CN106932353A - 一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明试剂盒一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，是通过使用复合稳定剂取代之前的单独的稳定剂来完成的，本发明试剂中所涉及到的试剂R1和试剂R2的最初配方是没有变化的，只是在此基础上进行优化。本发明试剂盒所涉及到的稳定剂复合物主要是由葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通X‑405和EDTA‑Na2按照不同含量组成，该复合物在水溶液中能够将有效物质进行包裹，形成一个球形囊状结构，只有当底物存在时，对其进行诱导作用，此时球形囊将包裹的物质释放到液体中参与反应。该方法与胶体包埋相似，这为生化试剂中有酶参与的生化反应试剂项目试剂稳定性提供了新的研究方向。
Description
技术领域
本发明试剂盒涉及生化试剂领域，具体涉及一种检测诊断试剂盒，主要是涉及一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒。
背景技术
肌酸激酶是细胞内能量转运，肌肉收缩，ATP再生有直接关系的一种重要激酶，通常存在于哺乳类动物的心脏，肌肉以及脑等重要组织器官中，肌酸激酶同工酶一般分为4种形式：线粒体型，主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中；肌肉型，主要存在于各种肌肉细胞中；杂化型，主要存在于心肌细胞中；脑型，主要存在于脑细胞中，临床上一般通过肌酸激酶检测进而诊断心肌梗塞，心肌梗塞患者发病后的2小时内，血液中肌酸激酶浓度升高，和乳酸脱氢酶、谷草转氨酶相比，肌酸激酶活性变化，优先表现出来，肌酸激酶是临床上重要的一种可检测酶，在诊断心肌梗塞上有较高临床检测价值和预防价值。
肌酸激酶检测方法如图1。
NADH在340nm处有吸收峰，通过监测340nm处的吸光度变化，然后乘以标准物质浓度即可计算出NADH变化速率，进而计算出计算激酶酶活；肌酸激酶含有巯基集团，具有较高的还原性，极易识货，因此检测时，要用带有巯基的物质来激活巯基集团，常用的物质主要有一下几种：巯基乙醇、硫代甘油、乙酰半管氨酸等；巯基在试剂中及其活跃，因此巯基的保护使其稳定，成为试剂中难以解决的一大难题；很大程度上一些专利和文献报道和介绍了是巯基集团稳定的方法，主要是隔离巯基物质，避免和氧气接触，但是缺陷依然存在。
发明内容
本发明内容主要是在于解决巯基集团在试剂中的稳定性问题，进而提高试剂稳定性，改善产品质量。
本发明是一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，本发明试剂盒是由R1 和R2组成的双试剂液体型检测诊断试剂盒。试剂组成为：
试剂R1为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
醋酸镁 3-5g/L
乙酰半胱氨酸 20mmol/L
羟乙基叉二磷酸 15mmol/L
辅酶I 1-5m mol/L
葡萄糖 5g/L
己糖激酶 2-8KU/L
曲拉通X-405 0.5ml/L
稳定剂复合物质 0.5-2.5%
试剂R2组成为：
咪唑 0.1mol/L
羟乙基叉二磷酸 10mmol/L
单磷酸腺苷盐 3g/L
二磷酸腺苷盐 5g/L
二五磷酸盐 0.45g/L
磷酸肌酸 32g/L
曲拉通X-405 1.5ml/L
其中稳定剂复合物主要是葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通X-405和EDTA-Na2按照不同的比例组成的。
本发明一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，试剂中物质成分的选择依据是：
咪唑缓冲液主要是缓冲作用，保证反应时外环境的稳定，致使检测结果不会受到波动和影响。
醋酸镁提供镁离子，用于激活反应中参与反应的酶类的活性，保证酶能够有效的发挥作用。
乙酰半胱氨酸用于提供巯基集团，激活肌酸激酶中的巯基。
