DE102014119027A1

DE102014119027A1 - Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie

Info

Publication number: DE102014119027A1
Application number: DE102014119027.0A
Authority: DE
Inventors: Jörg Siebenmorgen; Tobias Schröter; Jörg Ritter
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-06-23

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie mit einem Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten von Anregungslicht auf eine Probe, wobei das Anregungslicht Licht von mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen enthält, mit einer in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordneten Scan-Einrichtung zum Rastern des Anregungslichts über die Probe, und mit einem Detektionsstrahlengang zum Aufnehmen von von der Probe abgestrahltem Detektionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, und zum Weiterleiten des Detektionslichts zu einer Detektionseinrichtung, insbesondere einer Kamera. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs, in dem das Anregungslicht kollimiert ist, mindestens ein als Dammann-Gitter ausgebildetes Phasenelement zum diffraktiven Auftrennen des Anregungslichts in eine Mehrzahl von Anregungslichtbündeln angeordnet ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung weist einen Beleuchtungsstrahlengang zum Leiten von Anregungslicht auf eine Probe auf, wobei in dem Beleuchtungsstrahlengang eine Scan-Einrichtung zum Rastern des Anregungslichts über die Probe vorhanden ist. Außerdem weist eine gattungsgemäße Vorrichtung einen Detektionsstrahlengang zum Aufnehmen von von der Probe abgestrahltem Detektionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, und zum Weiterleiten des Detektionslichts zu einer Detektionseinrichtung, insbesondere einer Kamera, auf. Das Anregungslicht enthält mindestens zwei verschiedene Wellenlängen.
Eine Multispot-Beleuchtung, also eine Beleuchtung eines Objekts mit einer Mehrzahl von separaten Fokalflecken, ist durch den Vorteil eines hohen Parallelisierungsgrads interessant für eine Vielzahl von Mikroskopieverfahren, wie beispielsweise die konfokale Mikroskopie und die Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Bei der konfokalen Mikroskopie zum Beispiel erhöht sich die Aufnahmegeschwindigkeit um denselben Faktor, in dem auch die Anzahl der Beleuchtungsspots vergrößert wird. So verdoppelt sich die Aufnahmegeschwindigkeit bei zwei Beleuchtungsspots, verdreifacht sich bei drei Beleuchtungsspots usw.
Verschiedene Methoden, eine Multispot-Beleuchtung zu realisieren, sind bekannt. Beispielsweise werden Mikrolinsen-Arrays, ein sequenzieller Durchgang des Anregungslichts durch mehrere Strahlteiler, diffraktive optische Elemente oder Phasenmasken verwendet. Allerdings sind nicht alle Methoden in gleicher Weise geeignet, die hohen Anforderungen an eine Multispot-Beleuchtung bei der konfokalen Mikroskopie zu erfüllen. Beispielsweise sollen sich Form und Intensität der einzelnen Spots nicht um mehr als 3% unterscheiden. Außerdem soll die Position der einzelnen Spots sowohl absolut als auch relativ zueinander auf etwa 1/10 des Durchmessers eines Beugungsscheibchens reproduzierbar eingestellt werden können. Sind diese Bedingungen nicht erfüllt, werden im aufgenommenen Bild Artefakte, insbesondere Streifen, sichtbar sein.
Die genannten Kriterien sind mit optomechanischen Methoden, wie beispielsweise bei der Verwendung von Strahlteilern, aufgrund sehr enger Fertigungstoleranzen nur sehr schwer und mit hohem Aufwand zu erfüllen. Kandidaten, um dieses Problem zu lösen, sind sogenannte Phasenmasken. Dabei handelt es sich um im Wesentlichen transparente oder reflektierende Komponenten, die auf die Phase des durchtretenden oder reflektierten Lichts einwirken. Mit solchen Phasenmasken kann eine Multispot-Beleuchtung mit hoher Präzision erzielt werden, die außerdem nicht so strenge Fertigungstoleranzen erfordert. Gleichzeitig sind Phasenmasken sehr flexibel in der geometrischen Gestaltung der Multispot-Beleuchtung. Beispielsweise sind beliebig viele Spots mit beliebigen Spotabständen realisierbar. Auch zwei- und dreidimensionale Beleuchtungsarrays sind möglich.
Ein wesentlicher Nachteil von Phasenmasken ist, dass sie jeweils nur auf eine einzige Wellenlänge, die auch als Nominal- oder Designwellenlänge bezeichnet wird, optimiert sind. Wird Licht einer anderen Wellenlänge als diejenige, für welche betreffende Phasenmaske hergestellt wurde, eingestrahlt, reduziert sich die Effizienz der Phasenmaske, insbesondere hinsichtlich Beugungseffizienz, Transmission, Strahlprofil und Divergenzwinkel. Diese Nachteile begrenzen die Einsatzmöglichkeiten von Phasenmasken erheblich.
Beispielsweise besteht eine Aufgabenstellung der konfokalen Mikroskopie häufig darin, eine Probe mit mehreren Wellenlängen gleichzeitig zu beleuchten, um mehrere unterschiedliche Farbstoffe anregen zu können, um mehrfarbige Bilder aufzunehmen. Das sollte auch bei einer Multispot-Belechtung möglich und gewährleistet sein. Eine prinzipiell einfache Methode, diesen Nachteil zu umgehen, ist das schnelle sequenzielle Schalten der Beleuchtungswellenlänge während der Bildaufnahme, was letzten Endes nichts anderes ist, als die Aufnahme des gesamten Bilds mit unterschiedlichen Wellenlängen jeweils nacheinander. Dabei muss die jeweils verwendete Phasenmaske immer auf die jeweils verwendete Wellenlänge optimiert sein. Das kann beispielsweise mit einer schaltbaren Phasenmaske verwirklicht werden. Das schnelle Optimieren könnte beispielsweise mit Hilfe eines räumlichen Lichtmodulators (Spatial Light Modulator, SLM) durchgeführt werden. Zwar kann so ein chromatischer Fehler kompensiert oder, besser, umgangen werden. In der Regel geht das aber einher mit einem schlechteren Signal-zu-Rausch-Verhältnis und außerdem begibt man sich des Vorteils der verbesserten Aufnahmegeschwindigkeit.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, eine Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie zu schaffen, bei der besonders präzise Multispot-Muster für verschiedene Farben des Anregungslichts möglich sind.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
Die Vorrichtung der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass in einem Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs, in dem das Anregungslicht kollimiert ist, mindestens ein als Dammann-Gitter ausgebildetes Phasenelement zum diffraktiven Auftrennen des Anregungslichts in eine Mehrzahl von Anregungslichtbündeln angeordnet ist.
