CN107064082A - 用于多点扫描显微的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于多点扫描显微的设备和方法。该设备具有：多色光源；分束设备；第一光学装置，用于提供照射光路，照射光路用于将单独的照射子光束分别引导并且聚焦到待检验的样本上或样本中的光斑中；扫描单元；检测单元，用于检测在用单独的照射子光束辐照之后，检测子光束中的被样本辐射的检测光；第二光学装置，用于提供将检测子光束引导到检测单元的检测光路；控制和评价单元，用于控制扫描单元并且用于评价检测单元检测的检测光。所述设备的特征在于，在照射子光束中的至少两个照射子光束的照射光路中，存在用于独立地设定相应照射子光束的光谱组成的可控光束操纵装置，并且控制和评价单元被设计成控制光束操纵装置。

Description

用于多点扫描显微的设备和方法
技术领域
在第一方面，本发明涉及根据权利要求1的前序部分的一种用于多点扫描显微的设备。在第二方面，本发明涉及根据权利要求24的前序部分的一种用于多点扫描显微的方法。
背景技术
例如，在WO 13 131 808 A1中描述了一种用于多点扫描显微的常用装置，该设备具有以下构件：多色光源，其用于提供至少一个照射光束；分束设备，其用于将照射光束分束成多个照射子光束；第一光学装置，其提供照射光路，以将单独的(individual)照射子光束分别引导并聚焦到待检验的样本上或样本中的光斑中；扫描单元，其用于在样本上方引导光斑；检测单元，其用于检测在用单独的照射子光束辐照之后的检测子光束中的样本辐射的检测光；第二光学装置，其用于提供将检测子光束引导到检测器单元的检测光路；以及控制和评价单元，其用于控制扫描单元并且用于评价检测单元检测的检测光。
在WO 13 131 808 A1中还公开了一种用于多点扫描显微的常用方法。这里，执行以下步骤：用多色光源提供至少一个照射光束，将照射光束分束成多个照射子光束，将单独的照射子光束分别在照射光路中引导到待检验的样本上或样本中的光斑中并且在样本上方进行扫描，将在用单独的照射子光束辐照之后的检测子光束中的样本辐射的检测光引导到检测器单元并且由检测器单元进行检测。
激光扫描显微已经发展成生命科学中不可缺少的工具。特别地，散射背景下的三维结构的成像是适于大范围的生物医疗应用的方法。特别地，该方法的多面性导致了对应系统得以广泛传播和宽广的应用领域。
然而，该方法仍然有一系列问题。这些问题包括：第一，荧光被漂白并且通常对样本造成光损伤的显著倾向；第二，图像记录相对较慢；第三，相比于宽场方法，噪声增加。
这些问题的原因在于图像形成的类型。通常这样执行，使得点，更具体地，照射点扩散函数(PSF)的体积顺序地对样本进行光栅扫描或扫描。在针孔处将离焦光相对于焦点信号光区分开。这造成用光学层析的性质来生成图像。这意味着，只有来自焦平面的光才对信号有贡献。以此方式，也能对光学上更致密且略有散射的样本进行无模糊成像。一方面，用激光束对样本进行扫描导致焦斑的功率高。这是照射斑，在样本上或样本中，照射光被聚焦到照射斑上或照射斑中。另一方面，对样本进行扫描促进仅缓慢图像形成，这受到扫描仪的速度或样本中的染料发射速率的限制。因为在样本中相应地只扫描小体积，所以样本中的染料发射速率本质上是低的。
尽管共聚焦显微在生命科学中的非常广泛的传播，但它特别地具有以下问题：为了以可接受的信噪比(SNR)生成信息，必须在短时间内生成一定数目的光子(例如，对于以大约3的SNR在1μs的像素时间中检测10个光子，是10MHz速率信号光子；由于系统中的损失，导致样本中的速率必须还要高得多)。这与以下关联：第一，样本的漂白；第二，使在活细胞显微的视场中不能进行或者至少相当程度更难进行许多参数检验的损伤。
缩短像素时间造成图像形成略快，但另一方面，造成用于足够高信号生成的焦斑中的甚至更高的功率。因此，不能够用单斑激光扫描显微镜来解决与1)图像速度、2)良好的信噪比和3)低光子损伤这三个基本要求相关的内在困境。
荧光显微的其它重要性质是其光谱宽带。不同染料的激发最大值位于从UV经由可见光谱延伸远至红外光谱范围的范围内。在标准商业系统中，通常可用的是波长范围是400nm-645nm或更高范围的激发。用仅一个激光焦点对样本进行扫描就这点而言也是不利的。多个激发波长可以被聚焦在同一焦斑中，因此多个荧光团可以被同时激发。然而，即使在光谱选择性检测的情况下，也一直引起所谓的交叉激发和不期望的光谱部分的检测，这会导致结构或不期望背景的错误指认。
通过旋转盘(SD)系统来提供相对于可实现SNR的略好状况。这里，光被分布到许多(大约1000个)聚焦体积。以大致相同的SNR，样本中的特定区域的照射时间因此随每个聚焦体积的强度降低而同时增加。这整体上导致行为相对于由光毒性带来的光损伤有大幅提高。然而，不能够灵活使用这些系统。特别地，光斑距离不能变化。另外，检测限于相机，这使得检测多于2个光谱通道相当大程度上更困难。另外，不能够用这些非基于扫描仪系统在样本中进行电子变焦。用这些系统完全不能够进行诸如荧光相关光谱的点测量。
在DE 102 15 162 B4、WO 13 131 808 A1、US 6 028 306A中已经描述了其它多点系统。这些系统在提供扫描激光点时总是引起问题。例如，在DE 102 15 162 B4和DE 102010 047 353 A1中描述了其布置。
所有这些系统的性质另外在于，它们只提供无源多束生成。这意味着，例如，颜色分束通常是固定的并且对于所有光束而言是大体相等的。在AT-131942-E中，对于不同扫描点使用不同激光，这大幅限制了该系统的灵活性。此外，不能够独立地调谐单独的光束和颜色的亮度，这在要检验用不同染料进行不同程度的标记的结构时造成了问题。
在高质量尤其是关键因素的测量中，通常记录时间多轨道。这里，每个均要求用于激发的特定波长并且要求用于检测的特定光谱配置的不同荧光团的图像被在时间上一个接一个地记录，尽管传统系统原理上能够同时进行记录。即使用户在此具有时间上的不足，相对于所实现质量的益处也胜过了该不足。
AT-131942-E指示了如下系统，该系统避免了因样本中的各个不同位置处发生光谱激发导致光谱串扰的效果。这里，参照空间光谱多追踪。然而，颜色通道由此被固定地预先限定且是不能配置的。因此，因为波长分布被固定地预先限定，所以相对于诸如例如样本保存或速度的其它参数，在样本包含比原理上能检测到的染料的数目少的情况下，该系统不能够被优化。
发明内容
可以认为本发明的目的是指示广泛避免了以上提到的问题的设备和方法。
通过具有权利要求1的特征的设备并且通过具有权利要求24的特征的方法来实现该目的。
以下，特别地，将与随附权利要求书和附图关联地，描述根据本发明的设备的有利实施例和根据本发明的方法的优选变型。
根据本发明对以上所指示的常用装置的进一步改进之处在于，在照射子光束中的至少两个的照射光路中，存在用于独立设定相应照射子光束的光谱组成的可控光束操纵装置，并且还将控制和评价单元被设计成控制光束操纵装置。
根据本发明对以上所指示的常用装置的进一步改进之处在于，对于照射子光束中的至少两个独立地设定照射光的光谱组成。
可以看到，本发明的基本优点在于，根据本发明的设备可以取决于样本进行优化，或者可以甚至自身进行优化，使得可以实现扫描速度显著增加、光损伤减少、避免光谱交叉激发或者信噪比增大。此外，在由此形成的不同激发/检测路径中，可以组合不同类型的传感器(例如，可用其空间测量点扩散函数(PSF)的空间分辨(例如，像素化)检测器与集成检测器的组合)。因此，提供用于生物医疗成像中的不同测量任务的灵活光学布置。同时，提供了新的光谱选择性显微方法。
优选地，第一光学装置和第二光学装置具有至少一个显微镜物镜、x-y扫描仪单元和/或至少一个主颜色分束器作为公共构件。
已经通过在多个照射子光束中分别并且独立设定照射光的光谱实现了本发明的基本优点。然而，特别优选地是，在根据本发明的设备中，在检测子光束中的至少两个的检测光路中另外存在用于独立影响经由相应检测子光束传递到检测单元的检测光的光谱组成的可控光谱选择装置，并且控制和评价单元也被设计成控制光谱选择装置。根据本发明的方法的变型与之对应，其中，在至少两个检测子光束的情况下，经由相应检测子光束传递到检测单元上的检测光的光谱组成受到独立影响。在这些变型中，实现了在照射侧还有检测侧都存在光谱选择的特殊优点。因此，可以对相应样本，特别地对分别使用的荧光染料，高度明确地定制测量。
在原理上，如果可以在至少两个照射子光束中独立地设置光谱组成，则已经实现了本发明的基本思路。然而，以下的根据本发明的设备的变形是特别优选的，其中，在每个照射子光束的照射光路中，存在用于独立设定或调节相应照射子光束的光谱组成光束操纵装置。其中对于每个照射子光束独立设定照射光的光谱组成的根据本发明的方法的变型对应于这些示例性实施例。根据本发明的上述优点是，照射和检测可以在原理上特别好地适于任何种类的样本，并且在原理上，由此以特殊方式实现了任何期望的荧光染料。特别地，还可以用根据本发明的设备来测量光谱重叠带。
出于相同原因，以下的根据本发明的设备的示例性实施例是示优选的，其中，在每个检测子光束的检测光路中，存在用于独立影响经由相应检测子光束传递到检测单元的检测光的光谱组成的可控光谱选择装置。在根据本发明的方法的变型中，在每个检测子光束中，经由相应检测子光束传递到检测单元的检测光的光谱组成因此受到独立影响。用这些示例性实施例来提供相对于大部分变化的测量情形综合配置的高度功能化装置以及方法。
在原理上，例如，如果使用复用技术，则单个检测器可以足以对检测光进行检测。然而，检测单元优选地具有用于测量样本上的特定光斑相应地发射的检测光的多个单独的检测器。然后，可以特别有效地记录测量数据。