辅酶I、葡萄糖作为反应底物。
己糖激酶催化6-P-葡萄糖反应生成6-P-葡萄酸。
曲拉通X-405作为表面活性剂。
羟乙基叉二磷酸起到良好的缓蚀阻垢作用。
单磷酸腺苷盐、二磷酸腺苷盐、二五磷酸盐和磷酸肌酸用来提供不同的磷酸集团。
葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通X-405和EDTA-Na2按照不同比例组成的复合物能够形成一种球形膜，将酶和巯基集团包裹起来，起到一定的稳定和保护作用。
本发明一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，在很大程度上解决了试剂不稳定问题；本发明试剂盒成本较低，相对于市场流通的同类试剂盒，造价远低于同类试剂盒。
应用本发明试剂盒，可以在迪瑞系列，迈瑞系列，东芝系列和日立系列全自动生化分析仪上进行操作，具体操作方式以BS-800为例：样本量：试剂R1：试剂R2=10ul:225ul:75ul，检测波长设置为340nm检测方法为速率法，反应方向为上升反应，校准物质以朗道复合校准品为主。
附图说明
图1为常规肌酸激酶检测方法；
图2为试剂盒与对照试剂盒相关性曲线图；
图3为对照试剂与本发明试剂盒稳定性检测结果；
图4为本发明与对照试剂重复性检测结果；
图5为本发明试剂盒与对照试剂盒临床检测结果。
具体实施方式
我们将结合图表、实施例对本发明进行说明：
实施例1
试剂R1为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
醋酸镁 4.5g/L
乙酰半胱氨酸 20mmol/L
羟乙基叉二磷酸 15m mol/L
辅酶I 2.5mmol/L
葡萄糖 5g/L
己糖激酶 3.5KU/L
稳定复合物 5%
稳定剂复合物组成为：
曲拉通X-405 0.5ml/L
葡聚糖4000 1g/L
丙三醇 15g/L
甘露醇 37g/L
EDTA-Na2 0.6g/L
试剂R2组成为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
羟乙基叉二磷酸 10m mol/L
单磷酸腺苷盐 3g/L
二磷酸腺苷盐 5g/L
二五磷酸盐 0.45g/L
磷酸肌酸 32g/L
曲拉通X-405 1.5ml/L
实施例2
试剂R1为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
醋酸镁 4.5g/L
乙酰半胱氨酸 20mmol/L
羟乙基叉二磷酸 15m mol/L
辅酶I 2.5m mol/L
葡萄糖 5g/L
己糖激酶 3.5KU/L
曲拉通X-405 0.5ml/L
稳定复合物 7.5%
稳定剂复合物组成为：
葡聚糖4000 4g/L
丙三醇 25g/L
甘露醇 17g/L
EDTA-Na2 0.8g/L
试剂R2组成为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
羟乙基叉二磷酸 10m mol/L
单磷酸腺苷盐 3g/L
二磷酸腺苷盐 5g/L
二五磷酸盐 0.45g/L
磷酸肌酸 32g/L
曲拉通X-405 1.5ml/L
实施例3
试剂R1为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
醋酸镁 4.5g/L
乙酰半胱氨酸 20mmol/L
羟乙基叉二磷酸 15mmol/L
辅酶I 2.5mmol/L
葡萄糖 5g/L
己糖激酶 3.5KU/L
曲拉通X-405 0.5ml/L
稳定复合物 10%
稳定剂复合物组成为：
葡聚糖4000 20g/L
丙三醇 15g/L
甘露醇 57g/L
EDTA-Na2 0.5g/L
试剂R2组成为：
咪唑缓冲液 0.1mol/L
羟乙基叉二磷酸 10mmol/L
单磷酸腺苷盐 3g/L
二磷酸腺苷盐 5g/L
二五磷酸盐 0.45g/L
磷酸肌酸 32g/L
曲拉通X-405 1.5ml/L
本发明试剂盒性能检测试验：
稳定性试验检测：