Als Dammann-Gitter bezeichnete Phasenmasken oder Phasenelemente als solche sind im Stand der Technik bekannt.
Dammann-Gitter werden durch eine Phasenfunktion beschrieben, die zwischen 0 und π binär moduliert ist. Die Phasenfunktion hängt dabei ab von der Anzahl der Spots, die erzeugt werden sollen. Beispielsweise sind, wenn fünf Spots erzeugt werden sollen, die Punkte innerhalb einer Gitterperiode, bei denen ein Wechsel zwischen 0 und π erfolgt (diese Punkte werden auch als Übergangspunkte bezeichnet), 0,03863, 0,039084, 0,65552 sowie 1. Innerhalb einer Gitterperiode nimmt die Phasenfunktion also innerhalb von jeweils zwei Intervallen den Wert 0 beziehungsweise den Wert π an. Übergangspunkte für weitere Dammann-Gitter sind aufgeführt beispielsweise in „Applied Optics, Volume 34, Nr. 26, Seiten 5961 bis 5969. Die Spots können auf einer Linie, einer Fläche oder auch dreidimensional, also in einem Volumen, angeordnet sein.
Dammann-Gitter können technisch auf unterschiedliche Weise verwirklicht werden. Einerseits können Glasplatten strukturiert werden, so dass die Oberfläche nicht mehr eben ist, sondern Gräben oder Stege aufweist. Die Stege sind insbesondere so hoch, dass Licht, welches durch die Glasplatte propagiert, exakt um π in der Phase verschoben wird. Dammann-Gitter können auch mit SLMs erzeugt werden. Dabei wird die Phasenfunktion des gewünschten Gitters auf den SLM übertragen.
Eine Schwierigkeit besteht darin, dass sowohl eine Glasplatte als auch ein SLM eine wellenlängenabhängige Modulationstiefe besitzt. Der für das Gitter erforderliche Phasenhub von 0 bis π kann nur bei einer einzigen Wellenlänge, die auch als Nominal- oder Designwellenlänge bezeichnet wird, erzeugt werden. Wird eine andere Wellenlänge auf das erzeugende Element, also das Dammann-Gitter, eingestrahlt, so ist der Phasenhub größer oder kleiner und die Spots sind nicht mehr gleichmäßig hell. Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung von Dammann-Gittern ist, dass obwohl sich die Helligkeit der einzelnen Spots ändert, Position, Größe und Form der Spots erhalten bleiben. Die Nebenbeugungsmaxima werden gleichmäßig dunkler, so dass keine störenden Intensitätsabweichungen der Nebenbeugungsmaxima, die auch als Nebenspots bezeichnet werden, untereinander existieren. Diese Sachverhalte macht sich die Erfindung in vorteilhafter Weise zunutze.
Die reduzierten Intensitäten der Nebenbeugungsmaxima können prinzipiell vermieden werden, indem für jede verwendete Wellenlänge des Anregungslichts ein separates Gitter generiert und verwendet wird. Dann wird, je nach Wellenlänge, das jeweils richtige Gitter oder Phasenelement, genutzt. Dies ist nicht mehr möglich, wenn das Anregungslicht mindestens zwei, also mehrere Wellenlängen aufweist, die auf eine Probe eingestrahlt werden sollen. Nur bei einer einzigen Wellenlänge kann eine ideale oder optimale Intensitätsverteilung erzeugt werden.
Die ungleiche Intensitätsverteilung bei einer Modulationstiefe ungleich 0 bis π entsteht dadurch, dass die Beugungseffizienz des Dammann-Gitters verringert wird. Nur noch ein Teil der einfallenden Laserleistung wird auf die zu erzeugenden Spots verteilt. Der Rest des Lichts geht in die nullte Beugungsordnung. Dieser Effekt kann ausgenutzt werden, um ein Spot-Array mit homogener Intensitätsverteilung wellenlängenunabhängig zu generieren. Hierfür wird ein Spot-Array erzeugt, welches aus einer geraden Anzahl an Beugungsmaxima besteht und bei dem sich in der nullten Ordnung, jedenfalls für die Wellenlänge, für welche das jeweilige Dammann-Gitter gefertigt wurde, kein Beugungsmaximum befindet.
Sobald also die Modulationstiefe, die auch als Phasenmodulationstiefe bezeichnet werden kann, sich nicht mehr von 0 bis π erstreckt, hat das Dammann-Gitter eine reduzierte Beugungseffizienz und ein Teil der Lichtleistung geht in das Beugungsmaximum nullter Ordnung.
Unter einer Pupillenebene soll im Rahmen dieser Beschreibung die rückwärtige Brennebene eines Mikroskopobjektivs oder eine zu dieser Ebene optisch konjugierte Ebene im Beleuchtungsstrahlengang verstanden werden.
Die Fokalpunkte auf oder in einer zu untersuchenden Probe werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung auch als Beleuchtungsspots, Beugungsspots oder einfach Spots bezeichnet.
Bei der im Beleuchtungsstrahlengang vorhandenen Scan-Einrichtung kann es sich um Scan-Einrichtungen prinzipiell bekannter Art, insbesondere um schwenkbare Spiegel handeln. Besonders bevorzugt werden galvanometrische Spiegel verwendet.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind deshalb im Beleuchtungsstrahlengang optische Mittel vorhanden zum Ausblenden von Anregungslicht in einer nullten Beugungsordnung.
Besonders zweckmäßig kann als optisches Mittel zum Ausblenden mindestens eine mechanische Blende vorhanden sein, die insbesondere in einer Zwischenbildebene des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet sein kann. Das Beugungsmaximum nullter Ordnung kann so in der Zwischenbildebene herausgefiltert werden. Im Ergebnis erhält man so eine gleichmäßige Intensitätsverteilung für die einzelnen Beugungsmaxima unabhängig von der Wellenlänge. Besonders vorteilhaft ist, dass auch die dreidimensionale Intensitätsverteilung erhalten bleibt. Durch das Eliminieren des Beugungsmaximums der nullten Ordnung kann das Dammann-Gitter mit mehreren Wellenlängen gleichzeitig beleuchtet werden. Die reduzierte Intensität der Nebenbeugungsmaxima, die auch als Nebenspots bezeichnet werden können, bei Abweichungen von der Designwellenlänge kann prinzipiell durch eine höhere Laserleistung und/oder eine höhere Verstärkung auf der Detektionsseite ausgeglichen werden.