根据本发明的设备的其它优选示例性实施例的特征在于，检测光路中的光学构件，特别地，可控光谱选择装置，是保持点扩散函数的构件。关于待检验样本的其它可用信息可以得自点扩散函数。
在原理上，单独的检测器可以是例如光电倍增器或单独的光电二极管。然而，如果例如要测量点扩散函数，则在单独的检测器分别是空间分辨检测器且特别地分别是二维光电二极管阵列时是有用的。这里，单光子雪崩二极管阵列(SPAD阵列)是特别有利的。这些具有非常好的灵敏度，还可以借此对单独的光子进行计数。另外，可以形成这些雪崩二极管的像素化结构。然而，除了这些传感器之外，还可以使用传统的倍增光电二极管，如果它们设置有光传播装置(Zeiss的Airyscan模块)。最后，还可以使用微通道板和/或光纤连接光电倍增器。尤其有利的是使用不同的传感器类型，例如，用空间分辨检测器与集成检测器的组合进行点扩散函数的空间测量。在原理上，可以使用具有期望的光谱选择功能的所有构件作为光束操纵装置。该功能可以在原理上基于折射、衍射、选择性反射和/或吸收。
为了能够快速变化或调制激光的强度，优选地，在激光扫描显微中使用声光元件作为光束操纵装置。如果仅仅要影响一个激光线的强度，则可以使用声光调制器(AOM)。如果另一方面存在每一个强度都变化的不同波长的多个激光线的复用，则必须使用声光(AOF)滤波器。通常，声光调制器(AOM)允许有比AOTF更高的调制频率。这些声光元件是被特殊切割和研磨的晶体(例如，TeO2)，在这些元件中，使用激发用于振动的换能器的高频信号来形成衍射光栅。
基本上通过该换能器的形式和大小来确定声光元件的光谱性质和光学性质二者。耦合到声光元件中的激光的部分在晶体中激发的光栅处发生衍射。可以通过变化所供应的高频信号的功率来调节通过衍射而偏转的激光的该部分的强度。
虽然在AOM的情况下为了影响波长λ的一个激光线而需要供应仅具有特征频率fλ的高频载波，但在AOTF中，为了变化多个激光线的强度，需要复用多个高频载波。
这些声光元件被作为空间单通道还有多通道二者提供。在单通道AOM/AOTF中，仅仅一个换能器被布置在晶体上。因此，只有一个激光束或多个激光线的一个束可以受到影响。在空间多通道AOM/AOTF中，多个换能器被一个在另一个旁边地布置在同一晶体上。由此，可以影响同一波长(AOM)的多个平行激光束或同时自身共线性(AOTF)但其强度彼此独立的多个并行激光线束(AOTF)。
优选地，光束操纵装置具有多个声光元件，特别地，AOM、AOD和/或AOTF。声光构件是商购的，特别地，也具有非常小的结构大小，这对于显微而言是有利的。然而，此外，还可以有利地使用诸如例如多通道光电调制器(EOM)或空间光调制器(SLM、DMD、MEMS等)的替代分段的光束操纵装置。
在根据本发明的设备的特别优选的示例性实施例中，光束操纵装置具有至少一个空间多通道AOTF。对应地，在用于独立设定或调节照射子光束中的照射光的光谱组成的根据本发明的方法的特别优选的变型中，使用至少一个空间多通道AOTF/AOM作为光束操纵装置。这些空间多通道AOTF/AOM特别适于多点扫描显微，因为照射光束可以用这些构件相当密集地引导到彼此旁边。因此，所使用的透镜还可以相当小。
本发明还涉及用多个通道有利地控制或驱动声光元件，例如，AOTF/AOM。
为了控制AOM/AOTF，使用特殊HF合成器组件，这些组件取决于应用来提供单独的正弦高频信号(AOM)或不同频率的多个高频信号的复合(AOTF)。取决于合成器组件的设计，高频信号的功率可以受模拟控制信号影响或被数字调制。在控制空间多通道AOM/AOTF的情况下，在原理上，可以在换能器之间的功率分离器的辅助下，分离或划分合成器组件提供的控制信号。然而，通过以此方式进行，灵活性受相当大限制，因为随后对于空间多通道AOM/AOTF的所有换能器而言同步发生调制。
如果空间多通道声光元件的每个换能器受单独合成器组件控制，则可以进行显著更灵活的控制。由于空间多通道声光元件的换能器之间的相互作用，导致将在合成器组件的设计中满足一系列条件，以避免不期望的次生效应。
因此，本发明的子任务是提供导致空间多通道AOTF/AOM的换能器它们自身之间的影响(交叉耦合)尽可能低的合成器组件的布置和操作模式。
该子任务通过以下变型来实现：其中，空间多通道AOTF/AOM的不同通道的控制信号具有相对于彼此的恒定相位位置，特别地，在接通处理之后具有相对于彼此的恒定相位位置。使用多通道AOTF的主要优点是其相当小的构造尺寸，使得照射光束可以被引导成彼此靠近。这样促进相当小构件，特别地，相当小的透镜的使用。光束的横向距离优选地在光束直径的5倍和50倍之间，特别优选地在光束直径的8倍和15倍之间。
根据本发明认识到，通过调节信号发生器的相位差θn，可以显著改善空间多通道AOTF/AOM的通道之间的绝缘。
另外，本发明认识到，在合成器组件，即，提供空间多通道AOTF/AOM的换能器的控制信号的构件每次重新开启的情况下，在空间通道之间设定所限定的相对初始相位位置是有利的。当在本申请中描述的类型的并行图像记录中，使用空间多通道声光元件作为多点应用的均衡器时，这尤其显著。在这种模式下，每个子光束掠过样本的特定部分并且生成子图像。最终，通过在控制和评价单元中将子像素合在一起，一起合成最终图像。所有子图像必须在连接点具有相同亮度，因为否则在样本的最终图像中造成了干涉结构。如果不能确保控制信号的所限定的相对初始相位位置，则由于空间多通道声光元件的换能器之间的相互作用，取决于相位位置，可以在通道中引起强度差异。如果声光元件透射波长λ的多个激光线的复合，则必须分别对于每个激发频率fλ来设定所限定的相位差Δθ。
通过适当选择直接相邻的换能器的相位差Δθ，它们激发的衍射光栅之间的相互作用可以减少，因此实现了绝缘的优化。截止现在的测量已经表明，如果对于相位差Δθ而言应用下式，则引起最小的相互作用：
Δθ＝90°+k×180°(k是整数)。
可能偏离该值并且可能例如通过信号合成组件中和系统布线中的运行时间差异来引起这些偏离。
因此，在根据本发明的设备的实施例和根据本发明的方法的变型中可以进行其它改进，其中，空间相邻通道的多通道AOTF的激发信号具有90°+n×180°的相对相位距离，n由此是整数。在本发明的范围内，令人惊奇地认识到，如果选择了此相位距离，则多通道AOTF的相邻通道的信号串扰特别低。为了照射空间多通道AOTF/AOM，通过光学分束设备将照射光束分束成多个照射子光束。
在原理上，可以用于实现照射光束的期望分束的任何构件可以用作分束设备。特别地，这些构件可以是折射或衍射构件。其中分束设备具有至少一个波导芯片的变型是特别优选的。波导芯片是商购构件。
根据本发明的设备的特别优选的示例性实施例的特征在于，控制和评价单元被设计成一方面用于特定照射子光束中的光束操纵装置的彼此调谐，并且另一方面用于来自样本上的特定照射子光束生成的光斑的检测子光束中的光谱选择装置的彼此调谐。相对于该方法，优选地，一方面特定照射子光束中的光束操纵装置被彼此调谐，并且另一方面来自样本上的特定照射子光束产生的光斑的检测子光束中的光谱选择装置被彼此调谐。在这个实施例中，根据本发明的优点是特别有效的。光谱选择在照射侧执行，并且在检测侧被调谐。检测侧滤波器系统的复杂度可以因此显著降低。与之关联，可以保证滤波器布置的高光学透射率。
该变型可以通过将控制和评价单元设计成控制光束操纵装置和光谱选择装置来检测样本上或样本中的至少一种，特别精确地是一种确定的荧光染料来特别有用且有利地改进。依据该方法，可以优选地在照射子光束中设定照射光的光谱组成，并且可以在检测子光束中控制光谱选择装置，以检测至少一种特定，特别精确地是一种荧光染料。因此，可以用根据本发明的设备和根据办法明年的方法将单独的荧光染料特别好地分开。另外，装置可以目标明确地被设定成检测特定荧光染料。特别地，还可以检测光谱重叠带。
在原理上，可以用于实现选择进行检测所期望的检测光的光谱部分的所有构件可以用作可控光谱选择装置。例如，选择装置可以具有至少一个滤色器和/或至少一个色散装置，特别地，折射装置(例如，棱镜)和/或衍射装置(例如，与反射镜元件结合的衍射光栅)。基本上，在可以有利地使用本发明的荧光显微中，将检测所使用的染料的发射光。
在一个优选变型中，选择装置具有多个滤色器。这些可以是例如分度滤色器。对于所有检测子像素，可控选择装置可以例如是相同的。分度滤色器是其中如果进入光的波长小于阈值波长则反射该进入光，如果进入光的波长大于阈值波长则透射该进入光，或反之亦然的构件。这些构件因此被描述为分度滤色器，因为阈值波长取决于这些构件上的入射光接触点而不同，并且特别地，随着光的接触位置而连续改变。通过更换这些分度滤色器，因此可以有利地连续调节阈值波长。另外，可以使用分立的颜色分束器或可调节(可调谐)的颜色分束器，其波长选择性行为取决于它们的相对于光轴的角度取向(举例来说，这里可以提到商购的Semrock生产的Versa Chrome滤波器)。然而，在此时还可以使用在不同旋转位置具有不同光谱性质的旋转滤波器。
如果只扫描样本区域中的一种染料，则控制光束操纵装置使得对于所有照射子光束而言光谱组成相同可以是优选的。因此，可以实现样本区域的更快速记录或具有更好信噪比的记录。
替选地或另外地，可控选择装置可以是相同的和/或在所有检测子光束中设定成相同的。
根据本发明的设备因此可以被配置成，使得可以用原理上相同的多个照射子光束和检测子光束来执行多点扫描显微。
在根据本发明的方法的其它优选变型中，控制光束操纵装置，使得每个照射子光束具有不同的光谱组成。如果在样本区域中要同时检测多种染料，则可以使用该变型。
