐(144 g, 693mmol)和2-氯-8-甲基喹啉(125 g, 704 mmol)于DMSO (1.4 L)中的混合物中。将所得混合物在131 ± 1℃搅拌过夜。将混合物冷却至室温；过滤除去固体；收集滤液；用水(2 L)稀释滤液；然后用EtOAc (2 × 3 L)萃取。用水(3 × 1.5 L)洗涤合并的有机萃取物；经Na2SO4干燥；过滤；收集并在减压下浓缩滤液。所得粗物质进行硅胶快速层析，用25 %-30 % (10 %TBME/DCM)/己烷梯度洗脱，以提供标题化合物的外消旋物。将该物质溶于MeOH (7.5 L)并过滤。该物质进行手性SFC (Chiralpak OJ-H, 50 mm × 250 mm × 5 µm)，使用含15 %(0.2 %二甲基乙胺/i-PrOH)的CO2(scf)作为流动相，流速400 g/min，每95秒注射5 mL溶液，直至所有物质都耗尽。对于每次注射，收集洗脱的第一级分(t R = 2.57 min，SFC方法1)。将收集的级分与来自类似制备的之前反应的那些级分合并以提供98 g粗品3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐。在减压下浓缩混合物并自热EtOH (1.38 L)重结晶物质。收集晶体并在真空炉中在40℃下将结晶物质干燥过夜以提供为白色结晶固体的标题化合物(156 g, 43%产率，基于分批比例)。，如通过SFC方法1测定。
制备例6
(–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸
用硫酸(10% v/v于水中, 2.31 L, 2.75 mol)处理(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸甲酯 (154 g, 493 mmol)并将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温并添加NaOH (50 wt%于水中)直至pH达到13。添加TBME (500 mL)以提供三相混合物。从上至下将各层标记为：“层A”、“层B”和“层C”。除去层C (底层)。将水(600 mL)添加至层A和层B并自有机层分离水层。留出有机层(A和B)。将水层与层C合并。用TBME (500 mL)萃取合并的水层；分离各层；并留出有机萃取物。将HCl (5.0 M)添加至水层直至pH为6.5。用TBME (2 ×400 mL)萃取所得含水混合物。合并所有有机萃取物(包括层A和B)；经MgSO4干燥；过滤；收集并在减压下浓缩滤液以得到96%纯度的为白色固体的标题化合物(145 g, 95%)。 。
制备例7
(±)-2-((苄氧基)甲基)-2,3-二氢-4H-吡喃-4-酮
经90分钟将ZnCl2于THF中的溶液 (0.5 M, 1.21 L, 607 mmol)添加到(E)-1-甲氧基-3-(三甲基甲硅烷基)氧基-1,3-丁二烯 (95%纯, 100 g, 551 mmol)和(苄基氧基)乙醛(97 %纯, 80 mL, 551.370 mmol)于甲苯(551 mL)中的冷(0℃)溶液中，同时维持反应混合物的内部温度低于10℃。使混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物分为两等份；对每一份进行以下程序。以四份添加三氟乙酸 (35 mL, 457 mmol)。20分钟后，在减压下浓缩所得混合物；用EtOAc稀释；添加过量的饱和NaHCO3；过滤除去固体；收集滤液；分离并收集有机层。用饱和NaCl水溶液洗涤有机溶液；分离有机萃取物；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。合并从之前分离部分各自所得的物质。所得物质进行硅胶快速层析，用20%-50% EtOAc/己烷梯度洗脱，以得到92%纯度的为橙色油状物的标题化合物(96 g, 73%)。
制备例8
(±)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-酮
在氢气氛下在室温将EtOAc (880 mL)、(±)-2-((苄氧基)甲基)-2,3-二氢-4H-吡喃-4-酮 (96 g, 0.440 mol)、三乙胺(123 mL, 0.882 mol)和钯(10% /碳, 4.68 g, 4.40mmol)的混合物搅拌73小时。经由硅藻土过滤混合物；用EtOAc (250 mL)冲洗滤饼；并依此用HCl水溶液(0.1 M)、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤滤液。经MgSO4干燥有机层；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到为浅黄色物质的标题化合物(81.4 g, 84%)。 。
制备例9
(2S,4R)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-醇
将(±)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-酮 (40.6 g, 184 mmol)于THF (1.08 L)中的溶液冷却至–78℃。经15分钟逐滴添加LiAlH4溶液(1.0 M于THF中, 240 mL, 240 mmol)。添加完成后使混合物温热至0℃并缓慢地逐滴添加水 (8.4 mL)。将混合物搅拌5分钟后，添加NaOH溶液 (15 质量 %，于水中, 8.4 mL)并再搅拌5分钟。然后添加水(3 × 8.4 mL)并使混合物温热至室温。30分钟后，过滤混悬液以除去固体并在减压下浓缩滤液以提供为无色油状物的标题化合物。用THF冲洗固体一次；过滤；并在减压下浓缩滤液。将该物质与获自基本按照相同程序使用40 g、22 g和45 g的(±)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-酮起始进行的之前反应的那些物质合并。将合并的物质溶于i-PrOH (637 mL)。使用含25% i-PrOH的CO2(scf)作为流动相以流速300 g/min通过每114秒注射1.35 g溶液直至已注射所有物质来使所述物质进行手性SFC (Chiralpak AS-H, 50 mm × 150 mm × 5 µm)。对于每次注射，收集洗脱的第一级分(主要异构体)。合并所有收集的级分以得到如通过SFC方法2测定的为>99 % ee的标题化合物(62.8 g, 42 %产率，基于分批比例)。。
制备例10
甲磺酸((2S,4R)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-基)酯
