CN107073020A - 预防和/或治疗感染的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗领域,更具体地说,本发明涉及用于预防和/或治疗受试者胃肠道细菌引起的感染的药剂和成分,所述药剂和成分基于由末端α半乳糖基的药剂。
Description
技术领域
本发明涉及治疗领域,更具体地说,本发明涉及用于预防和/或治疗因受试者胃肠道细菌引起的感染的试剂和成分,所述试剂和成分基于由末端α半乳糖基的药剂。
背景技术
脓毒症(继发性感染引起的急性器官功能障碍)和脓毒性休克(液体复苏不可逆转的重症脓毒症加低血压)等严重感染是重大的医疗问题,每年影响着世界几百万人,四个患者中就有一个死亡(死亡率通常更高),且发病率呈上升趋势。在脓毒症和脓毒性休克的特例中,并没有具体的治疗方案。多年来,Dotrecogin alpha一直被认为是这些病症的独特疗法。但是,由于在反复的临床试验中未能发现初始PROWESS试验中观察到的功效而导致最近退出市场。
可以考虑的严重感染有两种。首先是因大量聚居在上呼吸道(包括肺炎球菌和脑膜炎球菌)的外源微生物而导致的感染,其中,可以使用特定疫苗来防止此类感染相关的疾病。接种疫苗对脑膜炎双球菌感染的作用是无可非议的,在过去的25年里,接种疫苗使青壮年的炎球菌性菌血症或脑膜炎的病例大幅度降低。因为在接种疫苗的受试者中仍然会感染肺炎球菌败血症或脑膜炎,因此接种疫苗对肺炎球菌败血症或脑膜炎的帮助越来越受争议。
第二种主要严重感染是内源性肠道细菌所导致的。“肠道感染的起源”假说提出,肠道腔内常驻细菌转移,通过肠上皮屏障,成为远位点感染源。经过研究发现,引起细菌移位的因素很多。包括内脏血流量不足引起的休克、肠外营养、肠上皮损伤和抗生素疗法。
细菌移位对于院内和中性粒细胞减少患者感染的意义重大,在脓毒症的成因中扮演着重要的角色。每年这可能影响着ICU收治(ICU获得性脓毒症)的高达12%的患者和1.6%的癌症患者。与总人口相比,癌症患者因严重感染住院的可能性高达四倍,住院死亡率为37.8%。其他可能受到肠道细菌感染的患者就是那些接受手术或医疗治疗的患者。接受心脏手术后,1.4%的患者出现严重的感染,死亡率高达32%。同时,最近一项研究显示,普通手术后,分别有2.3%和1.6的患者出现脓毒症和脓毒性休克,而肺栓塞和心脏病发作的发生率分别为0.3%和0.2%。严重感染、脓毒性休克、肺栓塞和心脏病发作在30天内的死亡率分别为5.4%、33.7%、9.1%和32%。这些数据表明,在接受普通手术的那些患者中,严重感染是一个常见的严重并发症,其发生频率高于肺栓塞或心脏病发作。
过去提出了一些预防和/或治疗受试者肠道细菌导致的感染的策略。US8361441B2公开了一种通过服用细菌外膜孔蛋白质A(OmpA)或其提取物来预防和/或治疗哺乳动物中肠杆菌科导致的细菌感染的方法。WO2004078209A1公开了一种治疗革兰氏阴性菌导致的肠道疾病的方法,包括接种疫苗或依据所述个人疫苗培育的超免疫材料,其中,所述疫苗有一个或多个细胞壁抗原以O组血清型特有的方式反应或以脂多糖相关抗原特有的方式反应,且至少有一些所述抗原从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离出来。
然而,目前工艺水平仍有必要确定一种合适、行之有效的试剂,用于治疗或预防胃肠道细菌(包括肠道细菌)导致的受试者感染。
发明摘要
本发明的发明者发现,消除利用受试者中GAS914介导的半乳糖α1,3半乳糖残基消除抗体可增加血清对大肠杆菌血液分离的杀菌活性,提出了由末端α半乳糖基组成的化合物在预防和/或治疗受试者胃肠道细菌,尤其是肠原杆菌导致的感染中的作用。
因此,在第一方面中,本发明涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染的药剂,所述药剂包括末端α-半乳糖基,其中,所述感染由胃肠道的细菌导致。
在又一个方面中,本发明涉及一种成分,包括:
(i)一种由末端α-半乳糖基组成的药剂,以及
(ii)一种抗生素。
在又一个方面中,本发明涉及上述一种用在药物中的成分。
在最后一方面中,本发明涉及上述一种用于预防/或治疗受试者胃肠道细菌导致的感染的成分。
附图简要说明
附图1所示为清除Gal-KO实验鼠中抗半乳糖基抗体的影响。CLP前GAS914治疗鼠(n=17)的存活率(A)和健康度(B)及对照鼠(n=17)。(C)CLP后12小时GAS914治疗鼠的存活率和对照鼠。(D)CLP前GAS914治疗鼠的抗半乳糖基抗体IgM和IgG及对照鼠。
附图2显示,用GAS914消除抗半乳糖基抗体后,患有脓毒病的Gal-KO鼠中粘附于大肠杆菌的IgG抗体出现增加的情况。
附图3所示为GAS914对Gal-KO鼠的杀菌作用,其中,使用GAS914治疗后Gal-KO鼠的血清反应性类似于在缺少抗半乳糖基抗体的野生型小鼠观察到的血清反应性。CLP:盲肠结扎穿孔。
附图4所示为使用多拷贝三糖α半乳糖功能化的二代(G2,16个分支)聚酰胺-胺树枝状聚合物。
本发明的详细说明
本发明的发明者发现,使用含有末端α半乳糖基的化合物(尤其是GAS914)消除血清的半乳糖α1-3半乳糖抗体(抗半乳糖基抗体),会使产生天然抗半乳糖基抗体的动物模型中血清对血液细菌分离,尤其是大肠杆菌分离的IgG反应性和杀菌活性提高。因此,这会引起IgG反应性水平类似于在缺少抗半乳糖基抗体的野生型小鼠中观察到的血清反应性(参见示例2)。基于这些实验数据,本发明的发明者得出结论,消除抗半乳糖基抗体后会提高血清杀菌活性,并提出由末端α半乳糖基组成的化合物在预防和/或治疗受试者胃肠道细菌,尤其是肠原杆菌导致的感染中的作用。
定义
本文使用的“α-半乳糖”或“α-半乳糖基”或“α-半乳糖残基”涉及到分子中的末端半乳糖残基,即,源自于α-半乳糖的糖基。在一些情况下,“α-半乳糖”一词特指结合第二单糖的一个α-半乳糖单位。
本文使用的“由末端α-半乳糖基组成的药剂”一词也称为“α-半乳糖药剂”或“抗半乳糖基抗体结合剂”,指的是任何分子,或分子的组成部分,其中,其末端结构包括Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-R或末端Galα1-3Gal在非还原端的任何糖链,或带末端α-半乳糖单位的任何分子,它能够结合抗半乳糖基抗体,其中所述α-半乳糖单位可结合第二单糖,例如,半乳糖或葡萄糖。α-Gal表位(也称为“α半乳糖表位”或“抗半乳糖基抗体结合表位”)通过糖基化酶α-1,3-半乳糖基转移酶(α1,3GT)合成,并且大量表现在非灵长类哺乳动物、原猴类和新大陆猴的细胞上。α1,3GT基因在旧世界灵长类动物中已灭活。因此,人类、类人猿和旧大陆猴缺少α-Gal表位,且会产生高效价抗半乳糖基抗体。尤其是,本发明的药剂含有末端α半乳糖,其中,所述α半乳糖选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组。
“α半乳糖糖脂”一词指的是在其糖链的非还原端上拥有至少一个α半乳糖基的任何糖脂。“α半乳糖脂质体”一词指的是拥有α半乳糖基,且能够结合抗半乳糖基抗体的任何脂质体。
本文使用的“抗半乳糖基抗体”一词指的是专门与糖脂、糖蛋白或其他含有α半乳糖表位的分子上的α半乳糖表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R或Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-R)相互作用的任何抗体。此抗体构成人类血清大约1%的循环免疫球蛋白(IgG),受刺激时,1%的循环B淋巴球可产生此抗体。抗半乳糖基抗体也以IgA抗体的形式存在于分泌体中,例如唾液、奶汁和初乳。有证据显示,在肠胃菌落的许多细菌中发现的α半乳糖式表位是持续产生抗半乳糖基抗体的抗原来源。尽管人类、类人猿和旧大陆猴的抗半乳糖基抗体非常充沛,但是新大陆猴、原猴类和非灵长类哺乳动物却缺少这类抗体。然而,后一组物种可以产生大量的α半乳糖表位。据估计,抗-Gal出现在不到2800万年前祖先旧大陆的灵长类动物体内,可能是因进化事件而产生,其通过使α1,3半乳糖基转移酶的酶基因失活,而对抑制α-半乳糖基表位表达施加选择压力。这也导致丧失对α-半乳糖基表位的免疫耐受性以及产生抗-Gal。当施用于人类或旧大陆猴时,抗-Gal抗体在体内结合α-Gal表位。这在异种移植情况下特别明显,其中抗-Gal与所移植猪心脏或肾脏上α-Gal表位的体内结合是此类移植物在人类和旧大陆猴体内快速排斥的主要原因。抗-Gal抗体是造成异种移植的超急性排斥的原因。
本文中使用的术语“抗生素”涉及由活性物质或其合成衍生物产生的化学物质,其在低浓度下杀死或阻止某些类别的敏感微生物(通常是细菌)的生长,尽管一些抗生素也用于治疗真菌或原生动物的感染。在人类、动物或园艺药物中使用抗生素,以治疗由微生物引起的感染。本发明中的抗生素包括但不限于氨基糖苷类抗生素、安沙霉素、卡波姆、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、大环内酯、单环内酰胺、青霉素、多肽、喹诺酮、磺胺类药物、四环素和其他药物(例如胂凡纳明)、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇片、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平、替硝唑、紫霉素和卷曲霉素;优选头孢菌素、四环素、糖肽、碳青霉烯、多肽、利福平、氨基糖苷类、磺酰胺、紫霉素和卷曲霉素。在优选实施例中,抗生素选自碳青霉烯、头孢菌素、单环内酰胺、青霉素、多肽、喹诺酮、磺酰胺和四环素。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”以及类似术语是指本质上由一种或多种免疫球蛋白基因或者其片段编码的多肽,并且特异性结合并识别分析物(抗原)。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε,其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成,每对具有一个“轻”链(大约25kD)和一个“重链”(大约50-70kD)。每条链的N末端限定了包含大约100至110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。每个重链的C末端二硫键结合在一起,并形成抗体的恒定区。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列,抗体可以被分配到不同的“类别”。有五种主要抗体类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中部分可进一步细分为“子类别”(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。全长免疫球蛋白“轻链”(包含大约25kDa或者大约214个氨基酸)由一个位于NH2末端的可变区(包含1-10个氨基酸)与一个位于COOH末端的κ或λ恒定区组成。全长免疫球蛋白“重链”(包含大约50kDa或者大约446个氨基酸)类似地由一个可变区(包含大约116个氨基酸)和一个诸如γ的前述重链恒定区或类别(包含大约330个氨基酸)组成。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域公知的。