所描述的变型的混合形式也是可能的，并且可以是有利的。这意味着：例如，在总共四个照射子光束的情况下，这些子光束中的每两个可以具有相同的照射光谱。因此，与照射子光束关联的检测子光束和位于这里的光束操纵装置可以均被设定成相同的。在原理上，用此布置，在每种情况下，都将存在两个相同的照射子光束和后续的检测子光束。
该布置可以如下取决于样本而被优化或者可以自身进行优化，即实现了扫描速度的明显增大和/或光损伤的减少和/或光谱交叉激发的避免和/或信噪比的增大。
最后，根据本发明的方法的优选实施例的特征在于从相应地检测到的检测子光束进行计算、生成和/或示出而得到的图像，来解决测量任务。
因此，对于生物医疗成像中的不同测量任务，可以进行灵活的光学布置。同时，描述了新的光谱选择性显微方法。
附图说明
以下，将参照附图来描述本发明的其它优点、特征和性质，在附图中：
图1示出根据本发明的设备的示意图；
图2示出根据本发明的设备和根据本发明的方法中使用的、光谱选择装置的示例性实施例；
图3示出不同操作状态下的图2的光谱选择装置；以及
图4示出根据本发明的设备的照射光路中的可以用作可控光束操纵装置的多通道AOTF的示意图。
具体实施方式
用根据本发明的设备进行测量的基本原理是基于激光扫描显微镜。显微镜的光学布置被设计成，使得用光学地产生并行模式的操作。关键的是，多个照射光束可以被耦合到显微镜中。
特定数目的激光线可以被提供到该显微镜，以便进行光谱照射。首先，它们是分立的激光线、可调谐的激光还是白光激光是不相关的。另外，激光是连续还是脉冲的并不重要。最后，本发明的可用性不限于诸如例如常规荧光激发的特定激发机构。可以使用非线性处理，特别地，诸如，两光子荧光或CARS显微中的两光子处理。特别地，可以使用主颜色分束器将这些光谱分量反射到显微镜的光路中。为此，主颜色分束器必须支持要耦合到显微镜中的所有波长。这意味着，主颜色分束器必须充当要耦合的所有波长的反射镜。这对于例如二向色元件是可能的。然而，这里还可以组合多个主颜色分束器的效果，并且操纵光谱分束空间中的一个或两个光束。此外，可以在主颜色分束器处将检测光分束。然而，除了传统的二向色分束器之外，激发和检测之间的波长分束的其它方法也是可能的。因此，还可以使用声光分束器(AOBS)。
传统上，在激光扫描显微中，只用一个激光点对对象进行扫描。然而，还已知其它布置，例如，线扫描系统。在本发明中，将把激发光引入样本中，使得多个照射斑对对象进行光栅扫描。为此，来自激光源的光必须被空间分束。以下，将描述提供用于对样本进行扫描的多个照射斑的光学布置。可以根据本发明来单独地设定这些照射斑的强度和颜色二者。
此外，还可以单独地调制单独的光束。特别优选地，单独的照射子光束的光束质量非常高，由此，如果要实现高图像质量的话，这构成了激光扫描显微镜的基本必备条件。
在所有附图中，总体上，用相同的附图标记来设置相同和类似的构件。
根据本发明的设备100的图1中示意性示出的示例性实施例具有以下的主要构件：多色光源10，其用于提供至少一个照射光束18；分束设备16，其用于将照射光束分束成多个照射子光束11、12、13、14；第一光学装置30、35、56、38、55，其用于提供照射光路，以将单独的照射子光束11、12、13、14、31、32、33、34分别引导和聚焦到待检验的样本40上或样本40中的光斑41、42、43、44中。
更进一步地，还存在扫描单元38(作为第一光学装置30的部分)和检测单元，扫描单元38用于在样本40上方引导光斑41、42、43、44，检测单元具有检测器D1至D4，检测器D1至D4用于在用单独的照射子光束31、32、33、34辐照之后，检测在检测子光束51、52、53、54中的被样本40辐射的检测光。
此外，装置100具有：第二光学装置50，其用于提供将检测子光束51、52、53、54引导到检测器单元的检测光路；以及最后，控制和评价单元90，其用于控制扫描单元38并且评价检测单元检测的检测光。第一光学装置30和第二光学装置50可以部分地具有相同光学构件，特别地，显微镜物镜。扫描单元38可以例如是具有检流计反射镜的传统x-y扫描仪。可以由控制和评价单元90经由连接件95来控制光源10。
根据本发明，在照射光路中还存在可控光束操纵装置21、22、23、24，在每种情况下，可以用这些装置来独立地设置相应照射子光束11、12、13、14的光谱组成。可控光束操纵装置21、22、23、24在图1中示出的示例性实施例中示意性地在一起，以形成精确包含这些光束操纵装置21、22、23、24的可控光束操纵装置20。此外，根据本发明，在检测光路中，存在可控光谱选择装置61、62、63、64，可以用这些装置来独立地影响经由相应检测子光束51、52、53、54、71、72、73、74传递到检测单元的检测光的光谱组成。
特别地，多色光源10可以是具有多个激光源的激光单元，如例示示例L1和L2中一样。在所示出的示例中，光源10发射的照射光束18经由反射镜36、67传递到分束设备16，特别地，分束设备16可以是波导芯片。例如，可以在与分束设备光学且机械连接的光纤的辅助下，实现将照射光束18耦合到分束设备16中。离开光纤的辐射因此耦合到分束设备中。然而，也可以进行自由光束耦合。分束设备16用于实现跨例如2n个子光束的照射光束18的分束。字母“n”指示分束设备16内，例如，进而波导芯片内的分束级联的数目。
在每个级联中，通过y个分束器，可以将光的路径大致等分地分束到两个新路径上。精确地，跨2n个子光束或者到2n个子光束上的分束的原因优选地是出于效率原因。然而，在原理上，例如，可以通过减弱不必要的子光束来生成任何数目的光束。
在通信工程中已知具有该功能的分束器。这里，然而，光学条件比较简单，因为需要观察仅一个波长，例如，1300nm或1550nm。
在本发明的前期工作的范围内，认识到，特别地，可以在显微中有利地使用基于层波导的分束器，还可以实现特别地相对于宽带方面的高要求。例如，认识到，可以在所有波长上调谐照射光的相应强度，使其相较于彼此高50％，甚至高25％或最终甚至高10％。在单独的照射子光束上越好地发生该光谱强度调谐，激光源可以越有效地用于所描述应用。然而，对于根据本发明的设备和根据本发明的方法，分束器还可以用于不完美调谐时，并且还可以用这些分束器来提高图像质量。
例如，可以执行平均化扫描。在该操作模式下，可以通过照射子光束中的每一个对样本中的关注区域进行彻底的光栅扫描，随后从所有单独的图像来计算平均图像。对于此平均化而言，光束的自身之间的的完美调谐不是绝对必要的。然而，这个初始无源的光束生成仍然被大幅改进，因此最终显著更广泛地使用。
这可以通过强度受影响的不同光路而在分束设备16上实现，例如，进而直接在波导芯片上实现。为此，已知诸如例如Mach-Zehnder干涉仪的集成光学电路。这里，使用Mach-Zehnder干涉仪的光路之间的相移来设定芯片上的该干涉仪的输出端处的功率。因此，可以例如在几毫秒内快速实现分束设备的光学输出调谐。
在图1中示意性示出的示例性实施例中，可以被称为第二级的光束操纵单元20在分束设备16的下游。在该第二级中，存在每个照射子光束11、12、13、14的可控光束操纵装置21、22、23、24。这些可控光束操纵装置还可以被描述为光谱选择性工作元件，并且用这些装置可以为每个照射子光束11、12、13、14设定强度和光谱组成两者。
在特别优选的变型中，可以使用AOTF(声光可调谐滤波器)作为可控光束操纵单元20。首先，可以实现分束设备16与该AOTF的光学连接。这是例如经由合适的自由光束光学系统发生的。然而，在原理上，经由光纤束进行耦合和直接耦合可控光束操纵装置，例如，直接耦合AOTF，也是可能的。
可控光束操纵装置21、22、23、24被设计成，使得照射子光束11、12、13、14中的每一个可以相对于其它照射子光束11、12、13、14单独地且独立地受到影响，或者换句话讲，被调制。照射子光束连同关联的可控操纵装置21、22、23、24也被称为单个空间通道。当使用AOTF时，可以在一个空间通道中处理高达八种颜色。例如，可以使用具有由例如大体TeO2组成的不同晶体的AOTF，或者具有分段的换能器电极的单晶。每个照射子光束的强度可以单独的受到影响。另外，可以相对于其它照射子光束单一地、单独地且独立地设定相应照射子光束中的相应波长的光及其光谱强度的选择。由于这些性质，布置和这些可控光束操纵装置被称为空间波长选择器。以下，将参照图4更详细地说明这些技术方面。
通过分别布置在照射子光束11、12、13、14中的可控光束操纵装置21、22、23、24的作用，产生照射子光束31、32、33、34。照射子光束31来自可控光束操纵装置21对照射子光束11的作用。对应地，对于其它照射子光束32、33、34，同样如此。随后，用第一光学装置30将照射子光束31、32、33、34引导到样本40上，在具体例示的示例中，第一光学装置30具有被示出为风格化透镜35、主颜色分束器56、扫描装置38和显微镜物镜55的光学构件。照射子光束31由此被引导并且聚焦在待检验的样本40上或样本40中的光斑41，也可以被称为焦点中。其它照射子光束32、33、34对应地被分别引导并且聚焦在光斑42、43或44上。在原理上，光学装置30是用于多点扫描显微的已知构件。