Wenn das Dammann-Gitter zum Generieren einer geradzahligen Anzahl von Beugungsmaxima bei der Designwellenlänge ausgelegt ist, erhält man nur dann Licht in der nullten Beugungsordnung, wenn die Wellenlänge des eingestrahlten Lichts von der Designwellenlänge abweicht. Wenn andererseits das Dammann-Gitter eine ungeradzahlige Anzahl von Beugungsmaxima bei der Designwellenlänge erzeugt, ist die Intensität der äquidistant zueinander liegenden Beugungsmaxima nicht mehr für alle Beugungsmaxima gleich groß, weil, wie beschrieben, die Intensität in der nullten Beugungsordnung bei zunehmender Abweichung der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts von der Designwellenlänge, zunimmt. Durch Ausblenden des Lichts der nullten Beugungsordnung erhielte man dann ein Muster der Beugungsmaxima, bei dem die einzelnen Beugungsmaxima nicht mehr äquidistant zueinander liegen. Prinzipiell kann auch mit einer solchen Anordnung von Spots oder Nebenbeugungsmaxima Scanningmikroskopie betrieben werden. Besonders bevorzugt sind aber Varianten der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher das Phasenelement, also das Dammann-Gitter, eine geradzahlige Anzahlung von Beleuchtungsspots für eine Designwellenlänge erzeugt, weil dann die Beugungsmaxima bei Ausblenden der nullten Beugungsordnung äquidistant zueinander liegen (siehe 2).
Grundsätzlich kann das Phasenelement irgendwo in einem kollimierten Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet werden. Besonders bevorzugt wird das Phasenelement aber in einer Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet. Dann kommen die beschriebenen Vorteile des als Dammann-Gitter ausgebildeten Phasenelements in besonderer Weise zum Tragen.
Wenn das Phasenelement oder die verwendeten Phasenelemente außerhalb der Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs oder dazu optisch konjugierte Ebenen angeordnet ist, weist vorteilhaft mindestens eines der verwendeten Phasenelemente eine Defokussierungsfunktionalität auf zum Kompensieren von Verzerrungen, die aufgrund der Positionierung des betreffenden Phasenelements außerhalb einer Pupille oder einer dazu konjugierten optischen Ebene auftreten.
Bei besonders zweckmäßigen Varianten der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das Phasenelement oder sind die Phasenelemente wenigstens teilweise eine strukturierte Glasplatte, eine Glasplatte mit optischen Schichten, ein Flüssigkristall, ein räumlicher Lichtmodulator (Spatial Light Modulator, SLM), ein diffraktives optisches Element, ein photonischer Kristall und/oder ein adaptiver Spiegel. Das erfindungsgemäß vorhandene Phasenelement kann transmittierend oder reflektierend sein.
Bei Verwendung eines SLMs, einer relativ teuren Komponente, kann der SLM in zwei Zonen aufgeteilt werden. Die erste Zone kann zur Erzeugung der Mehrzahl von Beugungsmaxima dienen. Mit Hilfe der zweiten Zone oder des zweiten Teilbereichs könnte wiederum eine achromatische Korrektur durchgeführt werden. Die Kosten für ein zweites Phasenelement können demgemäß gespart werden. Von Bedeutung ist jeweils, dass die Phasenmasken oder Phasenelemente im Frequenzraum, also jedenfalls in einem kollimierten Bereich des Strahlengangs positioniert werden müssen.
Wenn das Phasenelement in einer Probenebene eine gewisse ungeradzahlige Anzahl von Beleuchtungsspots, als welche die Beugungsmaxima auch bezeichnet werden können, erzeugt, ist dieselbe ungeradzahlige Anzahl von Beleuchtungsspots auch in jeder Zwischenbildebene vorhanden.
Prinzipiell kann eine Modulationstiefe des Phasenelements für alle der zum Einsatz kommenden optischen Wellenlängen verschieden sein von 0 bis π. Das bedeutet, dass die Nominalwellenlänge oder Designwellenlänge von keiner der verwendeten optischen Wellenlängen getroffen wird. Aufgrund der spezifischen Vorteile eines Dammann-Gitters sind solche Varianten möglich.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, alternativ zur Abblendung des Beugungsmaximums nullter Ordnung oder ergänzend hierzu, ein zweites Phasenelement vorhanden zum Ausgleichen von durch das erste Phasenelement erzeugten Farbfehlern. Ein solches zweites Phasenelement wird bevorzugt in einem kollimierten Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs, insbesondere in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs oder einer dazu optisch konjugierten Ebene angeordnet. Auch das zweite Phasenelement kann in vorteilhafter Weise ein Dammann-Gitter sein.
Weil die Phasenelemente, insbesondere die Dammann-Gitter, teure Komponenten sind, können auch Varianten bevorzugt sein, bei denen im Ergebnis dasselbe erzielt wird, wie durch ein separates, zweites Phasenelement, nämlich ein Ausgleich von durch das erste Phasenelement erzeugten Farbfehlern, ein separates, zweites Phasenelement aber tatsächlich nicht benötigt wird. Beispielsweise kann der Beleuchtungsstrahlengang so gestaltet sein, dass ein und dasselbe Phasenelement in zwei Zonen aufgeteilt wird und eine erste Zone des Phasenelements zur Spoterzeugung dient und eine zweite Zone des Phasenelements der achromatischen Korrektur.
Insbesondere sind Varianten der erfindungsgemäßen Vorrichtung in diesem Zusammenhang bevorzugt, bei denen das Phasenelement dergestalt im Beleuchtungsstrahlengang positioniert ist, dass ein erster Teilbereich des Phasenelements mit einem gesamten Strahlquerschnitt des Anregungslichts beaufschlagbar ist, dass ein Strahlumlenkmittel, insbesondere ein oder mehrere Spiegel, zum Umlenken des Anregungslichts im Beleuchtungsstrahlengang vorhanden ist und dass ein zweiter Teilbereich des Phasenelements mit dem von dem Strahlumlenkmittel umgelenkten Anregungslicht mit dem gesamten Strahlquerschnitt beaufschlagbar ist. Dabei dient der erste Teilbereich des Phasenelements zur Generierung einer Mehrzahl von Anregungslichtbündeln, also der Beleuchtungsspots, und der zweite Teilbereich dient zur Korrektur von durch den ersten Teilbereich erzeugten Farbfehlern. Bei dieser Variante können die Kosten für ein zweites Phasenelement eingespart werden.
