CN107001927B - 用于细菌成像、杀灭、光动力疗法和抗生素筛选的aie发光团及其生产方法 - Google Patents

用于细菌成像、杀灭、光动力疗法和抗生素筛选的aie发光团及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及具有聚集诱导发光(AIE)特性的荧光分子的合成，以及其作为细胞成像、杀灭和抗生素筛选的荧光探针的应用，其中细胞为细菌或哺乳动物细胞。荧光分子在光照下产生活性氧(ROS)。本申请还涉及包含显示AIE现象的荧光分子的探针可用于细菌和生物学研究。本申请进一步涉及成像和定量细菌的方法、杀灭细胞的方法、高通量抗生素筛选和测定细菌耐药性的方法、光动力疗法以及确定临界胶束浓度的方法。

Description

用于细菌成像、杀灭、光动力疗法和抗生素筛选的AIE发光团 及其生产方法
相关申请
本申请要求2014年11月21日递交的，申请号为62/123,596的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请的申请人为本专利申请的发明人，并且在此整个结合引用，以作参考。
技术领域
本申请涉及具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)特性的发光团的研发，以及这些材料在细菌，哺乳动物细胞和相关生物学研究中的应用。特别地，本申请涉及用作细菌定量、成像、杀灭、抗生素筛选和光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)的荧光探针的AIE发光团和磁体(magnetite)的制备。
背景技术
随着人类生活水平的提高，与人类健康密切相关的卫生和食品安全问题得到了科学家和公众的广泛关注。因为其抑制细菌生长的高效性和对哺乳动物细胞的低干扰性，抗生素成为病原体治疗中最广泛使用的材料。然而，抗生素耐药性的迅速出现，促使科学家开发新的抗生素，这通常是一个耗时耗钱的过程。新的灭菌方法(其中，细菌难以发展出对这些方法的抗性)和新的抗生素筛选方法的研究都已经成为解决抗生素抗药性问题的替代途径。
因此提出并应用PDT，其利用光敏剂产生用于局部病原体消除、肿瘤消除的有毒活性氧(reactive oxygen species,ROS)。目前，广泛使用的PDT材料是卟啉和吩噻嗪。作为新的光敏剂，共轭聚合物正在引发关注。然而，由于大多数材料本质上是共面或极疏水的，因此可能发生强烈的π-π或疏水相互作用，这将导致发色团聚集，细菌杀灭效率降低和荧光猝灭效应。
发明内容
本申请涉及一种螺旋桨状分子的物质(species)，其在聚集时表现出增加的发光，该现象被称为AIE。系统研究表明，分子内运动的限制是AIE效应的主要原因。AIE现象具有科学价值和实际应用。由于生物相容性，光稳定性和选择性，AIE材料已被应用于细胞和细菌成像，细胞凋亡检测，化疗和药物递送。一些AIE发色团(chromophores)能够产生光诱导的ROS生成，并且可以应用于哺乳动物细胞、细菌成像和杀灭研究以及高通量抗生素筛选。
在本申请中，设计并合成具有AIE特性的荧光分子。四苯乙烯(Tetraphenylethene,TPE)和噻咯(silole)通过不同的连接(linkage)，例如醚、酯、烷基链、酰胺或其任何组合，与三甲胺和三乙胺进行官能化，以产生具有AIE性质的荧光分子。然后将AIE活性分子应用于哺乳动物细胞和细菌成像，PDT和高通量筛选。
由于TPE-Bac的水溶性和TPE-Bac的典型的AIE特性，可以简化细菌的成像过程。例如，可以免除洗涤过程，这使TPE-Bac可用于抗生素筛选研究。除开发新的杀菌方法外，AIE材料可用于高通量抗生素筛选。当结合到标靶时，利用低背景光和高发光效率，可以以简单，快速的方式进行抗生素的筛选。
在一个实施例中，本申请涉及包括荧光分子的AIE发光团，所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中R，R′，R″，R″′，R″″和R″″′中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1，R2，和R3独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，和其盐构成的组；
R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，(OC2H4)n，C6H5，C10H7，C12H9，OC6H5，OC10H7，和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20。
本申请的另一实施例涉及包含显示AIE现象的荧光分子的探针，其中所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1，R2，和R3独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，和其盐构成的组；
R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，(OC2H4)n，C6H5，C10H7，C12H9，OC6H5，OC10H7，和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20。
本申请的另一实施例涉及一种成像和定量细菌的方法，包括将AIE发光团引入到样品；以及通过观察从聚集产生的荧光来检测细菌；其中，通过观察发光强度来定量所述细菌。
本申请的另一实施例涉及一种杀灭细胞的方法，包括将AIE发光团在正常光照的情况下引入含有细胞的样品；其中所述AIE发光团在光照下产生ROS；其中曝露在光照下杀灭细胞；以及其中所述细胞为细菌或哺乳动物细胞。
本申请的另一实施例涉及一种高通量抗生素筛选和测定细菌耐药性的方法，包括将AIE发光团引入到包含抗生素的样品；基于所述AIE发光团的发光强度评价所述抗生素；其中，所述样品中的细菌触发(turn on)所述AIE发光团的发光；其中快速的细菌生长表明抗生素无效，而抑制的细菌生长表明抗生素有效。
本申请的另一实施例涉及一种光动力疗法，包括将AIE发光团引入到包含肿瘤的样品，其中所述AIE发光团是光敏剂；以及通过PDT消除所述肿瘤，其中所述光敏剂产生光诱导的有毒活性物质。
本申请的另一实施例涉及一种确定临界胶束浓度(critical micelleconcentration,CMC)的方法，包括将权利要求1的AIE发光团引入到溶剂；以及通过评价荧光变化来确定所述CMC，其中没有发光表明浓度低于CMC，并且当浓度接近CMC时，触发发光。
附图说明
图1显示了TPE-Bac在DMSO中的UV光谱；
图2A显示了TPE-Bac在THF和具有不同THF含量(fTHF)的THF/DMSO混合物中的PL光谱；其中浓度：50μM；激发波长：405nm；
图2B显示了相对PL强度(I/I0)与TPE-Bac在THF/DMSO混合物中的含量之间的关系曲线；插图：在365nmUV照射下，拍摄的具有0％和100％的fTHF的TPE-Bac的THF/DMSO混合物的照片；
图3A显示了不同浓度的TPE-Bac水溶液的PL光谱；激发波长：405nm；
图3B显示了PL强度与溶液浓度的关系曲线；
图4显示了在水溶液中形成的TPE-Bac的聚集颗粒的粒度；浓度：0；4mM；插图为颗粒的SEM图像；
图5A显示不同时间的正常光照射后SOSG(5μM)和TPE-Bac(5μM)混合物的PL光谱；激发波长：505nm；
