CN107072995A - 用于处置flt3突变阳性癌的医药组合物、突变型flt3抑制剂以及这些的应用 - Google Patents

用于处置flt3突变阳性癌的医药组合物、突变型flt3抑制剂以及这些的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物、突变型FLT3抑制剂及这些的应用。本发明提供一种将由通式[1]所表示的化合物或其盐作为有效成分的、用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物、突变型FLT3抑制剂、抗癌剂以及如下几种方法：一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且预测对象中的通过供给含有由通式[1]所表示的化合物或其盐的医药组合物而带来的处置效果；另一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且选择适用含有由通式[1]所表示的化合物或其盐的医药组合物的对象；及又一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且决定是否将含有由通式[1]所表示的化合物或其盐的医药组合物供给于对象。

Description

用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物、突变型FLT3抑制剂 以及这些的应用
技术领域
本发明涉及一种将含氮杂环化合物或其盐作为有效成分的用于处置Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)突变阳性癌的医药组合物及突变型FLT3抑制剂以及这些的应用。
背景技术
Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)为属于受体型酪氨酸激酶的Ⅲ类型的蛋白质，在N末端细胞外结构域具有5个免疫球蛋白样模体(immnunoglobulin-like motif)，在C末端具有2个激酶结构域(kinase domain)。FLT3在正常的CD34阳性人骨髓前体细胞及树突状祖细胞上观察到表达，对这些细胞的增殖/分化等起到重要作用(非专利文献1)。并且，FLT3的配体(FL)在骨髓间质细胞及T细胞中表达，是对多数造血系统的细胞产生造成影响，同时通过与其他成长因子的相互作用而刺激干细胞、前体细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞的增殖的细胞因子之一。
FLT3若结合FL则进行二聚体化，通过自磷酸化而被活化。其结果，引起PI3及RAS信号传递途径的AKT及ERK的磷酸化。FLT3对造血细胞的增殖/分化起到重要作用。
在正常的骨髓中，FLT3的表达限于早期前体细胞，但在血癌中，通过FLT3以高浓度表达或FLT3发生基因突变，从而经由上述信号传递途径的活化而导致癌的增殖恶化。作为血癌，例如包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性前骨髓细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性中性粒细胞性白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞性白血病(PML)、青少年型骨髓单核细胞性白血病(JMML)、成人T细胞ALL、骨髓增生异常综合征(MDS)及骨髓增殖性疾病(MPD)等。
关于血癌中的AML，虽然通过一些现有疗法可见到一定程度的成功，但经常具有复发/抗性，5年存活率为24％左右(美国)，仍然是难治性癌(非专利文献2)。其复发/抗性的原因之一有AML细胞的基因突变，其中最频繁地确认到FLT3基因的突变。已知FLT3基因突变中有近膜区域的一部分多次反复的内部串联重复(Internal Tandem Duplication)(ITD)突变及位于酪氨酸激酶结构域(Tyrosine Kinase Domain)(TKD)的氨基酸残基通过取代、缺失或添加而变成不同的氨基酸残基的TKD突变(非专利文献2)，即使在不存在配体的情况下FLT3总是被活化，从而加速癌细胞的增殖。
已知ITD突变为AML中的预后不良因素，虽然正在尝试基于现有化学疗法的预后的改善但仍为困难的情况。从这样的状况来看，NCCN的AML治疗指南中清楚地记载有作为治疗选项之一，也应该考虑参加可成为对象的临床试验。并且，在WHO分类第4版中也作为在AML的诊断、治疗时应筛选的基因突变之一而被记载。
已知TKD突变是在AML中尤其是位于活化环(Activation loop)的835位的天门冬氨酸残基(D835)及其周围的氨基酸残基突变或缺失，也有在一部分报告中为预后不良因素。而且，在TKD突变中观察到在其他酪氨酸激酶中位于作为耐药机理之一而众所周知的门控区域的691位的苯丙氨酸残基(F691)及其周围的氨基酸残基产生突变。在将FLT3作为目标而使用药剂治疗AML为目的的临床试验中，已知有同时具有ITD突变及TKD突变的AML的耐药性。
抑制FLT3的活性的同时抑制突变型FLT3的活性对于AML的治疗及预后的改善而言是重要的，正在进行抑制这些的药剂的开发。例如，AC220(Ambit BiosciencesCorporation)为选择性地抑制Ⅲ类型酪氨酸激酶(FLT3、c-KIT、FMS及PDGFR)的化合物，正在进行将AML作为对象的开发(专利文献1)。然而，没有对充分抑制突变型FLT3的活性的药剂进行报告。
另一方面，作为FLT3抑制剂，已知有专利文献2中所记载的含氮杂环化合物或其盐。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2007/109120号
专利文献2：国际公开2013/157540号
非专利文献
非专利文献1：Brown P等，European Journal of Cancer，第40卷，707-721页，2004年
非专利文献2：American Cancer Society，Cancer Facts and Figures，9-24页，2012年
发明的概要
发明要解决的技术课题
本发明的课题在于提供一种用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物、突变型FLT3抑制剂及这些的应用。
用于解决技术课题的手段
为一种特定的含氮杂环化合物或其盐，且确认到突变型FLT3尤其是TKD突变的情况下有效的化合物还未被知晓。本发明提供以下内容。
[1]一种医药组合物，其含有由通式[1]所表示的化合物或其盐且用于处置FLT3突变阳性癌；
[化学式1]
式中，
R1表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
R2表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R3表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
m表示1～3的整数，
m个R4可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，选自m个中的一个R4可以与R3一起形成可被取代的C1-6亚烷基，
m个R5可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
X1表示氧原子、N(R20)(式中，R20表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基。)、C(＝O)、C(＝O)-N(R20)(式中，R20具有与上述相同的意义。)或连接键，
X2表示可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的二价的脂环式烃基或可被取代的二价的芳香族烃基，
n表示0～3的整数，
n个R6可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
n个R7可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
X3表示可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的C2-6亚烯基、可被取代的C2-6亚炔基或N(R20)-C(＝O)(式中，R20具有与上述相同的意义。)，
R8表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R9表示可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基、可被取代的C2-6炔基或可被取代的C3-8环烷基，
R8及R9也可以与它们所键合的氮原子一起形成可被取代的环状氨基，
R10表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R11表示可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基、可被取代的C2-6炔基、可被取代的C3-8环烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基。
[2]根据[1]所述的医药组合物，其中R10为氢原子。
[3]根据[1]或[2]所述的医药组合物，其中，
X1为C(＝O)-N(R20)(式中，R20表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基。)。
[4]根据[1]至[3]中任一个所述的医药组合物，其中，
X3为可被取代的C2-6亚炔基。
[5]根据[1]至[4]中任一个所述的医药组合物，其中，
FLT3突变包括TKD突变。
[6]根据[5]所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第823位～第861位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
[7]根据[6]所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第835位、第836位及第842位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[8]根据[7]所述的医药组合物，其中，TKD突变为选自包括下述组中的至少一个：
a.序列号：1的氨基酸序列中的第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
b.序列号：1的氨基酸序列中的第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸-天门冬氨酸；
c.序列号：1的氨基酸序列中的第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸或组氨酸。
[9]根据[5]所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第604位～第822位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
[10]根据[9]所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第621位、第627位、第676位、第691位及第697位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[11]根据[10]所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变。
[12]根据[11]所述的医药组合物，其中，
序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变为苯丙氨酸取代成亮氨酸。
[13]根据[5]至[12]中任一个所述的医药组合物，其中，
FLT3突变还包括ITD突变。
[14]一种突变型FLT3抑制剂，其包括[1]至[4]中任一个所定义的化合物或其盐。
[15]根据[14]所述的药剂，其抑制包括TKD突变的突变型FLT3。
[16]根据[15]所述的药剂，其还抑制包括ITD突变的突变型FLT3。
[17]根据[14]至[16]中任一个所述的药剂，其还抑制野生型FLT3。
[18]根据[14]至[17]中任一个所述的药剂，其为抗癌剂。
[19]一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且预测对象中的通过供给含有[1]至[4]中任一个所定义的化合物或其盐的医药组合物而带来的处置效果。
[20]一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且选择适用含有[1]至[4]中任一个所定义的化合物或其盐的医药组合物的对象。