Der einfachste Weg, eine Wellenlängenabhängigkeit eines Phasenelements zu umgehen, ist, für eine Beleuchtungswellenlänge ein eigenes, jeweils optimiertes Phasenelement zur Verfügung zu stellen. Der große Vorteil ist dabei, dass jedes Phasenelement genau für die jeweilige Wellenlänge konzipiert ist und so praktisch immer eine maximale Effizienz erzielt wird. Dies ist aber, wesentlich aus Bauraum- und Kostengründen, nur für wenige Beleuchtungswellenlängen möglich, wie sie beispielsweise bei einem konfokalen Mikroskop gegeben ist (etwa 4 bis 8 verschiedene Beleuchtungswellenlängen). Andernfalls sind die Kosten und der Aufwand im Allgemeinen zu hoch. Ein Gesichtspunkt dieses Verfahrens ist, dass die Mehrfachspots der einzelnen Wellenlängen wieder überlagert, mit anderen Worten, wieder zu einem gemeinsamen Strahlengang zusammengeführt werden müssen und man somit Komponenten (beispielsweise eine Spiegeltreppe) benötigt, mit welchen diese Strahlvereinigung bewerkstelligt wird.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist also für jede verwendete Wellenlänge des Anregungslichts ein separates Phasenelement vorhanden, wobei jedes dieser Phasenelemente bevorzugt in einem Kollimierungsbereich des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet ist. Zweckmäßig sind bei diesen Varianten außerdem Mittel zum Auftrennen des Anregungslichts in die Anteile der einzelnen verwendeten Wellenlängen vorhanden. Beispielsweise können hierfür dielektrische Strahlteiler verwendet werden.
Die Vorteile der Erfindung, insbesondere die geringe Abhängigkeit der Phasenelemente von Fertigungstoleranzen, wird in besonderer Weise erreicht, wenn eine Mehrzahl der Phasenelemente, insbesondere alle Phasenelemente, Dammann-Gitter sind.
In Situationen, wo der Bauraum in einem Mikroskopaufbau im Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs begrenzt oder jedenfalls Zwangsbedingungen unterworfen ist, können auch Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt sein, bei denen eine Mehrzahl von Phasenelementen, insbesondere alle Phasenelemente, in einem Bereich einer Schärfentiefe einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs oder einer optisch konjugierten Ebene hierzu positioniert sind. Auch hier macht sich die vergleichsweise geringe Empfindlichkeit des Dammann-Gitters gegenüber Fehlpositionierungen positiv bemerkbar.
Besonders gute Eigenschaften werden realisiert, wenn eine Mehrzahl der Phasenelemente, insbesondere alle Phasenelemente, in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs oder einer dazu optisch konjugierten Ebene angeordnet sind.
Der Grundgedanke eines Aufteilens eines vorhandenen Phasenelementes in eine Mehrzahl von Zonen, und dadurch das Einsparen von einem oder mehreren Phasenelementen und der entsprechenden Kosten, kommt auch bei Varianten der Erfindung zum Tragen, bei der das Phasenelement in eine Mehrzahl von Zonen, insbesondere zwei Zonen, aufgeteilt ist, und wobei die verschiedenen Zonen mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen beaufschlagt werden.
Wenn als Phasenelement ein räumlicher Lichtmodulator (Spatial Light Modulator, SLM) verwendet wird, ist dieser bevorzugt eingerichtet zum Schalten zwischen den zum Einsatz kommenden Wellenlängen. Hierzu müssen die entsprechenden Elektronikmittel vorhanden sein.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert. Hierin zeigen:
1 eine schematische Ansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
2 in sechs Teilabbildungen die Lage von Beugungsmaxima bei einem Dammann-Gitter;
3 einen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
4 in einer Teilansicht den Beleuchtungsstrahlengang eines zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung;
5 einen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
6 einen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
7 einen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
8 einen Teil eines Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung;
9 einen Teil eines Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung; und
10 einen Teil eines Beleuchtungsstrahlengangs eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung.
In den Figuren sind gleich wirkende oder äquivalente Komponenten und Bestandteile in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
In 1 ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 schematisch dargestellt. Als wesentliche Komponenten weist diese Vorrichtung 100 einen Beleuchtungsstrahlengang 10 mit einer Scan-Einrichtung 80 und einem Detektionsstrahlengang 30 auf. Der Beleuchtungsstrahlengang leitet Anregungslicht 14 aus einer Strahlungsquelle 11, bei der es sich insbesondere um einen Laser handeln kann, über eine Mehrzahl von optischen Komponenten bis zu einer Probe 20 in einer Probenebene 21.
Zunächst wird das von der Strahlungsquelle 11 kommende Anregungslicht von einer ersten Linse 13 kollimiert, gelangt danach über die Scaneinrichtung 80 auf ein erfindungsgemäße vorhandenes Phasenelement 40, bei dem es sich erfindungsgemäß um ein Dammann-Gitter handelt. Dieses Phasenelement 40 ist in einem kollimierten Bereich 36 des Beleuchtungsstrahlengangs 10 in einer Ebene 24 positioniert, bei der es sich um eine Pupillenebene des Beleuchtungsstrahlengangs 10, d. h. eine zu einer hinteren Brennebene 22 eines Mikroskopobjektivs 19 konjugierten Ebene, handelt. Nach Durchtritt durch das Phasenelement 40 gelangt das Beleuchtungslicht 14 auf eine weitere Linse 17, welche das Licht in eine Zwischenbildebene 23 fokussiert. In der Zwischenbildebene 23 ist eine mechanische Blende 50 zum Ab- oder Ausblenden des Lichts in einer nullten Beugungsordnung vorhanden. Im Anschluss erreicht das Beleuchtungslicht 14 über eine weitere Linie 18, welche das Anregungslicht wieder kollimiert, einen halbdurchlässigen Spiegel 58 und das Mikroskopobjektiv 19 die in der Probenebene 21 lokalisierte Probe 20.