特别地，扫描单元38优选地布置在光路的光瞳中。在图1中示意性示出的情形中，光斑41、42、43、44在y方向上(相对于图1中的坐标系45)偏移。例如，可以以光斑41、42、43、44从左到右(在图中，因此从上向下，因为这些行在x方向上延伸，参见坐标系45)逐行移动并且在一行的结尾处所有四个光斑向下跳一行(因此，到图1中的左边)的方式来实现样本40的扫描(如果四个照射光束的光谱都不同)。然而，原理上，任何变型是可能的。例如，并非所有光斑41、42、43、44需要被引导到每个样本位置上。例如，在刚描述的示例中，在一行的结尾处，所有四个光斑可以向下跳四行。如果四个照射光束的光谱都相同，则该变型是优选的。一般，在不同光谱的情况下，所有扫描斑应该扫描样本中的每个位置。然而，顺序可以是根据需要的。其中光斑41、42、43、44被在扫描方向上一个接着一个引导的变型也是可能的。在原理上，任何扫描轨迹是可能的，前提是最终图像的计算考虑到了这些轨迹。可以在这众多的可能变型中看出多点扫描显微的实质优点。
当单独的光斑41、42、43、44碰到待检验的样本40时，样本发射检测子光束51、52、53、54中的检测光，其中，检测子光束51来自光斑41，对应地，检测子光束52、53、54分别来自光斑42、43或44。因为照射子光束31、32、33、34可以在原理上分别具有不同的光谱组成，从而不同的波长具有不同的强度，所以单独的检测子光束51、52、53、54中的检测光因此在光斑41、42、43、44照射的区域中也将有所不同，即使假定待检验的样本40的类型相同。
然后，在根据本发明的设备100中，通过第二光学装置50、55、38、56、57将检测子光束51、52、53、54引导到可控光谱选择装置61、62、63、64上。具体地，检测子光束51、52、53、54，经由显微镜物镜55和扫描单元38被引导回到主颜色分束器56。主颜色分束器56被有用地设计，使得它透射检测子光束51、52、53、54中的红色偏移荧光部分。随后，经由被示意性示出为风格化透镜57的其它光学构件，检测子光束51、52、53、54到达可控光谱选择装置61、62、63、64。
检测子光束41由此碰到可控光谱选择装置61，并且因此，检测子光束52、53、54分别碰到可控光谱选择装置62、63、64。可控光谱选择装置通常是以某种方式操纵进入的或入射的电磁辐射，特别地光的设备。诸如吸收、散射、折射和衍射的不同物理效果由此可以变得有效。特别地，经由例如光学棱镜中的折射的波长依赖性和/或借助例如反射镜中的反射的波长依赖性，色散效果也可以变得有效。可调节滤波器，特别地分度滤波器优选地用作可控光谱选择装置61、62、63、64。
经由示例性指示的连接件，特别地通向控制和评价单元90的电线连接件65来实现可控光谱选择装置61、62、63、64的控制。另外，控制和评价单元90经由连接件25，特别地电线连接件来控制照射光路中的可控光束操纵装置21、22、23、24。
通过可控光谱选择装置61、62、63、64对检测子光束51、52、53、54的作用，其它检测子光束71、72、73、74从以上提到的检测子光束形成。具体地，通过可控光谱选择装置61的作用，例如，通过分度滤波器的作用，检测子光束71从检测子光束51形成。对应地，对于其它检测子光束52、53、54和72、73、74，同样如此。检测单元具有用于检测不同检测子光束71、72、73、74中的检测光的单独的检测器D1、D2、D3、D4。
具体地，由检测器D1检测检测子光束71中的检测光。对应地，用单独的检测器D2、D3或D4检测检测子光束72、73、74中的检测光。单独的检测器D1将检测到的检测光作为输出信号发送到控制和评价单元90。因此，单独的检测器D2、D3和D4向控制和评价单元90供应输出信号82、83和84。控制和评价单元90评价检测单元，具体地，进而单独的检测器D1、D2、D3、D4检测到的检测光。一般使用计算机作为控制和评价单元90。
因此，在根据本发明的设备和根据本发明的方法中，用其中在原理上已经可以单独地设定每个光斑的光谱组成的布置，因此执行对应的光谱选择性检测。由此，如果所描述的光谱检测，换句话讲，进而可控光谱选择装置61、62、63、64由滤波器，例如，分度滤波器构成，则可能是特别有利的。例如，在DE 10 2006 034 908 A1中描述了这种类型的光谱滤波器。基于滤波器的布置提供了光谱检测的成本有利且有效的可能。
另外，基于滤波器的布置允许以高光学质量进行点扩散函数(PSF)的扫描测量。这可用于诸如例如通过虚拟针孔(为此，参见：Handbook of Biological ConfocalMicroscopy,J.B.Pawley,3rd revised edition2010)或点扩散函数的空间分辨测量来增大检测效率和光学分辨率的方法。在原理上，还存在色散布置，从而基于提供类似效果的依赖波长的衍射或折射进行工作。这些还可以被设计成，使得确保检测PSF被保持。与基于滤波器的示例性实施例类似地，可以实现与空间光谱选择照射结合的有利使用。
另一方面，这些滤波器的效率由于它们的复杂结构而一直受到限制。换句话讲，如果这多个滤波器被布置成一个接着另一个，则是低效的。然而，用一个接着另一个布置的两个分度滤波器而有意义且有光效率地分束到三个不同波长带上仍然是有意义的且可行度高。同一光束，进而同一检测子光束上的其它滤波器将使检测单元的关联输出愈发低效。这与要用现今的激光显微镜测量的范围愈发宽广的荧光染料形成对照。要以高精度快速且在空间上实现测量。特别地，期望只在单次扫描中同时实现测量。在许多情况下，要能测量超过三个光谱通道。
该优点基于用染料标记的不同结构的信号没有串扰的事实。然而，待检验的样本的移动会导致例如共同位置测量中的伪影。
当测量多个波长时，因此有两个问题要克服：第一，要实现对所有波长的有效光谱检测；第二，在检测中尽可能避免通过样本中的交叉激发而发生的光谱串扰或光谱分配不当。
为此，根据本发明的设备和根据本发明的方法带来了本质改进。根据本发明，存在可控光束操纵装置21、22、23、24，用可控光束操纵装置21、22、23、24，可以将每个照射子光束的光谱组成(对于本发明而言，将被理解为相应强度)相对于其它照射子光束单独地且独立地设定，可以将每个照射子光束的光谱组成与光谱选择性检测结合，以形成非常有效且对光谱敏感的显微镜。
这是通过对于显微镜的相应测量任务经由波长选择器最佳设定检测和激发来实现的。可以区分不同的成像模式，从而以最佳配置来解决以上提到的问题。
对于本说明书，全体构件：光源10、分束设备16以及由控制和评价单元90经由连接件25进行控制的可控光束操纵装置20，也被称为空间波长选择器，或者，简称为选择器。
以下，将描述根据本发明的设备和根据本发明的方法的应用，其中，使记录速度最大化和/或待检验的样本将受到的光损伤最小化。为此，选择器提供了N个光束，其中，N(可以由2n构成，其中，n是整数)是特别有利但不是必要的。可控光谱选择装置，特别地，可以是滤波器，因此还可以被描述为检测滤波器，被设定在该激发设定中，使得它们均具有相同的光谱特征。以下，将结合图2对此进行更详细的说明，其中，出于简化的原因，在布置中并没有示出所有光束。
图2示出图1中的检测光路中的切口，其中，示出了可控光谱选择装置的特定示例性实施例。在图2中，检测子光束51、52、53、54从左边进入，而受可控光谱选择装置影响的检测子光束71、72、73、74在检测单元的方向上离开到右侧。对于所有四个检测子光束51、52、53、54，可控光谱选择装置分别由一对分度滤波器形成。在检测子光束51的情况下，这是一对分度滤波器611和613。因此，带有附图标记621和623、631和633以及相应地641和643的成对分度滤波器属于检测子光束52、53、54。分度滤波器均可在与这些检测子光束大体平行的方向上被相对于检测子光束51、52、53、54进行机械调节。在图2中用双箭头612、614、622、624、632、634、642、644示出该机械自由度。
分度滤波器611、621、631、641按以下这种方式进行工作：波长小于阈值波长的光被反射，而另一方面，波长大于阈值波长的光被透射。可以通过分别在双箭头所指示的方向上机械调节分度滤波器来设定阈值波长。对于图2中示出的情形，参照检测子光束54对此进行更详细的说明。从图2中的左边进入的检测子光束54具有特定光谱组成，该特定光谱组成基本上取决于照射光路中的关联的且在前的照射子光束11、31的光谱组成和待检验的样本40的性质。特别地，检测子光束54的光谱组成包含关于关联光斑44碰到的样本体积中包含的荧光染料的特定信息。检测子光束54碰到被设定成特定阈值波长的分度滤波器641。被该分度滤波器641反射回的光541只包含波长比设定的阈值波长小的辐射部分。被分度滤波器641透射的检测子光束54的部分542基本上只包含波长比对于分度滤波器641设定的阈值波长大的辐射部分。
已经穿过分度滤波器641的辐射部分542随后碰到的其它分度滤波器643具有相反的性质。波长比对于分度滤波器643设定的阈值波长大的入射部分被反射，而波长比对于分度滤波器643设定的阈值波长小的辐射部分被允许通过。向着右边离开的检测子光束74因此只包含波长比分度滤波器641的阈值波长大且比分度滤波器643的阈值波长小的辐射部分。被分度滤波器643辐射回的辐射部分543只包含既比分度滤波器641的第一阈值波长大又比分度滤波器643的阈值波长大的波长。
通过组合分度滤波器641和643，得到只允许其波长在分度滤波器641的阈值波长和分度滤波器643的阈值波长之间的辐射部分通过的带通滤波器。为了可以完全透射该辐射，使分度滤波器643的阈值波长大于分度滤波器641的阈值波长是绝对有必要的。因此，在输出541、543和74中有三个可检测波长带，其中，可以在541中检测波长比分度滤波器641的阈值频率短的部分，在543中检测波长比641和643的阈值波长大的部分，并且在74中检测波长在两个阈值波长之间的部分。光因此穿过长通，然后穿过短通。然而，通道的顺序还可以包含短通—长通组合。