在本发明的背景环境中,抗体是识别并结合α-Gal表位的抗-Gal抗体,其中所述表位包含末端α半乳糖基。更具体情况下,抗-Gal抗体识别并结合的药剂由选自Galα1-3Gal、Galα1-2Gal、Galα1-6Gal的末端α半乳糖基部分和能够结合抗-Gal抗体的α半乳糖单元组成。更优选情况下,抗-Gal抗体识别并结合α-Gal表位或包含末端Galα1-3Gal的药剂。在进一步优选情况下,抗-Gal抗体识别并结合GAS914。本文中使用的表述“抗体靶”是指抗体的特异性识别以及与特定抗原的结合。本文中使用的表述“特异性结合”是指抗体特异性结合包含末端α-半乳糖基表位的能力,而不是指包含其它碳水化合物表位的能力。
本文中使用的术语“胃肠道细菌”也称为“肠道微生物群落”或“胃肠道菌群”,是指包括通常存在于健康受试者肠道中的需氧和厌氧细菌在内的细菌。胃肠道菌群的组成在各动物物种之间以及单个动物物种内部都是不同的。在人类中,受年龄、饮食、文化条件和抗生素使用的影响,菌群的组成存在差异。在成年人的上胃肠道中,食道仅包含随唾液和食物吞咽的细菌。由于胃液是高酸性,因此可以从正常胃中培养的细菌非常之少(主要是耐酸乳杆菌)。近端小肠具有相对稀疏的革兰氏阳性菌群,主要由乳杆菌和粪肠球菌组成。此区域每毫升液体显示大约105至107个细菌。除了乳杆菌和肠球菌之外,小肠的远端部分还包含更多数量的细菌(108/ml)和其它物种,包括大肠菌(大肠杆菌以及同属菌种)和拟杆菌。大肠(结肠)中菌群的性质与粪便中类似。结肠中的细菌群体达到每毫升粪便1011的水平。大肠杆菌变得更加突出,并且可以定期发现肠球菌、梭菌和乳杆菌,但是优势种类是双歧杆菌(两岐双岐杆菌)属中的厌氧拟杆菌和厌氧乳酸菌。这些生物体在数量上超过大肠杆菌,可能达到1,000:1至10,000:1。有时,人类结肠中可能存在大量厌氧产甲烷菌(高达1010/gm)。胃肠道的菌群组成沿着肠道(在纵向层次)和跨越肠道(在水平层次)变化,其中某些细菌附着于胃肠上皮,而其他细菌则出现在管腔中。在本发明的一个具体实施例中,胃肠道的细菌是肠原杆菌。
本文中使用的术语“树枝状大分子”是指具有核并且具有从核发出的多个分支结构壳的大分子。树枝状大分子的形状和大小可能有所不同。在一个具体实施例中,树枝状大分子的形状近似于球形。树枝状大分子的直径可在大约15埃(A)到大约250A范围内,并具有相应的分子量范围,例如大约500道尔顿到大约2百万道尔顿。可以从各种来源(例如Dendritech、Midland、Michigan)商购获得或者通过本领域技术人员已知的方法合成树枝状大分子。树形分子可以大体上分为低分子量和高分子量两种。第一类包括树枝状大分子和树枝化基元,而第二类包括树枝状聚合物、超支化聚合物和刷状聚合物(也称为瓶刷)。树枝状大分子和树枝化基元是重复支链、单分散且通常高度对称的化合物。在定义树枝状大分子和树枝化基元时没有明显差异。树枝化基元通常包含称为焦点的单个化学定位基。由于缺乏摩尔质量分布,高摩尔质量的树枝状大分子和树枝状化基元是大分子,而不是聚合物。树枝状大分子的性质由分子表面上的官能团控制。功能分子的树枝状包封允许分离活性位点,该结构模拟生物材料中活性位点的结构,因为树枝状支架会分离内部与外部功能。例如,当树枝状大分子的端基是亲水性基团(例如羧基)时,树枝状大分子可以是水溶性的。
树枝状大分子通常可以表征为以下特征:(i)引发剂核(I),其可具有一个或多个反应位点,并且是点状或极大,以产生树枝状大分子的最终结构;(ii)连接到引发剂核上的一个或多个分支化重复单元层;(iii)官能端基,例如阴离子或阳离子基团,可通过连接基团连接到树枝状大分子的表面。
核心部分可仅包含构造单元的1个连接点,或者可包含2个、3个或更多个连接点,其可以或可以不进一步用于连接构造单元。通常,连接点是游离氨基。核心部分可以由构造单元组成、包括构造单元或衍生自构造单元,或者可以是不同于构造单元的分子。核心部分示例在本文中进行说明,并在出版物WO/2007/106944中进行描述。
本文中使用的术语“肠原杆菌”是指具有兼性厌氧代谢的革兰氏阴性杆状细菌,其存在于健康和患病动物的肠道中。它们还具有以下特征:对真实的过氧化氢酶和细胞色素呈阳性,通过两种主要途径之一将葡萄糖发酵成各种最终产物,呈氧化酶阴性,并且在细胞壁中具有肠道菌共同抗原。这个菌科的一些成员可以生存在肠道中,而不会导致健康个体发生健康问题,而其他成员则几乎总是造成感染的迹象,包括呕吐、腹泻和相关症状。在一个具体实施例中,本发明中的肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属,以及肠杆菌科。
本文中使用的术语“肠杆菌科”与肠原杆菌相关,这些肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。
本文中使用的术语“表位”或“抗原决定簇”包括抗体特异性识别的抗原的任何区域。同一抗原可能具有不同的表位。每个表位通常由分子化学活性表面簇(例如氨基酸或糖侧链)组成,其具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在本发明的背景环境中,表位是α-Gal表位,其中所述表位包含末端α-半乳糖基,并且其中所述表位被抗-Gal抗体所识别和结合。
本文中使用的术语“感染”涉及细菌、病毒、真菌、原生动物或其它微生物的侵入,是指在宿主生物体内非期望的病原微生物侵入增殖或存在。它包括通常存在于哺乳动物或其他生物体中或身体上的微生物的过度生长。更一般的情况下,微生物感染可以是微生物种群的存在对宿主哺乳动物造成损害的任何情况。因此,当哺乳动物体内或身体上存在过量微生物种群时,或者当微生物种群的存在影响影响破坏哺乳动物的细胞或其它组织时,即存在微生物感染。尤其是,在本发明的背景环境中,感染是细菌感染。在一个具体实施例中,细菌感染是由胃肠道的细菌所引起。在一个更具体的实施例中,胃肠道细菌是一种肠原杆菌,可能选自包含以下细菌属的菌群:不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属,以及肠杆菌科。再具体而言,肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、链球菌属和韦荣球菌属。在另一个实施例中,胃肠道的细菌不是引起胃肠道感染的肠杆菌科细菌,不是梭菌属细菌,并且/或者不是葡萄球菌属细菌。引起胃肠道感染的肠杆菌科肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属,以及肠致病性(EPEC,腹泻的病原体)、肠产毒素(ETEC,无发热腹泻的病原体)、肠侵入性(EIEC,导致类似于志贺氏菌病的综合症状)、肠出血性(EHEC,血性腹泻的病原体)和肠聚集性(EAEC,也称为异位粘附,无发热水性腹泻的病原体)大肠杆菌菌种。
本文中使用的术语“半乳糖”或“Gal”是指以开链和环状形式存在的葡萄糖的C-4差向异构体。开链形式的链末端具有羰基。在开链形式中,D-和L-异构体不能分离,但是环状形式可以结晶及分离。
术语“Gal(α1,3)Gal”或“Gal(α1,3)”或α1,3半乳二糖(在某些情况下也称为α-Gal)是指半乳糖(α1,3)半乳糖(CAS编号13168-24-6)。包含半乳糖-α-1,3-半乳糖表位的化合物包括但不限于半乳糖-α-1,3-半乳糖及其衍生物,包括半乳糖-α-1,3-半乳糖低聚物(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体)和具有末端为半乳糖-α-1,3-半乳糖的低聚糖的糖肽。半乳糖-α-1,3-半乳糖的衍生物包括例如酰胺、酯、醚、胺、磺酰胺、硫醚、缩醛、氨基甲酸酯、脲和脒。包含半乳糖-α-1,3-半乳糖表位的化合物示例包括但不限于半乳糖-α-1,3-半乳糖(α1-3半乳糖)(Galα1-3Gal)及其衍生物,例如,葡糖胺衍生物、线性B-2三糖(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc)、线性B-6三糖(Galα1-3Galβ1-4Glc)及其衍生物、α1-3半乳糖基β-甲基糖苷、α1-3、β1-4半乳糖三糖(Galα1-3Galβ1-4Gal)、半乳糖四糖(Galα1-3Galβ1-4Galα1-3-D-Gal)及其衍生物,例如氨基酸衍生物(例如十二赖氨酸、甘氨酸)和具有半乳糖-α-1,3-半乳糖的糖肽。
类似地,术语“Gal(α1,2)Gal”、“Gal(α1,6)Gal”和“Gal(α1,6)Glc”分别是指半乳糖(α1,2)半乳糖、半乳糖(α1,6)半乳糖和半乳糖(α1,6)葡萄糖。
本文中使用的术语“GAS914”是指大约500kDa的可溶性Gal三糖-聚赖氨酸偶联物,其通过α-Gal IgM(IC(50),43nM)和IgG(IC(50),28nM)抗体在体外有效竞争α-Gal结合(Katopodis G以及其他人。2002J.Clin.Invest.,110:1869-1877;Zhong R et al.2003Transplantation 75:10-19)。它是具有线性聚赖氨酸主链(平均长度为1,000个赖氨酸)和大约25%的侧链与线性B三糖(型2线性B三糖,Galα1-3Galβ1-4GlcNAc)缀合的人工可注射抗原。Novartis AG(瑞士巴塞尔)的WO9847915中对它进行了说明。GAS914具有以下结构(Katopodis G以及其他人。2002J Clin Invest 110(12):1869-1877)。
GAS914的化学结构在本文中显示为无规共聚物,其中n表示平均聚合度;x表示糖基化单体的分数;并且1-x表示硫甘油封端单体的分数。
本文中使用的术语“糖缀合物”是指与第二化学物质共价连接的碳水化合物,其中所述第二化学物质选自蛋白质(称为糖蛋白)、肽(肽聚糖、葡萄糖)、脂质(糖脂,脂多糖)、糖(糖类)。本发明中的糖缀合物包括但不限于其中包含末端α-半乳糖基部分的碳水化合物与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或1,2-双十六烷氧基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(HDPE)缀合。
术语“糖脂”是指与碳水化合物连接的脂质分子。糖脂包括甘油糖脂、糖鞘脂和糖基磷脂酰肌醇。本发明中的糖脂包含至少一个包含末端α-半乳糖基残基的碳水化合物残基。在一个具体实施例中,本发明中的糖脂包含末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc或者能够结合抗-Gal抗体的末端α-半乳糖单元,更优选的是末端Galα1-3Gal。
术语“糖蛋白”是指通过至少一个碳水化合物残基共价修饰的任何蛋白质。本发明采用的方法可以研究的糖蛋白包括被单糖或低聚糖修饰的糖蛋白,并且其中所述单糖或低聚糖通过包含氮原子(N-糖基化)或氧原子(O-糖基化)的侧链结合到多肽链。通常,N-糖基化包括天冬酰胺残基中的蛋白质修饰,其形成Asn-X-Ser或Asn-X-Thr型共有序列的一部分。O-糖基化出现在丝氨酸和/或苏氨酸残基的侧链中。本发明中的糖蛋白和糖肽包含至少一个包含末端α-半乳糖基部分的碳水化合物残基,特别是选自末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc或者能够结合抗-Gal抗体的末端α-半乳糖单元,更优选的是末端Galα1-3Gal。
