CN107006683A - 一种富硒发酵蚕蛹及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富硒发酵蚕蛹及其制作方法。本发明首先选育出高富硒假丝菌株，而后将富硒假丝酵母菌与米曲霉、枯草芽孢杆菌、发酵乳杆菌、乳酸片球菌五株菌株分别单独进行发酵，再按照相应比例进行复配，加入新鲜培养基质、保护剂后，制得富硒益生菌复合菌液；通过益生菌菌株之间的协同作用，将蚕蛹经过微生物发酵，制得具有富硒和高蛋白功效的复合蚕蛹。该复合蚕蛹不仅含有大量的有益微生物以及发酵过程产生的代谢产物，同时使得高活性蚕蛹有机硒含量大幅提高，蚕蛹的营养品质得到明显改善，无须再添加硒类添加剂，价廉质优；而且，动物食用后能促进营养物质的消化吸收，增强机体的免疫功能，对饲料工业、畜牧业生产具有重要意义。

Description

一种富硒发酵蚕蛹及其制作方法
技术领域
本发明属于蚕蛹处理技术领域，涉及一种发酵蚕蛹，尤其涉及一种富硒发酵蚕蛹及其制作方法。
背景技术
蚕蛹是缫丝业的副产品，营养丰富，其蛋白质含量高达50％-70％，氨基酸含量分别为：赖氨酸3.03％、色氨酸0.68％、蛋氨酸1.6％、胱氨酸3.31％，种类齐全，配比均衡，是一种优质、理想的动物性饲料蛋白源。
我国是养蚕大国，蚕蛹产量大，资源丰富。但是目前市场上，对缫丝蚕蛹的加工手段非常简单、粗放，大都烘干粉碎后即添加于饲料中使用，造成饲料适口性差，营养成分消化率低。
微生物发酵蚕蛹具有无污染、有效性高等优点，已成为当前研究的热点。目前微生物在蚕蛹加工应用中的应用大都集中在蚕蛹异味去除和提高蛋白质含量等方面，且经微生物处理后的蚕蛹仍然存在营养成分单一、蚕蛹品质不能得到充分的提高和改善等问题，这也大大限制了蚕蛹在在动物饲料生产中的应用。
硒(Se)是生物体必需的微量元素之一，与动物生长性能、免疫功能及机体抗氧化性能有着密切关系。同时，硒可与多种有毒元素，如汞、锅、铅等形成不溶性物质，从而拮抗、缓解降低其毒性，对动物抵御环境中的重金属污染起着重要作用。硒在自然界的存在方式分为两种：无机硒和有机硒。有机硒的生物利用率要高于无机硒，容易被动物吸收利用。同时，有机硒安全系数高，不会对人和环境造成不良影响。因此，可以利用益生菌将无机硒转化成有机硒，添加于饲料，以达到增强饲料品质、提高饲料利用率，增强动物生长性能的目的。
但是，目前在蚕蛹发酵处理技术领域中，并没有使得蚕蛹富硒的技术方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有富硒功效的复合多功能蚕蛹及其制作方法，以制得兼具益生菌和富硒双重功效的多功能蚕蛹。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、单株发酵菌液制备
1)、高富硒活性突变菌株选育：将热带假丝酵母Candida tropicalis进行氮离子注入诱变，筛选出高富硒活性突变菌株；
2)种子培养液制备：将高富硒活性突变菌株接种在斜面培养基中进行培养，得到斜面菌株；将上述斜面菌株接种于种子培养基中进行振荡培养，得到种子培养液；
3)发酵培养：将上述种子培养液接种至含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，在发酵产物中补加亚硒酸钠，继续发酵培养，收集发酵产物，得到高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17发酵菌液；
4)米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcusacidilacticiahas16单株菌发酵：将米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16分别单独进行发酵，获得米曲霉Aspergillusoryzaeahas14发酵菌液、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3发酵菌液、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7发酵菌液、乳酸片球菌Pediococcusacidilacticiahas16发酵菌液；
(2)益生菌复合菌液制备
将高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17发酵菌液、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14发酵菌液、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3发酵菌液、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7发酵菌液、乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16发酵菌液按照(3-5):(2-4):(2-4):(1-3):(1-3)的体积比混合，制得益生菌复合菌液；
(3)新鲜培养基质添加
按质量浓度为2％-3％向所述益生菌复合菌液中加入新鲜培养基质；
(4)保护剂添加
按质量浓度为2.5-3‰向所述步骤(3)中得到的液体中加入山梨酸钾，并搅拌均匀，以获得制剂；
(5)蚕蛹处理
将新鲜蚕蛹置于通风干燥箱中，在温度为85℃的情况下烘干至含水量为30％，然后采用粉碎机粉碎，粉碎粒径为2mm；
(6)高活性富硒蚕蛹制备
称取50公斤粉碎处理过的蚕蛹，然后加入菜粕10-15公斤、麸皮10-20公斤和过夜放置后的自来水30-50公斤，搅拌均匀后，按照质量比为1％-2％的比例加入所述步骤(4)中制得的制剂1.0-2.7公斤，混合搅拌均匀，在35-45℃恒温下发酵36-72小时，然后进行烘干，即可制成高活性富硒蚕蛹。