检测子光束51、71中的分度滤波器611和613、检测子光束52、72中的分度滤波器621、623和检测子光束53、73中的分度滤波器631、633以与检测子光束54、74中的分度滤波器641和643相同的方式进行工作。然而，对于检测子光束51、71…53、73，没有单独地示出分别被分度滤波器反射回的辐射部分，这是出于简明的原因。在原理上，一方面分度滤波器611、621、631和641可以分别是不同的分度滤波器，并且另一方面分度滤波器613、623、633和643可以分别是不同的分度滤波器。然而，特别优选地，分别使用相同的分度滤波器。
在图2中示出的情形下，一方面在检测光路上的第一分度滤波器611、621、631和641的阈值波长分别相同，并且另一方面在检测光路上的后续分度滤波器613、623、633和643的阈值波长分别相同。这意味着，通过成对的滤波器611和613、621和623、631和633以及641和643来提供相同的带通滤波器。可以使用该配置以并行模式对样本进行扫描。每个光斑，也可以被描述为扫描斑测量仅样本的一部分。例如，竖直地一个位于另一个下方的四个光斑可以在待检验的样本上方从左到右地引导，并且在扫描了第一区域之后，可以设定扫描仪，使得四个光斑以相当大的跳跃跳到待扫描的下一个区域。这被称为毛巾式扫描(Handtuch扫描)。
清楚的是，在给定像素停留时间的情况下，扫描特定样本区域的时间以与光斑或扫描斑的数目对应的倍数减少。在所示出的示例中，该时间因此减少至四分之一倍。图2中示出的配置还可以用于其它模式，以实现提高的信噪比。为此，每个光斑由此通过与刚描述的变型偏离，掠过样本中待使用的整个像场。因此，如果使用四个照射子光束，则将样本上的每个点扫描四次。相比于其中只在样本上方使单个光斑进行光栅扫描或扫描的扫描显微，假定存在不饱和或漂白效应，实现信号因此增大至与所使用光斑的数目对应的倍数，在所提到的示例中因此增大至四倍。在此之后，对以此方式得到的图像求平均，并且在信噪比提高至倍的情况下展示平均化图像。这样的前提是，染料的光发射必须还未饱和。如果用非常快速扫描的系统，例如，用谐振扫描仪对样本进行光栅扫描，则该成像模式是特别受关注的，但不是排他性的。
谐振扫描系统中的重要变量是像素停留时间，进而光斑停留或保持在特定样本区域或样本体积上的时间。这通常是标准设定，例如，512×512个像素和在8kHz或更高谐振频率下，明显低于100ns下操作的谐振扫描仪。
在(大像场中也可以进行的)谐振系统快速成像的情况下，平均化模式此时可造成像素停留时间被有效延长至N倍，因此还实现了高达倍的信噪比。然而，SNR的精确增益因子可以偏离因为它还取决于所使用的染料和激光功率。特别地，在染料饱和的情况下，通过增大激光功率，可以将信号略微增大，但样本愈发受损。另外，像素时间非常短的图像动态因样本在该时间内仍然只能够发射少量光子而受到限制。因为平均化模式使有效像素时间增加，所以图像中的动态同时增加。这种模式因此具有与快速扫描，特别地，谐振扫描系统结合的另外的大优点。
将参照图3来描述结合图2说明的分度滤波器的布置的其它示例应用。这里示出的分度滤波器的布置在原理上与图2中的相同。差异在于对单独的分度滤波器进行的阈值波长的相应设定。通过与其中一方面在光路上的第一分度滤波器611、621、631和641的阈值波长和另一方面在光路上的后续分度滤波器613、623、633和643的阈值波长相同的图2中示出的配置(带来的结果是，对于所有四个检测子光束51、52、53、54设置相同的带通滤波器)偏离，对于所有分度滤波器，图3中示出的配置中的阈值波长的设定是不同的。然而，一般，在任何情况下有用地设定阈值波长，使得设置具有最终宽度的带通滤波器。这意味着，分度滤波器613的阈值波长大于分度滤波器611的阈值波长。对应地，对于成对的分度滤波器621和623、631和633以及641和643，同样如此。然而，一般，被分别设置的带通滤波器覆盖的波长间隔是不同的。
具体地，取决于在光路中在先的关联照射子光束31的光谱组成，换句话讲，进而取决于碰到作为对应检测子光束51来源的光斑41的照射光的光谱组成，来实现检测子光束41的分度滤波器611和613的设定。对应地，对于其它检测子光束52、53和54，同样如此。这意味着，如果保持用第一检测子光束51的示例，则通过相对于彼此进行调谐来一方面实现可控光束操纵装置21，特别优选地，进而多通道AOTF的通道的控制，并且另一方面实现可控光谱选择装置，例如，进而分度滤波器611和613的控制。
由此，控制和评价单元可以有利地被设计成一方面用于特定照射子光束中的光束操纵装置的相互调谐控制，并且另一方面用于来自样本上的特定照射子光束生成的光斑的该检测子光束中的光谱选择装置的相互调谐控制。特别优选地，按目标明确地在样本上或样本中激发特定荧光染料并且检测其荧光发射这样的方式来控制光束操纵装置21和光谱选择装置611、613。
因此，在本发明中，可以有利地实现测量方法中的照射，进而激发，和检测的组合，使得在可控光束操纵装置的辅助下，对于N个照射子光束中的每一个设定所限定的光谱特征。取决于此并且与此对应，可以设定控制光谱选择装置，特别地，进而由图2和图3的分度滤波器全体形成的滤波器单元，使得可以在每个照射和检测通道中实现对于光谱激发特征而言最佳的检测。
可以实现这种模式，也可以被称为光谱模式下的图像形成，因为不同的光谱图像部分被记录在样本中的部分不同位置并且合并，即，合到一起以形成光谱图像。然后，可以在计算机屏幕上例如以错误颜色展示来显示该图像。为此，错误颜色展示被理解为是用分别不同的颜色来示出特定荧光染料所发射的光，但是其波长不一定对应于分别观察到的染料实际所发射的辐射。为了合并从单独的检测子光束形成的相应子图像，可能必须执行合适的坐标移位，因为同一扫描仪设定中的光斑41、42、43、44位于不同的样本位置。
在并行模式下，用N个照射子光束，检测子光束中的每一个提供了包含(如果在扫描时进行逐行扫描并且进一步跳N行，则)分别只用于每个第N条线的图像数据的子图像。这些单独的子像素可以被合到一起，形成整体图像。整体图像中的强度对比度对应于在样本的单独的点处测量的强度。以与光谱模式下相同的方式，为了合并从单独的检测子光束产生的相应子图像，将必须执行合适的坐标移位，因为光斑41、42、43、44位于同一扫描仪设定中的不同样本位置。
最简单地说，提供了平均化模式下的整体图像产生，其中，对于样本不同点的单独的检测子光束测得的强度被分别相加。显然，这里还必须确保，正确强度，进而实际属于同一样本点的强度被相加。这意味着，在平均化模式下，同样地，必须执行合适的坐标移位，因为用同一扫描仪设定，光斑41、42、43、44位于不同的样本位置。如并行模式下一样，平均化模式下的整体图像中的强度对比度对应于分别在样本的单独的点处测量的强度。
在原理上，为了在照射子光束中的每一个中进行激发，可以同时存在多种颜色。例如，在具有空间双分离的三通道检测的情况下，因此可以测量并使用六个光谱通道。如果每个光斑或扫描斑形成不同颜色特征，则可以在四倍空间激发和三通道检测的情况下，扩展12光谱通道。一般，可以在用M个检测通道进行N倍空间光谱激发的情况下，将N×M个构件分离。一般，在根据本发明的设备和根据本发明的方法中，可以根据需要将N个激发通道分离成空间和光谱通道。
通过本发明，因此指示如下光学布置，用该光学布置可以进行相对于测量任务和待测量样本被优化的显微镜图像记录。另外，可以控制根据本发明的设备，使得它对应于用户指令进行自身优化。这意味着，用户所定义的测量任务被翻译成光学布置的最佳设定，换句话讲，因此被翻译成一方面可控光束操纵装置的最佳设置和另一方面可控光谱选择装置的最佳设置。使用算法，用于测量特定样本的优化策略随后可以在硬件构件中被发现和设定。
与图4关联地，描述多通道AOTF，诸如，可以将其用作根据本发明的设备中的可控光束操纵装置20。图4示意性示出了原理上由均质晶体，例如TeO2组成的这种多通道AOTF20。通过虚线指示该晶体总共被分离成四个空间区域，即，四个空间通道，通过这些空间区域，分别形成一个可控光束操纵装置21、22、23、24，可控光束操纵装置21、22、23、24在原理上功能地构成单独的AOTF。为了控制这些单独的通道，进而单独的AOTF 21、22、23、24，分别以图4中示意性示出的方式，在这些AOTF处分别布置换能器211、221、231和241。换能器是与相应AOTF 21、22、23、24结合并且用其将实现期望光学性质所必需的声波引入晶体中的压电晶体。在图4中，用圆形212、222、232和242示意性示出用于控制单独的换能器211、221、231和241的信号。该原理可以被完全转移到任何数量的n个通道。
也被描述为阵列的换能器的二位布置在原理上也是可能的，这里说明的原理也可以被转移到它们。出于简明的原因，以简化方式示出换能器它们自身之间的相互作用。在图4中示出的示例中，认为AOTF22被来自下方的照射子光束12碰到。通过由换能器221在AOTF22中生成的声波的作用，照射子光束12中的光的部分被偏转成照射子光束32，更具体地：它被衍射。另外，存在在没有衍射的情况下穿过AOTF22的辐射部分19。出于以下考虑的重要因素不仅在于经由换能器221施加的控制信号222对于AOTF 22的透射性质是重要的，而且在于用于分别控制AOTF 21、23和24的换能器211、231和241的控制信号212、232和242是重要的。对其它AOTF 21、23、24的控制因此还影响在AOTF 22中产生的衍射光栅。在图4中用箭头201、202和203示意性示出这些相互作用。