[21]一种方法，其包括检测有无FLT3突变的工序，且决定是否将含[1]至[4]中任一个所定义的化合物或其盐的医药组合物供给于对象。
[22]根据[19]至[21]中任一个所述的方法，其中，
FLT3突变包括TKD突变。
[23]根据[19]至[22]中任一个所述的方法，其中，
FLT3突变进一步包括ITD突变。
[1a]一种方法，其包括将[1]至[4]中任一个所定义的化合物或其盐供给于对象的工序且用于处置对象中的FLT3突变阳性癌。
[2a]根据[1a]所述的方法，其中，FLT3突变包括TKD突变。
[3a]根据[2a]所述的方法，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第823位～第861位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
[4a]根据[3a]所述的方法，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第835位、第836位及第842位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[5a]根据[4a]所述的方法，其中，TKD突变为选自包括下述组中的至少一个：
a.序列号：1的氨基酸序列中的第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
b.序列号：1的氨基酸序列中的第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸-天门冬氨酸；
c.序列号：1的氨基酸序列中的第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸或组氨酸。
[6a]根据[2a]所述的方法，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第604位～第822位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
[7a]根据[6a]所述的方法，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第621位、第627位、第676位、第691位及第697位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[8a]根据[7a]所述的方法，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变。
[9a]根据[8a]所述的方法，其中，序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变为苯丙氨酸取代成亮氨酸。
[10a]根据[1a]～[8a]中任一个所述的方法，其中，FLT3突变还包括ITD突变。
[1b]一种[1]～[4]中任一个所定义的化合物或其盐，其在用于处置FLT3突变阳性癌的方法中使用。
[2b]根据[1b]所述的化合物或其盐，其中，FLT3突变包括TKD突变。
[3b]根据[2b]所述的化合物或其盐，其中TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第823位～第861位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
[4b]根据[3b]所述的化合物或其盐，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第835位、第836位及第842位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[5b]根据[4b]所述的化合物或其盐，其中，TKD突变为选自包括下述组中的至少一个：
a.序列号：1的氨基酸序列中的第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
b.序列号：1的氨基酸序列中的第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸-天门冬氨酸；
c.序列号：1的氨基酸序列中的第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸或组氨酸。
[6b]根据[2b]所述的化合物或其盐，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第604位～第822位的区域中的1或多个氨基酸的突变
[7b]根据[6b]所述的化合物或其盐，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第621位、第627位、第676位、第691位及第697位的组中的至少一个氨基酸的突变。
[8b]根据[7b]所述的化合物或其盐，其中，TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变
[9b]根据[8b]所述的化合物或其盐，其中，序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变为苯丙氨酸取代成亮氨酸。
[10b]根据[1b]至[8b]中任一个所述的化合物或其盐，其中，FLT3突变还包括ITD突变。
发明效果
由通式[1]所表示的化合物或其盐具有抑制FLT3突变阳性的细胞株及表达FLT3突变的细胞株的增殖及磷酸化的活性。因此，能够作为用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物或作为突变型FLT3抑制剂来使用。
附图说明
图1为序列号：1的氨基酸序列
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
本发明中，只要没有特别说明，各用语具有下面的意义。
所谓处置是指予防或治疗等。
所谓预防是指发病的抑制、发病风险的降低或发病的延迟等。
所谓治疗是指改善成为对象的疾病或状态或抑制(维持或迟延)其进行等。
所谓对象是指包括人的哺乳类等。
用“a～b”表示范围时，在范围中摆阔两端的值a及b。
所谓卤素原子是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
所谓C1-6烷基是指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等直链状或支链状的C1-6烷基。
所谓C1-3烷基是指甲基、乙基、丙基或异丙基。
所谓C2-6烯基是指乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、1，3-丁二烯基、戊烯基及己烯基等直链状或支链状的C2-6烯基。
所谓C2-6炔基是指乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基等直链状或支链状的C2-6炔基。
所谓C3-8环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基及环己基等C3-8环烷基。
所谓芳基是指苯基或萘基。
所谓芳基C1-6烷基是指苄基、二苯基甲基、三苯甲基、苯乙基及萘基甲基等芳基C1-6烷基。
所谓C1-6烷氧基是指甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、环丁氧基、戊氧基及己氧基等直链状、环状或支链状的C1-6烷基氧基。
所谓C1-3烷氧基是指甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基。
所谓C1-6烷氧基C1-6烷基是指甲氧基甲基及1-乙氧基乙基等C1-6烷基氧基C1-6烷基。
所谓芳基C1-6烷氧基C1-6烷基是指苄氧基甲基及苯乙氧基甲基等芳基C1-6烷基氧基C1-6烷基。
所谓C2-6烷酰基是指乙酰基、丙酰基、戊酰基、异戊酰基及新戊酰基等直链状或支链状的C2-6烷酰基。
所谓芳酰基是指苯甲酰基或萘甲酰基。
所谓杂环式羰基是指由烟酰基、噻吩甲酰基、吡咯烷基羰基或呋喃甲酰基。
所谓(α-取代)氨基乙酰基是指氨基酸(可以举出甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、羟基赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸及羟基脯氨酸等氨基酸。)衍生的N末端可被保护的(α-取代)氨基乙酰基。
所谓酰基是指甲酰基、琥珀酰基、戊二酰基、马来酰基、邻本二甲酰基、C2-6烷酰基、芳酰基、杂环式羰基或(α-取代)氨基乙酰基。
所谓酰基C1-6烷基是指乙酰基甲基、苯甲酰基甲基及1-苯甲酰基乙基等酰基C1-6烷基。
所谓酰氧基C1-6烷基是指乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、苯甲酰氧基甲基及1-(苯甲酰氧基)乙基等酰氧基C1-6烷基。
所谓C1-6烷氧基羰基是指甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、叔丁氧基羰基及1，1-二甲基丙氧基羰基等直链状或支链状的C1-6烷基氧基羰基。
所谓芳基C1-6烷氧基羰基是指苄氧基羰基及苯乙氧基羰基等芳基C1-6烷基氧基羰基。
所谓芳氧基羰基是指苯氧基羰基或萘氧基羰基。
所谓C1-6烷基氨基是指甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基及己基氨基等直链状或支链状的C1-6烷基氨基。
所谓二(C1-6烷基)氨基是指二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、二(叔丁基)氨基、二戊基氨基、二己基氨基、(乙基)(甲基)氨基及(甲基)(丙基)氨基等直链状或支链状的二(C1-6烷基)氨基。
所谓二(C1-3烷基)氨基是指二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、(乙基)(甲基)氨基及(甲基)(丙基)氨基等直链状或支链状的二(C1-3烷基)氨基。
所谓C1-6烷基磺酰基是指甲基磺酰基、乙基磺酰基及丙基磺酰基等C1-6烷基磺酰基。
所谓芳基磺酰基是指苯磺酰基、对甲苯磺酰基或萘磺酰基。
所谓C1-6烷基磺酰基氧基是指甲基磺酰基氧基及乙基磺酰基氧基等C1-6烷基磺酰基氧基。
所谓芳基磺酰基氧基是指苯磺酰基氧基或对甲苯磺酰基氧基。
所谓环状氨基是指氮杂环丁基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、哌啶基、四氢吡啶基、高哌啶基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哌嗪基、高哌嗪基、三唑基、四唑基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基及奎宁环基等作为形成该环的杂原子含有一个以上氮原子，还可以含有一个以上氧原子或硫原子的环状氨基。
所谓单环的含氮杂环基是指氮杂环丁基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、哌啶基、四氢吡啶基、吡啶基、高哌啶基、八氢吖辛因基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哌嗪基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、高哌嗪基、三唑基及四唑基等作为形成该环的杂原子仅包含氮原子的单环的含氮杂环基。
所谓单环的含氧杂环基是指四氢呋喃基、呋喃基、四氢吡喃基或吡喃基。
所谓单环的含硫杂环基是指噻吩基。
所谓单环的含氮-氧杂环基是指噁唑基、异噁唑基、噁二唑基及吗啉基等作为形成该环的杂原子仅包含氮原子及氧原子的单环的含氮-氧杂环基。
所谓单环的含氮-硫杂环基是指噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、硫代吗啉基、硫代吗啉基-1-氧化物及硫代吗啉基-1,1-二氧化物等作为形成该环的杂原子仅包含氮原子及硫原子的单环的含氮-硫杂环基。
所谓单环的杂环基是指单环的含氮杂环基、单环的含氧杂环基、单环的含硫杂环基、单环的含氮-氧杂环基或单环的含氮-硫杂环基。
所谓二环式的含氮杂环基是指二氢吲哚基、吲哚基、异二氢吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、喹嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、二氢喹喔啉基、喹喔啉基、萘啶基、嘌呤基、蝶啶基及奎宁环基等作为形成该环的杂原子仅包含氮原子的二环式的含氮杂环基。