本文中使用的术语“部分”是指可包括全部官能团或部分官能团作为亚结构的分子的一部分。
术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者,特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农场动物以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。在本发明的一个优选实施例中,受试者缺少α-Gal表位,但具有天然抗-Gal抗体,并且包括人类、猿和旧大陆猴(猴总科、狭鼻类进化支,包括狒狒和猕猴)。在本发明的一个更优选实施例中,受试者是人类。在一个具体实施例中,受试者被感染,特别是受试者被胃肠道细菌感染,更具体而言是被肠原杆菌感染。
本文中使用的术语“载体”是指被配置为以提供稳定缔合的方式,与包含本发明末端α-半乳糖基部分的试剂化学结合的任何材料。这种结合可以是共价,也可以是非共价。非共价结合包括静电、亲水和疏水相互作用。共价结合会形成共价键,其特征为在原子之间共享电子对。这种共价结合可以直接在试剂和载体之间,或者可以通过交联剂或通过在载体和/或试剂上包含特异性反应基团形成。可以使用固定在载体上的结合配偶体(例如抗生物素蛋白或链霉亲和素),以及生物素化的试剂与抗生物素蛋白或链霉亲和素的非共价结合来实现试剂的共价附着。固定化还可能涉及共价和非共价相互作用的组合。本发明中的载体允许在其上沉积试剂,其在所需位置,特别是在试剂发挥其效果的位置处的输送和/或释放。
用于预防和/或治疗感染的药剂
在第一方面中,本发明涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染的药剂,所述药剂包括末端α-半乳糖基,其中,所述感染由胃肠道的细菌导致。
或者,本发明涉及将包含末端α-半乳糖基部分的药剂用于制备预防和/或治疗受试者感染的药物,其中,所述感染由胃肠道的细菌导致。或者,本发明涉及预防和/或治疗受试者感染的方法,其中所述感染由胃肠道的细菌导致,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的药剂,该药剂包括末端α-半乳糖基部分。
在一个具体实施例中,通过从由所述药剂介导的血清中除去抗-Gal抗体,来执行所述感染的预防和/或治疗。在另一个优选实施例中,通过除去IgG2同种型的抗-Gal抗体,执行预防和/或治疗。这些抗体不能有效激活补体。除去IgG2同种型的抗-Gal抗体,允许作为更有效补体激活剂的其它IgG同种型结合细菌抗原,从而促进补体活化。
因此,本发明涉及用于预防和/或治疗受试者感染的药剂,其中包含末端α-半乳糖基部分。通过本发明中使用的药剂预防和/或治疗的所述感染是由胃肠道的细菌导致。在一个具体实施例中,胃肠道的细菌是肠原杆菌。更具体而言,肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣氏菌属,以及肠杆菌科。再具体而言,肠杆菌科的肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。再具体而言,肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、链球菌属和韦荣球菌属。在另一个实施例中,胃肠道的细菌不是引起胃肠道感染的肠杆菌科细菌,不是梭菌属细菌,并且/或者不是葡萄球菌属细菌。引起胃肠道感染的肠杆菌科肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属,以及肠致病性(EPEC)、肠产毒素(ETEC)、肠侵入性(EIEC)、肠出血性(EHEC)和肠聚集性(EAEC,也称为异位粘附)大肠杆菌菌种。
不动杆菌属是属于更广泛类型变形菌门丫亚群的革兰氏阴性需氧性细菌属。不动杆菌属菌种为非运动型且氧化酶阴性,并且在放大下成对出现。不动杆菌属菌种是医院中虚弱患者的主要感染源,特别是鲍氏不动杆菌菌种。在一个具体实施例中,不动杆菌属肠原杆菌是鲍氏不动杆菌。
放线菌属是革兰氏阳性的兼性厌氧放线菌属(迈尔放线菌除外,它是严格厌氧菌)。所有菌种都在厌氧条件下生长最好。放线菌属菌种不形成内生孢子,并且虽然单个细菌是杆状的,但是放线菌属菌落形成类真菌分支的菌丝网络。放线菌属菌种通常存在于牙龈中,并且是牙科手术和口腔脓肿中最常见的感染原因。许多放线菌属菌种是人类和其他哺乳动物的机会致病菌,特别是在口腔中。在极少数情况下,这些细菌可能导致放线菌病,这种疾病的特征是在口腔、肺或胃肠道中形成脓肿。放线菌病最常由衣氏放线菌引起。衣氏放线菌也可能导致心内膜炎。
拟杆菌属是革兰氏阴性的专性厌氧细菌属。拟杆菌属菌种是非内生孢子形成的杆菌,可以是运动型或非运动型,这取决于菌种。DNA碱基组成为40-48%GC。一些菌种(例如脆弱拟杆菌)是人类的机会致病菌,其通过脓肿形成引起腹膜腔、胃肠道手术和阑尾炎感染,抑制吞噬作用,以及灭活β-内酰胺类抗生素。拟杆菌属菌种虽然厌氧,但它们瞬时耐氧,因此可以在腹腔中存活。
双歧杆菌属是革兰氏阳性、非运动型且经常分枝的厌氧性细菌属。它们是哺乳动物(包括人类)的胃肠道、阴道和口腔(齿双歧杆菌)内普遍存在的内共生居民。双歧杆菌是构成哺乳动物结肠菌群的主要细菌属之一。一些双歧杆菌用作益生菌。
弯曲菌属是革兰氏阴性的微需氧性细菌属。它是因处理生肉或未烹熟肉类而导致食物中毒的重要原因。这些微生物是运动型、具有单极或双极鞭毛、具有特有螺旋外观且氧化酶阳性。空肠弯曲杆菌是许多发达国家细菌性食源性疾病的主要原因之一。人类疾病至少涉及到十几种弯曲杆菌菌种。本发明的优选实施例包括空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。弯曲杆菌病涉及由弯曲杆菌引起的感染。它产生炎症,有时导致出血、腹泻、牙周炎或痢疾综合征,多数包括痉挛、发烧和疼痛。
梭菌属是革兰氏阳性细菌属,是能够产生内生孢子的专性厌氧菌。个体细胞是杆状的。其中五个主要菌种会造成人类疾病,全部都是本发明的优选实施例:肉毒杆菌(它在食物/伤口中产生肉毒杆菌毒素并且可能引起肉毒中毒)、梭状芽胞杆菌(当在抗生素治疗期间肠道中的其他细菌被杀死时,它可以繁殖而导致假膜性结肠炎,这是抗生素相关腹泻的原因)、产气荚膜梭菌(也称为韦氏梭菌,它引起从食物中毒到气性坏疽各种症状,并且是责肠毒素血症的原因)、破伤风梭菌(它是破伤风的致病微生物)和索氏梭菌(它可能导致药物流产后的罕见情况下发生致命感染)。
棒状杆菌属是革兰氏阳性的杆状细菌属,广泛分布在自然界中,大部分是无害的。在优选实施例中,棒状杆菌属是白喉棒状杆菌。
肠球菌是革兰氏阳性的厚壁菌门乳酸菌细菌属。肠球菌引起的重要临床感染包括尿道感染、菌血症、细菌性心内膜炎、憩室炎和脑膜炎。这些细菌的敏感菌株可使用氨苄青霉素、青霉素和万古霉素进行治疗。在一个具体实施例中,肠球菌属肠原杆菌选自包含粪肠球菌和屎肠球菌的菌群。
真细菌是真杆菌科的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌属。这些细菌的特征是具有刚性细胞壁。它们可能是运动型(它们具有鞭毛)或非运动型。
梭菌属是革兰氏阴性的厌氧细菌属,其中个体细胞是具有尖头的杆状杆菌。
嗜血杆菌属是巴斯德氏菌科的革兰氏阴性多形球杆菌菌属,并且是需氧性或兼性厌氧。优选的实施例包括流感嗜血杆菌和杜克嗜血杆菌(软性下疳的病原体)。
螺杆菌属是具有特有螺旋形状的革兰氏阴性细菌属。在优选实施例中,螺杆菌属细菌是幽门螺杆菌。
乳杆菌属是革兰氏阳性的兼性厌氧或微需氧杆状细菌属。
动弯杆菌属是革兰氏阳性的厌氧杆状细菌属。它们存在于人类阴道中,特别是在细菌性阴道病情况下,与阴道加德纳氏菌联合。
消化链球菌属是非孢子形成的革兰氏阳性厌氧细菌属。在一个实施例中,消化链球菌属细菌是大消化链球菌。
卟啉单胞菌属是革兰氏阴性的非运动型杆状厌氧细菌属。在一个实施例中,卟啉单胞菌属细菌是牙龈卟啉单胞菌。
普氏菌属是革兰氏阴性的细菌属。普雷沃菌属是口腔和阴道菌群成员,并且从呼吸道的厌氧菌感染中重新获得。
丙酸杆菌属是能够通过转羧酶合成丙酸的革兰氏阳性杆状细菌属。
假单胞菌属是革兰氏阴性的需氧性葡萄球菌属。在一个具体实施例中,假单胞菌属肠原杆菌是绿脓杆菌。
葡萄球菌属是革兰氏阳性的细菌属,具有圆形外观(球菌)和葡萄簇样形状。在一个具体实施例中,葡萄球菌属肠原杆菌选自包含金黄色酿脓葡萄球菌的菌群。
链球菌属是属于厚壁菌门和乳酸菌群的革兰氏阳性球形细菌属。
韦荣氏菌属是革兰氏阴性厌氧性细菌属,以其乳酸发酵能力而闻名。在一个优选实施例中,韦荣氏菌属的细菌是小韦荣球菌。
肠杆菌科是革兰氏阴性的大型菌科,包括无害共生体以及病原体(包括沙门氏菌、大肠杆菌、鼠疫杆菌、克雷伯氏菌和志贺氏菌)。此菌科中的其他致病细菌包括变形杆菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属和柠檬酸杆菌属。此菌科的许多成员是存在于人类和其他动物肠脏中的正常肠道菌群的一部分,而其他成员则是存在于水或土壤中,或者是各种不同动物和植物体上的寄生虫。大肠杆菌是最重要的模式生物之一。在一个具体实施例中,肠杆菌科的肠原杆菌选自包含以下细菌属的菌群:柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。
柠檬酸杆菌属是肠杆菌科的革兰氏阴性大肠菌细菌属。丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌、科氏柠檬酸杆菌和弗劳地氏枸橼酸杆菌菌种可以使用柠檬酸盐作为唯一碳源。这些菌种全部都是本发明的优选实施例。
肠杆菌属是肠杆菌科非芽孢形成的通常革兰氏阴性的兼性厌氧杆状细菌属。在一个具体实施例中,肠杆菌属肠原杆菌选自包含产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的菌群。
埃希氏菌属是肠杆菌科非孢子形成的革兰氏阴性的兼性厌氧杆状细菌属。在一个具体实施例中,埃希氏菌属肠原杆菌是大肠杆菌。
克雷伯氏菌属是肠杆菌科具有突出多糖荚膜的革兰氏阴性氧化酶阴性的非运动型杆状细菌属。在一个具体实施例中,克雷伯氏菌属肠原杆菌是肺炎克雷伯杆菌。
变形杆菌属是肠杆菌科变形菌门的革兰氏阴性菌属。在优选实施例中,变形杆菌属的细菌是奇异变异杆菌或普通变形杆菌。
沙门氏菌属是肠杆菌科革兰氏阴性的杆状细菌属。沙门氏菌属包含两个菌种,即邦戈尔沙门菌和肠道沙门菌,其中后者包含大约六个亚菌种。沙门氏菌存在于世界范围内的冷血动物和温血动物体内以及环境中。它们引起诸如伤寒、副伤寒和食物中毒等疾病。沙门氏菌属菌种是兼性细胞内病原体。许多感染都是由于摄入了受污染的食物。它们可以分成两组:伤寒性和非伤寒性沙门氏菌血清型。伤寒性血清型包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌。