运用本发明实试剂盒（实施例1配方配制）和目前市场上流通的试剂盒进行对比，校准液和质控品分别是朗道926UN和1005UN，使用仪器为全自动生化分析仪BS-800，本发明试剂盒参数设置如下，波长为340nm，反应方向为反方向，读数点设置为21-27点，样本量：试剂R1：试剂R2=10ul：225ul：75ul；对照试剂盒严格按照试剂盒操作说明书进行，检测仪器为BS-800，以批号926UN进行校准检测，后进行结果检测，检测结果如图3所示。
通过本实验，我们发现本发明试剂盒在4℃条件下历时15天后，本发明试剂盒和对照试剂盒检测结果基本没有变化，相比对照试剂盒，检测结果更佳；37℃条件下，本发明试剂盒历时15天检测结果基本没有变化，但是对照试剂盒在37℃处理第7天时检测结果已经偏离靶值10%，15天后检测结果偏离靶值40%；45℃条件下，本发明试剂盒与对照试剂盒，经热处理后均有不同程度的降低，本发明试剂盒历经15天，检测结果尚未偏离靶值10%，对照试剂盒第三天已经偏离检测结果靶值10%，15天偏离检测结果50%。通过上述数据分析，本发明试剂盒在稳定性方面远优于对照试剂盒。
重复性实验
运用朗道校准品926UN进行校准，对朗道质控品标准物质溶液重复测试N=20次，所用试剂为本发明实施例2配方试剂与市场流通肌酸激酶检测试剂盒，使用BS-800全自动生化分析仪进行检测，检测方法在此不在重述，检测结果如图4所示。
通过重复性实验结果，我们发现，无论是对照试剂盒还是本发明试剂盒，变异系数均在5%以内，均能满足国家标准和行业标准中的相关要求，从另一方面也反应出本发明试剂盒能够胜任该试剂盒在市场和医学上的任务和要求。
临床样本检测实验
本发明试剂盒与市场流通的同类试剂盒对随机N=40个样本进行测试，测试结果以表格的形式在下表进行体现，通过图5记录的数值，进而计算出，本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性；本发明试剂盒采用实施例3配方进行检测，检测结果如图5所示。
通过图5和图2说明本发明试剂盒与市场流通试剂盒在检测临床40个随机样本，二者的相关系数r超过了0.999，这说明本发明试剂盒与市场上流通的试剂盒均可满足市场上的需求，亦可满足医院检验科的临床样本检测。
综上所述，再加上本实验室长时间来的检验数据(有部分数据在此没有呈现),本发明试剂盒中当试剂R1中复合稳定剂的比例为5.5%为最好，每个实施例中我们都进行了三组不同比例的检测，每次均是选择较好的一组，本发明试剂盒未将所有数据全部呈现，综合所有检测结果，均以实施例1的配方为最佳方案。
Claims (3)
1.一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂盒是由试剂R1(以后简称R1)和试剂R2(以后简称试剂R2)组成的双试剂液体型诊断检测试剂盒，其中R1：R2=3：1；试剂R1主要是由咪唑、醋酸镁、乙酰半胱氨酸、羟乙基叉二磷酸、辅酶I、葡萄糖、己糖激酶、表面活性剂和稳定剂复合物质组成；试剂R2主要是有咪唑、羟乙基叉二磷酸、单磷酸腺苷盐、二磷酸腺苷盐、二五磷酸盐、磷酸肌酸和表面活性剂组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中涉及到的稳定剂复合物是一种新型的稳定剂，它是由多种物质组成，在液体溶液中形成一种保护性球形膜，能够将试剂中参与反应的酶进行包埋，从而将反应酶与缓冲液和其他物质隔离在相对空间里。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，本发明试剂盒所用的稳定剂复合物主要是由以下物质组成：葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通X-405和EDTA-Na2组成。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2017
- 2017-04-12 CN CN201710237216.3A patent/CN106932353A/zh active Pending
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