图5B显示了在530nm处的相对PL强度(I/I0)与照射时间之间的关系曲线；[SOSG]＝5μM；[TPE-Bac]＝5μM；激发波长：505nm；
图6A显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的亮场(bright field)；激发波长：460-490nm；
图6B显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的表皮葡萄球菌的荧光图像；激发波长：460-490nm；
图6C显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的大肠杆菌(E.coli)的亮场图像；激发波长：460-490nm；
图6D显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的大肠杆菌的荧光图像；激发波长：460-490nm；
图7A显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的表皮葡萄球菌的亮场图像；激发波长：510-550nm；
图7B显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的表皮葡萄球菌的荧光图像；激发波长：510-550nm；
图7C显示了在暗处培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的表皮葡萄球菌的亮场图像；激发波长：510-550nm；
图7D显示了在暗处培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的表皮葡萄球菌的荧光图像；激发波长：510-550nm；
图7E显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的大肠杆菌的亮场图像；激发波长：510-550nm；
图7F显示了与10μM的TPE-Bac一起培养了10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的大肠杆菌的荧光图像；激发波长：510-550nm；
图7G显示了在暗处培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的大肠杆菌的亮场图像；激发波长：510-550nm；
图7H了显示在暗处培养10分钟，随后正常曝光10分钟，然后采用1.5μM的PI染色10分钟的大肠杆菌的荧光图像；激发波长：510-550nm；
图8显示了采用平板计数法评价细菌活力；在定量之前用正常光照射细菌1小时；
图9显示了在无和有不同时间的正常光照射下，TPE-Bac对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的杀灭效率；
图10A显示了在无TPE-Bac的情况下在黑暗中培养1小时，随后进一步培养24小时的大肠杆菌板；
图10B显示了在无TPE-Bac的情况下光照培养1小时，随后进一步培养24小时的大肠杆菌板；
图10C显示了采用10μM的TPE-Bac处理10分钟，随后在黑暗中存储1小时，然后进一步培养24小时的大肠杆菌板；
图10D显示了采用10μM的TPE-Bac处理10分钟，随后正常光照1小时，然后进一步培养24小时的大肠杆菌板；
图11A显示了在无TPE-Bac的情况下在黑暗中培养1小时，随后进一步培养24小时的表皮葡萄球菌板；
图11B显示了在无TPE-Bac的情况下光照培养1小时，随后进一步培养24小时的表皮葡萄球菌板；
图11C显示了采用10μM的TPE-Bac处理10分钟，随后在黑暗中存储1小时，然后进一步培养24小时的表皮葡萄球菌板；
图11D显示了采用10μM的TPE-Bac处理10分钟，随后正常光照1小时，然后进一步培养24小时的表皮葡萄球菌板；
图12A显示了在黑暗中培养10分钟的表皮葡萄球菌的SEM图像；然后将细菌在黑暗中额外储存1小时；
图12B显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的表皮葡萄球菌的SEM图像；然后将细菌在正常光照下暴露1小时；
图12C显示了在黑暗中培养10分钟的大肠杆菌的SEM图像；然后将细菌在黑暗中额外储存1小时；
图12D显示了与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟的大肠杆菌的SEM图像；然后将细菌在正常光照下暴露1小时；
图13A显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；第一次；
图13B显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；第二次；
图13C显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；第三次；
图13D显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；第四次；
图13E显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；第五次；
图13F显示了采用表皮葡萄球菌喷洒，随后在黑暗中储存1小时，然后连续6次培养24小时的琼脂平板；对照组(Control group)；
图14A显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后正常光照1小时，接着培养24小时；第一次循环；
图14B显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后正常光照1小时，接着培养24小时；第二次循环；
图14C显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后正常光照1小时，接着培养24小时；第三次循环；
图14D显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后正常光照1小时，接着培养24小时；第四次循环；
图14E显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后正常光照1小时，接着培养24小时；第五次循环；
图14F显示了采用细菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先采用表皮葡萄球菌喷洒平板，然后在黑暗中存储1小时，接着培养24小时；
图15A显示了采用表皮葡萄球菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先正常光照培养琼脂平板1小时，然后喷洒细菌，接着培养24小时；
图15B显示了采用表皮葡萄球菌喷洒的包含10μM的TPE-Bac的琼脂平板；首先将琼脂平板在黑暗中储存1小时，然后喷洒细菌，接着培养24小时；
图16显示了抗生素筛选的策略；
图17显示了14×10-5M TPE-Bac 1水溶液的UV光谱；
图18A显示了TPE-Bac1在具有不同含水量(fw)的H2O/DMSO混合物中的PL光谱；浓度：50μM；激发波长：405nm；
图18B显示了PL强度与TPE-Bac1(50μM)的H2O/DMSO混合物之间的关系曲线图；插图：在50μM浓度时，在365nmUV照射下，拍摄的具有不同含水量的TPE-Bac1的H2O/DMSO混合物的照片；