沙雷氏菌属是肠杆菌科革兰氏阴性的兼性厌氧杆状细菌属。在一个具体实施例中,沙雷氏菌属的细菌是粘质沙雷氏菌、普城沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、深红沙雷氏菌或臭味菌。
志贺氏菌属是非芽孢形成的革兰氏阴性的兼性厌氧非运动型杆状细菌属。在一个具体实施例中,志贺氏菌属的细菌是鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌或宋氏志贺氏菌。
耶尔森氏菌属是肠杆菌科革兰氏阴性的杆状兼性厌氧细菌属,长度为几微米,直径不到一微米。耶尔森氏菌的一些成员对人类来说是致病性的;特别是鼠疫耶氏菌是鼠疫的致病因子。啮齿类动物是耶尔森氏菌的自然宿主,而在较少情况下,其他哺乳动物也会作为宿主。感染可能通过血液(若为鼠疫耶氏菌),或者通过饮食方式,有时是因为食用了被尿液或粪便污染的食品(特别是蔬菜、乳制品和肉类)而发生。
在具体实施例中,受胃肠道细菌感染的受试者或受胃肠道细菌感染的潜在患者具有天然内源性抗半乳糖基抗体。在具体优选实施例中,受试者为人类。
胃肠道细菌可能感染受试者的任何器官或组织。在具体实施例中,受试者血液、胃肠道、心脏、心血管系统、肝脏、肺、呼吸道、肾、泌尿系统、中枢神经系统、皮肤、皮下组织或手术伤口出现由胃肠道细菌,尤其是肠原杆菌导致的感染。在更具体实施例中,受试者血液中出现由胃肠道细菌,尤其是肠原杆菌导致的感染。
在一个实施例中,通过消除血清中的抗半乳糖基抗体,提高血清的杀菌活性,实现了由末端α-半乳糖基组成的药剂的治疗效果。在另一个实施例中,通过调节患者对感染细菌的炎症反应,未实现由末端α-半乳糖基组成的药剂的治疗效果。
如前所述,本发明使用的药剂由末端α-半乳糖基组成。在具体实施例中,所述末端α半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组。在具体优选实施例中,本发明使用的末端α半乳糖基药剂由末端Galα1-3Gal组成。
本发明使用的由一个或多个末端α-半乳糖基组成的天然或合成分子包括,但不限于以下分子:
i.半乳糖-α-1,3-半乳糖、半乳糖-α-1,3-半乳糖低聚物(如二聚体或二糖、调聚物或三糖、四聚体或四糖、五聚体或五糖)及其衍生物,包括氨基葡萄糖衍生物、线性B-2三糖(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc,CAS号:101627-01-4)、线性B-6三糖(Galα1-3Galβ1-4Glc,CAS号:56038-36-9)及其衍生物、α1-3半乳二糖基β-甲基糖苷;α1-3,β1-4半乳三糖(Galα1-3Galβ1-4Gal,CAS号56038-36-9)、半乳四糖(Galα1-3Galβ1-4Galα1-3-D-Gal,CAS号:56038-38-1)、Galili五糖(L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)及其衍生物,如氨基酸衍生物(如十三赖氨酸、甘氨酸)、酰胺、酯、醚、胺、磺胺、硫醚、乙缩醛、氨基甲酸酯、脲和脒、
ii.由低聚糖和末端半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖肽、
iii.由低聚糖和末端半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖蛋白
iv.由末端α-半乳糖基组成的糖脂,如市售糖脂(英国Dextra Laboratories公司),如由血型B型2线性三糖(GN334,Galα1-3Galβ1-4GlcNac,CAS号:101627-01-4)和Galili五糖(L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)组成的Galα1-3Gal糖脂,
v.由末端α-半乳糖基组成的复合糖,如由半乳糖-α-1,3-半乳糖半乳糖抗原表位组成的市售复合糖,包括:Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(3-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2335)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-HDPE(#NGL0334)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP0203,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA(#NGP0333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-HSA(#NGP2333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(6-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2336,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4Glc-HSA(#NGP2330,3原子间隔)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP1203,14原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP2203,3原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP3203,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP0334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP1334,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP2334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP3334,14原子间隔)和Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-HDPE(#NGL0203)、
vi.半乳糖-α-1,3-半乳糖低聚糖,如Elicityl市售低聚糖,包括但不限于:Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc(#GLY076)、Galα1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc(#GLY075)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]4Galβ1-4Glc(#GLY079)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]3Galβ1-4Glc(#GLY078)、Galα1-3Galβ1-4Glc(#GLY070)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]2Galβ1-4Glc(#GLY077)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(#GLY071)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc(#GLY74-2,线性B-2三糖)和Galα1-3Galβ1-3GlcNAc(#GLY74-1),
vii.由终端α-半乳糖基组成的脂质体以及
viii.由适用于注射和随后原位结合抗半乳糖基抗体的α-GAL抗原表位组成的其它大分子包括,但不限于:
οLife Technologies(#23017-015)市售的50-70α-半乳糖抗原表位的小鼠层粘连蛋白(Galili U 1993施普林格免疫病理学研讨会15,155),
ο与牛血清白蛋白连接的多合成α-半乳糖抗原表位(Stone KR等人2007年,《移植杂志》,第83卷,第2期:第211-219页,
οGAS914,由Novartis(WO9847915)编制,由Zhong R等人披露2003年,《移植杂志》,第75卷,第1期:第10-19页,
οα-半乳糖聚乙二醇共轭TPC(Schirmer JM等人2004年,《异种移植杂志》,第11卷,第5期:第436-443页),以及
ο与高分子主链连接的α-半乳糖抗原表位-模拟多肽(Sandrin MS1997年,Glycoconj J,第14jaunty,第1期:第97-105页),以及由粘蛋白基因MUC1、3和4编码的多肽。
在本发明的一个实施例中,使用由末端α-半乳糖基组成的药剂予以支持。在具体实施例中,所述药剂通过一种连接剂予以支持,其中该连接剂是能够与支持药剂共价键链接的任何双功能(同型或异型双功能)单位。用于支持并由末端α-半乳糖基组成的药剂的结构可使目标抗体药剂实现更好疗效并使其成为更稳定化合物。此外,在皮下注射或静脉注射药剂的优选案例中,药剂半衰期高于以不支持形式给药时的半衰期,如单糖、二糖或三糖。
在具体实施例中,含有可通过交联剂共轭的反应性基团的分子为蛋白或多肽。就蛋白交联而言,蛋白交联剂功能基团包括胺基、赖氨酸ε-氨基、末端α-氨基、半胱氨酸巯基(-SH或硫醇基)、碳水化合物(糖蛋白)或羧基。
胺基、赖氨酸ε-氨基、末端α-氨基蛋白交联剂包括,但不限于酰亚胺酯和NH-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)。巯基蛋白交联剂包括,但不限于马来酰亚胺、卤乙酰基(如碘代乙酰基)和吡啶二硫。通过氧化处理糖蛋白碳水化合物的羰基蛋白交联剂(如醛或酮)包括,但不限于由酰肼组成的试剂(-NH-NH2-)。羧基蛋白交联剂包括,但不限于碳二亚胺。
本发明使用的适用支持材料包括能够与由末端α-半乳糖基组成的本发明药剂相结合的任何分子。适用支持材料包括高分子材料,尤其是纤维素材料和纤维素衍生材料,如含纤维纸、合成或改性天然聚合物,如聚氨基酸,尤其是多聚赖氨酸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸脂、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙、聚乙烯基丁醛)等;单独使用或与其他材料联合使用;玻璃、陶瓷和金属等。
在具体实施例中,支持末端α-半乳糖基连接的材料选自由线性多聚赖氨酸、最好是多聚赖氨酸和树枝状聚合物组成的组。用作支持材料的多聚赖氨酸含有10到5000个赖氨酸,优选20至2500个赖氨酸,50至2000个赖氨酸更佳,甚至约1000个赖氨酸最佳。
在具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中
-末端α-半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组,α-半乳糖优选末端Galα1-3Gal,而选择末端Galα1-3Gal更佳,选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc最佳。