在0℃下将甲磺酰氯(11.7 mL, 150.6 mmol)于DCM (70 mL)中的溶液逐滴添加到(2S,4R)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-醇 (31 g, 139.5 mmol)、DCM (1.40 L)和N,N-二异丙基乙胺(73.0 mL, 418.4 mmol)的混合物中。使混合物温热至室温并将其搅拌过夜。此后添加甲磺酰氯(0.537 mL, 6.98 mmol)于DCM (5 mL)中的溶液并将混合物在室温下搅拌5分钟。将混合物冷却至0℃，将其倒入水中；分离；并收集有机层。用水(500 mL)洗涤有机层；将有机层与获自其它基本相同反应的有机层/萃取物合并。经MgSO4干燥合并的有机溶液；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩滤液以得到为浅橙色油状物的标题化合物(84.7 g, 97 %产率，基于分批比例)。
制备例11
((2S,4S)-4-氨基四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇盐酸盐
将叠氮化钠(12.85 g, 191.7 mmol)添加到甲磺酸((2S,4R)-2-(苄氧基甲基)四氢吡喃-4-基)酯 (32.0 g, 106.5 mmol)于DMF (304 mL)中的溶液中。将所得混合物加热至100℃并将其搅拌4小时。将反应混合物冷却至室温。将混合物倒入水 (400 mL)中，然后用EtOAc (2 × 400 mL)萃取。合并有机萃取物并用饱和NaCl 水溶液(3 × 200 mL)洗涤。经MgSO4干燥有机萃取物；过滤；并收集滤液。在减压下将滤液浓缩至约100 mL总体积。将所得混合物溶于EtOAc (700 mL)并将其添加至含有PtO2 (2.7 g, 12 mmol)和EtOAc (700 mL)的PARR™容器。用氮冲洗容器；然后用氢将其增压至 414 kPa。在室温下搅动混合物4小时。过滤混合物并在减压下浓缩无色滤液以提供23.2 g无色油状物。与36.2 g来自通过基本相同的程序制备的之前反应的物质合并。将合并的物质溶于EtOH (600 mL)并添加HCl (37wt%于H2O中, 50 mL)。将所得混合物添加至含有Pd (10%/碳, 10.0 g, 9.40 mmol)和EtOH(600 mL)的PARR™容器。用氮冲洗反应器并用氢将其增压至 414 kPa。在室温下搅动混合物1小时。过滤混合物；收集滤液；并在减压下浓缩无色滤液以得到约72%纯度的为深色稠油状物的标题化合物(54.2 g, 85 %)。。
制备例12
(±)-3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸甲酯
将K2CO3 (460 mg, 3.33 mmol)添加到3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐(300 mg,1.44 mmol)、1-氟-4-(三氟甲基)苯 (475 mg, 2.89 mmol)和DMSO (2 mL)的混合物中。将所得混合物在130℃下搅拌2天。将混合物冷却至室温并搅拌3天。所得物质在C18硅胶上进行反相快速层析，用10 %-100 % 乙腈(0.1 %甲酸)/水(0.1 %甲酸)的梯度洗脱，以得到为黄色油状物的标题化合物 (113 mg, 25 %)。。
制备例13
(±)-3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸.
将2M NaOH水溶液 (1 mL, 2 mmol)添加到(±)-3,3-二甲基-1-[4-(三氟甲基)苯基]哌啶-4-甲酸甲酯 (113 mg, 0.36 mmol)、MeOH (1 mL)和THF (5 mL)的混合物中。将所得混合物在50℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温，添加HCl (33 wt %于水中) 直至混合物的pH为3。在减压下浓缩混合物以得到88%纯度的为黄色固体的标题化合物 (123 mg, 99 %产率)。。
制备例14
(±)-3,3-二甲基-1-[5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]哌啶-4-甲酸
将三乙胺(7.65 mL, 54.9 mmol)添加到(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐(8.55 g, 41.2 mmol)、2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶 (5.0 g, 27.4 mmol)和乙腈(67 mL)的混合物中。将混合物在微波中加热至180℃持续1小时；然后将混合物冷却至室温；并在减压下浓缩。添加MeOH (40 mL)、THF (80 mL)和2 M NaOH水溶液 (40 mL, 80 mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌2天。添加2 M NaOH水溶液 (45 mL, 90 mmol)并将所得混合物在50℃下搅拌4小时。将混合物冷却至室温，然后添加 HCl (33 wt %于水中) 直至pH达到3。在减压下浓缩。用1 N HCl水溶液 (100 mL)稀释并用EtOAc (2 × 100 mL)萃取。用盐水(100 mL)洗涤合并的有机萃取物；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到标题化合物(7.60 g, 61 %)。 。
制备例15
5,8-二甲基喹啉-1-氧化物
将3-氯过氧苯甲酸(5.96 g, 24.1 mmol)添加到保持在0℃下的5,8-二甲基喹啉 (2g, 12.1 mmol)和DCM (80 mL)的混合物中。1小时后，添加Na2SO4 (5 g)并过滤混合物。收集滤液。将所得混合物在室温下搅拌过夜。用 DCM (100 mL)稀释；用1 N NaOH水溶液 (3 ×50 mL)洗涤；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩至干。所得粗物质在C18硅胶上进行反相快速层析，用15 %-70 % 乙腈 (10 mM 碳酸氢铵)/水(10mM碳酸氢铵)梯度洗脱以得到标题化合物(372 mg, 18 %)。。
制备例16
(±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯.