图19A显示了不同浓度TPE-Bac1在水中的PL光谱；激发波长：405nm；
图19B显示了PL强度与TPE-Bac1浓度之间关系曲线图；插图：在手持UV光照下拍摄的不同浓度的TPE-Bac1的照片；
图20显示了Zeta电位粒度分析仪测量的0.4mM TPE-Bac1水溶液的粒度；插图：颗粒的TEM图像；
图21A显示了与10μM的TPE-Bac1一起培养10分钟的表皮葡萄球菌的亮场图像；激发波长：330-385nm；
图21B显示了与10μM的TPE-Bac1一起培养10分钟的表皮葡萄球菌的荧光图像；激发波长：330-385nm；
图21C显示了与10μM的TPE-Bac1一起培养10分钟的大肠杆菌的亮场图像；激发波长：330-385nm；
图21D显示了与10μM的TPE-Bac1一起培养10分钟的大肠杆菌的荧光图像；激发波长：330-385nm；
图22显示在有/无108CFU/mL的表皮葡萄球菌的情况下具有EtOH组分的TPE-Bac1的PL强度变化；激发波长：430nm；
图23显示了有/无108CFU/mL表皮葡萄球菌的情况下TPE-Bac1的MOPS/EtOH(v/v，8/2)混合物的PL光谱；激发波长：430nm；
图24显示了TPE-Bac1的MOPS/EtOH混合物(v/v，8/2)随着表皮葡萄球菌浓度的PL强度变化；激发波长：430nm；
图25显示了对表皮葡萄球菌的氨苄青霉(ampicillin)效力的评价；首先在不同浓度的氨苄青霉中培养表皮葡萄球菌，然后在MOPS/EtOH(v/v，8/2)混合物中采用TPE-Bac1进行定量；激发波长：430nm；
图26显示了表皮葡萄球菌对不同抗生素的有效性的评价；首先用不同浓度的不同抗生素培养表皮葡萄球菌，然后在MOPS/EtOH(v/v，8/2)混合物中采用TPE-Bac1进行定量；激发波长：430nm；
图27显示TPE-Bac2在乙醇中的UV光谱；浓度：10μM；
图28A显示了TPE-Bac2在不同己烷含量(fh)的乙醇/己烷混合物中的PL光谱；浓度：10μM；激发波长：355nm；
图28B显示了在502nm处的TPE-Bac2的相对PL强度(I/I0)与TPE-Bac2的乙醇/己烷混合物之间的关系曲线图；I0＝在纯己烷溶液(fh＝0)中的PL强度；插图：在来自手持UV灯的365nmUV照射下拍摄的在fh＝0和99vol％的TPE-Bac2的乙醇/己烷混合物的荧光照片；
图29显示了在来自手持UV灯的365nmUV照射下拍摄的具有不同己烷含量(fh)的TPE-Bac2的乙醇/己烷混合物的荧光照片；
图30显示了TPE-Bac2的纳米聚集体在具有90％己烷含量的乙醇/己烷混合物中的粒度分布；浓度：10μM；
图31A显示了大肠杆菌的亮场图像；
图31B显示了与10μM的TPE-Bac2一起培养2小时的大肠杆菌的荧光图像。
具体实施方式
定义
为了更好地理解本发明的主题和构造附加的权利要求，提供以下定义。
应该注意的是，除另有说明外，在此使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数形式。
“聚集诱导发光”是指基于聚集形成或者固态触发荧光/磷光。当分子溶解时，材料是不发光的。然而，当分子内旋转受到限制时，触发发光。
“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测量得到的荧光/磷光的大小。
“发光团”是指表现发光性质的分子。
“发色团”是指分子中产生其颜色的部分。
“荧光团”是指表现出荧光性质的分子。
除另有定义外，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述主题相关的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如果提供了一系列值的范围，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，则应理解，除上下文另有明确规定外，在该范围内的上限值和下限值之间的任何间隔为下限值的单位的十分之一的中间值，或该规定范围内的其他规定值或者中间值均包含在本申请所描述的主题中。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地包括在较小范围内，并且除在规定的范围中专门排除的限值以外，这些实施方案也包括在本申请所描述的主题内。在本申请所描述的主题中，还包括那些包括一个或两个限值的范围，以及排除一个或两个被包括的限值的范围。
在本申请中，各个实施例的描述使用“包括”的描述。然而，本领域技术人员可以理解，在某些特定的情况下，一个实施例可以交替使用的“基本上由…组成”或“由…组成”。
为了更好地理解本发明的教导，而非限制本发明，除另有说明外，所有的表示数量，百分比或比例的数值，或其他在本发明说明书或权利要求书中使用的其他数值，都应该为理解为是大约的。除另有说明外，在下述说明书和后附的权利要求书中出现的数值是估计的，并且取决于试图获得的性质。至少，每个数值参数至少应被解释为根据记载的重要数值通过应用普通的四舍五入获得。
缩写
AIE：聚集诱导发光
CFU(colony forming unit)：菌落形成单位
CMC：临界胶束浓度
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
DNA：脱氧核糖核酸
EtOH：乙醇
FL：荧光
HRMS：高分辨率质谱
LB：LB培养基
MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight)：基质辅助激光解吸电离飞行时间
MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)：3-(N-吗啉基)丙磺酸
NMR：核磁共振
PDI：多分散性指数
PDT：光动力疗法
PI：碘化丙啶
PL：光致发光
PBS：磷酸盐缓冲盐水
ROS：活性氧
SEM：扫描电子显微镜
SOSG(singlet oxygen sensor green)：绿色单线态氧传感器
TEM：透射电子显微镜
THF：四氢呋喃
TPE：四苯基乙烯
TPE-Bac：4-(2-(4'-(1-苯基-2，2-双(4-(十一烷氧基)苯基)乙烯基)-[1，1'-联苯]-4-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基铵基)丙基)吡啶-1-溴化锑
TPE-Bac1：4-((1E)-2-(4'-(1，2-二苯基-2-(4-(十一烷氧基)苯基)乙烯基)-[1，1'-联苯]-4-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基铵基)丙基)吡啶-1-溴化锑
TPE-Bac2：1，2-双{9，9-双[6-(N，N，N-三甲基铵)己基]-2-芴基}-1,2-二苯醚乙烯四溴化物
UV：紫外光
在一个实施例中，本申请涉及包括荧光分子的AIE发光团，所述荧光分子包括如下主链结构：
其中R，R′，R″，R″′，R″″和R″″′中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1，R2，和R3独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，和其盐构成的组；