-使用的支持材料为线性聚赖氨酸主链,最好是多聚赖氨酸,所述主链含有10到5000个赖氨酸,优选20至2500个赖氨酸,50至2000个赖氨酸更佳,甚至约1000个赖氨酸最佳。
在另一个实施例中,对多聚赖氨酸主链中不含末端α-半乳糖基的部分或全部ε-氨基基团形成帽式结构。在优选实施例中,帽式结构是一种硫代甘油。
在更具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc作为末端α-半乳糖基,选择线性多聚赖氨酸主链作为支持材料,最好选择GAS914作为药剂,所述线性多聚赖氨酸主链的平均长度为1,000个赖氨酸,约25%侧链与Galα1-3Galβ1-4GlcNAc共轭。
在另一个具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中
-末端α-半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组,α-半乳糖优选末端Galα1-3Gal,而选择末端Galα1-3Gal更佳,选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc最佳。
-选择一种树枝状聚合物作为支持材料。
在更具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc作为末端α-半乳糖基,选择树枝状聚合物作为支持材料。
可用代编号(GN)标识树枝状聚合物,每次完成合成反应后将生成一个新的树枝状聚合物代编号。分子量和末端基团数随树枝状聚合物代编号(层数)的增加而呈指数级增长。可基于启动聚合过程的核心结构合成不同类型的树枝状聚合物。本发明可使用任何一代的树枝状聚合物。
在某些方面,树枝状聚合物的核心结构决定分子整体形状、密度和表面功能等多个特征。在具体实施例中,球形树枝状聚合物使用氨作为三价引发内核或乙二胺(EDA)作为四价引发内核。杆状树枝状聚合物使用不同长度的聚乙烯亚胺线性内核;内核越长,杆长度越长。
在具体实施例中,根据以下公式从包含长链二胺、羟烷基胺或羟烯醇的组中选择树枝状聚合物内核:
其中n范围0到20,优选0到10,0到5更佳,而最好选择n为2;R选自氢和烷基。
在本发明的一个说明性、非限制性实施例中,组成模块与内核连接形成以下结构:
其中n范围0到20,优选0到10,0到5更佳,R选自氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氨基、(C1-C8)二烷胺基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)烯氨基、(C2-C8)二烯氨基、(C2-C8)炔基、(C2-C8)炔胺基、(C2-C8)二炔胺基、烷氧基、芳烷基、烷酰基、烷基、羟烷基、-CO2R’和-CONHR’,其中R’是烷基。
本发明使用的树枝状聚合物包括,但不限于对称和非对称支化树枝状聚合物、级联分子、树枝醇等,但致密型星形聚合物为最佳树枝状聚合物。本发明公开了一种对称致密型星形树枝状聚合物,分支臂长度相等。全代树枝状聚合物-NH2基团氢原子或半代树枝状聚合物末端-COOH基团氢原子发生支化。树枝状聚合物的最大分支数为2n。
本发明使用的树枝状聚合物包括,但不限于聚(胺基酰胺)(PAMAM)树枝状聚合物,如致密型星形树枝状聚合物和星状聚合物、聚(氨基有机硅)(PAMAMOS)树枝状聚合物、(聚(丙烯亚胺))(PPI)树枝状聚合物、舟状头树枝状聚合物、多语种树枝状聚合物、手性树枝状聚合物、混合树枝状聚合物/线性聚合物、两亲性类树枝状聚合物、胶束树枝状聚合物和Fréchet型树枝状聚合物。
在具体实施例中,本发明使用的药剂与一种树枝状聚合物连接,所述树枝状聚合物是一种PAMAM树枝状聚合物。PAMAM树枝状聚合物是一类水溶性聚合物,具有独特的树状分支结构,液体呈紧凑型球形。使用乙二胺(EDA)和1,4-二氨基丁烷(DAB)等不同内核可合成几类PAMAM树枝状聚合物与不同表面基团(如氨基、羟基或羧基)。在一些实施例中,PAMAM树枝状聚合物是N代(GN)树枝状聚合物的一种,其中n是0至10之间的整数,官能团数目为2n。在一个实施例中,树枝状聚合物为G1树枝状聚合物,而在另一个实施例中,树枝状聚合物为G2树枝状聚合物。
一方面,首选PAMAM树枝状聚合物。在具体实施例中,树枝状聚合物分支数量范围为4(G0)至1024(G7),优选8(G1)至512(G6),但16(G2)至128(G5)个可能分支更佳。这些分支的替代等级范围为10至100%,首选25%至100%。Gn和%两个替代参数可给出整个分子中抗原表位(药剂)分子的的总体数量。
图4通过案例显示由第二代(G2)PAMAM树枝状聚合物组成的分子结构完全取代由α-半乳糖组成的三糖。
这些化合物以及类似合成和天然复合糖、糖脂、糖蛋白或含末端α-半乳糖基,尤其是末端Galα1-3Gal并与活性基团连接的低聚糖也可与抗半乳糖基抗体结合,因此被认为是本发明使用药剂的功能等价物。在具体优选实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂是GAS914。
本领域技术人员熟知用于确定分子是否能够与抗体,尤其是抗半乳糖基抗体特异结合的方法,这些方法包括,但不限于免疫沉淀法、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光技术,如荧光显微镜或流式细胞仪。
同样,本领域技术人员也熟知用于确定药剂杀菌活性的方法,包括本申请实例2描述的由发明者进行的方法,以及用于确定药物最低杀菌浓度(MBC)和Hacek描述的治疗期间患者血液或体液的血清杀菌效价(SBT)的方法(Hacek DM等人,1999J Clin Microbiol 37(6):1881-1884)。
可用公式表示本发明使用的适当药剂量以及药学可接受辅料或载体,以获得用于预防和/或治疗由胃肠道细菌导致感染的药物组合物。可通过各种途径向受试者注射含本发明使用药剂的一种组合物,这些途径包括但不限于全身注射,如静脉注射、皮下注射、肌肉注射和腹腔内注射。此外,还可以鼻内或舌下服用含本发明使用药剂的组合物,允许通过非侵入性给药方式进行全身给药。另外,脑室内给药也十分充分。首选注射方式为皮下注射。在具体实施例中,向受试者皮下注射或静脉注射本发明使用药剂。在另一实施例中,未口服本发明使用药剂。本领域技术人员熟悉在广为人知有效来源中讨论的原理和程序,如本文引用的雷明顿药物科学(第十七版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985)和古德曼和吉尔曼治疗学的药理基础(第8版,Pergamon Press,Elmsford,N.Y.,1990)。
在本发明的一个优选实施例中,按照标准程序配制本发明药剂,作为向人类和其他生成天然和抗半乳糖基抗体的哺乳动物注射用药物组合物。采用用于确定抗体样本中感兴趣抗原的本领域已知方法可确定受试者中是否存在抗半乳糖基抗体。例如,可将受试者样本与含末端α-半乳糖基,最好含糖苷抗原表位Galα1-3Galβ1-4Glc-R的试剂接触并测定与试剂接触的抗体量确定受试者中是否存在抗半乳糖基抗体。最好固定试剂,便于从松散材料中分离试剂。Galili等人描述了用于确定抗半乳糖基抗体的适用方法。(Proc.Natl.Acad.Sic.USA,1987,84:1369-1373。可按绝对值或参照抗半乳糖基结合特性相关生物活性提供抗半乳糖基抗体水平,如不同物种的红细胞凝集,见Galili等人描述。如上所述,提供测定步骤中应完成所有稀释量的原始样本的抗体效价。在一个实施例中,采用Galili等人描述的使用大鼠红细胞、家兔红细胞、牛红细胞、猪红细胞或犬红细胞方法进行分析时,如果受试者样本(最好是血清)显示效价至少为1:5000、1:2500、1:2000、1:1000、1:500、1:100、1:50、1:25,1:10、1:5或以上,则认为受试者含有抗半乳糖基抗体。
在另一个实施例中,在引发感染之前服用本发明使用药剂,即用于预防目的。
通常而言,无菌等渗缓冲液的解决方案为静脉注射、肌肉注射、皮下注射或脑室内注射组合物。
如必要,组合物不仅含有本发明药剂,还可含有用于减轻注射部位疼痛的增溶剂和局部麻醉剂。一般而言,可以单位剂量形式单独或混合提供成分,例如,将冷冻干燥粉末或无水的浓缩物在密闭容器如显示活性剂的数量的安瓿或sachette中。静脉输注组合物时,可以用含有无菌制药用水或生理盐水的输液瓶配药。注射组合物时,可提供一安瓿注射用无菌水或生理盐水,以便在给药前混合成分。
除静脉给药外,该组合物可以含有少量润湿剂或乳化剂,或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、凝胶、聚合物或持续缓释制剂。本领域已知可使用传统粘合剂和载体配制该组合物。制剂包括医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等标准载体以及在药品生产方面具有良好功能的惰性载体。已知各种注射系统可用于注射本发明治疗药剂,包括脂质体、微粒、微囊等封装。
在另一优选实施例中,可将含有本发明药剂的治疗剂配制成中性或盐形式。药学可接受的盐包括与游离氨基基团形成的盐,如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生盐,以及与游离羧基基团形成的盐,如钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺,乙基羟乙胺、组氨酸,普鲁卡因等衍生盐。
可选择适用给药途径,如全身、口服、静脉或局部给药,以任何药物形式注射含本发明药剂的药物组合物,包括配制预期注射方法所需的药学可接受赋形剂。
本发明药剂的有效量范围很大,通常而言,视具体应用情况、接触时间和其他因素而有所不同。在具体实施例中,剂量范围为0.05mg/kg和20mg/kg。
口服固体剂型包括普通胶囊、持续缓释胶囊、普通片、持续缓释片、咀嚼片、舌下片、泡腾片、药丸、悬浮液、粉末、颗粒和凝胶。就这些固体剂型而言,其有效成分可至少与一种惰性赋形剂如蔗糖、乳糖、淀粉混合。在正常实践中,此剂型还可以包括惰性稀释剂以外的更多物质,如润滑剂、硬脂酸镁。若为胶囊、药片、泡腾片和药丸时,此剂型还包括缓冲剂。可使用肠溶剂制备药片和药丸。
口服液体剂型包括乳液、溶液、悬浮液、糖浆和本技术常用含惰性稀释剂的药学可接受酏剂,如水。这些组合物还可包含润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂等佐剂。
例如,可采用已知技术和合适分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制注射制剂、注射用无菌水质或油脂悬浮液。可使用的可接受赋形剂和溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。也通常使用无菌油作为溶剂或悬浮介质。
局部给药时,可将本发明化合物配制成乳霜、凝胶、乳液、液体、润发油、喷雾液、分散剂、实心条、乳液、微乳液和类似物,可采用常规方法以及适用赋形剂如乳化剂、表面活性剂、增稠剂、着色剂以及两种或以上组合物进行配制。