Durch die Wirkung des als Dammann-Gitter ausgebildeten Phasenelements 40 werden auf der Probe 20 eine Mehrzahl von Beleuchtungsspots generiert, die in der schematischen Ansicht in 1 mit den Bezugszeichen 61, .., 64 gekennzeichnet sind. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine geradzahlige Anzahl von Beleuchtungsspot (in dem in 1 gezeigten Beispiel sind es vier Beleuchtungsspots 61, .., 64). Das Phasenelement 40 generiert also bevorzugt eine geradzahlige Anzahl von Beugungsmaxima bei seiner Nennwellenlänge. Durch Ausblenden des Lichts in der nullten Beugungsordnung mit Hilfe der mechanischen Blende 50 werden äquidistant positionierte Beleuchtungsspots 61, .., 64 auf der Probe 20 erzielt, die außerdem, unabhängig von den im Anregungslicht 14 enthaltenen Wellenlängen 15, 16, jeweils dieselbe Intensität und dieselbe Position aufweisen.
Von der Probe 20 abgestrahltes Licht 32, bei dem es sich insbesondere um Fluoreszenzlicht von Farbstoffmolekülen, die durch das Anregungslicht 14 angeregt wurden, handeln kann, tritt durch den halbdurchlässigen Spiegel 58 hindurch und gelangt über eine Optik 31 auf einen Detektor 34, bei dem es sich insbesondere um eine Kamera handeln kann.
Einige Eigenschaften von Dammann-Gittern werden mit Bezug auf 2 erläutert. Die in 2 dargestellten Teilabbildungen a bis c zeigen jeweils Schnitte durch das Beugungsmuster im Bereich des Fokalvolumens in der x-y-Ebene. Die Teilabbildungen bis betreffen Schnittdarstellungen des Beugungsmusters im Bereich des Fokalvolumens in der x-z-Ebene. Die in 2 gezeigten Beugungsmuster stammen von einem Dammann-Gitter, welches für die Generierung von sechs Nebenmaxima ausgelegt ist. Bei den 2b und 2e wurde das Dammann-Gitter mit der Nominalwellenlänge beleuchtet. Das kann man daran erkennen, dass dort zwischen den beiden mittleren Beugungsspots 63, 64 kein weiterer zusätzlicher Beugungsfleck, der die Beugung nullter Ordnung darstellen würde, vorhanden ist. Die optische Achse verläuft parallel zur z-Richtung. Das bedeutet, dass die bis 2c Schnitte durch das Beugungsmuster in einer Ebene quer zur optischen Achse zeigen und entsprechend die 2d bis 2f Längsschnitte durch die Beugungsmuster darstellen.
Die Übergangspunkte für das verwendete Dammann-Gitter, das heißt die Punkte, an welchen die Phasenverschiebung für die Nominalwellenlänge von 0 auf π springt, sind (in Einheiten der Gitterperiode) 0,011444, 0,20897, 0,5, 0,61444, 0,50897,1. Die und 2d gehören zu einer Modulationstiefe von 0 bis 0,6 π. Die 2c und 2f gehören zu einer Modulationstiefe von 0 bis 1,4 π. In den bis 2c sind die Beugungsflecken jeweils durch Kreise dargestellt, wobei die Intensitäten der jeweiligen Beugungsspots umso größer ist, je größer der Durchmesser des Kreises ist. In 2b, die zu einer Modulationstiefe von 0 bis π, mit anderen Worten also zur Nominalwellenlänge gehört, sind sechs äquidistante Beugungsspots 61 bis 68 mit einer vergleichsweise großen Intensität erkennbar. Wenn nun im Vergleich zu dieser Situation die Wellenlänge erhöht oder erniedrigt, mit anderen Worten die Modulationstiefe verändert wird, tritt jeweils zwischen die beiden mittleren Beugungsspots 63, 64 ein neuer Beugungsspot, nämlich der zur nullten Beugungsordnung gehörende Beugungsfleck 57, 97, hinzu und die anderen Beugungsflecken verlieren Intensität, bleiben aber unverändert an ihrem Ort und sind nach wie vor alle gleich hell. In 2a sind also an den Positionen der entsprechenden Beugungsspots in 2b ebenfalls Beugungsspots 51 bis 56 vorhanden, allerdings mit im Vergleich zur 2b geringerer Intensität. Außerdem findet sich in 2a zwischen den Beugungsspots 53 und 54 mit vergleichsweise hoher Intensität ein Beugungsspot nullter Ordnung 57. Ganz entsprechend sieht das Bild aus: An denselben Stellen wie in 2b finden sich Beugungsspots 91 bis 96 mit im Vergleich zu 2b abgeschwächter Intensität. Zwischen den Beugungsspots 93 und 94 sieht man, wie in 2a, mit vergleichsweise großer Intensität einen Beugungsspot 97 nullter Ordnung.
Mit dem Unterschied, dass die Schnitte durch das Fokalvolumen bei den in den 2d bis 2f gezeigten Ansichten in der optischen Achse z keine Kreisform aufweisen, zeigen die 3d bis 3f im Wesentlichen dasselbe wie die 2a und 2c. Insbesondere ist dort erkennbar, dass sich auch die z-Positionen der Fokalvolumina nicht mit der Wellenlänge ändern. Es ändert sich allein die Intensität der Beugungsflecke und, weil im gezeigten Beispiel das Dammann-Gitter für sechs Beugungsmaxima ausgelegt ist, tritt in den Situationen, nämlich in 3d und 3f, wo die Wellenlänge des Lichts, mit welchem das Dammann-Gitter beaufschlagt wird, nicht mit der Nominalwellenlänge des Dammann-Gitters übereinstimmt, die nullte Beugungsordnung 57, 97 hinzu.
Wählt man als Phasenelement zur Erzeugung des Dammann-Gitters einen SLM, ergeben sich durch die Möglichkeit, die Phasenfunktion frei zu programmieren und dynamisch zu ändern, weitere Vorteile. Beispielsweise kann zwischen verschiedenen Beleuchtungsmodi umgeschaltet werden, beispielsweise zwischen einer Multispot-Beleuchtung und einer herkömmlichen Beleuchtung mit nur einem Spot. Außerdem kann die Anzahl der Spots, ihre Position und ihr Abstand prinzipiell beliebig eingestellt werden. Zusätzlich kann über eine Rückkopplungsschleife auf optische Fehler eines Deckglases oder der Probe reagiert werden und auch die Beleuchtung kann entsprechend angepasst werden. Dies entspricht im Prinzip einer adaptiven Optik im Beleuchtungsstrahlengang.