R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，(OC2H4)n，C6H5，C10H7，C12H9，OC6H5，OC10H7，和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20。
本申请的另一实施例涉及包含显示AIE现象的荧光分子的探针，其中所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1，R2，和R3独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，和其盐构成的组；
R，R′，R″，R″′，R″″，和R″″′独立地选自由H，CnH2n+1，OCnH2n+1，(OC2H4)n，C6H5，C10H7，C12H9，OC6H5，OC10H7，和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20。
在一个实施例中，荧光分子用于细菌成像。革兰氏阳性细菌和阴性细菌可以触发荧光分子的发光。由于这些分子的AIE特性和水溶性，由于背景发光较弱，因此不需要洗涤程序。发色团在光照下产生ROS，使其能够用于哺乳动物细胞和细菌治疗。在正常光的存在时，可以有效地杀死细菌和哺乳动物细胞。含有AIE材料的琼脂平板可以重复使用数次以杀灭细菌。
在一个实施例中，AIE材料被用于高通量抗生素筛选研究。在存在有效的抗生素时，细菌生长将受到抑制的。然而，在存在无效的抗生素时，细菌将快速地生长。细菌“触发”AIE材料的发光，且将基于发光强度来评价抗生素的效果。
根据本申请的一个示例性的荧光分子是TPE-Bac。在一个实施例中，制备TPE-Bac的合成途径如下所示：
通过4，4'-二羟基苯酮(1)和4-溴二苯甲酮(2)之间的交联McMurry偶联反应，建成TPE核心(3)。在Williamson醚合成之后，获得具有两个十一烷基基团(TP)的TPE。与4-溴苯甲醛(5)的Suzuki偶联反应容易得到高产率的化合物6。通过双电荷吡啶盐(7)和具有醛官能团(6)的TPE与之间的醛醇缩合反应生成TPE-Bac。所有中间体均以中高产率获得。利用1NMR、13NMR和高分辨率质谱(HRMS)对中间体和TPE-Bac进行表征，得到与其结构相符的令人满意的结果。
在一个实施例中，由芳环构成的TPE本质上是疏水性的。双电荷吡啶鎓盐基团使TPE具有良好的亲水性，使TPE-Bac易溶于极性溶剂如DMSO、甲醇和乙醇。在非极性溶剂如THF、己烷和氯仿中，TPE-Bac是不溶的。TPE-Bac可以低浓度溶解在水中，但以较高的浓度形成胶束。
在一个实施例中，当溶解在DMSO中时，TPE-Bac在428nm(图1)处显示吸收最大值，相比单独的TPE，约有100纳米的红移。吡啶鎓盐基是强吸电子基团，而醚基团是中等给电子基团。TPE核心之间的D-A相互作用可能促进电子运动并降低能隙，产生红移吸收最大值。吸收峰的尾部拖延到约550nm，几乎覆盖了全部的UV、蓝色和绿色光区，使TPE-Bac成为光动力疗法的良好候选者。
在一个实施例中，如图2所示，TPE-Bac在DMSO中的PL光谱显示出以约520nm为中心的小的发射峰。随着THF含量的逐渐增加，PL光谱保持不变。然而，TPE-Bac的THF溶液显示出显著不同的发光谱：从PL光谱容易地识别出641nm处的强发光峰。TPE-Bac在THF溶液中的发光强度比其DMSO溶液中高出53倍，当采用手持式UV灯照射时，肉眼容易区分初两者的差异(如图2B的插图所示)。该结果清楚地表明TPE-Bac是AIE活性的，采用水溶性官能团修饰TPE不会改变TPE-Bac的AIE特性。
在一个实施例中，长烷基链和双电荷吡啶鎓盐分别增加了TPE的疏水性和亲水性，使TPE-Bac成为两亲分子。TPE-Bac可以以低浓度溶解在水中；然而在高浓度下则会形成胶束。利用TPE-Bac在聚集时的发光增强，通过追踪荧光变化可以容易地确定临界胶束浓度(CMC)。当浓度低于CMC时，TPE-Bac将以分子形式存在于溶剂中，不会观察到发光。当浓度接近CMC时，分子间相互作用将限制分子内运动，从而触发TPE-Bac的发光。如图3所示，当TPE-Bac的浓度低于0.001mM时，增加的浓度不会影响TPE-Bac的PL强度大多。然而，当TPE-Bac的浓度达到0.001mM时，强度将显著增加。绘制PL强度与染料浓度之间的关系将产生两条线，其交叉点确定CMC为0.01mM。
在一个实施例中，通过Zeta电位粒度分析仪验证了纳米聚集体在高于CMC的浓度形成(图4)。可以检测有效直径为219nm的颗粒的PDI为0.278。通过TEM测量进一步证明了纳米聚集体的存在。如图4的插图所示，在TEM图像中清楚地观察到尺寸为100-200nm的黑点。
在一个实施例中，TPE-Bac的不同之处在于它具有两个较长的烷基链，但是其发色团是相同的。ROS的产生不应该有太大的差异。为了验证这一假设，将绿色单线态氧传感器(SOSG)用于检测生成的ROS中的单线态氧的产生。SOSG是非发光性的，但单线态氧的氧化导致其在约530nm处的发光。如图5所示，采用正常光单独照射SOSG或TPE-Bac不会显著改变荧光强度。然而，在SOSG和TPE-Bac两者均存在的情况下，随着照射时间的增加，530nm处的强度随照射时间而增加，这表明产生单线态氧。
在一个实施例中，TPE-Bac用于细菌成像。如图6所示，与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟后，细菌通过TPE-Bac清楚地成像。由于TPE-Bac的AIE特性和水溶性，无需洗涤程序，TPE-Bac的背景发光仍然很低。这可以简化成像过程并减少洗涤过程中细菌的损失。
在一个实施例中，在碘化丙啶(propidium iodide,PI)的帮助下测试TPE-Bac对革兰氏阳性和阴性细菌的杀灭作用。PI是细胞膜不可渗透的荧光生物探针。对于活细菌，细胞膜是完整的，PI不能进入细菌，因此活细菌未被染色。然而，对于死细菌，损伤的细胞膜将打开PI进入其DNA的通路，从而选择性地点亮细菌。首先将细菌与TPE-Bac一起培养10分钟。为了排除TPE-Bac在溶液中的干扰，通过离心和除去上清液洗涤细菌。
然后，细菌再次分散在PBS溶液中，然后进行正常光照10分钟，用PI染色。为了进行比较，还包括对照组，其中细菌仅暴露于正常光，但不与TPE-Bac一起培养。如图7所示，用TPE-Bac和光处理后，革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌聚集在一起。这可能是因为这些处理可能破坏细菌细胞膜的完整性并暴露膜的疏水部分，从而可能导致细菌的聚集。
PI染色后，从细菌中清楚地观察到红色发光，表明细菌膜受到破坏。然而，在对照组中，没有观察到PI发光的聚集。与革兰氏阳性菌的杀灭作用相比，对革兰氏阴性菌的杀灭效果不那么广泛(extensive)。如图7所示，还观察到细菌形态的变化，但是由于革兰氏阴性细菌具有另外的外膜，作为细菌的附加保护层，因此观察到的来自细菌的PI发光相对较低。
在一个实施例中，评价了采用平板计数法的TPE-Bac的杀灭效率。在研究TPE-Bac的效果之前，对单独光线的影响进行了研究。如图8所示，照射1小时后，大肠杆菌和表皮葡萄球菌均保持健康，细菌活力无明显降低。然后，加入TPE-Bac的作用。
在一个实施例中，如图9所示，当采用TPE-Bac处理大肠杆菌，然后在黑暗中保存10分钟时，细菌活力降低到约70％，表明TPE-Bac对大肠杆菌的暗毒性。在黑暗中进一步增加保存时间对细菌没有进一步的杀灭作用。对于表皮葡萄球菌，无光照，细菌活力约为50％。光照射可以显著增加对革兰氏阳性细菌和阴性细菌的杀灭效率。在正常光照射10分钟后，TPE-Bac处理的革兰氏阳性和阴性细菌的存活率分别为40％和45％，两者在光照射30分钟后降至10％以下，1小时的正常光线照射后小于1％。