进一步地，其中，所述步骤(1)的1)中的高富硒活性突变菌株选育具体为：热带假丝酵母Candida tropicalis采用YEPD液体培养基在培养平板上培养32-48h，挑取单菌落至含100ml YEPD液体培养基的250ml三角瓶中，以180-200rpm的转速震荡培养32h，之后菌液离心洗涤3-4次，制成单细胞悬液，使细胞浓度在108-109个/ml；然后，取0.1ml单细胞悬液均匀涂布到无菌培养皿中，置于超净工作台风干制成菌膜；接着，在N+注入机中进行离子注入，能量为16KeV，每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板，N+注入剂量分别为1.5×1014、2.5×1014、4.0×1014、5.5×1014、7.0×1014、1.0×1015ion/cm2，并做真空对照平板；诱变完成后，加入1ml无菌水洗涤菌体，制成菌悬液；然后，菌悬液稀释105-9倍，涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，采用3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐法测定酵母菌株硒的含量，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，也就是高富硒活性突变菌株，命名为Candida tropicalis ahas17，其中，所述高浓度亚硒酸钠的浓度为220mg/L。
更进一步地，其中，所述步骤(1)的2)中，所述种子培养液制备具体为：将上述高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17接种在斜面培养基上，在温度为28℃的情况下培养32-48h，得到斜面菌株，其中，所述斜面培养基的成分组成为：葡萄糖15-20g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母膏5-10g/L、亚硒酸钠20-30mg/L、琼脂12-18g/L；然后，将上述斜面菌株接种于80ml的种子培养基中，在温度为28℃的情况下以200r/min的转速振荡培养32-48h，得到种子培养液，其中，所述种子培养基的成分组成为：麦芽抽提物10-20g/L、蛋白胨10-15g/L、酵母膏5-10g/L、亚硒酸钠30-60mg/L。
再进一步地，其中，所述步骤(1)的3)中，所述发酵培养为：将所述种子培养液按体积百分含量为8-12％的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中，其中，所述发酵罐的装液量为40-50％，在温度为28℃、溶氧控制在50-70％、pH值维持在5.5-6.0的情况下发酵16-20h至对数生长期，并在发酵产物中补加终浓度为60-80mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20-24h，收集发酵产物，得到高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17发酵菌液；其中，所述发酵培养基的成分组成为：可发酵还原糖300-400g/L、硫酸铜0.035-0.05g/L、硫酸锰0.03-0.04g/L、硫酸亚铁0.35-0.45g/L、硫酸镁5.5-7.0g/L、硫酸锌2.5g-3.5g/L、氯化钙3.5g-5.5g/L、硫酸铵5-7g/L、氯化钠8.5g-11g/L、谷氨酸7-11g/L、L-半胱氨酸为11-1g/L，其余用蒸馏水补足。
再更进一步地，其中，所述步骤(1)的4)中，将米曲霉Aspergillus oryzaeahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentumahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16分别单独进行发酵，获得发酵菌液，具体如下：
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14采用PDA培养基培养36-72h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，PDA培养基的成份组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克、纯水1000ml；
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3采用LB培养基培养24-36h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，LB培养基的成份组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、纯水1000ml；
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7和乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16采用MRS培养基培养24-36h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，MRS培养基的成份组成为蛋白陈10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0Ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、纯水1000ml。