3 ist eine Teilansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung, welche in schematischer Form einen Teil des Beleuchtungsstrahlengangs 10 zeigt. Mit Hilfe eines Dammann-Gitters 40, welches das Anregungslicht transmittiert, werden dort auf oder in einer Probe in einer Probenebene 21 insgesamt vier Beleuchtungsspots 61, 62, 63, 64 generiert. Das Dammann-Gitter 40 ist zu einer Pupillenebene 22 optisch konjugierten Ebene 24 angeordnet. Die Pupillenebene 22 ist eine rückwärtige Brennebene des Mikroskopobjektivs 19, welches eine Brennweite f3 aufweist. Die Ebene 24 entspricht außerdem einer rückwärtigen Brennebene einer Linse 17 mit einer Brennweite f1. Die in Beleuchtungsrichtung stromabwärts gelegene zweite Brennebene der Linse 17 fällt zusammen mit einer Zwischenbildebene 23, in welcher naturgemäß ebenfalls die Beleuchtungsspots 61 bis 64 produziert werden. Außerdem befindet sich in der Zwischenbildebene 23 eine mechanische Blende 50, welche zum Ausblenden von Licht in einer nullten Beugungsordnung dient. Durch diese erfindungsgemäße Maßnahme wird erreicht, dass mit Hilfe des Dammann-Gitters 40 eine Multispot-Anordnung erzielt wird, bei der die einzelnen Beleuchtungsspots 61 bis 64 auf einer Probe in der Probenebene 21 in ihrer Form, in ihren Abständen voneinander und ihrer Intensität von der Wellenlänge weitgehend unabhängig sind. Die Zwischenbildebene 23 fällt außerdem zusammen mit einer hinteren Brennebene einer weiteren Linse 18 mit einer Brennweite f2, welche das aus der Zwischenbildebene 23 kommende Licht 23 kollimiert. In einem Abstand von der Linse 18, welcher der Summe der beiden Brennweiten f2 und f3 entspricht, befindet sich das Mikroskopobjektiv 19, welches das Anregungslicht 14 auf die in 3 nicht dargestellte Probe abbildet.
4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, bei dem im Vergleich zu der in 3 gezeigten Variante in der rückwärtigen Brennebene 22 des Mikroskopobjektivs 19 ein zweites Phasenelement 41, welches bevorzugt ebenfalls als Dammann-Gitter ausgebildet sein kann, positioniert ist. Dieses zweite Phasenelement 41 dient dazu, eine Wellenlängenabhängigkeit des ersten Phasenelements 40 auszugleichen. Dies entspricht einer achromatischen Korrektur. Auf diese Weise kann beispielsweise ein Helligkeitsverlust der Nebenbeugungsmaxima ausgeglichen werden. Eine optische Achse der Anordnung in 4 ist mit dem Bezugszeichen 25 versehen.
Prinzipiell könnte das zweite Phasenelement statt in der rückwärtigen Brennebene 22 des Mikroskopobjektivs 19 auch zwischen dem Phasenelement 40 und der Linse 17, also außerhalb einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs 10, positioniert werden. Für diese Situation wäre es zweckmäßig, wenn das zweite Phasenelement 41 außerdem eine Defokussierungsfunktion aufweist, um die Verzerrungen auszugleichen, die durch die Positionierung außerhalb einer Pupille des Strahlengangs entstehen.
Solch eine Anordnung entspräche, was die Abfolge der optischen Komponenten betrifft, im Wesentlichen der in 5 gezeigten Situation. Dort trifft das einkommende Beleuchtungslicht 14 mit den Strahlungsbestandteilen des Lichts 15 einer ersten und des Lichts 16 einer zweiten Wellenlänge zunächst auf einen ersten Teilbereich 42 eines Phasenelements 40. Der Teilbereich 42 ist als Dammann-Gitter ausgebildet und dient der Generierung einer Mehrzahl von Beleuchtungsspots. In der in 5 gezeigten Situation handelt es sich um drei Beleuchtungsspots 61, 62, 63. Außerdem handelt es sich bei der in 5 gezeigten Variante um ein Phasenelement 40, an welchem das einkommende Anregungslicht 14 reflektiert wird. Nach der Reflexion an dem ersten Teilbereich 42 des Phasenelements 40 gelangt das in seiner Phase strukturierte Anregungslicht 14 auf einen Spiegel 70, wird an diesem reflektiert und zurück in Richtung des Phasenelements 40 und dort auf einen zweiten Teilbereich 43 gestrahlt. Dieser zweite Teilbereich 43 des Phasenelements 40 dient zum Kompensieren von Wellenlängenabhängigkeiten der durch den ersten Teilbereich 42 dem Anregungslicht aufgeprägten Phasenstrukturierungen. Vorteilhafterweise weist der zweite Teilbereich 43 auch eine Defokussierungsfunktion auf, um damit die Positionierung außerhalb einer Pupille des Strahlengangs 10 auszugleichen. Das vom zweiten Teilbereich 43 des Phasenelements 40 reflektierte Licht wird von dem Mikroskopobjektiv 19 mit einer Brennweite von f1 auf eine in 5 nicht dargestellte Probe in einer Probenebene 21 gestrahlt. Mit Hilfe der erfindungsgemäß vorhandenen Scaneinrichtung (1, Bezugszeichen 80) können die Beleuchtungsspots 61 bis 63 über die Probe gerastert werden.
Eine dritte Möglichkeit, eine Vorrichtung zur Multispot-Scanning-Mikroskopie bereitzustellen, bei welcher die Position, die Form und die Intensität der Beugungs- oder Beleuchtungsspots auf einer Probe im Wesentlichen von der Wellenlänge des verwendeten Anregungslichts nicht abhängen, besteht darin, für jede der verwendeten Wellenlängen ein separates Phasenelement, insbesondere ein separates Dammann-Gitter zu verwenden.
In den 6 bis 10 sind Varianten gezeigt, bei denen diese Grundidee umgesetzt wurde, jeweils mit der Maßgabe, dass jedes einzelne Phasenelement im Frequenzraum des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet ist. Dies ist zum Teil nur möglich, wenn der Frequenzraum vergleichsweise lang ist. Jedes einzelne Phasenelement muss im Frequenzraum positioniert sein. Beispielsweise können die Bereiche des kollimierten Strahlengangs, in welchen die Phasenelemente positioniert werden können, dadurch vergrößert werden, dass Linsen mit langer Brennweite und demgemäß großer Schärfentiefe, verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit schließlich besteht darin, dass vor und nach jedem Phasenelement eine Linse vorhanden ist, um sicherzustellen, dass jedes Phasenelement exakt in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs steht. Ergänzend oder alternativ können die Phasenelemente zusätzlich eine Defokussierungsfunktionalität aufweisen.