在一个实施例中，为了获得对杀灭效果的直接印象，对大肠杆菌的杀灭效果的定量板的图像如图10所示。没有处理时，细菌在盘子上健康成长。单独的光照射对细菌活力没有明显的影响(图10B)，并且菌落的大小和数量都与图10A中的类似。单独使用TPE-Bac处理在将大肠杆菌降低到一定程度，但板上仍然存在许多菌落(图10C)，这表明在黑暗中TPE-Bac对大肠杆菌的杀灭效率低下。在TPE-Bac和光照射均存在的情况下，可以有效杀灭大肠杆菌，板上几乎没有菌落，这是表明几乎所有细菌被杀死的良好信号。在表皮葡萄球菌上可以观察到类似的效果(图11)。这些结果强有力地证明，TPE-Bac与光照一起可有效杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。
在一个实施例中，也可以通过跟踪形态变化来追踪细菌活力变化。采用TPE-Bac处理大肠杆菌和表皮葡萄球菌，正常光照1小时，然后干燥，并在SEM下成像。如图12所示，没有处理时(图12A和12C)，革兰氏阳性细菌和阴性细菌的形态是相当规律的。即使细菌重叠，也具有清晰的边界，清楚地表明了细菌的健康状态。然而，处理后(图12B和12D)，发生细菌收缩和融合，形态完全不同于图12A和12C。SEM结果清楚地表明TPE-Bac和光照的存在可能导致形态变化并导致细菌死亡。
在一个实施例中，TPE-Bac对细菌杀灭的作用鼓励进一步研究细菌杀伤的可重用性。为了简化实验过程，将使用表皮葡萄球菌用于示范。将TPE-Bac加入到琼脂平板中，然后将表皮葡萄球菌喷洒到琼脂平板上，然后进行正常光照1小时，并在37℃培养箱中进一步培养24小时以允许细菌生长。在对照组(图13A)中，培养24小时后，细菌生长成小菌落。然而，在实验组(图14A)中，没有观察到菌落。然后将实验板用新细菌喷洒以重复该过程。四次喷洒细菌后，仍未观察到形成菌落。在第五次中，表皮葡萄球菌的数量增加了一倍，板上仍然没有细菌生长。注意五次不是抑制细菌生长的极限。对于仅具有TPE-Bac的琼脂平板，表皮葡萄球菌生长形成菌落(图14G)，然而其量还是少于没有任何处理时的量。有趣的是，如果首先照射含有TPE-Bac的平板，然后将细菌喷洒在板上，则培养24小时后在板上仍然没有菌落形成(图15)。因此，通过正常的光诱导产生的ROS对细菌会产生一些毒性，这可能仍然会杀死细菌。
在一个实施例中，具有AIE特性的材料适用于高通量抗生素筛选。检测的工作机理如图16所示。在无效的抗生素存在的情况下，细菌的生长不会受到抑制，细菌的浓度会很高。然而，在有效的抗生素存在的情况下，细菌的生长将受到抑制，并且细菌的浓度将非常低。采用AIE材料培养后，细菌浓度与荧光强度呈线性关系。根据荧光强度，可以确定抗生素的有效性。
在一个实施例中，选择TPE-Bac1作为抗生素筛选材料。TPE-Bac1的结构如下所示：
在一个实施例中，如图17所示，当溶解在水中时，与单独的TPE相比，TPE-Bac1在400nm处显示吸收最大值，与TPE-Bac类似，其在约100nm处发生红移。
在一个实施例中，如图18所示，TPE-Bac1在DMSO中的PL光谱基本上是不发光的。随着含水量的逐渐增加，PL光谱保持不变。当含水量增加到40％时，PL强度随含水量而升高。从PL谱可以很容易地识别577nm处的强发光峰。当用手持式UV灯照射时，水溶液和DMSO溶液的荧光强度的差异容易通过肉眼区分开(如图18B的插图所示)。该结果清楚地表明TPE-Bac1是AIE活性的。此外，用水溶性官能团修饰TPE不会改变TPE-Bac1的AIE特性。
在一个实施例中，TPE-Bac1以低浓度溶于水。然而在高浓度下则会形成胶束。利用TPE-Bac1在聚集时的发光增强，通过追踪荧光变化可以容易地确定临界胶束浓度(CMC)。当浓度低于CMC时，TPE-Bac1将以分子形式存在于溶剂中，不会观察到发光。当浓度接近CMC时，分子间相互作用将限制分子内运动，从而触发TPE-Bac1的发光。如图19所示，当TPE-Bac1的浓度低于0.001mM时，增加浓度对TPE-Bac1的PL强度的影响不大。当TPE-Bac1的浓度达到0.001mM时，强度将显著增加。绘制PL强度与染料浓度之间的关系将产生两条线，其交叉点确定CMC为0.02mM。
在一个实施例中，通过Zeta电位粒度分析仪验证了纳米聚集体在高于CMC的浓度形成(图20)。可以检测有效直径为240nm的颗粒的PDI为0.202。通过TEM测量进一步证明了纳米聚集体的存在。如图20的插图所示，在TEM图像中清楚地观察到尺寸约为100nm的黑点。
在一个实施例中，TPE-Bac1用于细菌成像。如图21所示，与10μM的TPE-Bac1一起培养10分钟后，细菌通过TPE-Bac1清楚地成像。由于TPE-Bac的AIE特性和水溶性，即使没有洗涤程序，TPE-Bac的背景发光仍然很低。这可以简化成像过程并减少洗涤过程中细菌的损失。
在一个实施例中，添加乙醇以增加TPE-Bac1的溶解度并降低混合物中的背景发光(图22)。测试不同的乙醇含量，20％被确定为具有高信噪比和稳定信号的最佳含量。
在一个实施例中，评价了无和有108CFU/mL的表皮葡萄球菌的MOPS/乙醇混合物(v/v，8/2)的PL光谱(图23)。在存在细菌的情况下，发光量比没有细菌的情况下的发光高出约14倍。如图23的插图所示，差异可以通过肉眼很容易地识别。
在一个实施例中，收集PL强度与表皮葡萄球菌浓度的标准曲线。如图24所示，随着表皮葡萄球菌浓度的增加，荧光强度呈线性增加，这表明使用TPE-Bac1进行抗生素筛选的可行性。
在一个实施例中，使用该方法评价氨苄青霉素对表皮葡萄球菌的作用。如图25所示，无氨苄青霉素时，由于细菌浓度高，TPE-Bac1的荧光强度非常高。随着氨苄青霉素浓度的增加，荧光强度急剧下降，表明有效的抗生素可抑制表皮葡萄球菌，从而降低荧光强度。从该曲线可以看出，IC50小于1μg/mL，表明氨苄青霉素有效地抑制了表皮葡萄球菌生长。
在一个实施例中，用TPE-Bac1测试更多的抗生素。如图26所示，这些抗生素在不同程度上抑制了表皮葡萄球菌的生长。从该曲线可以看出，氨苄青霉素、卡那霉素、粘菌素、链霉素是非常有效的抗生素，其IC50低于1μg/mL，而塞来霉素(stectinomycin)不太有效，短杆菌肽无效。
在一个实施例中，TPE-Bac2用于细菌成像。TPE-Bac2的结构如下所示：
在一个实施例中，采用三氯化铝作为催化剂，通过Friedel–Crafts酰化反应将芴(8)和苯甲酰氯合成化合物9。然后将其与1，6-二溴乙烷在碱性溶液中偶联，得到化合物10。随后通过采用四氯化钛和Zn催化化合物8进行McMurry偶联反应生成化合物11。采用三甲胺处理化合物11，最终得到所需产物TPE-Bac2，产率为83％。在一个实施例中，制备TPE-Bac2的合成途径如下所示：
在一个实施例中，在UV光谱中，TPE-Bac2在280nm和350nm处吸收(图27)。
在一个实施例中，TPE-Bac2是AIE活性的：其乙醇溶液在光激发下几乎不发光，但其在己烷含量为80％的乙醇-己烷混合物中的纳米聚集体是强绿色发光体(图28A-B)。
在一个实施例中，在UV灯照射下，肉眼可以容易地分辨具有不同己烷含量的乙醇/己烷中的荧光强度的不同(图29)。
在一个实施例中，DLS分析显示TPE-Bac2在己烷含量为90％的乙醇/己烷混合物中形成纳米颗粒(图30)。