假定出于以下考虑，用相等频率的正弦信号来控制所有换能器211、221、231和241，其中，f(λ)是激光的波长λ要求的相应AOTF 21、22、23、24的激发频率。根据本发明，信号发生器它们自身之间同步，并且可以对于信号发生器212、222、232和242中的每一个来分别地设定起始相位θ(n)。正弦载波频率的幅度另外受调制函数mn(t)的影响。取决于应用，换能器211、221、231和241的调制函数mn(t)可以不同或相同。然后，可以如下地描述换能器处的时间信号：
Sn(t)＝mn(t)×sin(2πfλt+θn)。
如果具有不同波长λn的相应M个激光线的多个束要受声光元件20的影响，则通过M个信号Sn(t)的叠加/求和，得到第n个通道的结果控制信号。换能器之间的串扰导致例如属于AOTF 22的通道中的被衍射激光的强度不仅受控制信号222影响，而且受多通道声光元件20的其它换能器211、231、241处的控制信号影响。
影响程度尤其取决于不同通道之间的电绝缘、光学通道彼此的距离和换能器的特定几何形状。取决于设计，通道之间的光学绝缘达到大约30dB的值，其中，因通道之间电绝缘的缺陷，造成串扰的主要部分。尤其是，如果换能器211、221、231和241在空间上彼此靠近，则这样会存在问题。然而，这恰好是重要应用，如例如用于多通道激光扫描显微镜时存在的。待操纵或影响的光束彼此间的距离要尽可能短，以保持此可接受范围内的对光学系统的要求。因此，期望紧密相邻的换能器。然而，这些换能器必定不能如同期望的那样绝缘。
如果选择两个相邻通道的控制信号(212、222、232、242)的起始相位的差异使得它是90°+k×180°，其中，k是整数，则这些通道的控制信号相对于彼此正交。对于通道的相互影响，可以按这种方式来实现最小值。本发明因此认识到，在多通道声光元件，诸如例如多通道AOTF或多通道AOM的情况下的换能器控制被相位刚性地(phase-rigidly)实现是特别有利的。同时，这意味着，待透射的每个波长λ的所有通道的换能器处的控制信号必须具有精确相同的激发频率fλ。如果不是这样，则由于多通道声光元件的通道之间的相互作用，导致引起激光的强度波动，其中，强度波动的频率对应于控制信号的差分频率。
本发明因此涉及用于多点扫描显微的新型装置和新型方法。根据本发明的解决方案要求平行照射。该照射必须在每个照射通道中，至少在子数量通道中能以上述意义进行切换，即，特别地，能相对于该通道中的辐射的强度和波长进行切换。如上所述的波导芯片由此可以是有利的。分束也可以有其它可能性。
在没有光谱分离/分束的情况下，可以以根据本发明的教导的最简单配置实现检测。在N个空间光谱通道的情况下，可以通过以光谱激发特征进行空间划分来精确测量N个光谱通道。另一方面，还可以并行使用N个空间通道，以更快速地记录图像或者以给定帧速率来利用图像中提高的信噪比。这里，帧速率将被理解为是每个时间单元记录的显微图像的数量。
用根据本发明的设备和根据本发明的方法，提供了用于样本的最佳图像记录的可灵活调节的光学布置，其中，可以相对于空间和光谱测量通道进行优化。还可以相对于样本损伤和记录时间来设定并实现最佳值。在根据本发明的方法中，还可以通过相对于空间和光谱测量通道并且还相对于时间分辨率和样本损伤减少进行自优化对样本进行显微镜测量。
在特别有利的实施例中，用光学波导多色地生成空间光分布。可以用分段元件，例如，用多通道AOTF来单独地调制空间光分布。可以对于每个光束，单独地设定空间光分布的光谱特征。例如，用所有子光束的相同光谱特征，还可以设定所限定的但分别不同的亮度。因此，可以在图像中记录更多的动态。根据本发明的设备和根据本发明的方法还可以用于光束它们自身在时间上的影响。特别地，在上述平均化方法中，子光束的亮度可以取决于其它相应子光束的信号来调节。由此，继而可以增加图像动态并且有可能减少光损伤。
另外，还可以灵活地，特别地对应于激发并且关于待解决的测量任务与其一起设定检测。最终，可以选择光束路径中的构件，使得点扩散函数得以保持。为此，特别地，滤波器阵列优选地用于检测光路中，使用利用该检测光路进行的点扩散函数的空间扫描来增大信噪比并且增大分辨率。还已知关键词是“光子再分配”的这些方法或Airyscan方法。

Claims (39)

1.一种用于多点扫描显微的设备，所述设备具有：
多色光源(10)，所述多色光源(10)用于提供至少一个照射光束(18)，
分束设备(16)，所述分束设备(16)用于将所述照射光束(18)分束成多个照射子光束(11,…,14)，
第一光学装置(30)，所述第一光学装置(30)用于提供照射光路，所述照射光路用于将单独的照射子光束(11,…,14)分别引导并且聚焦到待检验的样本(40)上或所述样本(40)中的光斑(41,…,44)中，
扫描单元(38)，所述扫描单元(38)用于在所述样本(40)上方引导所述光斑(41,…,44)，
检测单元(D1,…,D4)，所述检测单元(D1,…,D4)用于检测在用所述单独的照射子光束(31,…,34)辐照之后，检测子光束(51,…,54)中的由所述样本(40)辐射的检测光，
第二光学装置(50)，所述第二光学装置(50)用于提供检测光路(51,…,54)，所述检测光路(51,…,54)用于将所述检测子光束(51,…,54)引导到所述检测单元(D1,…,D4)，以及
控制和评价单元(90)，所述控制和评价单元(90)用于控制所述扫描单元(38)并且用于评价由所述检测单元(D1,…,D4)检测到的检测光，
所述设备的特征在于
在所述照射子光束(11,…,14)中的至少两个照射子光束的照射光路中，存在用于独立地设定相应的照射子光束(11,…,14)的光谱组成的可控光束操纵装置(21,22,23,24)，并且
所述控制和评价单元(90)被设计成控制所述光束操纵装置(21,…,24)。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
在所述检测子光束(51,…,54；71,…,74)中的至少两个检测子光束的检测光路中，存在可控光谱选择装置(61,…,64)，所述可控光谱选择装置(61,…,64)用于独立地影响经由相应的检测子光束(51,…,54；71,…,74)传递到所述检测单元(D1,…,D4)的检测光的光谱组成，并且
所述控制和评价单元(90)还被设计成控制所述光谱选择装置(61,…,64)。
3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
在每个照射子光束(11,…,14)的照射光路中，存在光束操纵装置(21,22,23,24)，所述光束操纵装置(21,22,23,24)用于独立地设定所述照射子光束(11,…,14)的光谱组成。
4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
在每个检测子光束(51,…,54；71,…,74)的检测光路中，存在可控光谱选择装置(61,…,64)，所述可控光谱选择装置(61,…,64)用于独立地影响经由相应的检测子光束(51,…,54；71,…,74)传递到所述检测单元(D1,…,D4)的检测光的光谱组成。
5.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述检测单元(D1,…,D4)具有多个单独的检测器(D1,…,D4)，所述多个单独的检测器(D1,…,D4)用于测量所述样本(40)上的特定光斑(41,…,44)发射的检测光(51,…,54)。
6.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述检测光路中的光学构件是保持点扩散函数的构件。
7.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述可控光谱选择装置(61,…,64)是保持点扩散函数的构件。
8.根据权利要求5所述的设备，其特征在于
所述单独的检测器(D1,…,D4)分别是空间分辨检测器。
9.根据权利要求5所述的设备，其特征在于
所述单独的检测器(D1,…,D4)选自由二维光电二极管阵列、单光子雪崩光电二极管阵列(SPAD阵列)、微通道板和光纤耦合光电倍增器构成的组。
10.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述光束操纵装置(21,…,24)具有多个声光元件。
11.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述光束操纵装置(21,…,24)具有选自由AOM、AOD和AOTF构成的组的多个声光元件。
12.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述光束操纵装置(21,…,24)具有至少一个多通道AOTF。
13.根据权利要求12所述的设备，其特征在于
所述空间多通道AOTF的不同通道的控制信号(212,…,242)具有相对于彼此的恒定相位。
14.根据权利要求12所述的设备，其特征在于
在接通处理之后的所述空间多通道AOTF的不同通道的控制信号(212,…,242)具有相对于彼此的恒定相位。
15.根据权利要求12所述的设备，其特征在于
空间上相邻通道的所述多通道AOTF的激发信号(212,…,242)具有90°+n×180°的相对相位距离，其中，n是整数。
16.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述分束设备(16)具有至少一个波导芯片。