此外，其中，所述步骤(2)中，所述益生菌复合菌液中有效活菌数为9×109-1.9×1010cfu/ml。
进一步地，其中，所述步骤(3)中的新鲜培养基质为甘蔗糖蜜，其含糖分在50％以上，锤度在85％以上。
更进一步地，其中，所述步骤(4)中的山梨酸钾的纯度为98％以上，且搅拌时的转速150rpm，时间为30-60min。
最后，本发明还提供一种富硒发酵蚕蛹，其特征在于，其采用上述制作方法制作而成。
进一步地，其中，所述富硒发酵蚕蛹的粗蛋白含量不低于55％，粗脂肪含量不高于12％，灰分含量不高于7％，有机硒华灵不低于7.5mg/kg。
本发明采用选育的高富硒热带假丝酵母Candida tropicalis ahas17，将亚硒酸钠转化成安全无毒，生物有效性高的有机硒。随后，通过将富硒酵母与米曲霉、枯草芽孢杆菌、发酵乳杆菌、乳酸片球菌进行复配，将复配后的混合菌液发酵蚕蛹，通过益生菌菌株之间的协同作用，将蚕蛹经过微生物发酵，制得兼具益生菌和富硒双重功效的多功能蚕蛹。该活性蚕蛹不仅富含有机硒，还含有大量的有益微生物以及益生菌发酵过程产生的代谢产物。同时依靠益生菌对蚕蛹中有机质的分解转化作用，使得高活性蚕蛹具有富硒成分，营养更加丰富，蚕蛹的品质得到明显提高，动物食用后还能促进营养物质的消化吸收，增强机体的免疫功能。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
【实施例1】
在本实施例中，益生菌符合菌液的菌株构成为：
富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17 3.0×109cfu/ml
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14 2.0×109cfu/ml
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3 2.0×109cfu/ml
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7 1.0×109cfu/ml
乳酸片球菌Pediococcu sacidilactici ahas16 1.0×109cfu/ml。
在本还是理中，具体制作方法如下：
(1)单株菌发酵
将酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株分别单独进行发酵，获得单株发酵菌液。具体如下：
1)富硒酵母菌液制备：
将热带假丝酵母Candida tropicalis接种在斜面培养基中，在28℃下培养32h，得到斜面菌株。其中，斜面培养基成分组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，亚硒酸钠20mg/L，琼脂12g/L。
将上述斜面菌株接种于80ml的种子培养基中，在28℃、200r/min下振荡培养32h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，亚硒酸钠30mg/L。
发酵培养：发酵培养基成分为可发酵还原糖300g/L，硫酸铜0.035g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.35g/L，硫酸镁5.5g/L，硫酸锌2.5gg/L，氯化钙3.5g/L，硫酸铵5g/L，氯化钠8.5g/L，谷氨酸7g/L，L-半胱氨酸为11g/L，其余部分用蒸馏水补足。
将种子培养液按8％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为40％)，在28℃、溶氧控制在50％、pH维持在5.5-6.0下，发酵16h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为60mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20h，收集发酵产物，即获得富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17发酵菌液。
2)其余益生菌菌株菌液制备
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14采用PDA培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，纯水1000ml)培养36h。其中，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养24-36h。其中，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7和乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16采用MRS培养基(蛋白陈10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养24h。其中，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
(2)益生菌复合菌液制备
上述各单菌株发酵结束后，将富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株新鲜发酵液按照3:2:2:1:1的体积比混合，制得益生菌复合菌液。其中，复合菌液中有效活菌数为9.0×109cfu/ml。