在一个实施例中，TPE-Bac2可以在培养后染色细菌(图31A-B)。
实施例
以下实施例是为了说明本申请的主题，并非对其进行限制。
材料：
LB琼脂、LB培养基、无水磷酸氢钾和磷酸钠均购自USB有限公司，而绿色单线态氧传感器(SOSG)购自Invitrogen公司。锌粉、四氯化钛、4-羟基二苯甲酮、4-溴二苯甲酮、1-溴十一烷、哌啶、碘化丙啶、碳酸钾、4-甲酰基苯基硼酸和四(三苯基膦)钯购自Sigma-Aldrich并按原样使用。在使用之前，直接通过在二苯甲酮羰基钠(sodium benzophenone ketyl)中蒸馏纯化THF。根据Yan等人(P.Yan，A.Sie，M.We，L.M.Loew，J.Org.Chem.2008，73,6587)的方法合成了1-(3-三甲基铵丙基)-4-甲基吡啶鎓二溴化物。使用的其它试剂如二甲基亚砜、氯化钾和氯化钠均购自Sigma-Aldrich。
表征：
使用CDCl3和甲醇-d4作为氘化溶剂，在BrukerARX400NMR光谱仪上测量1H和13C的NMR光谱。在以MALDI-TOF模式操作的FinniganMATTSQ7000质谱仪系统上记录高分辨率质谱(HRMS)。在MiltonRaySpectronic3000阵列分光光度计上测量紫外吸收光谱。在PerkinElmer LS55光谱仪上记录稳态荧光光谱。在Olympus BX 41荧光显微镜上收集荧光图像。在Zeta电位分析仪(Brookhaven，ZETAPLUS)上测量粒径。使用透射电子显微镜(日本，JEOLJEM100CXII)在100kV的加速电压下研究TPE-Bac的聚集形态。
合成：
4，4'-(2-(4-溴苯基)-2-苯基乙烯-1，1-二基)二酚(3)
化合物3按照Duan等人报道的方法(Duan,X.-F.；Zeng,J.；Lue,J.-W.；Zhang,Z.-B.A Facile Synthesis of Tetraarylethenes via Cross McMurry Coupling betweenDiaryl Ketones.Synthesis2007,5,713–718)略作修改合成。将4，4'-二羟基二苯甲酮(3.21g，15mmol)，4-溴二苯甲酮(7.80g，30mmol)和锌粉(8.82g，135mmol)加入到500mL双颈圆底烧瓶中。将烧瓶抽真空并用氮气吹扫三次。然后，将200mL THF注入烧瓶中，然后用丙酮/干冰浴冷却至-78℃。逐滴加入TiCl4(6.74mL，67.5mmol)到混合物中。然后将该反应在氮气条件下回流过夜。冷却至室温后，向反应混合物中加入盐酸(1M)，将pH调节至2。采用DCM萃取有机混合物，并采用无水硫酸钠干燥。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，再使用己烷和乙酸乙酯(v/v，5/2)作为洗脱溶液，得到1白色固体(4.32g，65％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6，δ)：9.43(s，2H)，7.30-7.24(d，2H)，7.14-7.02(m，4H)，6.92-6.88(d，2H)，6.85-6.81(d，1H)，6.75-6.68(m，4H)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6，δ)：155.869，155.777，143.953，143.467，143.300，141.143，136.233，133.660，133.601，132.701，131.887，131.816，130.564，130.504，129.223，127.694，127.549，126.005，118.871，114.878，114.539，114.376；HRMS(MALDI-TOF)m/z：算的442.0568[M]；获得442.0099[M]+。
4，4'-(2-(4-溴苯基)-2-苯基乙烯-1，1-二基)双((十一烷氧基)苯)(4)
向250mL双颈圆底烧瓶中加入碳酸钾(4.00g，28.25mmol)和化合物3(2.5g，5.65mmol)。将烧瓶抽真空并用干燥氮气吹扫三次。加入1-溴十一烷(5.31mL，22.6mmol)和DMF(80mL)后，将反应在氮气条件下在70℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物采用DCM萃取，并采用蒸馏水洗涤数次，再采用无水硫酸镁干燥。将己烷和DCM(v/v，10/1)作为洗脱溶剂，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到化合物4，其为浅黄色粘稠油状物(3.30g，78％)。1HNMR(400MHz、CDCl3、δ)：7.24-7.20(m、2H)、7.14-6.99(m、6H)、6.94-6.87(m、5H)、6.68-6.60(m、4H)、3.92-3.84(m、4H)、1.80-1.69(m、4H)、1.47-1.24(m、32H)、0.92-0.87(t、6H)；13CNMR(100MHz、CDCl3、δ)：158.068、157.981、144.092、143.608、141.153、137.843、136.011、135.926、133.270、132.755、131.566、131.033、127.994、127.847、126.433、120.140、113.899、113.717、68.057、68.007、32.127、29.829、29.791、29.639、29.560、29.511、26.273、22.910、14.351；HRMS(MALDI-TOF)m/z：算的750.4011[M]；获得750.4021[M]+。
4'-(1-苯基-2，2-双(4-(十一烷氧基)苯基)乙烯基)-[1，1'-联苯]-4-甲醛(6)
向250mL双颈圆底烧瓶中加入化合物4(2.00g，2.60mmol)，4-甲酰基苯基硼酸(5)(0.59g，3.96mmol)，K2CO3(2.28g，16.50mmol)和Pd(PPh3)4(0.23g，0.20mmol)。将烧瓶抽真空并用氮气吹扫三次。然后，将THF(80mL)和水(20mL)注入烧瓶中，然后在氮气条件下回流过夜。冷却至室温后，将混合物采用DCM萃取，并采用蒸馏水洗涤数次，再采用无水硫酸镁干燥。将己烷和DCM(v/v，5/1)作为洗脱溶剂，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到化合物6，其为黄色粘稠油状物(1.72g，85％)。1HNMR(400MHz，CDCl3，δ)：10.03(s，1H)，7.93-7.89(d，2H)，7.74-7.70(d，2H)，7.42-7.39(d，2H)，7.16-7.05(m，7H)，7.00-6.92(m，4H)，6.68-6.62(t，4H)，3.90-3.83(t，4H)，1.78-1.70(m，4H)，1.47-1.24(m，32H)，0.92-0.87(t，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3，δ)：191.240，157.241，157.155，146.129，144.338，143.546，140.432，137.535，136.140，135.351，134.342，131.999，131.967，131.454，130.824，129.582，127.160，126.655，125.880，125.571，113.032，112.903，67.222，67.193，31.280，28.982，28.943，28.803，28.715，28.687，25.439，22.064，13.501；HRMS(MALDI-TOF)m/z：算的776.5168[M]；获得776.5176[M]+。