17.根据权利要求2所述的设备，其特征在于
所述控制和评价单元(90)被设计成一方面用于特定照射子光束(11,…,14)中的所述光束操纵装置(21,22,23,24)的相互调谐控制，并且另一方面用于来自所述样本(40)上由所述特定照射子光束(11,…,14)生成的所述光斑(41,…,44)的所述检测子光束(51,…,54；71,…,74)中的所述光谱选择装置(61,…,64)的相互调谐控制。
18.根据权利要求17所述的设备，其特征在于
所述控制和评价单元(90)被设计成控制所述光束操纵装置(21,22,23,24)和所述光谱选择装置(61,…,64)，以检测所述样本(40)上或所述样本(40)中的至少一种特定荧光染料。
19.根据权利要求17所述的设备，其特征在于
所述控制和评价单元(90)被设计成控制所述光束操纵装置(21,22,23,24)和所述光谱选择装置(61,…,64)，以精确地检测所述样本(40)上或所述样本(40)中的一种特定荧光染料。
20.根据权利要求2所述的设备，其特征在于
所述选择装置(61,…,64)具有滤色器、色散装置、折射装置、棱镜、衍射装置、衍射光栅、光谱选择性反射装置和反射镜中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的设备，其特征在于
所述滤色器是分度滤色器(611,…,641,613,…,643)。
22.根据权利要求2所述的设备，其特征在于
所有检测子光束(51,…,54)的所述可控选择装置(611,…,641,613,…,643)是相同的。
23.根据权利要求1所述的设备，其特征在于
所述第一光学装置(30)和所述第二光学装置(50)具有显微镜物镜(55)、x-y扫描仪单元(38)和主颜色分束器(57)中的至少一个作为公共构件。
24.一种用于多点扫描显微的方法
其中，用多色光源(10)提供至少一个照射光束(18)，
其中，将所述照射光束(18)分束成多个照射子光束(11,…,14)，
其中，在照射光路中，将单独的照射子光束(11,…,14)分别引导并且聚焦到待检验的样本(40)上或所述样本(40)中的光斑(41,…,44)中并且在所述样本(40)上方进行扫描，
其中，在用所述单独的照射子光束(31,…,34)辐照之后，检测子光束(51,…,54)中的由所述样本(40)辐射的检测光被引导到检测单元(D1,…,D4)上并且被所述检测单元(D1,…,D4)检测，
所述方法的特征在于
独立地设定所述照射子光束(11,…,14)中的至少两个照射子光束的照射光的光谱组成。
25.根据权利要求24所述的方法，
所述方法使用根据权利要求1所述的设备。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
在至少两个检测子光束(51,…,54；71,…,74)的情况下，独立地设定经由相应的检测子光束(51,…,54；71,…,74)传递到所述检测单元(D1,…,D4)上的检测光的光谱组成。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
对于每个照射子光束(11,…,14)独立地设定所述照射光的光谱组成。
28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于
对于每个检测子光束(51,…,54；71,…,74)独立地影响经由相应的检测子光束(51,…,54；71,…,74)传递到所述检测单元(D1,…,D4)上的检测光的光谱组成。
29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于
控制所述光束操纵装置(21,…,24)，使得所有照射子光束(31,…,34)的光谱组成相同。
30.根据权利要求25所述的方法，其特征在于
控制所述光束操纵装置(21,…,24)，使得每个照射子光束(11,…,14)具有不同光谱组成。
31.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
所述可控选择装置(611,…,614,613,…,643)被相等地设定在所有检测子光束(51,…,54)中。
32.根据权利要求25所述的方法，其特征在于
一方面特定照射子光束(11,…,14)中的所述光束操纵装置(21,22,23,24)被彼此调谐地控制，并且另一方面来自所述样本(40)上由所述特定照射子光束(11,…,14)生成的所述光斑(41,…,44)的所述检测子光束(51,…,54；71,…,74)中的光谱选择装置(61,…,64)被彼此调谐地控制。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于
设定所述照射子光束(11,…,14)中的照射光的光谱组成，并且在所述检测子光束(51,…,54；71,…,74)中控制所述光谱选择装置(61,…,64)，以检测至少一种特定荧光染料。
34.根据权利要求32所述的方法，其特征在于
设定所述照射子光束(11,…,14)中的照射光的光谱组成，并且在所述检测子光束(51,…,54；71,…,74)中控制所述光谱选择装置(61,…,64)，以精确地检测一种荧光染料。
35.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
为了独立地设定所述照射子光束(11,…,14)中的照射光的光谱组成，使用至少一个多通道AOTF作为光束操纵装置(21,…,24)。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于
所述多通道AOTF的不同通道的控制信号具有相对于彼此的恒定相位。
37.根据权利要求35所述的方法，其特征在于
在接通处理之后的所述多通道AOTF的不同通道的控制信号具有相对于彼此的恒定相位。
38.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
空间上相邻通道的多通道AOTF的激发信号具有90°+n×180°的相对相位距离，其中，n是整数。
39.根据权利要求24所述的方法，其特征在于
从相应地检测到的所述检测子光束来计算、生成和示出中的至少一个得到结果图像，以解决测量任务。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110488248A (zh) * 2019-08-26 2019-11-22 苏州迈斯泰克达光电科技有限公司 一种基于声光偏转器的阵列式扫描激光雷达装置
CN111751340A (zh) * 2020-06-24 2020-10-09 宁波舜宇仪器有限公司 光束复用共聚焦成像装置及成像方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017119478A1 (de) 2017-08-25 2019-02-28 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop
DE102017119480A1 (de) 2017-08-25 2019-02-28 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop
DE102017119479A1 (de) 2017-08-25 2019-02-28 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop
DE102018123381A1 (de) * 2018-09-24 2020-03-26 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Abrastern einer Probe
US11187962B2 (en) * 2018-12-14 2021-11-30 Mycronic AB Reducing impact of cross-talk between modulators that drive a multi-channel AOM
KR20230131936A (ko) * 2021-03-11 2023-09-14 주식회사 씨젠 광학 신호 검출 장치
DE102021203620A1 (de) 2021-04-13 2022-10-13 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Multispot-Scanning-Mikroskopie

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141319A (en) * 1990-11-22 1992-08-25 Olympus Optical Co., Ltd. Displacement detection device with adjacent semiconductor diode lasers
DE10215162A1 (de) * 2002-04-05 2003-10-23 Lavision Biotec Gmbh Strahlteilervorrichtung bzw. Laserrastermikroskop
JP2005140981A (ja) * 2003-11-06 2005-06-02 Nikon Corp 顕微鏡装置