将N,N-二异丙基乙胺(2.02 mL, 11.6 mmol)和PyBroP (1.75 g, 3.75 mmol)添加到(±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐 (600 mg, 2.89 mmol)、5,8-二甲基喹啉-1-氧化物 (678 mg, 3.91 mmol)和DCM (15 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌3天。粗反应物在C18硅胶上进行反相快速层析，用10 %-100 % 乙腈 (0.1%甲酸)/水(0.1%甲酸)梯度洗脱。合并含有目标产物的级分并真空浓缩至约30 mL体积。通过添加1N NaOH水溶液将pH调节至6。用EtOAc (2 x 30 mL)萃取水溶液，用pH 6缓冲水溶液 (4 x 30 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以得到标题化合物(166 mg, 18%)。。
制备例17
(±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸.
在微波容器中合并(±)-1-(5,8-二甲基-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯(166 mg, 0.51 mmol)、MeOH (0.1 mL)、THF (0.5 mL)和1 M NaOH水溶液 (2.5 mL, 2.5mmol)的混合物。将所得混合物在120℃下在微波反应器中加热2小时。将混合物冷却至室温并添加1 N HCl水溶液直至pH为6。用CHCl3 (2 × 25 mL)萃取；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到标题化合物 (135 mg, 85 %)。 。
制备例18
(±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯.
将K2CO3 (1.07 g, 7.75 mmol)添加到 (±)-3,3-二甲基哌啶-4-甲酸甲酯盐酸盐(700 mg, 3.37 mmol)、2,8-二氯喹啉 (876 mg, 4.38 mmol)和DMSO (4.5 mL)的混合物中。将所得混合物在130℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温；过滤以除去固体；用水 (5mL)稀释；并用EtOAc (4 × 20 mL)萃取。用水 (20 mL)、接着盐水(20 mL)洗涤合并的有机萃取物。有机萃取物经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用0 %-40 % EtOAc/己烷梯度洗脱以得到标题化合物(1.1 g, 98 %)。。
制备例19
(±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸
在微波容器中合并(±)-1-(8-氯-2-喹啉基)-3,3-二甲基-哌啶-4-甲酸甲酯 (1.1 g,3.3 mmol)、MeOH (0.8 mL)、THF (3.3 mL)和1 M NaOH水溶液 (3.3 mL, 17 mmol)的混合物。将所得混合物在120℃下在微波中加热2小时。将混合物冷却至室温，然后添加5 N HCl水溶液直至pH为6。用EtOAc (3 × 10 mL)萃取混合物。合并有机萃取物；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到标题化合物(815 mg, 77 %)。。
制备例20
4-苯胺基-2,5-二氢呋喃-3-甲酸甲酯
将p-甲苯磺酸 (500 mg, 3.16 mmol)添加到 (±)-4-氧代四氢呋喃-3-甲酸甲酯(6.6 g, 45.8 mmol)、苯胺(4.3 mL, 47.2 mmol)和甲苯(70 mL)的混合物中。给反应容器配备Dean-Stark阱并加热至140℃。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应加热至140℃并搅拌2小时。冷却混合物并添加乙醚 (100 mL)和水(100 mL)。用乙醚(3 × 50 mL)萃取混合物；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 0 %-100 % EtOAc/庚烷梯度洗脱，以得到标题化合物(6.7 g, 67 %)。。
制备例21
(±)-3-(碘甲基)-4-苯基亚氨基-四氢呋喃-3-甲酸甲酯
将(±)-4-苯胺基-2,5-二氢呋喃-3-甲酸甲酯 (3.6 g, 16.4 mmol) 和18-冠-6 (4.8g, 18 mmol)于甲苯(15 mL)中的溶液添加到叔丁醇钾(2.0 g, 17.8 mmol)和甲苯(15 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。添加二碘甲烷(4 mL)并在室温下将反应搅拌过夜。添加水(50 mL)并用乙醚(2 × 50 mL)萃取。收集有机萃取物并用盐水(50 mL)洗涤。有机萃取物经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 0 %-60 % EtOAc/庚烷梯度洗脱，以得到标题化合物(1.0 g, 17 %)。。
制备例22
(±)-5-氧代四氢吡喃-3-甲酸甲酯
将氢化三正丁基锡(1.12 mL, 4.18 mmol)、2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈) (35 mg, 0.21mmol)和甲苯(10 mL)的混合物加热至回流。经三小时逐滴添加(±)-3-(碘甲基)-4-苯基亚氨基-四氢呋喃-3-甲酸甲酯 (1.0 g, 2.78 mmol)于甲苯(50 mL)中的溶液。将所得混合物在回流下搅拌3小时。在减压下浓缩反应物。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 0 %-80% EtOAc/庚烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (0.37 g, 84 %)。