(3)新鲜培养基添加
按质量浓度2％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
(4)保护剂添加
按质量浓度2.5‰向3)中得到的液体中加入山梨酸钾(纯度98％以上)，搅拌均匀(150rpm，30min)。
(5)蚕蛹的处理
将新鲜蚕蛹置于通风干燥箱中，85℃烘干至含水量30％左右。然后采用粉碎机粉碎，粉碎粒径约为2mm。
(6)高活性富硒蚕蛹的制备
称取50公斤的蚕蛹，然后加入10公斤菜粕，麸皮10公斤，过夜放置自来水30公斤，和料。搅拌均匀后，按照1％比例加入(4)中制得的益生菌复合菌液1.0公斤，混合搅拌均匀，在35℃恒温下发酵36小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒蚕蛹。
对实施例1制备的高活性富硒发酵蚕蛹的含量进行检测：发酵蚕蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分测定分别采用半微量凯氏定氮法、索氏抽提法和马弗炉灼烧法。采用常规检测方法测定制备的蚕蛹中硒含量。检测结果表明，蚕蛹中粗蛋白含量为55.8％，粗脂肪含量为11.3％，灰分含量为6.2％，有机硒含量为7.5mg/kg。
【实施例2】
在该实施例中，复合益生菌菌液的菌株构成：
富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17 4.0×109cfu/ml
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14 3.0×109cfu/ml
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3 3.0×109cfu/ml
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7 2.0×109cfu/ml
乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16 2.0×109cfu/ml
在本实施例中，具体制作方法为：
(1)单株菌发酵
将酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株分别单独进行发酵，获得发酵菌液。具体如下：
1)富硒酵母菌液制备：
将热带假丝酵母Candida tropicalis接种在斜面培养基中，在28℃下培养36h，得到斜面菌株。其中，斜面培养基成分组成为：葡萄糖18g/L，蛋白胨18g/L，酵母膏8g/L，亚硒酸钠25mg/L，琼脂15g/L。
将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，在28℃、200r/min下振荡培养36h，得到种子培养液。其中，种子培养基成分组成为：麦芽抽提物15g/L，蛋白胨13g/L，酵母膏7g/L，亚硒酸钠50mg/L。
发酵培养：发酵培养基成分组成为可发酵还原糖350g/L，硫酸铜0.045g/L，硫酸锰0.035g/L，硫酸亚铁0.40g/L，硫酸镁6.5g/L，硫酸锌2.8g/L，氯化钙4.5g/L，硫酸铵5.5g/L，氯化钠9.5g/L，谷氨酸9.0g/L，L-半胱氨酸为12g/L，其余部分用蒸馏水补足。
将种子培养液按10％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为45％)，在28℃，溶氧控制在60-70％，pH维持在5.5-6.0下发酵18h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为70mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养22h，收集发酵产物，获得富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17菌液。
2)其余益生菌菌株制备
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14采用PDA培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，纯水1000ml)培养48h。其中，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养48h。其中，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7和乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16采用MRS培养基(蛋白陈10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养48h。其中，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
(2)益生菌复合菌液制备
上述各单菌株发酵结束后，将富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株新鲜发酵液按照4:3:3:2:2的体积比混合，制得益生菌复合菌液。其中，复合菌液中有效活菌数为1.4×1010cfu/ml。
(3)新鲜培养基添加
按质量浓度2.5％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
(4)保护剂添加
按质量浓度2.8‰向3)中得到的液体中加入山梨酸钾(纯度98％以上)，搅拌均匀(150rpm，40min)。