4-(2-(4'-(1-苯基-2，2-双(4-(十一烷氧基)苯基)乙烯基)-[1，1'-联苯]-4-基)乙烯基)-1-(3-(三甲基铵基)丙基)吡啶-1-溴化锑(TPE-Bac)
采用三滴哌啶催化1-(3-三甲基铵丙基)-4-甲基二溴吡啶鎓(7)(0.31g，0.40mmol)和化合物3(0.28g，0.79mmol)的溶液在氮气条件下在干燥的乙醇中回流。冷却至环境温度后，减压蒸发溶剂。使用二氯甲烷和甲醇混合物(2:1v/v)作为洗脱剂将残余物通过进行硅胶柱色谱法纯化，得到红色粉末状的TPE-Bac(0.24g，53％)。1HNMR(400MHz，CDCl3，δ)：9.18(s，2H)，8.01(s，2H)，7.69(d，1H)，7.47(d，2H)，7.35(d，2H)，7.17(d，2H)，7.10-6.83(m，12H)，6.55(dd，4H)，4.90(s，2H)，3.94-3.77(m，4H)，3.77-3.68(s，2H)，3.42(s，9H)，2.77(s，2H)，1.75-1.56(m，4H)，1.45-1.14(m，32H)，0.90-0.77(m，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3，δ)：157.160，157.058，152.857，143.839，143.592，141.900，140.753，140.112，137.596，136.028，135.497，135.285，132.764，131.951，131.356，130.795，128.403，127.107，126.416，125.419，123.627，121.471，112.998，112.829，67.096，62.118，53.823，31.267，31.214，29.058，28.980，28.930，28.890，28.829，28.727，28.702，28.648，28.605，25.448，25.378，22.040，22.002，13.487，13.471；HRMS(MALDI-TOF)m/z：算的1031.6024[M-Br]+；获得1031.6024[M-Br]+。
2-芴基酮(9)
在氮气条件下，向100mL双颈圆底烧瓶中加入化合物8(3.324g，20mmol)和氯化铝(III)(2.667g，20mmol)以溶于二硫化碳(40mL)中。将所得混合物在冰浴中冷却，然后将苯甲酰氯(3.093g，22mmol)滴加到混合物中。加完后，将混合物回流12小时。将混合物冷却至室温，加入40mL水以进行淬灭反应。然后将溶液用DCM萃取三次，然后用盐水和水洗涤，再采用无水硫酸镁干燥。过滤并减压蒸发溶剂后，将己烷/DCM作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化产物，得到的化合物9为白色固体，产率为90％(4.86g)。1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：8.01(s，1H)，7.85–7.81(m，5H)，7.61–7.57(m，2H)，7.51–7.47(m，2H)，7.43–7.35(m，2H)，3.95(s，2H).13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：196.7，145.9，144.4，143.0，140.5，138.1，135.8，132.1，129.9，129.6，128.2，127.9，127.0，126.8，125.2，120.8，119.3，36.8.HRMS(MALDI-TOF)：m/z270.1036(M+，算的270.1045)。
9，9-双(6-溴己基)-2-芴基酮(10)
向100mL圆底烧瓶中加入50mL50％NaOH溶液，依次加入四丁基溴化铵(0.8g)，1，6-二溴己烷(6mL，37.5mmol)和化合物9(2.027g，7.5mmol)。然后将混合物在75℃下加热12小时。冷却至室温后，将混合物采用DCM萃取几次，采用稀释氯化氢结合有机层，并采用饱和盐水和水洗涤有机层。然后采无水硫酸镁进行干燥。经过过滤和溶剂蒸发后，将己烷/DCM作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到化合物10，其为黄色油状物，产率为95％(4.24g)。1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：7.847.81(m，3H)，7.797.76(m，3H)，7.627.58(m，1H)，7.527.49(m，2H)，7.387.37(m，3H)，3.283.25(m，4H)，2.031.98(m，4H)，1.691.61(m，4H)，1.231.15(m，4H)，1.111.04(m，4H)，0.68-0.60(m，4H).13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：196.7，151.5，150.3，145.5，139.8，138.2，136.0，132.1，130.1，129.9，128.4，128.2，127.2，124.4，122.9，120.7，119.2，55.1，39.9，33.8，32.5，29.0，27.7，23.6.HRMS(MALDI-TOF)：m/z597.0724(M+，算的596.1112)。
1，2-双[9，9-双(6-溴己基)-2-芴基]-1，2-二苯乙烯(11)
在-78℃的氮气条件下向化合物10(2.98g，5mmol)和锌粉(0.82g，12.5mmol)的干蒸馏THF溶液中滴加氯化钛(IV)(1.3mL，12.5mmol)。将反应混合物温热至室温，然后加热回流12小时。再将反应物冷却至室温后，通过加入盐酸溶液进行淬灭反应。然后将混合物用DCM萃取数次。结合有机层，用饱和盐水溶液和水洗涤有机层，再采用无水硫酸镁干燥。过滤和溶剂蒸发后，将己烷/DCM作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化产物，得到化合物11，其为绿色油状物，产率为82％(2.38g)。1HNMR(400MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：7.61 7.54(m，2H)，7.49 7.40(m，2H)，7.29 7.22(m，6H)，7.13 7.00(m，14H)，3.36 3.22(m，8H)，1.90 1.49(m，16H)，1.26 1.08(m，8H)，1.06 0.85(m，8H)，0.57 0.43(m，8H).13CNMR(100MHz，CDCl3)，δ(TMS，ppm)：150.5，149.6，144.1，143.3，140.9，140.8，139.3，131.5，130.5，127.6，126.9，126.8，126.4，126.2，122.6，119.6，118.9，40.0，34.0，32.6，29.0，27.8，23.6.HRMS(MALDI-TOF)：m/z1160.6270(M+，算得1160.2327).