制备例23
(±)-反式-5-(苄基氨基)四氢吡喃-3-甲酸甲酯
将三乙酰氧基硼氢化钠 (0.96 g, 4.53 mmol)添加到 (±)-5-氧代四氢吡喃-3-甲酸甲酯(0.33 g, 2.08 mmol)、苄胺(0.31 mL, 2.84 mmol)和1,2-二氯乙烷 (5 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌2.5小时。添加碳酸氢钠的饱和水溶液(10 mL)；用DCM (3× 10 mL)萃取；分离有机层；用盐水(10 mL)洗涤；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 0 %-60 % EtOAc/庚烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (0.085 g, 16 %产率)。。
制备例24
(±)-反式-5-氨基四氢吡喃-3-甲酸甲酯
将10 %钯/碳 (0.07 g, 0.66 mmol)添加到 (±)-反式-5-(苄基氨基)四氢吡喃-3-甲酸甲酯 (0.085 g, 0.34 mmol)和乙醇(8 mL)的混合物中。用氢冲洗混合物并将所得混合物在室温下在氢气下(1 atm)搅拌过夜。过滤混合物并在减压下浓缩以得到标题化合物(0.045 g, 83 %产率)。
制备例25
(±)-反式-5-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]氨基]四氢吡喃-3-甲酸甲酯
将EDCI (0.087 g, 0.45 mmol)添加到(–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(0.087 g, 0.29 mmol)、(±)-反式-5-氨基四氢吡喃-3-甲酸甲酯 (0.045 g,0.28 mmol)、HOBT (9 mg, 0.06 mmol)、三乙胺(0.15 mL, 1.08 mmol)于DCM (5 mL)中的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌3小时。所得混合物在硅胶上进行快速层析，用 5 %-100 % EtOAc/庚烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (0.085 g, 66 %)。。
制备例26
(±)-反式-3-(二苄基氨基)环己烷甲酸甲酯
将碳酸钾(3.53 g, 25.6 mmol)和苄基溴(1.9 mL, 15.9 mmol)添加到(±)-反式-3-氨基环己烷甲酸甲酯(1.07 g, 6.8 mmol)于乙腈(40 mL)中的混合物中。将所得混合物加热至80℃并搅拌5小时。冷却混合物并添加乙腈 (40 mL)。经由硅藻土过滤并在减压下浓缩滤液。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用0 %-20 % EtOAc/己烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (1.6 g, 70 %)。。
制备例27
(±)-2-[反式-3-(二苄基氨基)环己基]丙-2-醇
将甲基溴化镁(于乙醚中的3.0 M溶液, 16 mL, 48 mmol)添加到保持在0℃下的(±)-反式-3-(二苄基氨基)环己烷甲酸甲酯 (1.6 g, 4.7 mmol)和THF (50 mL)的混合物中。使反应温热至室温并搅拌过夜。添加水(25 mL)并经由硅藻土过滤。收集含水滤液。用EtOAc(50 mL)萃取所得含水物质。收集有机萃取物；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。添加EtOAc (50 mL)；用饱和NH4Cl 水溶液(2 × 25 mL)洗涤；经Na2SO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到标题化合物(1.1 g, 69 %)。。
制备例28
2-[(1S,3S)-3-(二苄基氨基)环己基]丙-2-醇
将(±)-2-[反式-3-(二苄基氨基)环己基]丙-2-醇 (1.1 g, 3.26 mmol)溶解在乙醇(13 mg/mL)中。该物质进行手性SFC (Chiralpak IA, 2 cm × 15 cm)，使用含12 % (0.1% 二甲基乙胺/i-PrOH)的CO2(scf)作为流动相，在220 nm下，流速70 mL/分钟。收集并合并洗脱的第一级分并在减压下浓缩以提供标题化合物 (0.54 g, 49 %)，ee = >99 %。MS (m/ z): 338 (M + H)+。SFC分析方法(Chiralpak IA, (15 cm × 0.46 cm) 使用含10 % (0.1% 二甲基乙胺/i-PrOH)的CO2(scf)作为流动相，在220 nm下，流速3 mL/分钟)。
制备例29
2-[(1S,3S)-3-氨基环己基]丙-2-醇盐酸盐
将氢氧化钯(20%/碳, 0.51 g, 3.7 mmol)添加到 Parr™ 振动容器中的2-[(1S,3S)-3-(二苄基氨基)环己基]丙-2-醇 (0.54 g, 1.6 mmol)于MeOH (20 mL)中的混合物中。用氢冲洗并将容器增压至414 kPa。在室温下将混合物振摇4天。经由硅藻土过滤混合物并在减压下浓缩滤液。在乙醚(25 mL)和DCM (25 mL)中稀释混合物。添加HCl (1,4-二氧杂环己烷中的4.0 M溶液, 0.8 mL)并在减压下浓缩以得到标题化合物(0.24 g, 77 %)。。
制备例30
N-[(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-(羟甲基)降冰片烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯
将(乙酰丙酮)二羰基铑(10 mg, 0.03 mmol)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁 (27 mg,0.05 mmol)、二环[2.2.1]庚-2-烯-5-甲酸甲酯 (2.5 g, 11.9 mmol)和叔丁醇(25 mL)合并在带有机械搅拌器的PARR™高压釜中。用合成气(一氧化碳和氢气的1:1混合物，310kPa)冲洗和增压容器。搅拌过夜。在减压下浓缩混合物。在DCM (29 mL)和MeOH (2.9 mL)中稀释。添加硼氢化钠(0.26 g, 6.9 mmol)并在室温下搅拌20 min。添加DCM (60 mL)并用饱和碳酸钠水溶液(2 x 25 mL)和盐水(25 mL)洗涤。经Na2SO4干燥有机层；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用30 % DCM、30 %叔丁基甲基醚和40 %己烷的溶液洗脱，以得到为非对映异构体混合物的标题化合物(0.58 g, 21 %)。
制备例31
[(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-氨基降冰片烷-2-基]甲醇盐酸盐
将HCl (1,4-二氧杂环己烷中的4.0 M溶液, 2.1 mL, 8.3 mmol)添加到保持在0℃下的N-[(1RS,2RS,4SR,6RS)-6-(羟甲基)降冰片烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯 (0.2 g, 0.83mmol)于DCM (8 mL)中的混合物中。使所得混合物温热至室温并搅拌3小时。在减压下浓缩混合物以得到标题化合物(0.15 g, 100%)。
制备例32
((顺式-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己基)甲基)(氨磺酰基)氨基甲酸叔丁酯
将偶氮二甲酸二异丙酯 (1.6 mL, 7.8 mmol)添加到顺式-4-(羟甲基)环己基氨基甲酸叔丁酯 (1.5g, 6.5 mmol)、N-氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯(1.9 g, 9.8 mmol)、三苯基膦(2.1 g, 7.8 mmol)和EtOAc (33 mL)的混合物中。在室温下搅拌过夜。添加水(50 mL)；用EtOAc (2 × 50 mL)萃取；收集有机萃取物。用盐水(25 mL)洗涤有机萃取物；经 MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 10 %-80 %EtOAc/己烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (1.78 g, 67 %)。。
制备例33
顺式-1-氨基-4-[(氨磺酰基氨基)甲基]环己烷盐酸盐
将HCl (1,4-二氧杂环己烷中的4.0 M溶液, 15 mL, 60 mmol)添加到((顺式-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环己基)甲基)(氨磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(1.78 g, 4.37 mmol)中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。在减压下浓缩。在MeOH (10 mL)中稀释并逐滴添加乙醚(150 mL)，同时剧烈搅拌。通过真空过滤收集所得白色沉淀物以得到标题化合物(0.68 g,56 %)。。
制备例34
(1RS,3RS)-3-((S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲酰胺基)环己烷-1-甲酸甲酯
将三乙胺(0.9 mL, 7 mmol)添加到 (–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸 (0.8 g, 3 mmol), (±)-反式-3-氨基环己烷甲酸甲酯盐酸盐(0.5 g, 3mmol)、BOP (2.0 g, 3 mmol)和DMF (5 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。添加碳酸氢钠的饱和水溶液(20 mL)并用EtOAc (2 × 25 mL)萃取。收集有机萃取物；用盐水(25 mL)洗涤；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质在硅胶上进行快速层析，用 10 %-90 % EtOAc/己烷梯度洗脱，以得到标题化合物 (1.00 g, 80 %)。。
实施例1
(S)-N-((2S,4S)-2-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-4-基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲酰胺
将为 DMF (152 mL)中的浆液形式的苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(153 g, 293 mmol)添加到 (–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸(76.0 g, 245 mmol)、((2S,4S)-4-氨基四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇盐酸盐 (72 %纯, 57.37g, 246 mmol)、三乙胺(153 mL, 1.10 mol)和DMF (380 mL)的冷(10℃)混合物中，同时保持内部反应温度低于20℃。此后使混合物温热至室温并将其搅拌30分钟。将混合物倒入冰水中(1.5 L)，同时将其搅拌。用DCM (2 × 600 mL)萃取混合物并用半饱和NaCl水溶液(1.0 L)洗涤合并的有机萃取物。