此外,可通过透皮贴剂形式或离子电渗装置服用本发明化合物。在一个实施例中,将本发明化合物作为透皮贴剂给药,例如以持续缓释透皮贴剂形式施用。US5262165、US5948433、US6010715和US6071531对适用透皮贴剂进行了更详细描述。
含本发明药剂的组合物还包括常规赋形剂,即适用于肠外应用且不会破坏活性化合物的药学可接受载体。适用的药学可接受赋形剂包括水、盐溶液、乙醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性蜡、芳香油、单硬脂酸甘油酯和脂肪酸甘油酯,脂肪酸酯petroetrals、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和类似物。
可采用几种已知药物注射系统注射本发明药剂或组合物,包括脂质体、微气泡、乳液、微粒、微胶囊和类似物等封装。可以单一单位或持续缓释剂型注射所需剂量。
Rathbone、M.J.Hadgraft,J.和Roberts,M.S.(eds.),Marcel Dekker,Inc.,NewYork(2002)《缓释给药技术》和Wise、D.L.(ed.)、Marcel Dekker,Inc.New York,(2000)《药物控制缓释技术手册》对持续缓释剂型、适用材料和制备方法进行了阐述。在本发明的一个实施例中,本发明化合物的口服缓释剂型还包括至少一个包衣或骨架。包被或缓释骨架包括,但不限于天然高分子、半合成或合成非水溶性、改性蜡、油脂、脂肪醇、脂肪酸、天然半合成或合成增塑剂,或两种或以上组合物。
可使用本领域技术人员已知过程应用肠溶包衣,参见Johnson,J.L.《药片剂包衣》,包衣技术手册(第二版),Satas,D.和Tracton,A.A.(主编),Marcel Dekker,Inc.NewYork,(2001),Carstensen,T.,《先进固体药剂包衣片》,Swarbrick,J.(主编),MarcelDekker,Inc.New York(2001),第455-468页。
虽然个体需求并不相同,但确定本发明药剂有效量的最佳范围属于本领域技术人员的共同经验。通常而言,本领域的一名技术人员所能够调节为提供有效量的化合物所需剂量取决于受体的年龄、健康状况、适应度、性别、饮食、体重、变化程度、治疗次数、损伤或疾病性质和程度、患者身体状况、给药方式、如果使用一种药物注射系统或作为组合药物的一部分注射化合物时所使用具体化合物的活性、疗效、药代动力学和毒理学方面的药理学考虑。
能够有效治疗特殊疾病或病症的本发明化合物的量取决于疾病或病症,尤其是由胃肠道细菌导致感染的性质,可采用常规临床技术予以测定,包括参考上文《Goodman&Gilman治疗学的药理学基础》;《医师案头参考》,Medical Economics Company,Inc.,Oradell,NJ,1995年和《药物的事实与比较》,Inc.,St.Louis,MO,1993年。本处方使用的精确剂量也取决于给药方式,以及疾病或紊乱严重程度,并应根据医生意见和患者情况决定。
本发明的组合物及其用途
从另一方面而言,本发明涉及一种
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂化合物,以及
(ii)抗生素。
上文已描述了在本发明治疗用途环境中由末端α-半乳糖基组成的发明药剂。在具体实施例中,所述末端α半乳糖选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组。在一个更具体实施例中,末端α-半乳糖为末端Galα1-3Gal。在优选实施例中,所使用药剂为上文在第i至第viii组治疗应用环境中定义的任何药剂。
上文已描述了在本发明治疗用途环境中由本发明的一个或多个末端α-半乳糖基组成的天然或合成分子。本申请所描述的所有药剂同样适用于与本发明的抗生素联合使用。
在本发明的一个实施例中,使用由组合物的末端α-半乳糖基组成的药剂予以支持。已在本发明及本申请使用的药剂环境中描述了适用支持材料。在具体实施例中,支持末端α-半乳糖基连接的材料选自由线性多聚赖氨酸和树枝状聚合物组成的组。在另一个实施例中,对多聚赖氨酸主链中含末端α-半乳糖基的部分或全部ε-氨基基团形成帽式结构。在优选实施例中,帽式结构是一种硫代甘油。
在具体实施例中,根据本发明由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中
-末端α-半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组,α-半乳糖优选末端Galα1-3Gal,而选择末端Galα1-3Gal更佳,选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc最佳。
-使用的支持材料为线性多聚赖氨酸,所述主链含有10到5000个赖氨酸,优选20至2500个赖氨酸,50至2000个赖氨酸更佳,甚至约1000个赖氨酸最佳。
在更具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc作为末端α-半乳糖基,选择线性多聚赖氨酸主链作为支持材料,最好选择GAS914作为药剂,所述线性多聚赖氨酸主链的平均长度为1,000个赖氨酸,约25%侧链与Galα1-3Galβ1-4GlcNAc共轭。
在另一个具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中
-末端α-半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α半乳糖糖单位组成的组,α-半乳糖优选末端Galα1-3Gal,而选择末端Galα1-3Gal更佳,选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc最佳。
-选择一种树枝状聚合物作为支持材料。
在更具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc作为末端α-半乳糖基,选择树枝状聚合物作为支持材料。已在本发明及本申请使用的药剂环境中描述了本发明使用的树枝状聚合物。在一个具体实施例中,树枝状聚合物为聚酰胺胺(PAMAM)树枝状树枝状聚合物。在更具体实施例中,本发明使用的由末端α-半乳糖基组成的药剂与支持材料连接,其中选择末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc作为末端α-半乳糖基,选择PAMAM作为支持材料,最好选择如图4显示的化合物。
本发明使用的组合物抗生素包括但不限于碳青霉烯类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、青霉素类、多肽类、喹诺酮类药物、磺胺类和四环素类
从另一方面而言,本发明涉及一种
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素
用于医疗目的。
在另一个替代实施例中,本发明涉及一种
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素
用于生产可预防和治疗胃肠道细菌感染的药物。
在另一个替代实施例中,本发明涉及一种使用由以下成分组成的有效量组合物治疗患者疾病的方法
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素
从另一方面而言,本发明涉及一种
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素
用于预防和治疗由胃肠道细菌导致的感染。
在另一个替代实施例中,本发明涉及一种
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素
用于生产可预防和/或治疗由胃肠道细菌导致的感染的药物。
在另一个替代实施例中,本发明涉及一种使用由以下成分组成的有效治疗量组合物预防和/或治疗受试者炎症的方法
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂组合物,以及
(ii)一种抗生素。
在具体实施例中,感染由胃肠道细菌导致,其中胃肠道细菌是肠道杆菌。更具体的讲,肠道杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌以及肠杆菌科细菌组成的组。更具体的讲,肠杆菌科肠道杆菌选自由枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属细菌组成的组。更具体的讲,肠道杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌组成的组。在另一个实施例中,胃肠道的细菌不是引起胃肠道感染的肠杆菌科细菌,不是梭菌属细菌,并且/或者不是葡萄球菌属细菌。导致胃肠道感染的肠杆菌科肠道杆菌选自由沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属和致肠病(EPEC)、产肠毒素(ETEC)、肠侵袭性(EIEC)、肠出血性(EHEC)和肠聚集性(EAEC,也称为heteroadherent)大肠杆菌菌株组成的组。
在具体实施例中,受试者血液、胃肠道、心脏、心血管系统、肝脏、肺、呼吸道、肾、泌尿系统、中枢神经系统、皮肤、皮下组织或手术伤口出现此感染。
已在本发明所使用药剂的环境中对适用注射途径进行了描述。在具体实施例中,向受试者皮下注射或静脉注此类组合物。在另一实施例中,未口服本发明使用药剂。在具体实施例中,受试者体内具有内源性抗半乳糖基抗体。已在本发明治疗方法的环境中对用于确定受试者体内是否存在抗半乳糖基抗体和将受试者归类为存在或不存在抗半乳糖基抗体的方法进行了定义,这些方法也同样适用于本发明所申请组合物的使用环境。在优选实施例中,受试者为人类。
以下对多个示例性实施例的说明本质上仅仅是说明性的并且决不是意在限制本发明的范围。
实例
实例1消除抗半乳糖基抗体预防半乳糖基基因敲除小鼠出现脓毒症
本实例使用了一种缺乏α-1,3-半乳糖基转移酶(α1,3GT)基因的基因敲除小鼠。此小鼠无需任何额外免疫即可产生天然抗半乳糖基抗体,使得发明人可探究仅用GAS914消除抗半乳糖基抗体是否会对半乳糖基基因敲除小鼠在结肠结扎穿刺(CLP)后出现脓毒症产生影响。在此模型中,使用30号针共对0.5cm盲肠结扎和穿刺两次,使盲肠内容物突出,确保腹膜存在细菌。
为评价小鼠的临床状况,使用既定健康度评分系统评价了小鼠的自发性活动、食物摄取和对外源性刺激的反应,分析了小鼠的体力活动。本研究共纳入34只动物。17只动物(对照组)未接受任何治疗。结肠结扎穿刺前3天及之后隔天向其余17只动物(GAS914组)腹腔注射10mg/kg GAS914。根据之前显示结肠结扎穿刺当天完全消除抗半乳糖基抗体的局部研究选择GAS914注射剂量和间隔。本质上,初步GAS914注射消除了所有抗半乳糖基抗体。