(5)蚕蛹的处理
将新鲜蚕蛹置于通风干燥箱中，85℃烘干至含水量30％左右。然后采用粉碎机粉碎，粉碎粒径约为2mm。
(6)高活性富硒蚕蛹的制备
称取50公斤的蚕蛹，然后加入13公斤菜粕，麸皮15公斤，过夜放置自来水37公斤，和料。搅拌均匀后，按照1.2％比例加入(4)中制得的益生菌复合菌液1.38公斤，混合搅拌均匀，在35℃恒温下发酵36小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒蚕蛹。
对实施例2制备的高活性富硒采用进行含量检测：发酵蚕蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分测定分别采用半微量凯氏定氮法、索氏抽提法和马弗炉灼烧法。采用常规检测方法测定制备的蚕蛹中硒含量。检测结果表明，蚕蛹中粗蛋白含量为58.5％，粗脂肪含量为10.3％，灰分含量为6.1％，有机硒含量为8.8mg/kg。
【实施例3】
在该实施例中，复合益生菌菌液的菌株构成为：
富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17 5.0×109cfu/ml
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14 4.0×109cfu/ml
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3 4.0×109cfu/ml
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7 3.0×109cfu/ml
乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16 3.0×109cfu/ml。
在本实施例中，具体制作方法如下：
(1)单株菌发酵
将酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株分别单独进行发酵，获得发酵菌液。具体如下：
1)富硒酵母菌液制备：
将热带假丝酵母Candida tropicalis接种在斜面培养基中，在28℃下培养48h，得到斜面菌株。其中，斜面培养基成分组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，亚硒酸钠30mg/L，琼脂18g/L。
将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，在28℃、200r/min下振荡培养48h，得到种子培养液。其中，种子培养基成分组成为：麦芽抽提物20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏10g/L，亚硒酸钠60mg/L。
发酵培养：发酵培养基成分组成为可发酵还原糖400g/L，硫酸铜0.05g/L，硫酸锰0.04g/L，硫酸亚铁0.45g/L，硫酸镁7.0g/L，硫酸锌3.5g/L，氯化钙5.5g/L，硫酸铵7g/L，氯化钠11g/L，谷氨酸11g/L，L-半胱氨酸为13g/L，其余部分用蒸馏水补足。
将种子培养液按12％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为50％)，在28℃、溶氧控制在60-70％、pH维持在5.5-6.0下发酵20h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为80mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养24h，收集发酵产物，获得酵母菌Candida tropicalis ahas17菌液。
2)其余益生菌菌株制备
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14采用PDA培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，纯水1000ml)培养72h。其中，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养72h。其中，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7和乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16采用MRS培养基(蛋白陈10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养72h。其中，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
(2)益生菌复合菌液制备：
上述各单菌株发酵结束后，将富硒酵母菌Candida tropicalis ahas17、米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16五株菌株新鲜发酵液按照5:4:4:3:3的体积比混合，制得益生菌复合菌液。其中，复合菌液中有效活菌数为1.9×1010cfu/ml。
(3)新鲜培养基添加
按质量浓度3％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
(4)保护剂添加
按质量浓度3‰向3)中得到的液体中加入山梨酸钾(纯度98％以上)，搅拌均匀(200rpm，60min)。
(5)蚕蛹的处理
将新鲜蚕蛹置于通风干燥箱中，85℃烘干至含水量30％左右。然后采用粉碎机粉碎，粉碎粒径约为2mm。