有机溶液经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩滤液以得到湿固体。用水研磨湿固体并通过过滤分离固体。再次用水 (1.5 L) 研磨固体并通过过滤分离固体。用水 (2 × 250 mL)洗涤固体。留出该第一批次的分离固体。收集水洗液；用DCM (2 × 800 mL)萃取；合并DCM萃取物。将第一批次的分离固体添加到合并的DCM萃取物中并用HCl水溶液 (2.5 M, 2 × 800 mL)洗涤。分离水层并添加50% NaOH水溶液至水层直至pH达到12以诱发沉淀。过滤混合物以收集所得固体。用水 (2 × 300 mL)冲洗固体。将固体在真空炉中在50℃干燥3小时。将固体溶解在MeOH (1.2 L)中；添加巯丙基介孔二氧化硅清除树脂(1.2 mmol/g, 715 m2/g, 54 µm平均粒径)；并在50℃搅拌过夜。过滤除去固体，收集滤液。用1:1 CH2Cl2:MeOH (2 × 500 mL)冲洗固体。合并滤液并在减压下浓缩以得到白色固体。用TBME (1.5 L)研磨固体并收集固体。自热EtOH (1.8 L)结晶固体。将固体在真空炉中在50℃干燥2.5小时以得到为结晶白色固体的标题化合物(76.7 g, 76 %)。。
表1中的下列实施例可基本通过制备例34的程序使用适当的起始胺代替(±)-反 式-3-氨基环己烷甲酸甲酯盐酸盐和适当的起始羧酸代替(–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸而制备。
纯化方法(Purif Meth): A= 粗产物通过硅胶正相柱层析纯化，使用EtOAc/己烷梯度洗脱。B= 粗产物通过C18反相柱层析纯化，使用乙腈和水的梯度洗脱。C= 粗产物通过Chiralpak AS-H (21 × 150 mm)的手性柱层析纯化，使用含15% IPA的CO2 作为流动相，流速70 mL/min。
实施例13
(4S)-N-[(1S,3S)-3-(1-羟基-1-甲基-乙基)环己基]-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酰胺
将N,N-二异丙基乙胺 (0.7 mL, 4 mmol) 和HATU (0.31 g, 0.8 mmol)添加到 (–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸 (0.2 g, 0.67 mmol)、2-[(1S,3S)-3-氨基环己基]丙-2-纯盐酸盐(0.13 g, 0.67 mmol)和DMF (5 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌45分钟。所得反应混合物进行C18上的反相快速层析，用5 %-80 % ACN/水的梯度洗脱，以得到标题化合物 (0.26 g, 88 %)。。
基本通过实施例13的程序使用适当的起始羧酸代替 (–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸来制备表2中的下列实施例。
基本通过制备例25的程序使用适当的起始胺代替(±)-反式-5-氨基四氢吡喃-3-甲酸甲酯和适当的起始羧酸代替(–)-(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-甲酸来制备表3中的下列实施例。
纯化方法: A= 粗产物通过硅胶正相柱层析纯化，使用EtOAc/己烷梯度洗脱。C=粗产物通过手性柱层析纯化，使用手性SFC (Chiralcel OD-H, 21 × 250 mm)，使用含25%EtOH(0.2% IPAm)的CO2(scf)作为流动相，流速70 mL/min。
实施例18
(S)-N-((3RS,5SR)-5-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3-基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲酰胺
将5 N NaOH水溶液 (0.5 mL)添加到 (3RS,5RS)-5-((4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]氨基]四氢吡喃-3-甲酸甲酯 (0.085 g, 0.19 mmol)、MeOH (2 mL)和THF (2 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌1小时。添加5 N HCl水溶液 (0.5mL) 并浓缩。粗混合物在THF (6 mL)中稀释并冷却至0℃。逐滴添加硼烷-THF络合物于THF中的2 M溶液(0.15 mL, 0.3 mmol)。将混合物缓慢温热至室温并在室温下搅拌过夜。添加碳酸氢钠饱和水溶液(10 mL)并用EtOAc (3 × 10 mL)萃取混合物。收集有机萃取物；用盐水 (10 mL)洗涤；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得粗物质进行硅胶上的快速层析，用100 % EtOAc洗脱以得到标题化合物(0.046 g, 经2个步骤59 %产率)。。
实施例19
甲基(1RS,3RS)-3-((S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]氨基]环己烷甲酸
将5 N NaOH水溶液(2.2 mL)添加到(±)-反式-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]氨基]环己烷-3-甲酸甲酯 (1.0 g, 2.2 mmol)、MeOH (2 mL)和THF (8mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。添加5 N HCl水溶液 (2.2 mL) 以调节pH至6.5。用EtOAc (2 × 25 mL)萃取并收集有机萃取物。用盐水 (25 mL)洗涤有机萃取物；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩以得到标题化合物(0.935 g, 98 %)。。