如附图1A所示,经GAS914治疗的17只半乳糖基基因敲除小鼠中有4只(24%)在结肠结扎穿刺后死亡,而对照组有11只(65%)动物死亡(p=0.01),大多数死亡小鼠死于结肠结扎穿刺后48小时内。另外,与对照组相比,经GAS914治疗的动物的健康度评分在结肠结扎穿刺后第一天较好(见附图1B)。为获得消除脓毒症抗半乳糖基抗体后的疗效,必须在行结肠结扎穿刺前消除抗半乳糖基抗体。此外,发明者还探究了两组10只动物在经GAS 914消除抗半乳糖基抗体后接受结肠结扎穿刺后12小时是否影响动物生存率和健康度。在此情况下,与对照组相比,GAS914并未实现任何效益(见附图1C)。
结肠结扎穿刺之前经GAS914治疗的效果与结肠结扎穿刺时几乎消除所有抗半乳糖基IgM和IgG抗体关联密切(见附图1D)。结肠结扎穿刺后这些抗体几乎无变化,而对照组动物在行结肠结扎穿刺后的抗半乳糖基IgM和IgG抗体显著降低,表明术后存在抗原(见附图1D)。尽管如此,观察结果表明行结肠结扎穿刺24小时后,接受或未接受GAS914治疗的动物的血液分离细菌数、微生物类型(均为大肠杆菌)和基因型无显著差异。
实例2消除抗半乳糖基抗体增强血清杀菌活性
本发明作者发现GAS914能够更改结肠结扎穿刺后天然抗体与细菌血液分离的结合。消除抗半乳糖基抗体增强了半乳糖基基因敲除小鼠至大肠杆菌其他IgG抗体的反应性(见附图2)。因此,对半乳糖基基因敲除小鼠行结肠结扎穿刺会引起由与大肠杆菌结合的抗半乳糖基抗体血液分离导致的脓毒症,而经GAS914消除抗半乳糖基抗体可实现与相同大肠杆菌其他IgG抗体的反应。
在37℃振荡器营养肉汤培养培养基(Becton Dickinson)中培养行结肠结扎穿刺后从半乳糖基基因敲除小鼠血液中分离的大肠杆菌和大肠杆菌O86:B7(ATCC)一整夜。第二天,用新鲜培养基稀释细菌悬液100倍。向细菌悬液(30μl/mL)加入无菌兔补体蛋白(Serotec)。然后在37℃下用50μl/mL热灭活小鼠血清样本(含有和不含抗半乳糖基抗体)培养混合液12小时。在37℃下1.5%(w/v)琼脂培养基板中培养充足稀释液18小时,通过夹层培养每小时评价血清杀菌活性。第二天进行细菌菌落计数。通过替代补体蛋白途径,单独使用肉汤作为细菌生长的阴性对照,使用不添加小鼠血清的补体蛋白作为致死阳性对照。大肠杆菌O86:B7(ATCC)。
血液分离大肠杆菌的抗体结合可增强半乳糖基基因敲除小鼠的血清直接杀菌活性(见附图3)。市售小鼠混合血清(Sigma S3509)表明75%和74%补体蛋白介导抗体可杀灭行结肠结扎穿刺后从半乳糖基基因敲除小鼠血液中分离的大肠杆菌和大肠杆菌O86:B7菌株(见附图3)。使用后者作为对照细菌,可有效结合α-半乳糖基抗体(Posekany KJ等人2002Infect Immun 70(11):6215–6222;Lamontagne A等人2013PLoS One 8(6):e64992)。携带抗半乳糖基抗体的半乳糖基基因敲除血清小鼠证明对两种大肠杆菌的平均杀灭率分别为18.3%和32%,而经GAS914消除抗半乳糖基抗体后,平均杀灭率分别提高至73%和78%(两种情况p<0.05)。
总而言之,这些数据证实半乳糖基基因敲除小鼠的GAS914将血清抗体IgG活性和血液分离大肠杆菌的杀菌活性增强至在缺乏半乳糖基抗体的野生型小鼠血液中观察到的类似水平。
实例3使用GAS914消除抗半乳糖基抗体后的血清抗糖模式
在含435个糖链抗原和141个细菌抗原的聚糖阵列中探究了使用GAS914治疗前后血清抗糖类抗体模式。显示经GAS914治疗后降低的唯一糖类抗原包括半乳糖三糖、半乳糖四糖和半乳糖五糖,与治疗前相比,水平分别下降了96.5%、95%和90%。此外,相对于48糖和9个细菌抗原也显著增强。许多增强对应于低于1000的相对荧光单位(RFU)。然而,此增强包括以大肠杆菌O86:B7表示的两种Fuca1-2Galb1-3(Fuca1-4)GlcNAcb结构,观察到其中一种细菌在消除抗半乳糖基抗体后杀菌活性增强。因此,显著变化可能与低于1000的值相关。消除数值大于1500RFU的抗半乳糖基抗体后显示显著增强的糖和细菌抗原如下所示:
1.壳三糖、壳五糖和五糖,显示高数值显著增加。用两种细菌抗原表达N-乙酰氨基葡萄糖残基,也显示高数值显著变化:沙门氏菌O62和铜绿假单胞菌O3。
2.另一种显著增强和高数值的糖是8糖透明质酸。在大肠杆菌O161中表达透明质酸,大肠杆菌O161是经GAS914治疗后变化最显著的细菌抗原。
3.Galb1-4GalNAcb残基、b-甘露糖和唾液酸化蛋白也具有显著变化和高数值。
4.沙门氏菌O47显示显著变化和高数值。
Claims (43)
1.本发明涉及一种用于预防和/或治疗受试者感染的药剂,所述药剂包括末端α-半乳糖基,其中,所述感染由胃肠道的细菌导致。
2.根据前述权利要求所述的使用药剂,通过消除由所述药剂介导的抗半乳糖基抗体可预防和/或治疗感染。
3.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,胃肠道细菌为肠原杆菌。
4.根据前述权利要求所述的使用药剂,肠原杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌以及肠杆菌科细菌组成的组。
5.根据前述权利要求所述的使用药剂,肠杆菌科肠原杆菌选自由枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属细菌组成的组。
6.根据权利要求3所述的使用药剂,肠原杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌组成的组。
7.根据权利要求1所述的使用药剂,导致胃肠道感染的胃肠道细菌不是肠杆菌科细菌、梭状芽胞杆菌属细菌和/或葡萄球菌属细菌。
8.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,受试者血液、胃肠道、心脏、心血管系统、肝脏、肺、呼吸道、肾、泌尿系统、中枢神经系统、皮肤、皮下组织和外科手术伤口处出现感染。
9.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,末端α-半乳糖基选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α-半乳糖糖单位组成的组。
10.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,末端α-半乳糖为末端Galα1-3Gal。
11.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,所述药剂选自由以下成分组成的组:
-半乳糖-α-1,3-半乳糖(Galα1-3Gal)、
-半乳糖-α-1,3-半乳糖低聚物和寡糖,包括线性B-2三糖(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc,CAS号:101627-01-4)、线性B-6三糖(Galα1-3Galβ1-4Glc,CAS号:56038-36-9)、α1-3半乳二糖基β-甲基糖苷;α1-3,1-4β半乳四糖(GALα1-3Galβ1-4gal,CAS号56038-36-9)、半乳四糖(Galα1-3Galβ1-4Galα1-3-D-Gal,CAS号:56038-38-1)、Galili五糖L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)、Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc(#GLY076)、Galα1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc(#GLY075)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]4Galβ1-4Glc(#GLY079)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]3Galβ1-4Glc(#GLY078)、Galα1-3Galβ1-4Glc(#GLY070)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]2Galβ1-4Glc(#GLY077)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(#GLY071)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc和Galα1-3Galβ1-3GlcNAc(#GLY74-1)及其衍生物,
-半乳糖-α-1,3-半乳糖的衍生物包括酰胺、酯、醚、胺、磺酰胺、硫醚、缩醛、氨基甲酸酯、脲和脒,
-由低聚糖和末端半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖肽和糖蛋白、
-由半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖脂,如由血型B型2线性三糖(GN334,Galα1-3Galβ1-4GlcNac,CAS号:101627-01-4)和Galili五糖(L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)组成的糖脂,
-半乳糖α-1,3-半乳糖复合糖,包括Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(3-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2335)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-HDPE(#NGL0334)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP0203,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA(#NGP0333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-HSA(#NGP2333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(6-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2336,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4Glc-HSA(#NGP2330,3原子间隔)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP1203,14原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP2203,3原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP3203,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP0334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP1334,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP2334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP3334,14原子间隔)和Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-HDPE(#NGL0203)和