所谓二环式的含氧杂环基是指2,3-二氢苯并呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、异苯并二氢吡喃基、1,3-苯并间二氧杂环戊烯基、1,3-苯并二噁烷基及1,4-苯并二噁烷基等作为形成该环的杂原子仅包含氧原子的二环式的含氧杂环基。
所谓二环式的含硫杂环基是指2,3-二氢苯并噻吩基及苯并噻吩基等作为形成该环的杂原子仅包含硫原子的二环式的含硫杂环基。
所谓二环式的含氮-氧杂环基是指苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并吗啉基、二氢吡喃并吡啶基、二氢二噁英并吡啶基及二氢吡啶并噁嗪基等作为形成该环的杂原子仅包含氮原子及氧原子的二环式的含氮-氧杂环基。
所谓二环式的含氮-硫杂环基是指苯并噻唑基、苯并异噻唑基及苯并噻二唑基等作为形成该环的杂原子包含氮原子及硫原子的二环式的含氮-硫杂环基。
所谓二环式的杂环基是指二环式的含氮杂环基、二环式的含氧杂环基、二环式的含硫杂环基、二环式的含氮-氧杂环基或二环式的含氮-硫杂环基。
所谓杂环基是指单环的杂环基或二环式的杂环基。
所谓C1-6亚烷基是指亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基及亚己基等直链状或支链状的C1-6亚烷基。
所谓C1-3亚烷基是指亚甲基、亚乙基或亚丙基。
所谓C2-6亚烯基是指亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基及亚戊烯基等直链状或支链状的C2-6亚烯基。
所谓C2-6亚炔基是指亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基及亚戊炔基等直链状或支链状的C2-6亚炔基。
所谓二价的脂环式烃基是指1,2-环亚丁基、1,3-环亚丁基、1,2-环亚戊基、1,3-环亚戊基、1,2-环亚己基、1,3-环亚己基、1,4-环亚己基、二环(3.2.1)亚辛基、二环(2.2.0)亚己基及二环(5.2.0)亚壬基等从脂环式烃环中除去2个氢原子而形成的基团。
所谓二价的芳香族烃基是指亚苯基、亚茚基、亚萘基、亚芴基、亚菲基、亚蒽基及亚芘基等从芳香族烃环中除去2个氢原子而形成的基团。
所谓硅烷基是指三甲基硅烷基、三乙基硅烷基或三丁基硅烷基。
所谓氨基保护基，包括通常的可作为氨基的保护基使用的所有基团，例如可以举出T.W.Greene等的Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)第4版、第696～926页、2007年、John Wiley&Sons,INC.)中记载的基团。具体而言，可以举出芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、酰基、C1-6烷氧基羰基、芳基C1-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基或硅烷基。
作为亚氨基保护基，包括通常的可作为亚氨基的保护基使用的所有基团，例如可以举出T.W.Greene等的Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)第4版、第696～868页、2007年、John Wiley&Sons,INC.)中记载的基团。具体而言，可以举出芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、酰基、C1-6烷氧基羰基、芳基C1-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基或硅烷基。
作为羟基保护基，包括通常的可作为羟基的保护基使用的所有基团，例如可以举出T.W.Greene等的Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)第4版、第16～299页、2007年、John Wiley&Sons,INC.)中记载的基团。具体而言，例如可以举出C1-6烷基、C2-6烯基、芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基C1-6烷基、酰基、C1-6烷氧基羰基、芳基C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基、硅烷基、四氢呋喃基或四氢吡喃基。
作为羧基保护基，包括通常的可作为羧基的保护基使用的所有基团，例如可以举出T.W.Greene等的Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)第4版、第533～643页、2007年、John Wiley&Sons,INC.)中记载的基团。具体而言，可以举出C1-6烷基、C2-6烯基、芳基、芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基C1-6烷基、酰基C1-6烷基、酰氧基C1-6烷基或硅烷基。
〔通式[1]的化合物及其盐〕
本发明的含氮杂环化合物为由通式[1]所表示的化合物。
[化学式2]
(式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、X1、X2、X3、m及n具有与上述相同的意义。)
R1为氢原子或可被取代的C1-6烷基，优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R1的C1-6烷基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
R1的可被取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选C1-3烷基。
R2为氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为氢原子或可被取代的C1-6烷基，更优选为可被取代的C1-6烷基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R2的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基也可以被选自以下基团中的一个以上的基团取代，即可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的C1-6烷基氨基、可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的二(C1-6烷基)氨基及可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的杂环基。
取代基组A：卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的C1-6烷基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的C3-8环烷基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的芳基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的C1-6烷氧基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的C1-6烷基氨基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的二(C1-6烷基)氨基、可被选自取代基组B中的一个以上的基团取代的杂环基、氧基。
取代基组B：卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基、可被卤素原子或羟基取代的C1-6烷基、可被卤素原子或羟基取代的C1-6烷氧基、芳基、杂环基、氧基。
R2的可被取代的C1-6烷基优选为被二(C1-6烷基)氨基取代的C1-6烷基，更优选为被二(C1-3烷基)氨基取代的C1-3烷基，进一步优选为二甲氨基甲基。
R2的可被取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
R2的可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基的各自的取代基分别优选为可被选自取代基组A-1中的一个以上的基团取代的二(C1-6烷基)氨基或可被选自取代基组A-1中的一个以上的基团取代的杂环基，更优选为可被选自取代基组A-1中的一个以上的基团取代的二(C1-6烷基)氨基。
其中，可被选自取代基组A-1中的一个以上的基团取代的二(C1-6烷基)氨基的二(C1-6烷基)氨基优选为二(C1-3烷基)氨基，更优选为二甲基氨基。
可被选自取代基组A-1中的一个以上的基团取代的杂环基的杂环基优选为氮杂环丁基、哌嗪基或吗啉基。
取代基组A-1：卤素原子、可被保护的羟基、可被羟基取代的C1-6烷基。
R3为氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为氢原子或C1-6烷基，更优选为C1-6烷基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R3的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基、可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的芳基及可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的杂环基中的一个以上的基团取代。
R3的可被取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
m为1～3的整数，优选为1或2的整数，更优选为整数1。
m个R4可相同或不同，为氢原子或可被取代的C1-6烷基，优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R4的C1-6烷基可被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
选自m个的一个R4可以与R3一起形成可被取代的C1-6亚烷基，可被取代的C1-6亚烷基的C1-6亚烷基优选为C1-3亚烷基，更优选为亚丙基。可被取代的C1-6亚烷基的取代基优选为卤素原子、羟基或C1-3烷氧基，更优选为氟原子、羟基或甲氧基，进一步优选为氟原子或甲氧基。
m个R5可相同或不同，为氢原子或可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为可被取代的C1-6烷基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R5的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基可被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
R5的可被取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
n为0～3的整数，优选为0或1的整数，更优选为整数0。
n个R6可相同或不同，为氢原子或可被取代的C1-6烷基，优选为氢原子或C1-6烷基，更优选为氢原子。
n个R7可相同或不同，为氢原子或可被取代的C1-6烷基，优选为氢原子或C1-6烷基，更优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R6及R7的C1-6烷基可被卤素原子、氰基、可被保护的氨基或可被保护的羟基取代。
R8为氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R8的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基可被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
R9为可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基或可被取代的C3-8环烷基，优选为可被取代的C1-6烷基或可被取代的C3-8环烷基，更优选为可被取代的C1-6烷基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R9的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或C3-8环烷基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基及可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的C1-6烷氧基中的一个以上的基团取代。