实施例20
(S)-N-((1RS,3RS)-3-(乙基氨基甲酰基)环己基)-3,3-二甲基-1-(8-甲基喹啉-2-基)哌啶-4-甲酰胺
将三乙胺(0.7 mL, 5 mmol)添加到(±)-反式-3-[[(4S)-3,3-二甲基-1-(8-甲基-2-喹啉基)哌啶-4-羰基]氨基]环己烷甲酸 (0.9 g, 2 mmol)、乙胺(2 mL, 3 mmol)、BOP(1.0 g, 3 mmol)和DMF (4 mL)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌3小时。添加碳酸氢钠的饱和水溶液(20 mL)。用EtOAc (2 × 50 mL)萃取所得混合物。收集有机萃取物；用盐水(3 × 25 mL)洗涤；经MgSO4干燥；过滤；收集滤液；并在减压下浓缩。所得物质进行C18硅胶上的反相快速层析，使用20 %-80 %乙腈 (0.1 %甲酸)/水(0.1 %甲酸)梯度洗脱，以得到标题化合物(0.25 g, 30 %)。。
生物测定
人mPGES-1酶抑制测定
将人mPGES-1 (Invitrogen™ (Cat# 97002RG, 克隆ID 6374722))亚克隆至pcDNA3.1并在293E细胞中瞬时表达。基于已公布的方法由细胞团块制备微粒体 (Oullet等人,Purification and characterization of recombinant microsomal prostaglandin Esynthase-1, Protein Expression and Purification, 26 pp 489-495 (2002); 和Thoren等人, Human Microsomal Prostanglandin E Synthase-1, J. Biol Chem. 278(25) pp 22199-22209 (2003))。简言之，将团块引入均化缓冲液 (15 mM Tris-HCl, pH8.0; 0.25 M蔗糖; 0.1 mM EDTA; 1 mM谷胱甘肽)并在冰上超声处理5 × 30秒。匀浆在4℃下以5,000 × g离心10分钟。倾析上清液部分并装载至Beckman Quick-Seal®管中并在4℃下以150,000 × g离心90分钟。通过倾析弃去上清液部分并将团块再悬浮于测定缓冲液(10 mM磷酸钠，pH 7.0; 10%甘油; 2.5 mM谷胱甘肽；完全蛋白酶抑制剂混合物(Cocktail) (Roche))中。使用Pierce Coomassie Plus™试剂测定蛋白浓度。
对于酶测定，将微粒体稀释至测定缓冲液并将14 µL/孔的所得溶液添加到384孔测定板中。在Tecan_MC384™上生成化合物稀释板 (Nunc Cat#249944)并将4 µL/孔添加到测定板中。在临用前将前列腺素 H2 (PGH2)稀释至测定缓冲液并将14 µL/孔添加到测定板中。终浓度为6.55 µg/mL微粒体和1.67 µM PGH2。在室温下孵育1.5分钟后，添加5 µL/孔的1 mg/mL SnCl2/0.5 N HCl以中止反应。将5 µL中止的反应物转移至含有45 µL 0.1%甲酸的384孔板并将板在–80℃下储存。将板运至Agilent Technologies（之前为BiociusLifesciences (Wakefield, MA 01880)）用于PGE2的标准LC/MS分析。使用数据计算IC50 (µM)。实施例的化合物以小于100 nM的IC50 µM值抑制人mPGES-1。示例性的实施例1的化合物以 0.00193, + 0.00064 (n=17) 的IC50 µM值抑制人mPGES-1。该结果证实示例性的实施例1的化合物在分离的酶制品中是强效的mPGES-1酶抑制剂。
用于测量类花生酸选择性的基于细胞的测定
人上皮肺癌细胞株 A549获自ATCC (CCL-185)并在Kaighn’s F12细胞培养基 + 10%胎牛血清 (FBS) (平板培养基)中在标准5% CO2 增湿气氛下在37℃下维持。细胞每周以1:3继代两次。
对于该测定，通过用PBS洗涤一次、接着用胰蛋白酶/EDTA洗涤一次，从瓶中释放细胞。在37℃下3-5分钟后，将细胞悬浮在平板培养基中并以2,000 rpm在25℃下离心5分钟。抽吸上清液并将细胞团块再悬浮于F12K平板培养基中。通过在血细胞计数器上对已在PBS和台盼蓝中稀释的细胞等分试样进行计数来测定细胞数目。在处理前24小时将细胞以40,000/孔铺板于96孔Falcon板。将化合物在Screen Mates管中在DMSO中稀释至100 ×终浓度。从细胞中除去培养基并向细胞添加新鲜培养基 (90 µL/孔)。以1 µL/孔(n=2)添加化合物以得到各自的7个浓度。在37℃、5% CO2下用化合物预处理细胞30分钟。通过添加在平板培养基中稀释至10 ×终浓度的重组人白介素(rhIL-1β)来诱发前列腺素 E2生成。添加10µL/孔等分试样以得到0.1 ng/mL的最终rhIL-1β浓度。处理周期为大约18小时。移出条件培养基至v-底聚丙烯板。根据生产商的方案(Cayman)，通过特定酶免疫分析EIAs测定条件培养基的PGE2水平和前列腺素 I2 (PGI2)水平。简言之，将条件培养基(1 µL)添加到涂覆有捕获抗体并含有生产商提供的EIA缓冲液 (49 µL)的96孔板的各孔中。用EIA缓冲液(50 µL)稀释示踪物。用EIA缓冲液(50 µL)稀释检测抗体。板用胶粘密封膜覆盖并在室温下在定轨振荡器上以100 rpm孵育1小时。将洗涤缓冲液稀释至MILLIPORE纯净水中，并将板用平板清洗器清洗(5 × 350 µL/孔)。将底物 (Ellman’s试剂)用MILLIPORE纯净水稀释，然后以200µL/孔添加到板中。在室温下在定轨振荡器上以100 rpm大约 90-120分钟后，在读板器上在A412下读板。使用PGE2的标准曲线校正未知物。示例性的实施例1的化合物以0.00471 µM +0.00301(n=2)的IC50抑制PGE2形成。
人全血分析