-由半乳糖-α-1,3-半乳糖、鼠层粘蛋白、与牛血清白蛋白GAS914连接的合成α-半乳糖抗原表位、α-半乳糖苷聚乙二醇组成的大分子与TPC和与大分子主链连接的α-Gal抗原表位模拟肽连接。
12.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,末端α-半乳糖为末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc。
13.根据权利要求1至权利要求12中任意权利要求所述的使用药剂,末端α-半乳糖基与支持材料连接。
14.根据前述权利要求所述的使用药剂,其中支持材料选自由线性多聚赖氨酸主链和树枝状聚合物组成的组。
15.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,所述药剂为无规共聚物GAS914,其结构如下所示:
其中n表示平均聚合度,x表示糖化单体的分数;1-x表示甘油封端单体分数。
16.根据权利要求14所述的使用药剂,其中树枝状聚合物为聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物。
17.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,所述药剂和树枝状聚合物通过以下公式连接:
18.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,受试者具有内源性抗半乳糖基抗体。
19.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,受试者为人类。
20.根据前述任意权利要求所述的使用药剂,向受试者皮下注射或静脉注射所述药剂。
21.根据权利要求1至权利要求20中任意权利要求所述的使用药剂,不能口服所述药剂。
22.一种由以下成分组成的组合物:
(i)由终端α-半乳糖基组成的药剂化合物,以及
(ii)抗生素。
23.根据前述权利要求所述的组合物,由末端α-半乳糖基组成的药剂选自由末端Galα1-3Gal、末端Galα1-2Gal、末端Galα1-6Gal、末端Galα1-6Glc和能够结合抗半乳糖基抗体的末端α-半乳糖糖单位组成的组。
24.根据前述权利要求所述的组合物,末端α-半乳糖基为末端Galα1-3Gal。
25.根据权利要求22至权利要求24中任意权利要求所述的组合物,所述药剂选自由以下成分组成的组:
-半乳糖-α-1,3-半乳糖(Galα1-3Gal)、
-半乳糖-α-1,3-半乳糖低聚物和寡糖,包括线性B-2三糖(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc,CAS号:101627-01-4)、线性B-6三糖(Galα1-3Galβ1-4Glc,CAS号:56038-36-9)、α1-3半乳二糖基β-甲基糖苷;α1-3,1-4β半乳四糖(GALα1-3Galβ1-4gal,CAS号56038-36-9)、半乳四糖(Galα1-3Galβ1-4Galα1-3-D-Gal,CAS号:56038-38-1)、Galili五糖L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)、Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc(#GLY076)、Galα1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc(#GLY075)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]4Galβ1-4Glc(#GLY079)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]3Galβ1-4Glc(#GLY078)、Galα1-3Galβ1-4Glc(#GLY070)、Galα1-3[Galβ1-4GlcNAcβ1-3]2Galβ1-4Glc(#GLY077)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(#GLY071)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc和Galα1-3Galβ1-3GlcNAc(#GLY74-1)及其衍生物,
-半乳糖-α-1,3-半乳糖的衍生物包括酰胺、酯、醚、胺、磺酰胺、硫醚、缩醛、氨基甲酸酯、脲和脒,
-由低聚糖和末端半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖肽和糖蛋白、
-由半乳糖-α-1,3-半乳糖组成的糖脂,如由血型B型2线性三糖(GN334,Galα1-3Galβ1-4GlcNac,CAS号:101627-01-4)和Galili五糖(L537,Gal-α1,3Gal-β1,4GlcNAc-β1,3Gal-β1,4Glc,CAS号:119502-59-9)组成的糖脂,
-半乳糖α-1,3-半乳糖复合糖,包括Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(3-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2335)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-HDPE(#NGL0334)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP0203,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA(#NGP0333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-HSA(#NGP2333,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4(6-deoxyGlcNAc)-HSA(#NGP2336,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4Glc-HSA(#NGP2330,3原子间隔)、Galα1-3Gal-BSA(#NGP1203,14原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP2203,3原子间隔)、Galα1-3Gal-HSA(#NGP3203,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP0334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(#NGP1334,14原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP2334,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(#NGP3334,14原子间隔)和Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA(#NGP0330,3原子间隔)、Galα1-3Galβ1-HDPE(#NGL0203)和
-由半乳糖-α-1,3-半乳糖、鼠层粘蛋白、与牛血清白蛋白GAS914连接的合成α-半乳糖抗原表位、α-半乳糖苷聚乙二醇组成的大分子与TPC和与大分子主链连接的α-Gal抗原表位模拟肽连接。
26.根据权利要求22至权利要求25中任意权利要求所述的组合物,末端α-半乳糖基为末端Galα1-3Galβ1-4GlcNAc。
27.根据权利要求22至权利要求26中任意权利要求所述的组合物,末端α-半乳糖基与支持材料连接。
28.根据前述权利要求所述的使用组合物,其中支持材料选自由线性多聚赖氨酸主链和树枝状聚合物组成的组。
29.根据权利要求22至权利要求28中任意权利要求所述的组合物,所述药剂为无规共聚物GAS914,其结构如下所示:
其中n表示平均聚合度,x表示糖化单体的分数;1-x表示甘油封端单体分数。
30.根据权利要求28所述的使用组合物,其中树枝状聚合物为聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物。
31.根据前述任意权利要求所述的使用组合物,所述药剂和树枝状聚合物通过以下公式连接:
32.权利要求22至权利要求31中任意权利要求所述的组合物用于医疗目的。
33.权利要求22至权利要求31中任意权利要求所述的组合物用于预防和治疗由受试者胃肠道细菌导致的感染。
34.根据权利要求33所述的组合物,胃肠道细菌为肠原杆菌。
35.根据前述权利要求所述的组合物,肠原杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌以及肠杆菌科细菌组成的组。
36.根据前述权利要求所述的组合物,肠杆菌科肠原杆菌选自由枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属细菌组成的组。
37.根据权利要求34所述的组合物,肠原杆菌选自由静止杆菌属、放线菌属,拟杆菌属、双歧杆菌属、弯曲杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、真杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、乳杆菌属、动弯杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属、链球菌属和韦荣球菌属细菌组成的组。
38.根据权利要求33所述的使用组合物,导致胃肠道感染的胃肠道细菌不是肠杆菌科细菌、梭状芽胞杆菌属细菌和/或葡萄球菌属细菌。
39.根据权利要求33至权利要求38中任意权利要求所述的使用组合物,受试者血液、胃肠道、心脏、心血管系统、肝脏、肺、呼吸道、肾、泌尿系统、中枢神经系统、皮肤、皮下组织和外科手术伤口处出现感染。
40.根据权利要求33至权利要求39中任意权利要求所述的使用组合物,向受试者皮下注射或静脉注射所述组合物。
41.根据权利要求33至权利要求40中任意权利要求所述的使用组合物,不能口服所述组合物。
42.根据权利要求33至权利要求40中任意权利要求所述的组合物,受试者具有内源性抗半乳糖基抗体。
43.根据前述权利要求所述的组合物,受试者为人类。
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