1，2-双{9，9-双[6-(N，N，N-三甲基铵)己基]-2-芴基}-1,2-二苯醚乙烯四溴化物(TPE-Bac2)
在-78℃向化合物11(25mg，0.02mmol)在THF(5mL)中的溶液中滴加三甲胺(2mL)。将混合物搅拌12小时，然后温热至室温。通过加入甲醇(5mL)将沉淀再溶解。将混合物冷却至-78℃后，另加入三甲胺(2mL)，然后将混合物在室温下搅拌24小时。除去溶剂后，加入水以再溶解所有沉淀物，并采用DCM萃取水溶液。将水层冷冻干燥，得到产率为83％的绿色粉末状的TPE-Bac2(25mg)。1HNMR(400MHz，CD3OD)，δ(TMS，ppm)：7.69 7.64(m，2H)，7.54 7.50(m，2H)，7.39 7.34(m，2H)，7.33 7.26(m，4H)，7.16 6.95(m，14H)，3.32 3.22(m，8H)，3.11(s，36H)，1.93 1.69(m，8H)，1.63 1.52(m，8H)，1.16 1.03(m，16H)，0.59 0.45(m，8H).13CNMR(100MHz，CD3OD)，δ(TMS，ppm)：152.1，151.0，145.5，144.7，142.5，142.3，140.9，132.5，131.6，128.9，128.1，127.7，124.2，121.0，120.4，67.6，60.5，55.9，53.7，41.1，30.4，26.9，23.9.HRMS(MALDI-TOF)：m/z1317.6105[(M–Br)+，算得1317.6083]。
样品制备：
在DMSO中制备浓度为10mM的TPE-Bac储备溶液并储存在4℃冰箱中。通过将NaCl(8g)，KCl(0.2g)，Na2HPO4(1.44g)和KH2PO4(0.24g)溶于800mL蒸馏水中，再用HCl将pH调节至7.4，然后加入水校准至1L，制备磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在液体循环下，通过在15Psi(1.05kg/cm2)下高压灭菌20分钟将PBS灭菌并在室温下储存。
细菌培养、成像和杀灭：
细菌染色：将固体培养基(用于大肠杆菌和表皮葡萄球菌的LB培养基(LB))上的单个菌落转移至5mL液体培养基中，并在37℃下生长10小时。通过测量600nm处的光密度(OD600)测定细菌的浓度，然后将109菌落形成单位(CFU)的细菌转移到1.5mLEP管中。通过在7000rpm离心3分钟收获细菌。去除上清液后，将1mL浓度为10μMTPE-Bac的PBS溶液加入到EP管中。用涡旋分散后，将细菌在室温下培养10分钟。
为了拍摄荧光图像，将约2μL的染色细菌溶液转移到载玻片上，然后用盖玻片覆盖。使用100×目标收集图像。使用不同组合的激发和发射滤光片对每种染料在FL显微镜(BX41显微镜)下对细菌进行成像：对于TPE-Bac，激发滤光片＝460-490nm，二向色镜＝505nm，发射滤光片＝515nm长通；对于PI，激发滤光片＝510-550nm，二向色镜＝570nm，发射滤光片＝590nm长通。
对于PI染色实验，将细菌与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟后，然后将细菌暴露于正常光下10分钟，而将对照组置于黑暗中。然后将PI加入到实验组和对照组中，最终浓度为1.5μM，然后在黑暗中额外培养10分钟。然后在荧光显微镜下按照以下设置成像细菌：激发滤光片＝510-550nm，二向色镜＝570nm，发射滤光片＝590nm长通。
对于光诱导的毒性实验，将108CFU的细菌分散在1mLPBS中。与10μM的TPE-Bac一起培养10分钟后，将溶液以7000rpm离心3分钟，然后除去上清液并进行PBS洗涤。然后将细菌分散在PBS中，在设计的时间段暴露于常规光照下，而对照组则处于黑暗中。然后通过平板计数法定量细菌的生存力。
基于在此包含的信息，对于本领域技术人员来说，在不偏离下述权利要求的精神和范围的情况下，对本发明的精确描述做出各种改变是显而易见的。本发明的主题不限于在此定义的步骤，性质和组分，因为这些优选的实施例以及其他描述是用于示例本发明的各个特定方面。实际上，对于化学，生物化学领域的技术人员来说，可以对本发明所描述的示例做出各种修改，这些修改都落入本发明的权利要求的保护范围。

Claims (12)

1.一种包括荧光分子的AIE发光团，其特征在于，所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中，R、R’、R”、R”’、R””和R””’中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1、R2和R3独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1和其盐构成的组；
R、R’、R”、R”’、R””、和R””’独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1、(OC2H4)n、C6H5、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20；
所述AIE发光团是TPE-Bac：
2.一种包括荧光分子的AIE发光团，其特征在于，所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中，R、R’、R”、R”’、R””和R””’中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1、R2和R3独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1和其盐构成的组；
R、R’、R”、R”’、R””、和R””’独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1、(OC2H4)n、C6H5、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20；
所述AIE发光团是TPE-Bac1：
3.如权利要求1或2所述的AIE发光团，其特征在于，所述荧光分子在光照时产生活性氧。
4.如权利要求3所述的AIE发光团，其特征在于，所述AIE发光团是光敏剂。
5.如权利要求3所述的AIE发光团，其特征在于，所述AIE发光团用于光动力疗法。
6.如权利要求5所述的AIE发光团，其特征在于，所述AIE发光团适用于琼脂平板以杀灭细菌。
7.如权利要求1所述的AIE发光团，其特征在于，所述AIE发光团具有用于细胞膜成像的正电荷和长疏水尾官能团。
8.一种包含包括荧光分子的AIE发光团的探针，其特征在于，所述荧光分子包括如下的主链结构：
其中，R、R’、R”、R”’、R””和R””’中的至少一个独立地选自
构成的组；
R1、R2和R3独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1和其盐构成的组；
R、R’、R”、R”’、R””、和R””’独立地选自由H、CnH2n+1、OCnH2n+1、(OC2H4)n、C6H5、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7和OC12H9构成的组；以及
n＝0到20；
其中所述AIE发光团是TPE-Bac：
或者
所述AIE发光团是TPE-Bac1：
9.如权利要求8所述的探针，其特征在于，所述探针用于细菌研究。
10.如权利要求8所述的探针，其特征在于，所述探针用于生物学研究。
11.一种高通量抗生素筛选和测定细菌耐药性的方法，其特征在于，包括：
将如权利要求1或2所述的AIE发光团引入到包含抗生素的样品；
基于所述AIE发光团的发光强度评价所述抗生素；
其中，所述样品中的细菌触发所述AIE发光团的发光；
其中快速的细菌生长表明抗生素无效而抑制的细菌生长表明抗生素有效。
12.一种确定临界胶束浓度的方法，其特征在于，包括：
将如权利要求1或2所述的AIE发光团引入到溶剂；以及
通过评价荧光变化来确定所述临界胶束浓度，其中没有发光表明浓度低于临界胶束浓度，并且当浓度接近临界胶束浓度时，触发发光。
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