收集正常自愿供者的血液于肝素钠VACUTAINER管中。选择供者的部分依据为确认其在供给的两周内未服用NSAIDs、阿司匹林、Celebrex®或糖皮质激素。将所有管/供者汇集到250 mL Corning圆锥形离心管中并将436.5 µL/孔分配到深孔聚丙烯板中。化合物在DMSO中稀释至100 × 最终浓度并一式两份或一式三份添加4.5 µL/孔以得到7点曲线。血液在37℃、5% CO2下在增湿气氛下用化合物预处理，用MicroClime Environmental微板盖覆盖，30分钟后，每孔添加9 µL 的5 mg/mL LPS (Sigma, serotype 0111:B4)于1 mg/mL BSA/PBS中的溶液以得到100 µg/mL的最终LPS浓度。将板在37℃、5% CO2下在增湿气氛下孵育20-24小时。板用铝箔盖紧密密封并在冰上冷冻大约1小时。然后将板以1,800 × g在4℃下在Eppendorf 5810R离心器中离心10分钟。使用具有无菌过滤嘴的Rainin L200从细胞层移去血浆并转移至v-底聚丙烯板。将100微升定量转移至Costar聚集管座中并添加400 µL/孔的MeOH中止试剂和内标d 4-PGE2、 d 4-PGF2α和d 4-TXA2β。将样品涡旋5分钟并在 –20℃下放置至少一小时。样品在Eppendorf 5810R中以4000 rpm离心10分钟。
使用Waters HLB 30 mg/床 96孔板在真空歧管上进行固相萃取：步骤1，基质用MeOH (1 mL)洗涤，接着用0.1%甲酸/水(1 mL)洗涤；步骤2，400 µL样品连同0.1%甲酸/水(900 µL)一起涂覆并允许结合5分钟；步骤3，基质用0.1%甲酸/水 (600 µL)洗涤，接着用80/20 水/MeOH (600 µL)洗涤；步骤4，产物用2-500 µL体积的EtOAc稀释；步骤5，样品在氮气下干燥并在75/25 水/含0.1%甲酸的乙腈 (50 µL)中重构。通过LC/MS/MS分析产物。在该分析中，实施例1以0.00205 ± 0.00082(n=11)的IC50抑制PGE2形成。该结果支持实施例1在人全血中抑制PGE2合成。

Claims (23)

1.式1化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是H或-CH3；
R选自：
和
G选自：
,和。
2.式2化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是H或-CH3；
R选自：
和
G选自：
,和。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是H或-CH3；
R选自：
,和；
G选自：
,和。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R选自：
,和。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R选自：
和。
6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中G是：
或。
7.根据权利要求1-6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是 -CH3。
8.化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物是：
。
9.根据权利要求所述的化合物，其为：
。
10.根据权利要求1-9任一项所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是盐酸盐。
11.药学上可接受的组合物，其包含根据权利要求1-10任一项所述的化合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.治疗需要治疗与关节炎或骨关节炎相关的疼痛的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求11所述的药学上可接受的组合物。
13.治疗需要治疗与关节炎或骨关节炎相关的炎症的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求11所述的药学上可接受的组合物。
14.治疗需要治疗关节炎或骨关节的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求1-10任一项所述的化合物。
15.治疗需要治疗与关节炎相关的疼痛的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求1-10任一项所述的化合物。
16.治疗需要治疗与骨关节炎相关的疼痛的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的权利要求1-10任一项的化合物。
17.治疗需要治疗与关节炎相关的炎症的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求1-10任一项所述的化合物。
18.治疗需要治疗与骨关节炎相关的炎症的患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的根据权利要求1-10任一项所述的化合物。
19.根据权利要求1-10任一项所述的化合物，用作药物。
20.根据权利要求1-10任一项所述的化合物，用于疗法。
21.根据权利要求1-10任一项所述的化合物，用于治疗关节炎或骨关节炎。
22.根据权利要求1-10任一项所述的化合物，用于治疗与关节炎或骨关节炎相关的疼痛或炎症。
23.根据权利要求1-10任一项所述的化合物用于制备治疗关节炎或骨关节炎的药物的用途。
CN201580058595.9A 2014-10-29 2015-10-22 用于抑制微粒体前列腺素e2合成酶-1的新型甲基-哌啶化合物 Active CN107074829B (zh)

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