Bei der in 6 gezeigten Anordnung enthält das Anregungslicht drei Wellenlängenkomponenten, also Licht 15 einer ersten, Licht 16 einer zweiten und Licht 12 einer dritten Wellenlänge. Mit Hilfe von dichroitischen Spiegeln 71, 72, 73 werden diese Anteile des Beleuchtungslichts in einen gemeinsamen Strahlengang eingekoppelt und auf das Mikroskopobjektiv 19 geleitet, welches eine Brennweite f1 aufweist und das Anregungslicht in eine Probenebene 21 fokussiert. Das Licht 15 gelangt über einen dichroitischen Spiegel 71 auf das Mikroskopobjektiv 19. Das Licht 16 wird über den dichroitischen Spiegel 72 in den Strahlengang eingekoppelt und gelangt zum Mikroskopobjektiv 19. Das Licht 12 schließlich wird von dem dichroitischen Spiegel 73, bei dem es sich prinzipiell auch um einen normalen Spiegel handeln kann, in Richtung des Mikroskopobjektivs 19 geleitet. Damit die Beleuchtungsspots 61, 62, 63 möglichst unabhängig von der verwendeten Wellenlänge des Anregungslichts dieselben Positionen, dieselbe Form und dieselbe Intensität aufweisen, sind für jeden Teilstrahlengang bei der Anordnung in 6 jeweils separate Phasenelemente 44, 45, 46 vorhanden. Hierbei kann es sich bevorzugt jeweils um Dammann-Gitter handeln. Eine Besonderheit besteht bei dem in 6 gezeigten Aufbau darin, dass die Phasenelemente 44, 45, 46 relativ zum Mikroskopobjektiv 19 nicht in demselben optischen Abstand angeordnet sind. Dies ist möglich, weil die Phasenelemente 44, 45, 46 jedenfalls im Bereich der Schärfentiefe um die rückwärtige Brennebene des Mikroskopobjektivs 19 positioniert sind. Die durch diese Fehlpositionierung generierten Ungenauigkeiten können toleriert werden.
Eine Verbesserung stellt gleichwohl der in 7 gezeigte Aufbau dar, der im Hinblick auf die Anordnung des Mikroskopobjektivs 19 und der Spiegel 71, 72, 73 dem Aufbau aus 6 entspricht. Die Phasenelemente 44, 45, 46 sind in 7 aber alle in demselben optischen Abstand, nämlich der Brennweite f1 des Mikroskopobjektivs 19, von eben diesem Mikroskopobjektiv 19 entfernt.
Dem entspricht auch weitgehend der Aufbau aus 8, wobei dort aber das Licht 12 der dritten Wellenlänge nicht über einen eigenen Spiegel in den Strahlengang eingekoppelt wird, sondern direkt über den dichroitischen Spiegel 72, mit welchem das Licht 16 der zweiten Wellenlänge eingekoppelt wird, in den Strahlengang gelangt. Auch in 8 sind die Phasenelemente 44, 45, 46 jeweils im Abstand der Brennweite f1 zum Mikroskopobjektiv 19 angeordnet.
Weitere Varianten, bei denen für die verwendeten Wellenlängen jeweils separate Phasenelemente vorhanden sind, sind in den 9 und 10 gezeigt. Grundidee ist dabei, ein Phasenelement 40 zu unterteilen in einen ersten Teilbereich 48 und einen zweiten Teilbereich 49. Mit Hilfe von geeigneten optischen Mitteln werden dann die spektralen Anteile des Anregungslichts aufgeteilt und dem ersten Teilbereich 48 beziehungsweise dem zweiten Teilbereich 49 des Phasenelements 40 zugeführt. Im Anschluss werden die spektralen Anteile des Anregungslichts mit dielektrischen Spiegeln wieder auf einen gemeinsamen Strahlengang gebracht und dem Mikroskopobjektiv 19 zugeführt. Bei den in 9 und 10 gezeigten Varianten enthält das Anregungslicht 14 Licht 15 einer ersten Wellenlänge und Licht 16 einer zweiten Wellenlänge. Das Anregungslicht wird zunächst mit einem dielektrischen Spiegel 77 spektral aufgeteilt, wobei das Licht 15 der ersten Wellenlänge von diesem dielektrischen Spiegel 77 reflektiert und das Licht 16 der zweiten Wellenlänge von diesem dielektrischen Spiegel 77 durchgelassen wird. Das Licht 15 der ersten Wellenlänge wird durch den Spiegel 77 auf einen ersten Teilbereich 48 eines Phasenelements 40 geleitet, welches als Dammann-Gitter ausgebildet ist. Dem Licht 15 wird dort eine Phasenstrukturierung in der Weise aufgeprägt, dass das Mikroskopobjektiv 19, wie in 9 gezeigt, das Licht 15 mit der ersten Wellenlänge in drei Beleuchtungsspots 61, 62, 63 in einer Probenebene 21 fokussiert. Der erste Teilbereich 48 befindet sich in einer hinteren Brennebene oder, mit anderen Worten, der Objektivpupille, des Mikroskopobjektivs 19. Entsprechend wird das Licht 16 mit der zweiten Wellenlänge von dem Spiegel 76 auf den zweiten Teilbereich 49 des Phasenelements 40 geleitet, welcher ebenfalls als Dammann-Gitter ausgebildet und ebenfalls in der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs 19 positioniert ist. Mit Hilfe dielektrischen Spiegels 74, der das Licht 15 mit der ersten Wellenlänge, welches vom Spiegel 75 reflektiert wurde, hindurchlässt und das Licht 16 der zweiten Wellenlänge in den gemeinsamen Strahlengang einspiegelt, gelangt das Licht 16 der zweiten Wellenlänge auf das Mikroskopobjektiv 19 und wird von diesem ebenfalls in Form von drei Beleuchtungsspots 61, 62, 63 in die Probenebene 21 fokussiert. Der besondere erfindungsgemäße Vorteil besteht, wie bei den bisher erläuterten Ausführungsbeispielen darin, dass die Beleuchtungssports 61, 62, 63 in ihrer Position, Intensität und Form weitgehend unabhängig von den verwendeten Wellenlängen sind.