US20060012872A1 (en) * 2002-09-30 2006-01-19 Terutake Hayashi Confocal microscope, fluorescence measuring method and polarized light measuring method using cofocal microscope
CN1815137A (zh) * 2006-03-14 2006-08-09 清华大学 阵列垂直腔面发射激光器共焦显微系统
CN1858650A (zh) * 2006-06-07 2006-11-08 哈尔滨工业大学 基于微光学阵列多点曝光的极坐标直接写入方法及装置
CN101080627A (zh) * 2004-12-17 2007-11-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 多点检查装置
JP2009103958A (ja) * 2007-10-24 2009-05-14 Olympus Corp 走査型レーザ顕微鏡
JP2013525866A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 ライカ マイクロシステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー 調整可能な多重レーザパルス走査顕微鏡およびその操作方法
DE102013021182A1 (de) * 2013-12-17 2015-06-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Scanning-Mikroskopie
DE102013022026A1 (de) * 2013-12-19 2015-06-25 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mehrfarben-Scanning-Mikroskop

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT131942B (de) 1930-06-05 1933-02-25 Siemens Ag Leitungsschutzanordnung mit Impedanzrelais.
GB9015793D0 (en) 1990-07-18 1990-09-05 Medical Res Council Confocal scanning optical microscope
JP3816632B2 (ja) 1997-05-14 2006-08-30 オリンパス株式会社 走査型顕微鏡
DE19829981C2 (de) 1998-07-04 2002-10-17 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie
JP2001116696A (ja) 1999-10-21 2001-04-27 Olympus Optical Co Ltd 走査型光学装置
DE10225838B4 (de) * 2002-06-11 2021-10-21 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Scanmikroskopie, Scanmikroskop und Vorrichtung zum Codieren eines Beleuchtungslichtstrahles
JP2007127740A (ja) 2005-11-02 2007-05-24 Olympus Corp 走査型レーザ顕微鏡装置及び顕微鏡用照明装置
DE102006034908B4 (de) 2006-07-28 2023-01-26 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Laser-Scanning-Mikroskop
KR20100045964A (ko) 2007-07-06 2010-05-04 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 형광 초점변조 현미경 시스템 및 방법
EP2181351A2 (en) * 2007-08-16 2010-05-05 Koninklijke Philips Electronics N.V. A method of imaging a sample
DE102010047353A1 (de) 2010-10-01 2012-04-05 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Laser-Scanning-Mikroskop mit umschaltbarer Betriebsweise
DE102012203736A1 (de) 2012-03-09 2013-09-12 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Lichtrastermikroskop mit spektraler Detektion
JP6047325B2 (ja) * 2012-07-26 2016-12-21 浜松ホトニクス株式会社 光変調方法、光変調プログラム、光変調装置、及び光照射装置
US9404869B2 (en) * 2012-10-09 2016-08-02 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
CN104359862B (zh) 2014-11-06 2017-02-01 佛山市南海区欧谱曼迪科技有限责任公司 一种基于光外差干涉术的共聚焦扫描显微成像方法及系统
DE102014119027A1 (de) * 2014-12-18 2016-06-23 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141319A (en) * 1990-11-22 1992-08-25 Olympus Optical Co., Ltd. Displacement detection device with adjacent semiconductor diode lasers
DE10215162A1 (de) * 2002-04-05 2003-10-23 Lavision Biotec Gmbh Strahlteilervorrichtung bzw. Laserrastermikroskop
US20060012872A1 (en) * 2002-09-30 2006-01-19 Terutake Hayashi Confocal microscope, fluorescence measuring method and polarized light measuring method using cofocal microscope
JP2005140981A (ja) * 2003-11-06 2005-06-02 Nikon Corp 顕微鏡装置
CN101080627A (zh) * 2004-12-17 2007-11-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 多点检查装置
CN1815137A (zh) * 2006-03-14 2006-08-09 清华大学 阵列垂直腔面发射激光器共焦显微系统
CN1858650A (zh) * 2006-06-07 2006-11-08 哈尔滨工业大学 基于微光学阵列多点曝光的极坐标直接写入方法及装置
JP2009103958A (ja) * 2007-10-24 2009-05-14 Olympus Corp 走査型レーザ顕微鏡
JP2013525866A (ja) * 2010-05-06 2013-06-20 ライカ マイクロシステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー 調整可能な多重レーザパルス走査顕微鏡およびその操作方法
DE102013021182A1 (de) * 2013-12-17 2015-06-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Scanning-Mikroskopie
DE102013022026A1 (de) * 2013-12-19 2015-06-25 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mehrfarben-Scanning-Mikroskop

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110488248A (zh) * 2019-08-26 2019-11-22 苏州迈斯泰克达光电科技有限公司 一种基于声光偏转器的阵列式扫描激光雷达装置
CN111751340A (zh) * 2020-06-24 2020-10-09 宁波舜宇仪器有限公司 光束复用共聚焦成像装置及成像方法
CN111751340B (zh) * 2020-06-24 2023-08-11 宁波舜宇仪器有限公司 光束复用共聚焦成像装置及成像方法

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