(6)高活性富硒蚕蛹的制备
称取50公斤的蚕蛹，然后加入15公斤菜粕，麸皮20公斤，过夜放置自来水50公斤，和料。搅拌均匀后，按照2％比例加入(4)中制得的益生菌复合菌液2.7公斤，混合搅拌均匀，在35℃恒温下发酵72小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒蚕蛹。
对实施例3制备的高活性富硒采用进行含量检测：发酵蚕蛹粗蛋白、粗脂肪、灰分测定分别采用半微量凯氏定氮法、索氏抽提法和马弗炉灼烧法。采用常规检测方法测定制备的蚕蛹中硒含量。检测结果表明，蚕蛹中粗蛋白含量为56.5％，粗脂肪10.5％，灰分6.8％，有机硒含量为8.1mg/kg。
本发明采用富硒酵母Candida tropicalis ahas17发酵得到的产品生物量高，且酵母细胞有机硒含量高，每kg富硒酵母水解物中，有机硒含量可达5000-5800mg，硒转化率高达95-99％。绝大部分无机硒被转化成生物有效性高、安全无毒的有机硒。采用含有该富硒酵母的益生菌菌株发酵蚕蛹，在提高蚕蛹中蛋白质等营养物质含量的同时，提高了蚕蛹中硒的含量，可以迅速被动物吸收利用，大大提升蚕蛹对硒的吸收利用率，打造高富硒的多功能蚕蛹。
此外，本发明还提供了该富硒发酵蚕蛹的制作方法，制作方法工艺简单，步骤少，取材便利，仅需简单的设备即可完成，成本低，容易推广。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、单株发酵菌液制备
1)、高富硒活性突变菌株选育：将热带假丝酵母Candida tropicalis进行氮离子注入诱变，筛选出高富硒活性突变菌株；
2)种子培养液制备：将高富硒活性突变菌株接种在斜面培养基中进行培养，得到斜面菌株；将上述斜面菌株接种于种子培养基中进行振荡培养，得到种子培养液；
3)发酵培养：将上述种子培养液接种至含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，在发酵产物中补加亚硒酸钠，继续发酵培养，收集发酵产物，得到高富硒活性突变菌株Candidatropicalis ahas17发酵菌液；
4)米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiahas16单株菌发酵：将米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16分别单独进行发酵，获得米曲霉Aspergillus oryzae ahas14发酵菌液、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3发酵菌液、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum ahas7发酵菌液、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16发酵菌液；
(2)益生菌复合菌液制备
将高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17发酵菌液、米曲霉Aspergillusoryzae ahas14发酵菌液、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3发酵菌液、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7发酵菌液、乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiahas16发酵菌液按照(3-5):(2-4):(2-4):(1-3):(1-3)的体积比混合，制得益生菌复合菌液；
(3)新鲜培养基质添加
按质量浓度为2％-3％向所述益生菌复合菌液中加入新鲜培养基质；
(4)保护剂添加
按质量浓度为2.5-3‰向所述步骤(3)中得到的液体中加入山梨酸钾，并搅拌均匀，以获得制剂；
(5)蚕蛹处理
将新鲜蚕蛹置于通风干燥箱中，在温度为85℃的情况下烘干至含水量为30％，然后采用粉碎机粉碎，粉碎粒径为2mm；
(6)高活性富硒蚕蛹制备
称取50公斤粉碎处理过的蚕蛹，然后加入菜粕10-15公斤、麸皮10-20公斤和过夜放置后的自来水30-50公斤，搅拌均匀后，按照质量比为1％-2％的比例加入所述步骤(4)中制得的制剂1.0-2.7公斤，混合搅拌均匀，在35-45℃恒温下发酵36-72小时，然后进行烘干，即可制成高活性富硒蚕蛹。
2.根据权利要求1所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)的1)中的高富硒活性突变菌株选育具体为：热带假丝酵母Candida tropicalis采用YEPD液体培养基在培养平板上培养32-48h，挑取单菌落至含100ml YEPD液体培养基的250ml三角瓶中，以180-200rpm的转速震荡培养32h，之后菌液离心洗涤3-4次，制成单细胞悬液，使细胞浓度在108-109个/ml；然后，取0.1ml单细胞悬液均匀涂布到无菌培养皿中，置于超净工作台风干制成菌膜；接着，在N+注入机中进行离子注入，能量为16KeV，每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板，N+注入剂量分别为1.5×1014、2.5×1014、4.0×1014、5.5×1014、7.0×1014、1.0×1015ion/cm2，并做真空对照平板；诱变完成后，加入1ml无菌水洗涤菌体，制成菌悬液；然后，菌悬液稀释105-9倍，涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，采用3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐法测定酵母菌株硒的含量，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，也就是高富硒活性突变菌株，命名为Candida tropicalis ahas17，其中，所述高浓度亚硒酸钠的浓度为220mg/L。