Der Aufbau in 10 entspricht im Grundsatz demjenigen der 9, wobei allerdings der Strahlverlauf nach Reflexion am ersten Teilbereich 48 und zweiten Teilbereich 49 dahingehend abgewandelt ist, dass wegen des größeren Abstands der Spiegel 76 und 77 und der deshalb veränderten Winkel die Reihenfolge der Spiegel 74, 75 im optischen Strahlengang vertauscht ist. Das bedeutet, dass das Licht 16 der zweiten Wellenlänge von dem Spiegel 74 in Richtung des Mikroskopobjektivs 19 gespiegelt wird. Das Licht 15 der ersten Wellenlänge wird von dem dichroitischen Spiegel 75 in den gemeinsamen Strahlengang eingekoppelt, wobei das Licht 16 von diesem dichroitischen Spiegel 75 transmittiert wird. Im Prinzip kann also bei dem Aufbau in 10 der Spiegel 74 ein normaler Spiegel sein. Bei der Situation in 9 kann dagegen der Spiegel 75 ein gewöhnlicher Spiegel sein.
Wenn zur achromatischen Korrektur der Wellenlängenabhängigkeit eines ersten Phasenelements ein zweites Phasenelement, insbesondere ein Dammann-Gitter verwendet wird, kann ein Helligkeitsverlust der Nebenbeugungsmaxima ausgeglichen werden.
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie bereitgestellt, mit welcher eine sehr weitgehende Unabhängigkeit der Multispot-Muster hinsichtlich Abstand, Intensität und Form der Spots von den verwendeten Wellenlängen erzielt wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Applied Optics, Volume 34, Nr. 26, Seiten 5961 bis 5969 [0012]

Claims

Vorrichtung zur Multispot-Scan-Mikroskopie mit einem Beleuchtungsstrahlengang (10) zum Leiten von Anregungslicht (14) auf eine Probe (20), wobei das Anregungslicht (14) Licht (15, 16) von mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen enthält, mit einer in dem Beleuchtungsstrahlengang (10) angeordneten Scan-Einrichtung (80) zum Rastern des Anregungslichts (14) über die Probe (20), und mit einem Detektionsstrahlengang (30) zum Aufnehmen von von der Probe (20) abgestrahltem Detektionslicht (32), insbesondere Fluoreszenzlicht, und zum Weiterleiten des Detektionslichts (32) zu einer Detektionseinrichtung, insbesondere einer Kamera (34), dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs (10), in dem das Anregungslicht (14) kollimiert ist, mindestens ein als Dammann-Gitter ausgebildetes Phasenelement (40) zum diffraktiven Auftrennen des Anregungslichts (14) in eine Mehrzahl von Anregungslichtbündeln (61, 62, 63, 64) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (10) optische Mittel (50) vorhanden sind zum Ausblenden von Anregungslicht (14) in einer nullten Beugungsordnung.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Phasenelement (40) in einer Pupillenebene (24) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) oder einer dazu optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als optische Mittel (50) zum Ausblenden mindestens eine mechanische Blende vorhanden ist, die insbesondere in einer Zwischenbildebene (23) des Beleuchtungsstrahlengangs (10) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Phasenelement (40) oder die Phasenelemente wenigstens teilweise eine strukturierte Glasplatte, eine Glasplatte mit optischen Schichten, ein Flüssigkristall, ein Spatial Light Modulator (SLM), ein diffraktives optisches Element, ein photonischer Kristall und/oder ein adaptiver Spiegel ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Phasenelement (40) für eine Nominalwellenlänge eine geradzahlige Anzahl von Beleuchtungsspots (61, 62, 63, 64) erzeugt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Modulationstiefe des Phasenelements (40) für alle der zum Einsatz kommenden optischen Wellenlängen verschieden ist von 0 bis π.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites Phasenelement (41) vorhanden ist zum Ausgleichen von durch das erste Phasenelement (40) erzeugten Farbfehlern.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Phasenelement (41) ein Dammann-Gitter ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Phasenelement (41) in einem kollimierten Bereich des Beleuchtungsstrahlengangs (10), insbesondere in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs (10) oder einer dazu optisch konjugierten Ebene, angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Phasenelement (40) dergestalt im Beleuchtungsstrahlengang (10) positioniert ist, dass ein erster Teilbereich (42) des Phasenelements (40) mit einem gesamten Strahlquerschnitt des Anregungslichts (14) beaufschlagbar ist, dass ein Strahlumlenkmittel (70) zum Umlenken des Anregungslichts (14) im Beleuchtungsstrahlengang (10) vorhanden ist und dass ein zweiter Teilbereich (43) des Phasenelements (40) mit dem von dem Strahlumlenkmittel (70) umgelenkten Anregungslicht (14) mit dem gesamten Strahlquerschnitt beaufschlagbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der verwendeten Phasenelemente (40, 41) eine Defokussierungsfunktionalität aufweist zum Kompensieren von aufgrund einer Positionierung dieses Phasenelements (40, 41) außerhalb einer Pupille oder einer dazu optisch konjugierten Ebene auftretenden Verzerrungen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass für jede verwendete Wellenlänge des Anregungslichts (14) ein separates Phasenelement (44, 45, 46) vorhanden ist, wobei jedes Phasenelement bevorzugt in einem Kollimierungsbereich des Beleuchtungsstrahlengangs (10) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlgengang (10) Mittel (71, 72, 73) zum spektralen Auftrennen des Anregungslichts (14, 15, 16), insbesondere dichroitische Spiegel, vorhanden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl der Phasenelemente (44, 45, 46), insbesondere alle Phasenelemente, Dammann-Gitter sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl von Phasenelementen (44, 45, 46), insbesondere alle Phasenelemente, in einem Bereich einer Schärfentiefe einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs (10) oder einer dazu optisch konjugierten Ebene positioniert sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl der Phasenelemente (44, 45, 46), insbesondere alle Phasenelemente in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlgengangs (10) oder einer dazu optisch konjugierten Ebene angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Phasenelement (40) in eine Mehrzahl von Zonen, insbesondere zwei Zonen (48, 49), aufgeteilt ist und dass die verschiedenen Zonen (48, 49) mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen (15, 16) beaufschlagt werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Phasenelement (40) ein Spatial Light Modulator (SLM) und dass der Spatial Light Modulator zum Schalten zwischen den zum Einsatz kommenden Wellenlängen (15, 16) eingerichtet ist.