R9的可被取代的C1-6烷基优选为不具有取代基的C1-6烷基。
R9的可被取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选为C1-3烷基。
R9的可被取代的C1-6烷基的取代基优选为卤素原子或C1-3烷氧基，更优选为甲氧基。
R8及R9也可以与它们所键合的氮原子一起形成可被取代的环状氨基，可被取代的环状氨基的环状氨基优选为吗啉基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R8及R9与它们所键合的氮原子一起而形成的环状氨基可被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基及氧基中的一个以上的基团取代。
R10为氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R10的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基可被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基及可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的C1-6烷氧基中的一个以上的基团取代。
R11为可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基、可被取代的C2-6炔基、可被取代的C3-8环烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基，优选为可被取代的C1-6烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基，更优选为可被取代的芳基或可被取代的杂环基。
在其他的取代基为任一者的情况下，R11的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8环烷基、芳基或杂环基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基、可被保护的羟基及可被选自取代基组A中的一个以上的基团取代的C1-6烷氧基中的一个以上的基团取代。
R11的可被取代的C1-6烷基、可被取代的C3-8环烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基的各自的取代基分别优选为可被选自取代基组A-2中的一个以上的基团取代的C1-6烷氧基。
取代基组A-2：卤素原子、C1-6烷基、C3-8环烷基、C1-6烷氧基、杂环基。
R11的可被取代的C1-6烷基优选为被取代的C1-6烷基，更优选为被取代的C1-3烷基，进一步优选为被取代的乙基。
R11为被取代的C1-6烷基的情况下，C1-6烷基的取代基优选为杂环基，更优选为吡啶基、吡咯烷基或吗啉基。
R11的可被取代的芳基优选为被取代的芳基，更优选为被取代的苯基。
R11为被取代的苯基的情况下，苯基的取代基优选为卤素原子、氰基或氨甲酰基，更优选为氟原子、氰基或氨甲酰基。
R11为被取代的苯基的情况下，苯基优选在邻位不具有取代基，在间位或对位具有取代基，更优选仅在对位具有取代基。
间位或对位的优选取代基如上所述。
R11的可被取代的杂环基优选为可被取代的吡啶基、可被取代的吲唑基、可被取代的吡唑并吡啶基或可被取代的异喹啉基。
R11为可被取代的吡啶基的情况下优选为由下述式[I]所表示的吡啶基。
[化学式3]
(式中，R12及R13可相同或不同，表示氢原子、卤素原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或杂环基，*表示键合位置。)
R12为氢原子、卤素原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或杂环基，优选为氢原子。
R13为氢原子、卤素原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或杂环基，优选为卤素原子或C1-6烷氧基，更优选为氟原子或甲氧基。
R11为可被取代的吲唑基的情况下，优选为由下述式[II]-(1)或[II]-(2)所表示的吲唑基。
[化学式4]
(式中，R14及R16可相同或不同，表示氢原子或C1-6烷基，R15及R17可相同或不同，表示氢原子或C1-6烷氧基，*表示键合位置。)
R14及R16可相同或不同，为氢原子或C1-6烷基，优选为氢原子。
R14及R16的C1-6烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
R15及R17可相同或不同，为氢原子或C1-6烷氧基，优选为氢原子或甲氧基。
R15及R17的C1-6烷氧基优选为甲氧基、乙氧基或丙氧基，更优选为甲氧基。
R11为可被取代的吡唑并吡啶基的情况下，优选为由下述式[Ⅲ]所表示的吡唑并吡啶基。
[化学式5]
(式中，R18表示氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，R19表示氢原子、可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，*表示键合位置。)
R18为氢原子或可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，优选为氢原子或可被C1-3烷氧基取代的C1-3烷基，更优选为氢原子、甲基、被甲氧基取代的乙基，进一步优选为氢原子或甲基。
R19为氢原子、可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，优选为氢原子、C1-3烷基或C1-3烷氧基，更优选为氢原子、甲基或甲氧基。
R18及R19的可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基的C1-6烷氧基优选为甲氧基。
R18及R19的可被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基的C1-6烷基优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
R11为可被取代的异喹啉基的情况下，优选为由下述式[IV]所表示的异喹啉基。
[化学式6]
(式中，*表示键合位置。)
X1为氧原子、N(R20)(式中，R20具有与上述相同的意义。)、C(＝O)、C(＝O)-N(R20)(式中，R20具有与上述相同的意义。)或连接键，优选为C(＝O)-N(R20)(式中，R20具有与上述相同的意义。)。
R20为氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，优选为氢原子。
在其他的取代基为任一者的情况下，R20的C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
X2为可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的二价的脂环式烃基或可被取代的二价的芳香族烃基，优选为可被取代的C1-6亚烷基或可被取代的二价的脂环式烃基。
在其他的取代基为任一者的情况下，X2的C1-6亚烷基、二价的脂环式烃基或二价的芳香族烃基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
X2的可被取代的C1-6亚烷基优选为未被取代的C1-6亚烷基。
X2的可被取代的C1-6亚烷基的C1-6亚烷基优选为亚甲基、亚乙基或三亚甲基，更优选为三亚甲基。
X2的可被取代的C1-6亚烷基的取代基优选为C1-6烷基，更优选为C1-3烷基，进一步优选为乙基。
X2的可被取代的二价的脂环式烃基优选为未被取代的二价的脂环式烃基。
X2的可被取代的二价的脂环式烃基的二价的脂环式烃基优选为环亚丁基或环亚己基，更优选为环亚丁基。
X2为环亚丁基的情况下，优选为由下述式[2]所表示的环亚丁基，
[化学式7]
(式中，*表示键合位置。)
更优选为由下述式[3]所表示的环亚丁基。
[化学式8]
(式中，*表示键合位置。)
X2为环亚己基的情况下，优选为由下述式[4]所表示的环亚己基。
[化学式9]
(式中，*表示键合位置。)
X2的可被取代的二价的芳香族烃基的二价的芳香族烃基优选为亚苯基。
X2为亚苯基的情况下，优选为由下述式[5]所表示的亚苯基。
[化学式10]
(式中，*表示键合位置。)
X2的可被取代的二价的芳香族烃基的取代基优选为卤素原子或C1-6烷基。
取代基为卤素原子的情况下，优选为氯原子。
取代基为C1-6烷基的情况下，优选为C1-3烷基，更优选为甲基。
X3为可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的C2-6亚烯基、可被取代的C2-6亚炔基或N(R20)-C(＝O)(式中，R20具有与上述相同的意义。)，优选为可被取代的C2-6亚炔基或N(R20)-C(＝O)(式中，R20具有与上述相同的意义。)更优选为可被取代的C2-6亚炔基。
在其他的取代基为任一者的情况下，X3的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基或C2-6亚炔基也可以被选自卤素原子、氰基、可被保护的氨基及可被保护的羟基中的一个以上的基团取代。
X3的可被取代的C2-6亚炔基的C2-6亚炔基优选为亚乙炔基。
作为通式[1]的化合物的盐，可以举出通常所知的氨基等碱性基团、羟基及羧基等酸性基团的盐。
作为碱性基团的盐，例如可以举出与盐酸、氢溴酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天门冬氨酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐等。
作为酸性基团的盐，例如可以举出与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土类金属的盐；铵盐；以及与三甲基胺、三乙基胺、三丁基胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙基胺、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羟甲胺及N,N'-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。
上述盐中，作为优选的盐，可以举出药理学上容许的盐。
盐可以为无水物、水合物或溶剂化物。
由通式[1]所表示的化合物或其盐可以按照公知的方法，例如上述专利文献2中所记载的方法合成。
〔通式[1]的化合物及其盐的新的医药用途〕
通式[1]的化合物及其盐用于处置FLT3突变阳性癌而有用。
＜FLT3＞
FLT3为包括序列号：1的氨基酸序列(UniProt accession number:P36888)的多肽，或为与包括序列号：1的氨基酸序列的多肽实质上相同的多肽。并且，FLT3为属于受体型酪氨酸激酶的Ⅲ类型的蛋白质，使PI3K-AKT信号途径及ERK-MAPK信号途径活化，对细胞增殖、生存及分化造成影响。FLT3包括N末端侧细胞外域的5个免疫球蛋白样区域、跨膜区域、近膜区域、酪氨酸激酶区域(TKD)及C末端区域。
根据本发明人的研究结果可知，由通式[1]所表示的化合物通过与序列号：1的氨基酸序列的第695位的半胱氨酸的特异的共价键合来与FLT3键合。
TKD为包括序列号：1的氨基酸序列的第604位～第958位的氨基酸序列的多肽，或为与包括序列号：1的氨基酸序列的第604位～第958位的氨基酸序列的多肽实质上相同的多肽。
TKD的门控区域为包括序列号：1的氨基酸序列的第604位～第822位的氨基酸序列的多肽，或为与包括序列号：1的氨基酸序列的第604位～第822位的氨基酸序列的多肽实质上相同的多肽。
已知TKD的门控区域的突变为对于激酶抑制剂的耐性化机理的原因之一。FLT3抑制剂中有因门控区域的突变而引起ATP键合位置的结构发生变化，键合位置变窄这样的空间位阻或与突变部位的氨基酸的分子间相互作用消失等，而导致FLT3活性抑制作用大大减弱的可能。
TKD的活化环(Activation loop)为包括序列号：1的氨基酸序列的第823位～第861位的氨基酸序列的多肽，或为与包括序列号：1的氨基酸序列的第823位～第861位的氨基酸序列的多肽实质上相同的多肽。
TKD的活化环(Activation loop)通常在TKD的N末端侧N端小叶(lobe)与C末端侧C端小叶(lobe)之间为折叠结构，起到妨碍基质或ATP向基质键合位置或ATP键合位置接近的作用(FLT3非活性体)。另一方面，若位于活化环(Activation loop)的氨基酸尤其是D835或Y842引起突变，则在活化环(Activation loop)引起较大的结构变化，ATP键合位置成为开放结构(FLT3活性体)。在FLT3非活性体的ATP键合位置以静电相互作用或氢结合等分子间相互作用键合的FLT3抑制剂中有因D835或Y842的突变导致对于FLT3活性体无法保持分子间相互作用，结合力下降，FLT3活性抑制作用减弱的可能。