3.根据权利要求2所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)的2)中，所述种子培养液制备具体为：将上述高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17接种在斜面培养基上，在温度为28℃的情况下培养32-48h，得到斜面菌株，其中，所述斜面培养基的成分组成为：葡萄糖15-20g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母膏5-10g/L、亚硒酸钠20-30mg/L、琼脂12-18g/L；然后，将上述斜面菌株接种于80ml的种子培养基中，在温度为28℃的情况下以200r/min的转速振荡培养32-48h，得到种子培养液，其中，所述种子培养基的成分组成为：麦芽抽提物10-20g/L、蛋白胨10-15g/L、酵母膏5-10g/L、亚硒酸钠30-60mg/L。
4.根据权利要求3所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)的3)中，所述发酵培养为：将所述种子培养液按体积百分含量为8-12％的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中，其中，所述发酵罐的装液量为40-50％，在温度为28℃、溶氧控制在50-70％、pH值维持在5.5-6.0的情况下发酵16-20h至对数生长期，并在发酵产物中补加终浓度为60-80mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20-24h，收集发酵产物，得到高富硒活性突变菌株Candida tropicalis ahas17发酵菌液；其中，所述发酵培养基的成分组成为：可发酵还原糖300-400g/L、硫酸铜0.035-0.05g/L、硫酸锰0.03-0.04g/L、硫酸亚铁0.35-0.45g/L、硫酸镁5.5-7.0g/L、硫酸锌2.5g-3.5g/L、氯化钙3.5g-5.5g/L、硫酸铵5-7g/L、氯化钠8.5g-11g/L、谷氨酸7-11g/L、L-半胱氨酸为11-1g/L，其余用蒸馏水补足。
5.根据权利要求4所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)的4)中，将米曲霉Aspergillus oryzae ahas14、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ahas16分别单独进行发酵，获得发酵菌液，具体如下：
米曲霉Aspergillus oryzae ahas14采用PDA培养基培养36-72h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，PDA培养基的成份组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克、纯水1000ml；
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ahas3采用LB培养基培养24-36h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，LB培养基的成份组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、纯水1000ml；
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum ahas7和乳酸片球菌Pediococcusacidilactici ahas16采用MRS培养基培养24-36h，且接种量为2％-3％，摇床转速为180-200rpm，其中，MRS培养基的成份组成为蛋白陈10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0Ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、纯水1000ml。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述益生菌复合菌液中有效活菌数为9×109-1.9×1010cfu/ml。
7.根据权利要求6所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(3)中的新鲜培养基质为甘蔗糖蜜，其含糖分在50％以上，锤度在85％以上。
8.根据权利要求7所述的富硒发酵蚕蛹的制作方法，其特征在于，所述步骤(4)中的山梨酸钾的纯度为98％以上，且搅拌时的转速150rpm，时间为30-60min。
9.一种富硒发酵蚕蛹，其特征在于，其采用权利要求1-8中任一项所述制作方法制作而成。
10.根据权利要求9所述的富硒发酵蚕蛹，其特征在于，所述富硒发酵蚕蛹的粗蛋白含量不低于55％，粗脂肪含量不高于12％，灰分含量不高于7％，有机硒华灵不低于7.5mg/kg。
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