FLT3的近膜区域为包括序列号：1的氨基酸序列的第572位～第603位的氨基酸序列的多肽、或为与包括序列号：1的氨基酸序列的第572位～第603位的氨基酸序列的多肽实质上相同的多肽。
已知在近膜区域中，可在该区域内的各处产生各种长度的氨基酸序列重复的氨基酸的突变。
另外，关于多肽实质上相同是指具有1或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列，或氨基酸序列的相同性较高(例如，具有80％以上，优选90％更优选95％以上，进一步优选98％以上的序列相同性)且具有相同功能。
关于氨基酸序列，除特别记载，相同性是指将两个序列以最佳方式排列时考虑了在两个序列之间所共有的一致的氨基酸的个数的百分率。关于氨基酸序列的相同性的检索、分析，可以通过本领域技术人员所周知的算法或程序(例如，BLASTP或ClustalW)来进行。利用程序时的参数只要是本领域技术人员可以适当地设定，或也可使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法也是本领域技术人员所周知的。
＜FLT3突变＞
FLT3突变是指FLT3的氨基酸序列中有氨基酸的突变。因突变，除了PI3K-AKT信号途径及ERK-MAPK信号途径以外，STAT5信号途径或其他途径有可能被活化。
氨基酸的突变是指氨基酸序列中的1或多个氨基酸的缺失、取代或添加。氨基酸的突变包括缺失、取代或添加的任一者(例如，取代)产生一和或多个的情况和选自缺失、取代及添加的两个以上分别独立地组合一个或多个而产生的情况(例如，1个取代和3个添加)。
另外，“1或多个氨基酸缺失、取代或添加”时的缺失、取代或添加的氨基酸的数量及位置在任何情况下只要具有产生的突变体所意图的功能，则并无特别限制。缺失、取代或添加的氨基酸的数量在任何情况下例如均为1～30个。
氨基酸的缺失是指氨基酸序列中的氨基酸残基的一个以上缺失的突变，缺失包括从氨基酸序列的端部缺失氨基酸残基及在氨基酸序列的中段缺失氨基酸残基。
氨基酸的取代是指氨基酸序列中的氨基酸残基的一个以上变成一个以上不同种类的氨基酸残基的突变。
氨基酸的添加是指氨基酸序列中添加一个以上氨基酸残基的突变，添加包括在氨基酸序列的端部添加氨基酸残基及在氨基酸序列的中段添加氨基酸残基。
FLT3突变优选包括TKD突变。TKD突变包括TKD的门控区域中的突变及TKD的活化环(Activation loop)中的突变。FLT3突变除TKD突变以外，还可以包括ITD突变。
TKD突变是指在TKD的氨基酸序列中有突变。
TKD的门控区域中的突变例如为序列号：1的氨基酸序列的第604位～第822位的区域中的1或多个氨基酸的突变，优选为序列号：1中的选自包括第621位、第627位、第676位、第691位及第697位的组中的至少一个氨基酸的突变。TKD的门控区域中的突变更优选为序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变，进一步优选为序列号：1的第691位的氨基酸的从苯丙氨酸取代成亮氨酸的突变。在任何情况下，所产生的FLT3的突变体均具有FLT3活性，优选具有突变型FLT3活性。
TKD的门控区域中的突变可以包括下述任一氨基酸序列的突变。在任何情况下，所产生的FLT3的突变体均具有FLT3活性：
a.序列号：1的氨基酸序列中，第691位的苯丙氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成亮氨酸)的氨基酸序列；
b.上述a的氨基酸序列中，第691位的氨基酸以外的1或多个氨基酸缺失、被取代或被添加的氨基酸序列；
c.与上述a的氨基酸序列具有80％的序列相同性的氨基酸序列(其中，第691位的苯丙氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成亮氨酸))。
TKD的活化环(Activation loop)中的突变例如为序列号：1的氨基酸序列的第823位～第861位的区域中的1或多个氨基酸的突变。优选为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第835位、第836位及第842位的组中的至少一个氨基酸的突变。更优选为选自包括下述的组中的至少一个突变：
a.序列号：1的氨基酸序列中的第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
b.序列号：1的氨基酸序列中的第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸-天门冬氨酸；
c.序列号：1的氨基酸序列中的第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸或组氨酸。
在任何情况下，所产生的FLT3的突变体均具有FLT3活性，优选具有突变型FLT3活性。
TKD的Activation loop中的突变也可包括下述任一氨基酸序列的突变。在任何情况下，所产生的FLT3的突变体均具有FLT3活性：
a.序列号：1的氨基酸序列中，第835位的天门冬氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺)的氨基酸序列；
b.上述a的氨基酸序列中，第835位的氨基酸以外的1个或多个氨基酸缺失、被取代或被添加的氨基酸序列；
c.与上述a的氨基酸序列具有80％的序列相同性的氨基酸序列(其中，第835位的天门冬氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺))；
d.序列号：1的氨基酸序列中，第836位的异亮氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代或缺失，更优选取代成亮氨酸-天门冬氨酸)的氨基酸序列；
e.上述d的氨基酸序列中，第836位的氨基酸以外的1个或多个氨基酸缺失、被取代或被添加的氨基酸序列；
f.与上述d的氨基酸序列具有80％的序列相同性的氨基酸序列(其中，第836位的异亮氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代或缺失，更优选取代成亮氨酸-天门冬氨酸))。
g.序列号：1的氨基酸序列中，第842位的酪氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成半胱氨酸或组氨酸)的氨基酸序列；
h.上述g的氨基酸序列中，第842位的氨基酸以外的1个或多个氨基酸缺失、被取代或被添加的氨基酸序列；
i.与上述g的氨基酸序列具有80％的序列相同性的氨基酸序列(其中，第842位的酪氨酸缺失、被取代或被添加(优选取代，更优选取代成半胱氨酸或组氨酸))。
所产生的FLT3的突变体是否具有FLT3活性，或是否具有突变型FLT3活性，只要是本领域技术人员，可以按照公知的方法进行测定、判断。更具体的测定方法及判断基准可以参考上述专利文献2的实施例的项及本说明书的实施例的项的内容。是否具有突变型FLT3活性，也可以以具有FLT3活性，但使用现有技术的FLT3抑制剂，优选选自包括Quizartinib(Ambit Biosciences Corporation)及Sorafenib(Bayer HealthCare Pharmaceuticals,Inc.)的组中的至少一个FLT3抑制剂无法抑制为基准进行判断。无法抑制是指例如利用本说明书的实施例的项中所记载的测定方法，可以将在酶抑制试验中IC50值为10nmol/L或100nmol/L以上，在细胞增殖试验中GI50值为10nmol/L或100nmol/L以上，在细胞内磷酸化抑制试验中IC50值为90nmol/L以上设为判断基准。
ITD突变是指在FLT3的近膜区域中，该区域内的氨基酸序列在区域内各处重复突变。ITD突变的氨基酸序列的重复长度报告有为2至42氨基酸的各种长度。尤其在持有ITD突变的较多病例中，序列号：1的第591位～第599位的氨基酸序列中高频率地见到该突变。关于ITD突变及具有ITD突变的FLT3，可以参考国际公开2000/011470号(专利第4542268号公报)。
＜FLT3突变阳性＞
某种癌为FLT3突变阳性是指在该癌细胞的FLT3的氨基酸序列中有突变。并且，FLT3突变阳性还指以编码具有这种突变的氨基酸序列的方式FLT3基因中有突变。显而易见，FLT3的氨基酸序列中有突变的情况为在FLT3基因中有突变。
是否为FLT3突变阳性，即FLT3的突变可以通过分析FLT3的基因序列或FLT3的转录物即mRNA的序列进行调查。序列的分析方法例如可以举出双脱氧核苷酸链终止法(Sangeret al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)等。也可以利用适当的DNA测序仪来分析序列。
并且，FLT3的突变例如也可以利用原位杂交(in situ hybridization)、Southern印迹杂交(Southern blot)分析、Northern印迹杂交(Northern bl ot)分析、DNA微阵列(DNA microarray)、RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)、Fragment分析、PCR-SSCP(PCR-Single-Str and Conformation Polymorphism-PCR)、PCR-RFLP(PCR-Restriction fragm ent length polymorphism)、ARMS(amprificationrefractory mutation s ystem)、PNA(peptide nucleic acid)-LNA PCR clamp、PCR-Invader、Scorpi on ARMS、Cyleave、iPLEX及SMAP(SMart Amplification Process)等方法进行分析。可根据常规方法利用这些方法。
作为用于检测FLT3的突变的样本，可以举出血液、骨髓、手术样本及活检样本等。
通式[1]的化合物及其盐可以在各种癌中使用。FLT3的表达限于早期前体细胞，但在血癌中通过FLT3以高浓度表达，或FLT3发生基因突变，从而经由上述信号传递途径的活化而导致癌的增殖恶化。通式[1]的化合物及其盐有效的血癌中，例如包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AM L)、急性前骨髓细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性中性粒细胞性白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞性白血病(PML)、青少年型骨髓单核细胞性白血病(JMML)、成人T细胞ALL、骨髓增生异常综合征(MDS)及骨髓增殖性疾病(MPD)等。
通式[1]的化合物及其盐可以对作为FLT3突变阳性的这些癌使用。
〔剂型、其他〕
通式[1]的化合物或其盐可以作为突变型FLT3抑制剂的有效成分来使用。可以优选作为抑制包括TKD突变的突变型FLT3的药剂来使用。这样的药剂也可以为抑制野生型FLT3的药剂。将通式[1]的化合物或其盐作为有效成分的突变型FLT3抑制剂尤其作为抗癌剂而有效。
在医药组合物或药剂中，通式[1]的化合物及其各种盐中可以仅使用一种，或可以含有两种以上。本发明的医药组合物可以与含有该技术领域中一直以来使用的公知的抗肿瘤剂的其他治疗药组合来使用。
医药组合物或药剂中可以添加通常用于制剂化的赋形剂、结合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、悬浮剂、等张化剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂及吸収促进剂等添加剂。
作为医药组合物或药剂的给药途径，例如可以举出静脈内、动脉内、直肠内、腹腔内、肌肉内、肿瘤内或膀胱内注射的方法、口服给药、透皮给药及栓剂等方法。给药量及给药次数例如对于成人可以通过口服或非口服(例如，注射、点滴及直肠部位的给药等)给药，例如每天将0.01～1000mg/kg分成1次至数次给药。作为剂型的例，可以举出片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、粉末制剂、栓剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂、软膏剂及注射剂。
如上所述，认为通式[1]的化合物或其盐对FLT3突变阳性癌尤其有效。因此，为了预测使用含有通式[1]的化合物或其盐的医药组合物或药剂进行处置的效果；为了选择适合使用医药组合物的对象；并且，为了决定是否适合使用医药组合物或药剂进行处置，可以进行调查有无FLT3突变的FLT3基因检测。本申请还提供这些实施方式。
在现有技术的FLT3抑制剂中，对于FLT3的活性较高，但对特定的突变型FLT3有效性明显差。然而，根据本发明人的研究，通式[1]的化合物或其盐可对各种突变型FLT3有效。尤其在Activation loop的突变中，进一步进行特定，则在关于序列号：1的氨基酸序列的第835位、第836位或第842位的氨基酸的突变中，可对各种突变型FLT3有效。
接着，列举出实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例]
〔制造例〕
按照上述专利文献2中所记载的方法合成表1-1～表1-4中所记载的化合物。
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
[表1-4]
〔实施例1突变型FLT3(FLT3D835Y)酶抑制试验〕
比较化合物1使用了Quizartinib(Ambit Biosciences Corporation)。
混合突变型FLT3蛋白质(FLT3D835Y、Life Technologies公司)6μL(0.75ng)及含有规定浓度的试验化合物的溶液(100mmol/L HEPES、10mmol/L MgCl2、25mmol/L NaCl、0.01％BSA、1mmol/L DTT、pH7.5)3μL，在25℃下静置15分钟。然后，分别添加基质肽Biotin-AAA-AEEEEYFELVAKKK(Toray公司)(序列号：2)3μL(终浓度0.25μmol/L)及ATP(Sigma-Aldrich公司)3μL(终浓度15μmol/L)，振荡2分钟后，进一步在25℃下静置40分钟而进行酶反应。另外，FLT D835Y是指将第835位的天门冬氨酸取代为酪氨酸的FLT3蛋白质。
然后，添加含有Streptavidin-Xlent(Cisbio公司)及Mab PT66-K(Cisbio公司)的酶反应停止液(5μg/mL Streptavidin、0.19μg/mL PT66-K、30μmol/L HEPES(pH7.0)、150mmol/L KF、75mM EDTA、0.15％BSA、0.075％Tween20)30μL，停止酶反应，同时在室温下静置1小时，由此进行抗原抗体反应。然后，使用Envision(Perkin Elmer公司)测定615nm及665nm的时间分辨荧光，测定基质肽的磷酸化。将665nm下的荧光值除以615nm下的荧光值的值设为测定值，将未添加化合物(仅用DMSO处理)且添加ATP的孔的测定值设为0％抑制，未添加化合物(仅用DMSO处理)且未添加ATP的孔的测定值设为100％抑制，利用XLfitVer.5.3.1(ID Business solutions Limited)的Fit Model 205算出试验化合物的50％抑制浓度(IC50值)。将结果示于表2。
[表2]
表中，对于突变型FLT3蛋白质的酶活性的IC50值的评价基准如下。
+++：小于1nmol/L
++：1nmol/L以上且小于10nmol/L
+：10nmol/L以上且小于100nmol/L
-：100nmol/L以上
〔实施例2突变型FLT3表达32D细胞株的形成与使用这些细胞株的细胞增殖试验〕
2-1.材料
野生型FLT3/FLT3配体共表达32D细胞株(32D FLT3/FL)使用了非专利文献3中所记载的公知的细胞。从Life Technologies公司或SIGMA公司购买RPMI1640及DMEM。32D细胞从RIKEN生物资源中心获得，使用含有1ng/mL小鼠IL-3、10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素及100ng/mL链霉素的RPMI1640培养基在37℃下，5％CO2存在下进行培养。PLAT-E细胞由东京大学的北村俊雄博士提供，在含有1μg/mL嘌呤霉素、10μg/mL杀稻瘟菌素(blasticidin)S、10％FBS、100U/mL青霉素及100ng/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。pMXs-IP逆转录病毒载体(retroviral vector)由东京大学的北村俊雄博士提供(非专利文献4)。pGEM-T载体、FuGENE6及CellTiter 96AQueous One Solution Cell ProliferationAssay购自Promega Corporation。
2-2.细胞株的形成
32D FLT3/FL以外的细胞株按照非专利文献5及非专利文献6中所记载的公知的方法如下准备并进行制作。
(1)FLT3D835Y、FLT3D835V、FLT3D835H、FLT3D835E、FLT3D835N、FLT3D835Ins、FLT3Y842C及FLT3Y842H
D835Y突变、D835V突变、D835H突变、D835E突变、D835N突变及D835Ins突变(I836L/D突变)FLT3表达载体通过将插入于非专利文献7中所记载的pMKIT-Neo载体中的D835突变FLT3基因序列整体插入pMXs-IP逆转录病毒载体中而制作。
Y842C突变或Y842H突变FLT3表达载体通过将插入于pGEM-T载体的C末端FLAG序列添加FLT3基因作为模板，使用以下所示出的引物，按照QuikChange定点诱变试剂盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)的操作说明导入Y842C及Y842H突变后，将Y842突变FLT3基因序列整体插入pMXs-IP逆转录病毒载体而制作。所导入的突变通过序列分析进行了确认。
(2)FLT3ITD、FLT3ITD/D835Y、FLT3ITD/Y842C及FLT3ITD/Y842H
ITD突变FLT3表达载体通过将非专利文献8中所记载的ITD突变FLT3基因(克隆Mt2)作为在C末端中添加了FLAG序列的序列而引入pMXs-IP逆转录病毒载体而制作。
ITD/D835Y同时突变FLT3表达载体通过在插入于pGEM-T载体的C末端FLAG序列添加ITD突变FLT3基因中，将包括用SphI切断的第835位的天门冬氨酸的序列用插入于pGEM-T载体的C末端FLAG序列添加D835Y突变FLT3基因所对应的序列取代后，将C末端FLAG序列添加ITD/D835Y同时突变FLT3序列整体插入pMXs-IP逆转录病毒载体而制作。
ITD/Y842C同时突变或ITD/Y842H同时突变FLT3表达载体通过将插入于pGEM-T载体的C末端FLAG序列添加ITD突变FLT3基因作为模板，使用以下所示出的引物，按照QuikChange定点诱变试剂盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)的操作说明导入Y842C及Y842H突变后，将ITD/Y842同时突变FLT3基因整体插入pMXs-IP逆转录病毒载体而制作。所导入的突变通过序列分析进行了确认。
将利用上述方法制作的突变型FLT3pMXs-IP逆转录病毒载体通过使用FuGENE6从而导入PLAT-E细胞，培养两天以后，回收含有病毒的培养上清。将该含病毒培养上清在10μg/mL的聚凝胺(Polybrene)存在下，添加至小鼠造血前体细胞株32D细胞中以后，在0.5ng/mL的小鼠IL-3存在下进行培养。进行病毒感染操作两天后，使用4μg/mL的嘌呤霉素选择细胞，从而制作各突变型FLT3表达32D细胞株(32D FLT3D835Y、32D FLT3D835V、32DFLT3D835H、32D FLT3D835E、32D FLT3D835N、32D FLT3D835Ins、32D FLT3Y842C、32DFLT3Y842H、FLT3ITD、FLT3ITD/D835Y、FLT3ITD/Y842C及FLT3ITD/Y842H)。FLT3的表达通过蛋白质印迹法(Western Blot)进行了确认。所制作的所有的突变型FLT3表达32D细胞株及FLT3/FLT3配体共表达32D细胞株在IL-3非存在下可以增殖，在含有10％FBS、100U/mL的青霉素及100ng/mL的链霉素的RPMI1640培养基中进行培养。
向FLT3基因的Y842C突变或Y842H突变导入中所使用的引物序列
Y842C突变导入中所使用的引物
5‘-CATGAGTGATTCCAACTGTGTTGTCA-3’(序列号：3)
5‘-TGACAACACAGTTGGAATCACTCATG-3’(序列号：4)
Y842H突变导入中所使用的引物
5‘-CATGAGTGATTCCAACCATGTTGTCA-3’(序列号：5)
5‘-TGACAACATGGTTGGAATCACTCATG-3’(序列号：6)
以底线表示突变导入位置。
本实施例中所引用的文献
[非专利文献3]Shiotsu Y等，Blood，第114卷，1607-1617页，2009年
[非专利文献4]Kitamura T等，Exp Hamtol，31卷，1007-1014页，2003年
[非专利文献5]Tsujimura A等，Int J Hematol，92卷，624‐633页，2010年
[非专利文献6]Lu Y等，Leukemia，21卷，2246-2257页，2007年
[非专利文献7]Yamamoto Y等，Blood，97卷，2434-2439页，2001年
[非专利文献8]Kiyoi H等，Leukemia、12卷，1333-1337页，1998年
2-3.细胞增殖试验
(1)
比较化合物1使用Quizartinib(Ambit Biosciences Corporation)、比较化合物2使用Sorafenib(Bayer HealthCare Pharmaceuticals,Inc.)。
按照以下方法进行FLT3/FLT3配体共表达32D细胞株及突变型FLT3表达32D细胞株(32D FLT3D835Y、32D FLT3D835V、32D FLT3D835H、32D FLT3D835E、32D FLT3D835N、32DFLT3D835Ins、32D FLT3Y842C及32D FLT3Y842H)的化合物的细胞生存性试验。
在96孔板(Becton、Dickinson and Company)中，以各细胞分别成为1000-10000细胞/孔的方式进行种植，在5％CO2存在下37℃下开始进行培养。第二天将以3倍公比进行稀释的化合物添加至各自的孔中，再进行两天的培养之后，为了评价细胞的生存性，按照Promega Corporation的操作说明将CellTi ter 96AQueous One Solution Reagent添加至各孔中，进行一个小时的培养。然后，使用MPR-A4iⅡmicroplate reader(TOSOHCORPORATION)测定吸光度(OD＝492nm)。吸光度不充分的情况下，追加培养1到2小时以后测定吸光度。将未添加化合物的孔设为0％增殖抑制，将未种植细胞的孔设为100％增殖抑制，将试验化合物的50％抑制浓度(GI50值)利用XLfit 5.3.1software(Fit Mod el 205)(IDBusiness solutions Limited)进行计算。
将结果示于表3。
[表3]
表中，对于各種FLT3蛋白质表达32D细胞的增殖的GI50值的评价基准如下。
+++：小于1nmol/L
++：1nmol/L以上且小于10nmol/L
+：10nmol/L以上且小于100nmol/L
-：100nmol/L以上
并且，表中，各用语具有下面的意思。
FLT3/FL：FLT3蛋白质及FL(FLT3配体)蛋白质共表达株
FLT3D835Y：将第835位的天门冬氨酸取代成酪氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3D835V：将第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3D835H：将第835位的天门冬氨酸取代成组氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3D835E：将第835位的天门冬氨酸取代成谷氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3D835N：将第835位的天门冬氨酸取代成天冬酰胺的FLT3蛋白质表达株
FLT3D835Ins：将第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸及天门冬氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3Y842C：将第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3Y842H：将第842位的酪氨酸取代成组氨酸的FLT3蛋白质表达株
本发明化合物对于表达任一突变型FLT3的细胞显示较强细胞增殖抑制效果，而且该抑制效果的强度与对于FLT3/FLT3配体共表达细胞的抑制效果相比为同等以上。
(2)
按照2-3.(1)所记载的方法进行对于突变型FLT3表达32D细胞株(FLT3ITD、FLT3ITD/D835Y、FLT3ITD/Y842C及FLT3ITD/Y842H)的化合物的细胞生存性试验。
将结果示于表4。
[表4]
表中，对于各種FLT3蛋白质表达32D细胞的增殖的GI50值的评价基准与表2相同。
并且，表中，各用语具有下面的意思。
FLT3ITD：具有ITD突变的FLT3蛋白质表达株
FLT3ITD/D835Y：具有ITD突变且将野生型FLT3中的相当于第835位的天门冬氨酸取代成酪氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3ITD/Y842C：具有ITD突变且将野生型FLT3中的相当于第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸的FLT3蛋白质表达株
FLT3ITD/Y842H：具有ITD突变且将野生型FLT3中的相当于第842位的酪氨酸取代成组氨酸的FLT3蛋白质表达株
本发明化合物对于具有ITD突变且具有D835Y、Y842C或Y842H的突变型FLT3表达细胞显示较强细胞增殖抑制效果，而且该抑制效果的强度与对于仅具有ITD突变的突变型FLT3表达细胞的抑制效果相比为同等以上。
〔实施例3使用突变型FLT3瞬时表达HEK293T细胞的FLT3磷酸化抑制试验〕
3-1.材料
HEK293T细胞株购自DS Pharma Biomedical Co.,Ltd。DMEM购自LifeTechnologies公司。关于本细胞培养，使用含有10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基在37℃、5％CO2存在下进行。pcDNA3.1(+)载体及基因导入试剂Lipof ectamine 2000购自LifeTechnologies公司。细胞内磷酸化FLT3的定量使用PathScan Phospho-FLT3(Tyr591)Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit#7021(Cell Signaling Technology公司)进行。
3-2.突变型FLT3表达载体的制作
ITD突变FLT3表达载体通过将ITD突变FLT3基因作为在C末端添加有FLAG序列的序列而引入到pcDNA3.1(+)载体中进行制作。
ITD/F691L同时突变FLT3表达载体将ITD突变FLT3表达载体作为模板，使用以下所示出的引物，按照QuikChange定点诱变试剂盒(QuikChange Site-Directed MutagenesisKit)(Stratagene公司)的操作说明将F691L突变导入之后，将ITD/F691L同时突变FLT3基因整体再次插入pcDNA3.1(+)载体而进行制作。所导入的突变通过序列分析来进行确认。
F691L突变导入中所使用的引物序列
5‘-CCAATTTACTTGATTTTGGAATACTGTTGC-3’(序列号：7)
5‘-GCAACAGTATTCCAAAATCAAGTAAATTGG-3’(序列号：8)
以底线表示突变导入位置。
3-3.突变型FLT3(FLT3ITD或FLT3ITD/F691L)瞬时表达HEK293T细胞内磷酸化抑制试验
比较化合物1使用Quizartinib(Ambit Biosciences Corporation)。关于突变型FLT3即FLT3ITD或FLT3ITD/F691L，通过引入了各自基因的表达载体，分别向HEK293T细胞进行基因导入，并按照以下方法进行对于瞬时性表达这些突变型FLT3的本细胞内的FLT3磷酸化的化合物的抑制作用试验。
将HEK293T细胞种植至T75烧瓶中(8×106细胞/烧瓶)，在5％CO2存在下37℃下培养24小时以后，交换培养基(15mL)。将Lipofectamine2000溶液(Lipofectamine试剂160μL与OPTIMEM 4.0mL的混合液)与载体溶液(Pl asmid DNA 64μg与OPTIMEM 4.0mL的混合液)以1:1进行混合，在室温下静置20分钟之后，将其中的3mL添加至进行培养基交换的HEK293T细胞，在5％CO2存在下37℃下再培养24小时。将导入有FLT3ITD或FLT3ITD/F691L基因的HEK293T细胞以分别成为50000细胞/孔的方式在96孔板(#3300、Corning公司)中种植，在5％CO2存在下37℃下前培养24小时。前培养后，将连续稀释系列的化合物溶液添加至各孔中，在5％CO2存在下在37℃下培养60分钟。为了对培养后的HEK293T细胞内的磷酸化FLT3进行定量，使用PathScan Phosph o-FLT3(Tyr591)Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit，按照附属操作说明处理样品。若进行简要说明，则为将各孔使用PBS100μL进行清洗之后，添加Lysis Buffer 50μL，分取Lysate。适当稀释Lysate之后，向固相化有FL T3Mouse mAb的ELISA板的各孔中添加50μL，在4℃反应24小时。反应后，去除各孔的上清，利用Wash Buffer清洗之后，添加Phospho-FLT3(Tyr591)Rabbit Detection Antibody，在室温下反应1小时，清洗各孔以后，添加HRP-linked secondary antibody，进一步在室温下反应30分钟。反应后，清洗，将检测液(Luminol/Enhancer溶液与Stable Peroxide Buffer的1:1混合液)添加至各孔中，利用微孔板检测仪EnVision测定425nm下的发光量。将未添加化合物的孔设为0％磷酸化抑制，将未种植细胞的孔设为100％磷酸化抑制，将试验化合物的50％抑制浓度(IC50值)利用XLfit 5.3.1software(Fit Mod el 205)(ID Business solutions Limited)进行计算。
将结果示于表5。
[表5]
表中，对于突变型FLT3瞬时表达HEK293T细胞内的FLT3磷酸化的IC50值的评价基准如下。
+++：小于10nmol/L
++：10nmol/L以上且小于30nmol/L
+：30nmol/L以上且小于90nmol/L
-：90nmol/L以上
并且，表中，各用语具有下面的意思。
FLT3ITD：具有ITD突变的FLT3蛋白质瞬时表达株
FLT3ITD/F691L：具有ITD突变且将野生型FLT3中的相当于第691位的苯丙氨酸取代成亮氨酸的FLT3蛋白质瞬时表达株
本发明化合物与比较化合物1相比，将FLT3ITD突变表达HEK293T细胞内的FLT3磷酸化较强抑制为同等以上。而且，对于比较化合物1的FLT3磷酸化抑制作用明显减弱的FLT3ITD/F691L突变表达HEK293T细胞，本发明化合物也显示较强的FLT3磷酸化抑制作用。
产业上的可利用性
含氮杂环化合物或其盐作为用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物及突变型FLT3抑制剂而有用。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO.:1FLT3
SEQ ID NO.:2FLT3substrate peptide
SEQ ID NO.:3Primer for Y842C mutation
SEQ ID NO.:4Primer for Y842C mutation
SEQ ID NO.:5Primer for Y842H mutation
SEQ ID NO.:6Primer for Y842H mutation
SEQ ID NO.:7Primer for F691L mutation
SEQ ID NO.:8Primer for F691L mutation
SEQUENCE LISTING
<110> FUJIFILM Corporation
<120> 用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物、突变型FLT3抑制剂以及这些的应用
<130> 15F00798
<150> JP 2014-169709
<151> 2014-08-22
<150> JP 2014-178737
<151> 2014-09-03
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 993
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20 25 30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35 40 45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50 55 60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85 90 95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100 105 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115 120 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130 135 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145 150 155 160
Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met
165 170 175
Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu
195 200 205
Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu
210 215 220
Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu
225 230 235 240
Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr
245 250 255
Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys
260 265 270
Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu
275 280 285
Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser
290 295 300
Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val
305 310 315 320
Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro
325 330 335
Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala
340 345 350
Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys
355 360 365
Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr
370 375 380
Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr
405 410 415
Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr
420 425 430
Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser
435 440 445
Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp
450 455 460
Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu
465 470 475 480
Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val
485 490 495
Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val
500 505 510
Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu
515 520 525
Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe
530 535 540
Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu
545 550 555 560
Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu
565 570 575
Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val
580 585 590
Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu
595 600 605
Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val
610 615 620
Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln
625 630 635 640
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu
645 650 655
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu
660 665 670
Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr
675 680 685
Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg
690 695 700
Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu
705 710 715 720
His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser
725 730 735
Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile
740 745 750
Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr
755 760 765
Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr
770 775 780
Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu
785 790 795 800
Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
805 810 815
Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu
820 825 830
Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala
835 840 845
Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile
850 855 860
Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu
865 870 875 880
Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala
885 890 895
Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe
900 905 910
Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe
915 920 925
Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly
930 935 940
Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly
945 950 955 960
Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser
965 970 975
Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp
980 985 990
Ser
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLT3 底物肽
<400> 2
Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu Tyr Phe Glu Leu Val Ala Lys Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y842C突变的引物
<400> 3
catgagtgat tccaactgtg ttgtca 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y842C突变的引物
<400> 4
tgacaacaca gttggaatca ctcatg 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y842H突变的引物
<400> 5
catgagtgat tccaaccatg ttgtca 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Y842H突变的引物
<400> 6
tgacaacatg gttggaatca ctcatg 26
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F691L突变的引物
<400> 7
ccaatttact tgattttgga atactgttgc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F691L突变的引物
<400> 8
gcaacagtat tccaaaatca agtaaattgg 30

Claims (23)

1.一种含有由通式[1]所表示的化合物或其盐的用于处置FLT3突变阳性癌的医药组合物；
式中，
R1表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
R2表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R3表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
m表示1～3的整数，
m个R4可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，选自m个中的一个R4可以与R3一起形成可被取代的C1-6亚烷基，
m个R5可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
X1表示氧原子、N(R20)、C(＝O)、C(＝O)-N(R20)或连接键，式N(R20)中，R20表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，式C(＝O)-N(R20)中，R20具有与上述相同的意义，
X2表示可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的二价的脂环式烃基或可被取代的二价的芳香族烃基，
n表示0～3的整数，
n个R6可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
n个R7可相同或不同，表示氢原子或可被取代的C1-6烷基，
X3表示可被取代的C1-6亚烷基、可被取代的C2-6亚烯基、可被取代的C2-6亚炔基或N(R20)-C(＝O)，式中，R20具有与上述相同的意义，
R8表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R9表示可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基、可被取代的C2-6炔基或可被取代的C3-8环烷基，
R8及R9也可以与它们所键合的氮原子一起形成可被取代的环状氨基，
R10表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基，
R11表示可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基、可被取代的C2-6炔基、可被取代的C3-8环烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基。
2.根据权利要求1所述的医药组合物，其中，
R10为氢原子。
3.根据权利要求1或2所述的医药组合物，其中，
X1为C(＝O)-N(R20)，式中，R20表示氢原子、可被取代的C1-6烷基、可被取代的C2-6烯基或可被取代的C2-6炔基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的医药组合物，其中，
X3为可被取代的C2-6亚炔基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的医药组合物，其中，
FLT3突变包括TKD突变。
6.根据权利要求5所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第823位～第861位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
7.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第835位、第836位及第842位的组中的至少一个氨基酸的突变。
8.根据权利要求7所述的医药组合物，其中，
TKD突变为选自包括下述组中的至少一个：
a.序列号：1的氨基酸序列中的第835位的天门冬氨酸取代成缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
b.序列号：1的氨基酸序列中的第836位的异亮氨酸取代成亮氨酸-天门冬氨酸；
c.序列号：1的氨基酸序列中的第842位的酪氨酸取代成半胱氨酸或组氨酸。
9.根据权利要求5所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第604位～第822位的区域中的1或多个氨基酸的突变。
10.根据权利要求9所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的选自包括第621位、第627位、第676位、第691位及第697位的组中的至少一个氨基酸的突变。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其中，
TKD突变为序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其中，
序列号：1的氨基酸序列中的第691位的氨基酸的突变为苯丙氨酸取代成亮氨酸。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的医药组合物，其中，
FLT3突变进一步包括ITD突变。
14.一种突变型FLT3抑制剂，其包括权利要求1至4中任一项所定义的化合物或其盐。
15.根据权利要求14所述的药剂，其抑制包括TKD突变的突变型FLT3。
16.根据权利要求15所述的药剂，其还抑制包括ITD突变的突变型FLT3。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的药剂，其还抑制野生型FLT3。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的药剂，其为抗癌剂。
19.预测对象中的通过供给含有权利要求1至4中任一项所定义的化合物或其盐的医药组合物而带来的处置效果的方法，其包括检测有无FLT3突变的工序。
20.选择适用含有权利要求1至4中任一项所定义的化合物或其盐的医药组合物的对象的方法，其包括检测有无FLT3突变的工序。
21.决定是否将含有权利要求1至4中任一项所定义的化合物或其盐的医药组合物供给于对象的方法，其包括检测有无FLT3突变的工序。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，
FLT3突变包括TKD突变。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中，
FLT3突变进一步包括ITD突变。
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